FRANCE cÔTÉ

Pu rification et caractérisation d'une UDP-glucose:cmcétine 8,8'-glucosykrsnsfé.rsse impliquée dans la synthèse de la crocine 1 partir de cultures cellulaires de safran

(Crocus sativus L.)

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures de l'université Laval

pour l'obtention du grade de Phüosophiae Doctor (Ph. D.)

Département de phyto logie FACULTÉ DES SCIENCES DE L~AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITE LAVAL QUÉBEC

JANVIER 2000

O France Côté, 2000

National Library 1*1 of Canada Bibliothèque nationale du Canada

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L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

UNIYERSm LAVAL A T T E S T A T I O N

Faculte des B î W e a supérieures

Ce 17e jour du mois de decembre 19 99 , les personnes soussign6es . en leur qualit6 de membres du jury de la these de Hadame France c6te I

ont assiste la soutenance de cette these.

S e l i m Kermasha McGi 1 1

Lou i s-P . Vézi na Lava l

Dominique Michaud Lava 1

Claude W i l lemot Lava 1 1

François Cormier R & D, Colarôme Inc.

RÉSUMÉ COURT

Une UDP-g lucose:crocét ine 8,8'-glucosyltransférase impliquée dans la synthèse des mono-

glucosyles et diglucosyles esters de la crocétine a été purifiée et caractérisée pour la première

fois à partir de suspensions ceiIulaires de &?an (Crocus sativus L.). Le poids moléculaire,

déterminé par nItration sur gel est de 50 kD et l'enzyme pourrait être formée de 2 sous-unités

de 26 kD, déterminées par électrophorèse en conditions dénaturantes. Le point isoélectrique se

situe entre le pH 4.4 et le pH 4.6, alors que la température optimale pour l'activité de l'enzyme

a été établie a 40°C. Les valeurs Km apparentes pour 1'UDP-glucose et la crocétine sont de

0.72 mM et 0.17 mM respectivement, alors que la valeur Vmax est de 30 pkatdmg. La

préparation enzymatique purifiée est hautement spécifique à la crocétine et ne contient pas

d'activité permettant la formation des gentiobiosyles esters de la crocétine. Cette étude amène

des évidences concrètes appuyant l'hypothèse selon laquelle au moins deux glucosyltransférases

distinctes seraient impliquées dans la biosynthèse des glycosyles esters de crocétine chez le

sa&.

Claude Wiemot. directeur ' Fra'riCe Côté

RÉSUMÉ LONG

Les stigmates du safian (Crocus safivus L.) contiennent des caroténoïdes rares qui sont

solubles dans l'eau, principalement la crocine, le digentiobiosyle ester de la crocétine. En plus

de posséder un pouvoir colorant important, la crocine est un très bon antioxydant qui o£Ee une

protection contre le cancer. L'uiformation au sujet de la glycosylation des caroténoïdes est

limitée, mais des études ont indiqué qu'une serie de glucosyltransférases seraient impliquées

dans la formation des glucosyles et gentiobiosyles esters de la crocétine [Duf?esne et al., 1997,

Planta Med., 63: 150-1531. Le but de cette thèse était de véritier cette hypothèse en purifiant et

en séparant les enzymes impliquées dans la glucosylation de la crocétine en crocine. Deux

protocoles de purincation ont été mis au point, le premier utilisant une précipitation à l'acétone

suivie de chromatographies d'échange anionique et de filtration sur gel. Cette purification a

permis de caractériser Io UDP-g1ucose:crocé the 8,8'-glucosyltransférase par son poids

moléculaire (environ 50 kD), son point isoélectnque (pH 4.4-4.6)' sa température optimale

(40°C) et ses paramètres cinétiques (Km pour la crocétine = 0.17 rnM et Km pour I'UDP-

glucose = 0.72 rnM, Vmax = 30 pkatdmg).

Le deuxième protocole de purincation est une simplification du premier: seulement deux

techniques de séparation ont été utilisees afin d'obtenir un extrait enrichi 300 fois: la

c hrornatographie de filtration sur gel et I'isoélectrofocalisation préparative. Cette dernière

technique a permis d'isoler l'une des enzymes impliquées dans k formation des glycosides de la

crocétine, I'UDP-glucose:crocétiw 8,8'-glucosyitransféta~e. Une étude de spécificité a permis

de démontrer que cette enzyme est hautement spécifique envers la crocétine et qu'elle ne

catalyse que la synthèse des monoglucosyles et diglucosyles esters de la crocétine, sans

formation des gentiobiosyles esters. L'extrait enzymatique non purifié contenait également des

g lucosy ltransférases capables de glucosyler les acides abscissique et rétino ique. Les résultats

découlant de nos travaux sont les premiers qui rapportent la purification et la caractérisation de

I'UDP-glucose:crocéthe 8'8'-glucosyltransférase.

AVANT-PROPOS

A Arianne

Ce n 'est pas fini tant que ce n 'est pas fini.. . Yogi Berra

REMERCIEMENTS

La Fondation de l'université Laval Le Fonds FCAR Le Centre de Recherche et de Développement sur les Aliments de St-Hyacinthe

François Cormier Claude WiNemot

Ma famille:

Simon Claire

Mes collègues et amis..

Christine Gendron Steve Bourassa Nathalie Chartier Marie-Josée Lemay Brian Stewart Carole McKinnon Tony Savard Pierre Brouillette Danielie Leblanc Claude Champagne

Remerciements spéciaur=

Louis Vézina François Belzile

Sarah André

Claude Gagnon Marie-Claude P o u h Sébastien Soucy Richard Voisine Laurent Bazinet François St-Ge& Hélène Gagnon André Morin Nancy Gardner Claude Dannis

Daniel Dostaler

Daniel

Nicolas Chagnon Joël Girouard Denis Bélanger Ali Kademi Hélène Gaudreau Luc Lagacé Daniel Vincent Normand Robert Denise Chabot Edward Farnwort h

À Christiane Dufiesne pour son travail, sa ciisponibüité et ses précieux conseils. À François Brion pour son amitié et pour m'avoir permis de terminer mon doctorat en m'engageant comme assistante de recherche. À Yolande Lambert, ma belle-maman, pour m'avoir hébergée et gâtée de ses bons petits plats.

Page ................................................................................... RESUME COURT II

RESUMELONG ..................................................................................... III .................................................................................... AVANT.PROPOS IV

REMERCIEMENTS ................................................................................... V .......................................................................... TABLE DES MATERES VI ........................................................................... LISTE DES TABLEAUX X

............................................................................... LISTE DES FIGURES Xi

CHAPITRE 1

......................................................................................... INTRODUCTION . . ............................................................................................... 1 . 1 Introduction generaie .......................................................................... 1.2 Objectifs de ia thèse .... ..

1.3 Aperçu du contenu de la thèse ................. .. ............................................................

REVUE DE LA LITTERATURE ........... .. .................................................... 6

.................................................................................. 2.1 Les caroténoïdes .............................................................................. 2.1.1 Définition ............................................................................... 2.1.2 Structure

.................................................................... 2.1 -2.1 Diversité ............................................................................... 2.1.3 Synthèse

2.1.3.1 Voie de l'acide mévdonique: de l'acétyl-CoA a I'IPP ............... 2.1 .3.2 Conversion de l'acide mévaionique en IPP ............................. 2.1.3.3 Synthèse du géranylgéranylpyrophosphate .............................

............................................ 2.1.3.4 Biosynthèse des caroténoïdes 2.1.3.5 Voie de synthèse indépendante de l'acide mévalonique ..............

.................................................... 2.1.3.6 Biotechnologie ...... .. ................................................ 2.1.3.7 Régulation de l'expression

2.1.4 Fonctions et localisation des caroténoïdes ......................................... .................................................. 2.1.4.1 Tissus photosynthétiques

2.1 A.2 Tissus non-photosynthétiques ............................................ 2.1.4.3 Alimentation humaine .....................................................

........................................................................................... 2.2 Le s a h 2.2.1 Généralités .............................................................................

................................................... 2.2.1.1 Description de la plante ....................................................................... 2.2.1.2 Culture

........................................................... 2.2.1.3 Culture cel3ulaire .................................................................. 2.2.1.4 Utilisations .. . .

2.2.2 Composition chimique ................................................................ 2.2.3 La crocétine ............................................................................ . .

2.2.3.1 Synthèse chimique ......................................................... 2.2.3.2 Synthèse biologique .................... ,. ..................................

2.2.3 .2.1 Dégradation oxydat ive ......................................... . . 2.2.3.2.2 Dixnémation .....................................................

............................................................ 2.2.4 Glycosides de la crocét ine ......................................................... 2.2.4.1 Synthèse chimique

............................................................. 2.2.4.2 Bioconversion 2.3 Glycosyltransférases ..............................................................................

2.3.1 Définition ............................................................................... .............................................................................. 2.3.2 Spécificité

2.3.3 Rôles .................................................................................... ............................................................................. 2.3.4 Purification

2.3.5 Glucosy ltransférases catalysant la glucosy lat ion de la fonction carboxylique 2.3 .5 . 1 L'UDP-g1ucose:crocétine 8,8'-glucosyltransférase .................. 2.3 S.2 Hypothèse de la voie de biosynthèse des glycosides de la crocétine . .

2.4 Problématique et objectifs .........................................................................................

CHAPITRE III

PROPERTIES OF A GLUCOSYLTRANSFERASE INVOLVED IN CROCiN SYNTHESIS (PROPRIÉTÉS D'UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE IMPLIQUÉE DANS LA SYNTHÈSE DE LA CROC~NE) ....................................................................

............................................................................................... RESW ........................................................................................... AB STRACT

3.1 Introduction ....................................................................................... 3.2 Materials and methods ...........................................................................

.............................................................. 3.2.1 Chernicals and reagents 3.2.2 CeU culture ............................................................................. 3.2.3 Extraction and pudication of UDP-g1ucose:crocetin 8,8 '-

.................................................................... glucosyltransferase .............................................................. 3.2.3.1 Buffer systems

................................................................... 3.2.3.2 Extraction 3.2.3.3 Ion exchange chrornatography ...........................................

3.2.3.4 Gel permeation ............................................................. 3 .2.3.5 Glucosyltransferase assay ................................................. 3 .2.3 -6 f3-glucosidase assay ........................................................ 3.2.3.7 Protein assay ................................................................

3.2.4 Other purification methods tested .................................................. 3.2.4.1 Dye columns ................................................................ 3.2.4.2 Affinity with UDP-glucuronic acid ......................... ... .......

3.2.5 Characterization of the glucosyltransferase ........................................ 3.2.5.1 Effect of temperature ...................................................... 3.2.5.2 Isoelectric point @I) .......................................................

.......................................... 3.2.5.3 Estimation of molecular weight 3 .2.5.4 Enzyme kinetics ............................................................

3 -3 Results and discussion ........................................................................... 3.3.1 Enzyme purification ................................................................... 3.3.2 Characterization .......................................................................

3 -4 Acknowledgements .............................................................................. 3.5 References .........................................................................................

CHAPITRE IV

A HIGHLY SPECIFIC GLUCOSYLTRANSFERASE IS INVOLVED IN THE SYNTHESIS OF CROCETIN GLUCOSYL ESTERS IN CROCUS S A T ' W S CULTURED CELLS (UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE HAUTEMENT SPÉCIFIQUE EST IMPLIQUÉE DANS LA SYNTHÈSE DES G L U C O S ~ E S ESTERS DE LA CROCÉTTNE DANS LES CULTURES CELLULAIRES DE CROCUS

.............................................................................................. SA TI WS)

.............................................................................................. RÉsm ........................................................................................... AB STRACT

....................................................................................... 4.1 Introduction 4.2 Materials and methods ...........................................................................

........................................................ 4.2.1 Plant materials and chernicals 4.2.1 . 1 CeU culture ................................................................. 4.2.1.2 Chernicals ...................................................................

4.2 -2 Enzyme purification ................................................................... 4.2.2.1 Extraction ...................................................................

................................................................ 4.2.2.2 Gel filtration 4.2.2 -3 Preparat ive IEF .............................................................

............................................................ 4.2.3 Enzyme and protein assay . . 4.2.4 Enzyme charactemation .............................................................. 4.2.4.1 SDS-PAGE and native molecular weight deterrninat ion .............. 4.2.4.2 Isoelectnc focusing ........................................................ 4.2.4.3 Effects of the enzymatic extract on glycoside composition of

safllion pigment .............................................................

................................. ............... 4.2.4.4 Substrate spécificity .... ............................................................................................. 4.3 Results

........................................................... 4.3.1 Purification and properties 4.3.2 Specificity ..............................................................................

................ ............ 4.3.3 Separation of GTASE 1 and GTASEZ activities .... ..... 4.3.4 Glucosykting and deglucosyiating activities in the crude desalted extract

......................................................................................... 4.4 Discussion .............................................................................. 4.5 Acknowledgements

.................................................................................... 4.6 Literature cited

. . ....................................................................... CONCLUSION GENERALE 93

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................... %

LISTE DES TABLEAUX

CHAPITRE II

Tableau 1.

Tableau 2.

Tableau 3.

CHAPITRE III

Table 1.

Table 2.

CHAPITRE IV

Table 1.

Table II.

Table III.

Table IV.

Gènes clonés codant pour des enzymes impliquées dam la biosynthèse des caroténoTdes végétaux (Bartley et al ., 1 994). .................................................................. 1 7 Composition des stigmates séchés du d a n (Crocus sativus).

................................................. (Pfander et Rychener, 1 982). -25 Liste et caractéristiques de quelques glycosyltransférases.. ........... .37

Purification of UDP-g1ucose:crocetin glucosyltransferase fiom Crocus sativus L. ceU suspension culture. Purification is as

................................. descriid in "Materials and Methods" .54 Propenies of UDP-glucose:crocetin glucosyltransferase in a

............................. Crocus sativus L. celi suspension culture. -6 1

Purification of UDP-Glc:crocetin glucosyltransferase fiom Crocus sativus L. ceil suspensions. Results are the means of dupücates. Enzyme activity was assayed with 1 .O mM crocetin

............................................. and 2.5 mM üDP-glucose.. -8 1 Substrate specificity of GTASEl purifïed 2- or 300-fold. Reactions were assayed with 2.5 rn of each glycosyl donor, and with 200 m~ of each glucosyl acceptors. Results are the

.................................................... rneans of dupîicates.. -83 Glucosylation profile foliowing 60 min incubation of crude desalted (PDIO), gel iïltration-purified and preparative enryme IEF-pded preparations with 1 .O mM crocetin and 2.5 mM UDP-Glc. Reaction products have been identined by NMR and

.................... m a s spectroscopy (Van Calsteren et al., 1997). .85 Modification of the profile of a d o n stigmata pigment extract d e r 1 and 3 hours of incubation with a crude desalted (PDIO) extract of Crocus sativus cell suspensions. Resuhs are the means

............................................................ of duplicates.. -86

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE II

Figure 1. Figure 2. Figure 3.

Figure 4.

Figure 5.

Figure 6.

Figure 7.

Figure 8. Figure 9. Figure 10.

Figure 1 1.

Figure 12.

Figure 13.

Figure 14.

Figure 1 5.

Exemples de carotéwïdes xanthophylles retrouvés dans la nature.. ..... .7 ................................ Structure de l'unité de base des carotènes.. ..8

Voie de synthèse de l'acide mévalonique et de I'IPP ....................... ...................... (Gershenzon et Croteau, 1 993).. .. .9

Voie de synthèse des prényles pyrophosphates et des classes majeures de terpènes. (Gershemn et Croteau, 1 993). .................................. 1 2 Voie de biosynthèse des caroténoîdes d'origine végétale

....................................................... (Bariley et Scoinik, 1995) -14 Schéma de la compartimentation suggérée de la biosynthèse de I'IPP et des lipides isoprénoïdes chez les végétaux supérieurs basé sur les études de marquage au cl3. Le site d'inhibition de la formation de stérols par la mévinoiine est indiqué par une croix

.................................................... (Lichtenthaler et al., 1997) 15 Mécanisme proposé du cycle des xanthophyiles

.............................................................. (Goodwh, 1 980). .20 . . ......................................................... Forme cis de la bwne .22 ...................................................... Morphologie du crocus. .23

Conversion chimique et enzymatique de la picrocoche .............. en oxysafianol et safianal (Adapté de Lozano et al., 1999) ..26

Voie possible de la formation de la crocétine (Adapté de Pfander ..................................................... et Schurtenberger, 1982). .29

Structure chimique de la crocétine et des ses glycosyles esters retrouvés ................................................................. dans le s a h . . -3 1

Synthèse et hydrolyse des glycosides végétaux ..................................................................... (HGsel 198 1 ). .32

Profl HPLC et identification des pics des produits de glucosylation après 150 minutes d'incubation du mélange de crocétine et d'UDP- glucose avec un extrait de cals de s a h . a croche, b gentiobiosyle- glucosyle ester, e diglucosyle ester, f monogentiobiosyle ester, h mo~glucosyle ester et I crocétine. d, e, g, i, j, k et m sont les dérivés cis de la crocétine et ses glycosyles esters

........................................ (Adapté de Dufresne et al., 1997).. ..39 Voie proposée pour la biosynthèse par l'addition en plusieurs étapes de molécules de glucose a la molécule de crocétine par un extrait de cals de &an GTASE 1 est la glucosyltransférase responsable de l'addition de glucose aux groupements carboxyles terminaux et GTASE2 aux groupes glucosyle ester (Adapté de Dufiesne

..................................................................... et al., 1 997) .40

XII

CHAPITRE III

Fig. 1 Structure of crocetin and its glycosides.. .................................... 46 Fig. 2 Anion-exchange chrornatography of UDP-glucose:crocetin

glucosyltransferase using a Mono Q FPLC column. The bound proteins were eluted using a hear gradient (0-0.5 M) of NaCl (-O-). Fractions (2.5 mL) were collected and assayed for enyme activity against 1 .O mM crocetin (solid bars). The protein content (-) in each fiaction was monitored at 280 nm. ........................................ - 3 6

Fig. 3 Elution profile of proteins (-) and glucosyltransferase activity against 1 .O mM crocetin (solid bars) d e r gel permeation FPLC on a Superdex 200 prep grade column. The protein content in each 2.5 mL hct ion was rnonitored at 280 m.. ......................................................... 57

Fig. 4 SDS-PAGE of the 125-fold purifieci extract after gel permeation FPLC on Superdex 200 prep grade column (Lane 1 ) and moiecular weight markers (Lane 2). The stacking gel was 4.0%, the separating gel was 12% using Tris-HC1 b a e r at pH 8.8. The sarnple b a e r contained SDS and P-mercaptoethanol. The gel was stahed with silver nitrate.. ....... .58

Fig. 5 SDS-PAGE of the glucosyltransferase preparations fkom &on ceils after purification by afEnity with Cikcron Blue column d e r gel p e m t i o n FPLC on Superdex 200 prep grade column. The stacking gel was 4.0%, the separating gel was 10% using Tris-HC1 bufEer at pH 8.8. The sample buffer contained SDS and B-mercaptoethanol. The gel was stained with silver nitrate. .................................................... -59

Fie. 6 a) Activity of partially purified g1i;cosyltransferase &et acetone precipitation at temperatures ranging fiom 20 to 55°C. b) Activity of partially purifîed glucosyltransferase aller gel permeation FPLC at temperatures ranging fiom 30 to 4S°C. Activity was measured with 1 mM crocetin and 2.5 rnM UDP-glucose as substrates. Results are the . . .......................................................... means of tnplicates.. -62

CHAPITRE IV

Figure 1. Multi-step pathway proposed for crocet in glycoside biosynt hesis by addition of glucose moieties to crocetin: GTASE 1 and GTASE2 are responsible for the addition of glucose moieties to a terminal carboxyl group and to a glucosyl group, respectively (adapted fkom Dufiesne et al., 1997). ...................................................................... -72

Figure 2. Chemicai structure of the substrates tested wit h the g lucosy ltransferase extract. a. valeric acid, b. 4-methyl valeric acid, c. 2-methyl valeric acid, d. h-ans-2-penteno ic acid, e. pans-2,4-pentadieno ic acid, f. trans-2- methyl-Zpentenoic acid, g. ail-tram-retinoic acid, h. 1 3-cis-retinoic acid, i. ail-tram-abscisic acid, j. b i i k. norbixin, 1. crocetin ........ ..79

Figure 3. Analysis of the 300-fold purified glucosyltransferase extract fkom &on cell. A, SDS-PAGE of protein extract &er preparative IEF, stained with silver nitrate. B, IEF of highly pudïed GTASEI, stained . . wtth silver nitrate.. . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -82

CHAPITRE 1

INTRODUCTION

1.1 Introduction générale

L'utilisation d'enzymes végétales comme biocatalyseurs trouve de plus en plus d'applications

au niveau des industries pharmaceutiques, chimiques et alimentaires. Bien que plusieurs

composés d'origine végétale puissent être produits par synthèse organique, certaines synthèses

sont d'une telle complexité (e-g. la morphine, la scopotamine, la Wiblastine. la Wicristine et la

digoxine) que la seule source économiquement rentable demeure la plante elle-même.

Toutefois, la culture des végétaux dépend de nombreux facteurs enviromementaux tels que le

climat, les insectes et les saisons. Les rendements et la qualité sont aussi très variables et des

facteurs politiques, comme l'état de guerre dans le pays producteur, peuvent rendre dacile la

culture ou la récolte de la plante recherchée (Pras et al., 1995). En revanche, la

biotransformation à l'aide d'enqmes végétales ne dépend pas de ces facteurs et elle offre, de

plus, de nombreux avantages comparés à la synthèse chimique. Les réactions catalysées par des

protéines peuvent se faire sous des conditions de température, de pH et de pression modérées

(Roberts et Turner, 1992). La plupart des biocatalyseurs effectuent des réactions stéréo- et

régiospécifiques sur des composés qui peuvent même être synthétiques ou étrangers à la plante

d'où proviennent les enzymes. Quelques-unes des ces réactions sont d'intérêt pour l'industrie

pharmaceutique, mais ne se font pas ou sont faites difncilement par synthèse organique ou à

l'aide de microorganismes (Pras et al., 1995).

L'une de ces réactions est la glycosylation et, particulièrement, la glucosylation. Cette réaction

peut être catalysée par des enzymes de la classe des transférases (EC 2.4.œ) ou des glycosidases

(EC 3.2.-), mais le transfert d'un sucre sur un substrat accepteur est généralement réservé aux

transférases telles que les glycosyItransférases. Les glucosy1transférases utilisant de ITJDP-

glucose se retrouvent presque uniquement chez les végétaux supérieurs et y jouent des rôles

physiologiques importants. Elles agissent, entre autres, au niveau de la régulation hormonale et

permettent l'entreposage, dans la vacuole, de plusieurs métabolites secondaires sous forme de

glucosides. Ces derniers dEerent de leur agiycone par leur plus faible réactivité chimique et

leur plus grande solubilité dans I'eau (HBsel, 1981), une propriété qui peut être intéressante à

exploiter dans les domaines pharmaceutique et alimentaire.

Les caroténoïdes sont des substances fipophiles généralement insolubles dans l'eau à moins

qu'un groupement fortement polaire, comme un sucre, n'y soit associé. Cette insolubilité rend

leur utilisation en industrie alimentaire diaicile. Une partie dispendieuse, mais essentiele, du

procédé industriel est la transformation du composé Lipophile en une microdispersion qui puisse

être dispersible dans les milieux aqueux tels que les jus de h i t s (Britton et al., 1995).

Quelques-uns de ces composés comme le B-carotène et la bWne (annato) ont trouvé des

applications comme colorant alirnentaire.

Le matériel colorant du safhn est composé en grande partie des formes glucosylées du

caroténoïde crocétine (Sampathu et al., 1984; Rios et al.. 1996). La forme glucosylée

principale, la crocine ou le di-(P-D-gentiobiosyle) ester de trans-crocétine, est soluble dans

I'eau ce qui est une propriété rare chez les caroténoïdes et une qualité importante pour

l'industrie alimentaire. La crocine est la remplaçante idéale du colorant artificiel tartrazine.

c'est-à-dire le FD & C Yellow No 5 (Timberlake et Henry, 1986). De plus, la crocétine et la

crocine font partie des constituants actifs des extraits de safkan au niveau pharmacologique

(Rios et al., 1996). Toutefois, le safian étant l'épice la plus dispendieuse au monde, son

utilisation comme source de crocine est peu rentable. Un procédé de bioconversion à l'aide de

celiules de d i a n pourrait diminuer les coûts et rendrait le procédé plus reproductible

comparativement à la source végétale, mais le taux de bioconversion à I'aide de suspensions

cellulaires de safian n'est pas assez élevé pour être rentable industrieliement (Dufiesne et al.,

1999). De plus, le coût du substrat, la crocétine, est trop élevé. Par contre, le clonage des gènes

impliqués dans la synthèse de la croche suivi de leur intégration au génome de

microorganismes serait une fàçon intéressante de produire efficacement la croche.

La voie de synthèse de la crocétine n'a toutefois pas encore été élucidée. Deux hypothèses ont

été proposées pour la synthèse de l'aglycone de la crocine, la crocétine. La première serait une

dégradation oxydative d'un caroténoïde à quarante carbones comme la zéaxanthine. La

dimérisation du gérany lgéranyle pyrophosphate suivi de réactions de désaturat ion et

d'oxydation sont à la base de la deuxième hypothèse ( P W e r et Schurtenberger, 1982). 11

existe peu d'études qui ont porté sur la transformation de la crocétine en crocine. De plus, les

enzymes impliquées dans la glucosylation de la crocétine en crocine n'ont jamais été purifiées ni

caractérisées.

Dufiesne et collaborateurs (1997) ont montré que la bioconversion de la crocétine peut être

faite par un extrait cellulaire de cals de safian et que le processus se fait en plusieurs étapes

pour générer plusieurs glycosides de la crocétine. Les cinétiques de formation des

monoglucosyles et diglucosyles esters sont semblables, mais dEerent de celles des

gentiobiosyles esters de la crocétine. Les extraits de cals de Vitis vinifru contie~ent une

enzyme catalysant le transfert de glucose sur les fonctions carboxyliques terminales mais non

sur les groupes glucosylee esters de la crocétine. Ces observations semblent indiquer que la

glucosylation de la crocétine serait catalysée par deux glucosyltransférases différentes; lhne

(GTASE 1 ) cataiysant l'ajout d'une molécule de glucose à chaque extrémité de la molécule de

crocétine et l'autre (GTASE2) favorisant la f o m t ion des gentiobiosyle esters (Dufiresne et al-,

1997).

1.2 Objectifs de la thèse

Afin de mieux connaître le mode d'action des glucosyltransférases qui catalysent la formation

de la crocine à partir de la crocétine, les objectifs de cette recherche sont:

1) de purifier les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de la croche;

2) de caractériser ces enzymes;

3) de séparer les enzymes qui catalysent k glucosylation de la crocétine en crocine.

Les résultats obtenus permettront de vérifier l'hypothèse de Ddesne et coiiaborateurs (1997):

Ia glucosylation de la crocétine en crocine est catalysée par deux glucosyltransférases

différentes; GTASEl catalysant la formation des glucosyles esters de la crocétine et la

GTASE2 favorisant la formation des gentiobiosyles esters de la crocétine.

Les glucosyltransférases végétales sont généralement reconnues comme ayant des spéciticités

de substrat variables (Hosel 1981). Nous dons vérifier la spécificité de substrat des

glucosyltransférases étudiées afin de déterminer si d'autres substrats ayant un intérêt médical ou

une similarité de structure avec la crocét ine pourraient être glucosy lés.

1.3 Aperçu du contenu de la thèse

La thèse est présentée sous la forme d'articles scientifiques.

Au chapitre II, une revue de littérature a été rédigée sur les caroténoïdes et les divers

constituents du safian. Une attention particulière a été portée à la glycosylation par les

glycosyltransférases.

Le chapitre III présente, sous k forme d'un article qui a été accepté pour publication dans la

revue Plant Science, les résultats expérimentaux concernant la purification partielle et la

caractérisation d'une glucosyltransférase impliquée dans la synthèse de la croche à partir de

suspensions cellulaires de s h (Crocus sa t iw) .

Le chapitre IV contient les résultats obtenus lors de 19étude de la spécificité de substrat de la

GTASEI pudiée et séparée de la GTASE2 à pariir de suspensions cellulaires de Crocus

sarivus. Les résultats sont présentés sous la forme d'une article qui soumis à la revue Pknt

Physiology.

Le chapitre V, en conclusion générale de la thèse, se termine pat les perspectives de la

poursuite de la recherche.

CHAPITRE II

R E W E DE LA LITTÉRATURE

2.1 Les caroténoïdes

2.1.1. Définition

Les caroténoïdes représentent l'un des plus grands groupes de pigments retrouvés dans la

nature. Ils passent par toutes les teintes entre le jaune et le rouge et 1orsqu.ils sont complexés à

des protéines, leur couleur peut devenir bleue ou verte (Goodwin, 1984). Ces molécules

appartiennent au groupe des terpénoïdes et sont synthétisées par les végétaux supérieurs, les

algues, les champignons et les bactéries. Les animaux semblent incapables de les synthétiser.

mais la coloration de certaines espèces provient des caroténoïdes contenus dans leur nourriture

(Britton et al., 1995). Dans les tissus photosynthétiques, la couleur des caroténoïdes est

masquée par la chlorophylle, mais lors des derniers stades du développement de la plante. ces

pigments vont contribuer aux couleurs vives de plusieurs fleurs et h i t s , et à l'orangé des

racines des carottes (Bartley et Scolnik, 1995).

2.1.2 Structure

2.1.2.1 Diversité

Environ 600 caroténo~des differents ont été identifiés chez une vaste gamme de végétaux, de

bactéries et d'algues. En plus d'être nombreux, ces composés possèdent une grande diversité

de structure. La figure 1 illustre quelques exemples retrouvés dans la nature. Les caroténoTdes

peuvent être séparés en deux groupes: k classe des hydrocarbones, nommés carotènes, et celle

des dérivés oxygénés, les xanthophylles (Goodwh, 1980). La plupart possèdent un squelette de

base a 40 carbones qui consiste en huit unités isoprènes dont l'mangement est renversé au

centre de la molécule (figure 2), le lycopène représentant le squelette carboné de base. Les

caroténoïdes peuvent être acycliques ou avoir une des deux ou les deux extrémités cycliques.

De plus, leur degré d'insaturation peut varier (Bartley et Scolnik, 1 995).

V Capsmot bioc

Figure1 . Exemples de caroténoïdes xanthophylles retrouvés dans la nature.

Quelques glycosides de caroténoïdes ont été identifiés, le plus connu étant la croche, le

pigment majeur des stigmates du safian (Crocus sativus). D'autres caro ténoïdes glycosy lés ont

également été isolés chez des bactéries non-photosynthétiques et les algues bleues-vertes

(Pfander, 1976). Le mono- et le di-glucoside de la zéaxanthine chez Enviniu herbicolu et

Envinia uredovora ainsi que la zéaxanthine rhamnosylée chez Corynebocteria sont des

exemples de caroténoïdes cycliques glycosylés (Hundle et al., 1992).

Des caroténoïdes associés à des protéines sont également présents dans la nature. Cette

association permet de aabiiiser le pigment, mais en change la couleur. Le caroténoïde rouge

astaxanthine, lorsqu'il est complexe à une protéine, donne k couleur bleue des carapaces de

homard. Les complexes caroténoïdes-protéines n'existent pas seulement chez les animaux

puisqu'ils sont présents chez certaines feuiles vertes, h i t s , légumes et bactéries (Francis.

1985).

Pbyrotie

Figure 2. Structure de l'unité de base des carotènes.

2.1.3 Synthèse

Les caroténoïdes sont synthétisés dans les plastides. Dans les chloroplastes, iis s'accumulent

principalement dans les membranes photosynthétiques en association avec les complexes

d'absorption de lumière et les centres réactionnels. Dans les chromoplastes des h i t s en cours

de mûrissement et des pétales des fleurs ainsi que dans les chloroplastes des feuiiies

sénescentes. les caroténoïdes peuvent se retrouver dans les membranes et les corps lipidiques

ou dans d'autres structures à l'intérieur du stroma (Cunningham et Gantt. 1998). Dans

plusieurs cas, ces structures se développent à partir des chloroplastes et ont une forme

irrégulière (Goodwin, 1980).

Les pigments caroténoïdes liposolubles font partie des nombreux composés produits par la voie

de biosynthèse des isoprénoïdes, décrite dans les pages suivantes.

2.1.3.1 Voie de l'acide mévalonique: de l'acétyl-CoA a I'IPP

La biosynthèse de tous les terpénoïdes, dont font partie les caroténoïdes, commence par la

formation de l'acide mévalonique. La figure 3 illustre la voie de synthèse de cet acide.

CH,CO-SCoA AcCtyI-CoA icy I t r i isfCrau

CoASH

CH,CO-SCOA

HMG-COA syntbalc

CoASH

ZSADPH + 2H+ H %le-COA rtdacuse 2SADP+

CoASH

M4valosrte kinase

Phospho- mCvaloaatc kinase

H O O C S O P P

- OPP H,C .

Figure 3. Voie de synthèse de l'acide mévalonique et de I'IPP (Gershenzon et Croteau, 1993).

Les premières réactions de la voie de I'acide mévalonique sont la fusion séquentielle de trois

molécules d'acétyl-CoA qui permet de produire un composé à six carbones, le 3-hydroxy-3-

methylglutaryl-CoA (HMGCoA). Ces réactions sont catalysées par deux enzymes, I'acétyl-

CoA acetyltransferase (EC 2.3.1.9) qui catalyse la condensation des deux premières unités

d'acétyl-CoA et la HMG-CoA synthase (EC 4.1.3.5) qui favorise la formation de HMG-CoA.

Ce composé, en plus d'être un intermédiaire dans la biosynthèse des terpenordes, est égaiement

formé au cours du catabolisme de la leucine (Spurgeon et Porter, 1980).

Avant la formation de I'acide mévalonique, le WG-CoA doit être réduit en deux étapes. un

processus catalysé par la HMG-CoA réductase (EC 1.1.1.34) en présence de NADPH à chaque

étape. Premièrement, le HMG-CoA est réduit en hémithioacétai qui en perdant le CoA donne

l'aldéhyde correspondant, I'acide mévaldique. Deuxièmement, la fonction aldéhydique est

réduite en fonction alcoolique avec formation d'acide mévalonique. L'hémithioacétal et

l'aldéhyde sont des intermédiaires qui demeurent liés à l'enzyme et ne se retrouvent pas sous

forme libre (Gershenzon et Croteau, 1993).

2.1.3 -2 Conversion de l'acide mévalonique en IPP

L'isopentényl pyrophosphate (IPP) est l'unité de base a cinq carbones qui sert à la construction

des terpénoïdes. Il est formé par la conversion de l'acide mévalonique en trois étapes

biosynthétiques (figure 3). En premier lieu, le mévalonate est pyrophosphorylé par l'action

successive de deux enzymes, la mévalonate kinase (EC 2.7.1 -36) et la phosphomévalonate

kinase (EC 2.7.4.2). Le mévalonate-5-pyrophosphate est ensuite décarboxylé par la

pyrophosphomévalonate décarboxylase (EC 4.1 .1.33) pour produire de I'IPP (Gershenzon et

Croteau, 1 993).

2.1 -3 -3 Synthèse du géranylgéranylpyrophosphate

La seconde phase de la formation des terpénoïdes, c'est-à-dire la formation des prényl

pyrophosphates, correspond égaiement à la seconde pbase de la biosynthèse des caroténoïdes,

la synthèse du géranylgérany lpyro phosphate (GGPP). Elle commence par 1' isomérisation de

I'IPP en diméthylailyl pyrophosphate (DMAPP), catalysée par l'enzyme IPP isomérase (EC

5.3.3.2). Cette réaction est irréversible et pourrait limiter la biosynthèse des caroténoïdes et

d'autres isoprénoïdes chez les végétaux (Cunningham et Gantt, 1998). L'PP seul n'est pas

suffisamment réactif pour permettre l'ionisation qui initie la condensation menant à la formation

des terpénoïdes de plus de cinq carbones. C'est au DMAPP que les unités IPP seront

additionnées de façon séquentielle (Gershenzon et Croteau, 1993). Tel qu'illustré à la figue 4.

la condensation du DMAPP avec une unité d'IPP forme un composé à dix carbones, le géranyl

pyrophosphate (GPP). Une autre molécule d'IPP peut se condenser au GPP et générer un autre

composé allylique, le fimésyl pyrophosphate (CI 5, FPP), alors que l'addition d'une troisième

unité d'IPP donne le GGPP (C~O). Ces molécules sont classées comme mono-, sesqui- et

diterpène, respectivement. Les réactions de condensation sont catalysées par des enzymes

nommées prényltransférases (EC 2.5.1.1) (McGarvey et Croteau, 1995). La GGPP synthase

(GGPS) forme la molécule de vingt carbones sans qu'ii y ait accumulation des intermédiaires

GPP et FPP (Gershenzon et Croteau, 1993). Le GGPP est le précurseur direct non seulement

de la biosynthèse des caroténoïdes, mais également d'autres composés végétaux comme la

chaîne p hyt 01 de la c hlorophylie, les phylloquinines, les plastoquinones, le taxo 1. l'acide

abiét iq ue, les phytoalexines diterpénoïdes et les diterpènes (McGarvey et Croteau, 1 995).

2.1.3.4 Biosynthèse des caroténoïdes

La biosynthèse du lycopène est une étape commune à la biosynthèse de presque tous les

caroténoïdes. La première étape est la condensation tête-à-tête de deux molécules de GGPP

pour mener au phytoène. La phytoène synthase (PSY) (EC 2.5.1.32) catalyse cette réaction à

deux étapes qui correspond à la conversion de deux molécules de GGPP en préphytoène

pyrophosphate, un intemiediaire instable, et ensuite en phytoène (Dogbo et al., 1988). Le

mécanisme de réaction de l'enzyme est la jonction de deux molécules de GGPP dans une

réaction de condensation avec la perte d'un hydrogène et d'un groupement diphosphate en C-1

de la même molécule. Le phytoène ainsi formé peut être 15-cis ou tout-hoans selon la

stéréochimie de la réaction. Il constitue le squelette de quarante carbones des caroténoïdes

(Bartley et Scolnik, 1995). La condensation de deux molécules de FPP qui permet de produire

le squaiène, précurseur des stérols à 30 carbones, ressemble à la formation du phytoéne à partir

de GGPP (Cunningham et Gantt, 1998).

VOIE DE L'ACIDE 1

OPP

( *C plusieurs fois )

Figure 4. Voie de synthèse des prényles pyrophosphates et des classes majeures de terpènes.

(Gershenzon et Croteau, 1993).

Le phytoène est un composé incolore à cause de l'absence d'insaturations dans sa longue

cWîe carbonée. Une série de désaturations permet de convertir cette molécule incolore en des

caroténoïdes jaunes, oranges et rouges par la création de doubles liaisons conjuguées qui

forment le chromophore (figure 5). II y a quatre étapes de déshydrogénation entre le phytoène

et le lycopène (Bartley et Scolnik, 1995). Ces étapes sont catalysées par deux désatwases, la

phytoène désatwase (PDS) et la zeta-carotène désaturase. La PDS catalyse les désaturations

1 1 - 12 et 1 1'-12', c'est-à-dire la transformation du phytoène en zeta-carotène (Schuch et al.,

1996).

La cyclisation du lycopène permet sa conversion en p-carotène, une étape catalysée par

l'enzyme lycopène cyclase (Bartley et Scolnik, 1995). Elle ouvre la voie à la formation d'autres

caroténoïdes cycliques tels la daxanthine et I'astaxanthine. Il existe de plus en plus d'évidences

qu'une autre cyclase serait impliquée dans la cyclisation du lycopène. Cette enzyme catalyserait

la formation du caroténoïde a-carotène, qui mènerait a la synthèse de xanthophylles comme la

lutéine (Schuch et al., 1996).

Lors des dernières étapes de la synthèse des carotènes, des dérivés hydroxy-, époxy-, fiiranoxy-

et oxy- peuvent être formés. Ces dérivés sont les xanthophyiles. II existe peu d'information

concernant les mécanismes enzymatiques impliqués dans la biosynthèse des xanthophylles

(Bart ley et al, 1 994).

2.1.3.5 Voie de synthèse indépendante de l'acide mévalonique

La voie acétate/mévalonate est généralement acceptée comme étant la voie de synthèse menant

a 1'IPP chez les végétaux supérieurs et les animaux. Cependant, il a été démontré que la

mévinoline, un inhibiteur de la synthèse de I'acide mévalonique, n'inhiiit pas la formation des

caroténoïdes, de la chlorophylle et de la plastoquinone-9 chez des végétaux supérieurs. Des

expériences faites sur des algues vertes et sur la plante Lernna gibba L. ont montré que les

L O P P i s o p e n t é n y l d i p h o s p h a t e

d i m C t h y l a l l y l d i p h o s p h a t e g k r a n y l d i p h o s p h a t e f a r n t s y l d i p h o s p h a t e

\ \ \ O P , I l g e r a n y l g k r a n y l d i p h o s p h a t e

a c i d e a b s c i s s i q u c - -- - -

Figure S. Voie de biosynthèse des caroténoïdes d'origine végétale.

caroténoïdes, les chaînes prényl de la chlorophylle et de k phstoquinoae-9 sont marqués via

une voie retrouvée également chez quelques eubactéties et Scenedesmus obliquus et qu'elle e n

indépendante du mévalonate pour la biosynthèse de I'IPP (Litchenthder et al., 1997). La figure

6 illustre la voie proposée par l'équipe de Lichtenthaler (1997). Ainsi, chez les végétaux

supérieurs. la biosynthèse des stérols cytoplasmiques se ferait par la voie de l'acide

mévalo nique et par une autre voie indépendante, ceiie du glycéraldéhyde phosphate/pyruvate

pour la formation de I'IPP dans les plastides.

4 + IPP

4 + IPP

Sesquiterpi X Stérols, Triterpènes

Figure 6. Schéma de la compartimentation suggérée de la biosynthèse de L'IPP et des lipides

isoprénoïdes chez les végétaux supérieurs basé sur les études de marquage au cl3. Le site

d'inhibition de la formation de stérols par la mévinoline est indiqué par une croix (Lichtenthaler

et al.. 1997).

2.1.3.6 Biotechnologie

Les connaissances actuelles de la biologie moléculaire des caroténoïdes découlent

principalement des études de ses voies de biosynthèse Eiites chez les organismes suivants: les

procaryotes photosynthétiques Rhodobacter et Synechocus, les bactéries du genre Erwinia, les

champignons Neurospora et Phycomyces et les végétaux supérieurs Zea mays (maïs),

Lycopersicum esculentum (tomate), Narcissus pseudonarcissus (narcisse) et Capsinm

annuum (poivron) (Bartley et al., 1994). Le tableau 1 présente quelques gènes impliqués dans

la biosynthèse des caroténoïdes qui ont été clonés. Les technologies de l'ADN recombinant

permettent d'augmenter la production des caroténoïdes dans les O rganisrnes qui les produisent

normalement, de favoriser la synthèse de nouveaux caroténoïdes pour des appiications

particulières et égaiement de produire des caroténoïdes chez des organismes qui n'en

produisent pas n o d e m e n t (Ausich, 1994). L'introduction d'une séquence d'ADN

recombinant contenant le gène d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes

( C d ) a permis d'obtenir des plants de tabac résistants à certains herbicides. Un consortium de

physiologistes commandité par la Fondation Rockefeller tente de modifier le contenu en

carotène du riz sans en altérer les caractéristiques agronomiques. Cette transformation

permettrait de palier au manque en vitamine A dans la diète des populations de certains pays en

voie de développement (Bartley et Scolnik, 1995).

Des systèmes microbiens peuvent aussi servir à la production des caroténoïdes. Des organismes

CO rnme BIakesIea trispora et Phycomyces blakedeeanus, qui sont caro ténogéniques ainsi que

la levure rouge Phofla rhodoryrna ont déjà été considérés. Certaines micro-algues des genres

DunalieIZa et Haematococcus produisent de grandes quantités de caroténoïdes à l'extrérieur

des chloroplastes lorsqu'elles sont soumises à des conditions de stress (luminosité élevée,

température élevée, salinité élevé, stress minéral). Quelques bactéries sont également

considérées pour la production de caroténoïdes par fermentation et certaines, comme

Escherichia coli, sont des candidates pour l'introduction de gènes pour la biosynthèse de

caro ténoïdes qui les rendraient caroténogéniques (Britten, 1992)

2.1.3.7 Régulation de l'expression

Les premières étapes de la biosynthèse des caroténoïdes qui sont communes à celles des

terpénoïdes sont régulées par deux types de contrôle: la régulation spatiale et la régulation

temporelle au cours du développement de la plante. La biosynthèse peut être limitée à certaines

structures physiques au niveau histologique, comme c'est le cas pour certains terpénoïdes qui

sont produits et accumulés dans des structures spécialisées (McGarvey et Croteau, 1995).

Les caroténoïdes sont produits dans les chromoplastes (Bartley et Scolnik, 1995). Quant a la

localisation subceliulaire de la biosynthèse de I'IPP, il existe deux modèles, l'un suggérant que

I'IPP est synthétisé dans chacun des compartiments intracellulaires

Tableau 1. Gènes clonés codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse des

caroténoïdes végétaux (Bartley et al., 1 994).

E r n e Organisme Gène Type de clone # d'accès

GGPP Fragment synt hase A. thaliana GGPS génornique L22347

GGPS 1 ADNc L258 13 C. annuum P80042

Phytoène PSY ADNc L258 12 synt hase A. haliana PSY ADNc X680 1 7

B. C. annuum PSY 1 ADNc Y0052 1 C. L. esculentum (TOM5) Mg4744

PSY 1 ADNc PSY 1 génomique X6044 1

(GTOMS) PSY2 génornique X60440

(GTOMF) PSY2 ADNc L23424

2. mays Psy ADNc ---- P hyt oène PDS ADNc L16237 désaturase A. haliana PDS ADNc X68058

B. C-annuum PDS ADNc M64704 C. G. max PDS ADNc Mg8683 D. L. esculentum PDS ADNc X59948

PDS génomique ----

dans lesquels il est utilise, l'autre proposant que I'IPP est synthétisé exclusivement dans le

cytosol et qu'il est ensuite réparti dans les autres compartiments cellulaires (McGarvey et

Croteau, 1995). Toutefois, il semble y avoir des évidences a l'effet que la biosynthèse des

caroténoïdes, incluant les premières étapes, se hse dans les plastides selon le modèle proposé

récemment par L'équipe de Lichtenthaler et collaborateurs (1997).

Au niveau de la régulation dans k temps, c'est le développement des végétaux qui contrôle la

composition qualitative et quantitative des caroténoïdes (Bart ley et al., 1 994). Ils s'accumulent

dans Ies chromoplastes des fleurs, des bits, des vieilles feuilles et de certaines racines. II existe

également une diffërence au niveau du contrôle de l'expression des gènes entre les fruts

c hc tér iques et non-climactériques. La biosynthèse dans les tissus non-photosynt hét iques est

contrôlée par des signaux développementaux qui n'ont pas encore été identifiés, alors que la

biosynthèse dans les tisdw photosynthétiques semble être sous le contrôle de signaux

environnement aux, principalement la lumière (Bartley et Sco lnik, 1 995)' mais également par le

stress photooxydatX Les chloroplastes sont les sites de synthèse des caroténoïdes qui vont

servir à la formation des complexes photosynthétiques et à l'absorption de lumière (Bartley et

al.. 1994). Les enzymes irnpiiquées dans la biosynthèse des caroténoïdes et des protéines qui

leur sont Liées sont codées par des gènes nucléaires et les protéines précurseures

correspondantes sont importées dans les plastides de façon post-traductionnelie. La

concentration finale de caroténoïdes peut être contrôlée par des mécanismes Sectant le niveau

d'enzymes et par la disponibilité des sites de liaison dans les complexes photosynthétiques.

L'induction de la formation de tels complexes induite par la lumière serait donc contrôlée aux

étapes transcriptionneiles et post-transcriptionneUes (Bartley et Scolnik, 1 995).

La réponse de la plante au stress photooxydatifcausé par la transition d'intensité lumineuse de

faible à élevée au champ se traduit par une augmentation des composants du cycle des

xanthophylles, particulièrement la zéaxanthine. Un modèle de régulation de la synthèse de la

zéaxanthine à partir de la violaxanthine a été proposé, impliquant une diminution du pH du

lumen à intensité lumineuse élevée (Demrning-Adams et Adams, 1992).

La voie de transduction de signaux au cours d'une réguiation positive ou négative de

l'expression des gènes par la photooxydation demeure inconnue, tout comme les facteurs de

régulation qui contrôlent les niveaux de caroténoïdes au cours du développement des fleurs et

des fhits (Bartley et al., 1 994).

2.1.4 Fonctions et localisation des caroténoïdes

2.1.4.1 Tissus photosynthétiques

Les caroténoïdes sont présents dans tous les tissus photosynthét iques. Ceux des plantes

supérieures contiennent généralement les caroténoïdes suivants: P-carotène, lutéine,

violaxanthine et néoxanthine (Spurgeon et Porter, 1980). Ces pigments sont localisés dans les

chloroplastes, probablement dans les grana, et peuvent être présents sous forme de

caroténoprotéines (Jones et Porter, 1 986).

Certains caroténoïdes jouent le rôle de pigments accessoires lors de la photosynthèse. Les

centres réactionnels des photosystèmes I et II sont composés de caroténoïdes, de chiorophyiles

et de diverses apoprotéines. Les caroténoïdes peuvent absorber la lumière dans la région bleue

du spectre (400 à 600 nrn). Leur poids moléculaire peu élevé leur permet d'être plus efficaces

que la chlorophylle dans l'absorption de lumière. L'énergie d'excitation absorbée est transférée

à la chlorophylle, permettant ainsi d'élargir la gamme de longueurs d'onde utilisées pour la

photosynthèse (Siefermann-Ham, 1987). Dans le complexe du photosystème II, les carotènes

sont absents, et on y retrouve seulement des xanthophylles comme la lutéine. Par contre, dans

le centre de réaction du photosystème 1, seulement le B-carotène est présent, mais iI agit de

façon similaire (Schuch et al., 1 996).

En plus de leur rôle dans la récolte d'énergie lumineuse, les caroténoïdes colorés jouent un rôle

essentiel au niveau de la photoprotection. La protection contre la photooxydation est causée

par leur capacité à absorber et transférer les électrons provenant des radicaux libres des triplets

de la chlorophylle et des singulets d'oxygène générés au cours de la photosynthèse. Ces

radicaux Libres peuvent réagir avec les lipides, les protéines et d'autres macromolécules.

causant des dommages irréparables au tissu touché (Bartley et Scolnik, 1995).

Le cycle des xanthophylies (Figure 7) jouerait un rôle important dans la photoprotection. En

condition d'excès d'énergie d'excitation, la zéaxanthine s'accumulerait à partir de la

violaxanthine au cours de deux étapes de dé-époxydation enzymatique (Demmig-Adams et

Adams. 1993). Les enzymes seraient séparées physiquement vu la différence marquée de leurs

pH optimaux et des pH à l'intérieur et à l'extérieur de la membrane des thylakoïdes (Goodwin,

Figure 7. Mécanisme proposé du cycle des xanthophyiies (Goodwin, 1 980).

2.1.4.2 Tissus non-photosynthétiques

Les chromoplastes sont des structures qui contiennent les camténoïdes responsables de la

couleur jaune, orange et rouge de certaines parties des plantes. Lorsque la chlorophylle

disparaît dans les derniers stades du développement, la fonction de photoprotection des

caroténoïdes n'est plus essentielie à la plante. Une des seules fonctions probables des

caroténoïdes à ce stade est l'attraction des insectes poUinisateurs et des animaux pour la

dispersion des semences (Bartley et Scotnik, 1995). Les caroténoïdes pourraient également

jouer un rôle au niveau de la structure du tapetum pendant le développement du poilen

(Goodwin, 1980). Les chromoplastes contiennent des structures spéciaiwes composées de

caroténoïdes, de Lipides et de protéines qui permettent de séquestrer les grandes quantités de

caro t énoïdes responsables des couleurs intenses des fleurs et des h i t s @art ley et al., 1 994).

2.1 -4.3 Atimentation et santé humaine

Les caroténoïdes sont présents dans de nombreux aliments, où ils jouent plusieurs rôIes, dont

certains essentiels à la santé. Les caroténoïdes possédant une activité provitamine A, comme le

p-carotène, sont des composants essentiels de la diète humaine. Plusieurs caroténoïdes

semblent montrer un effect protecteur contre le cancer par leurs propriétés d'antioxydantes

(Bartley et Scolnik, 1994). Une diète riche en aliments contenant une teneur élevée en

caroténoïdes est aussi associée à une réduction des risques de maladies cardiaques

(Kritchevsky, 1 999).

Certains caroténoïdes sont ajoutés aux aliments dans un but strictement visuel afin d'en ajouter,

d'en rehausser ou d'en uniformiser la couleur. Ils possèdent des qualités importantes pour

l'industrie, telles que leur origine naturelle, leurs propriétés antioxydantes, l'absence de toxicité

et leur couleur variant du jaune au rouge (Minguez-Moquera et Jaren-Galan, 1995). Le B- carotène, le P-apo-8-caroténal et la cathanxanthine sont synthétisés industriellement pour être

utilisés comme colorants alimentaires, la cathaxanthine remphçant le colorant FD & C Red No.

2 (Francis, 1985). La bixine (figure 8), constituant majeur de I'annatto qui est extrait de la

plante Bixa oreIIana, est utilisée dans i'industrie laitière pour colorer des produits comme le

beurre et le fiornage. Les caroténoïdes peuvent colorer des aliments de base lipidique tels la

margarine, le beurre et l'huile, mais également des aiiments de base aqueuse comme les

boissons et les jus de nuits, les soupes, les produits laitiers, les produits camés ou les sirops.

Dans ces cas, ils doivent être préparés de façon à les rendre dispersibles dans l'eau. Des

suspensions coiioidaies ou des microdispersions peuvent être formées. Les caroténordes

peuvent être associés à des protéines et former des caroténoprotéines qui peuvent devenu des

colorants solubles, stables et de couleur bleue, verte ou violette. Les caroténoïdes sont

également utilisés comme colorants de certaines préparations pharmaceutiques tels que les

sirops, les suppositoires et les enrobages de pilules (Britten, 1992).

Figure 8. Forme cis de la bixine.

2.2 Le safran

2.2.1 Généralités

2.2.1.1 Description de la plante

Crocus sativus est une plante vivace de ia famille des Iriduceae (Ingram, 1969). La figure 9

illustre la morphologie de la plante crocus. Eue est constituée d'un corme sous-terrain de 3 A 5

cm de diamètre et au-dessus du sol, de 6 à 9 feuilies minces ressemblant à de l'herbe et une

fleur en forme de tube long et mince composée de 6 à 8 pétales violets. Au centre de la fleur se

trouve le pistii, qui consiste en un ovaire bulbeux prolongé par une mince tige appelée style. De

couleur jaune pâle, le style se divise en trois stigmates d'un rouge orangé brillant de 2,s à 3 cm

de long. L'épice de s a h n pure est constituée des stigmates et d'une petite portion du style

séché.

2.2.1.2 Culture

Le crocus d a n est un géophyte stérile. II se propage annueiiement par le remplacement du

corme. II fleurit à l'automne peu de temps après la plantation, avant, en même temps ou après

I'apparition des feuilles. Le reste de la saison de croissance consiste en l'initiation. le

remplissage et la maturation des cormes fiiles au début de l'été (Plessner et al., 1989).

Figure 9. Morphologie du crocus.

L'Espagne est le pays qui produit le plus de s a h n et également celui de meilleure qualité. Les

autres pays exportateurs sont, en ordre d'importance de la production, l'Inde, la France,

l'Algérie et l'Italie (Ingram, 1 969).

2.2.1 -3 Culture cellulaire

La production de sah.n par des techniques de culture in viîro a permis d'induire la production

de cals rouges et globulaires et de structures rouges filamenteuses qui contiennent le pigment

jaune crocine dans des quantités inférieures a celles retrouvées daas les stigmates (Ravishankar

et Venkataraman, 1990). D'autres auteurs rapportent également la présence de faibles quantités

de crocine dans des structures ressemblant a des stigmates cultivés in vitro (Hirneno et Sano,

1987; Koyama et al., 1987).

Des cultures de cals non différenciés et de cals avec des tiges ainsi que des suspensions

celiulaires ne contenant pas le pigment crocine peuvent être produites a partir de matériel fiais

pour des besoins expérimentaux. Ces cultures sont produites en plaçant des bourgeons de

connes stérilisés en surface sur un milieu Murashige et Skoog (1962) additionné des vitamines

de More1 (1970), de 250 mgL d'hydrolysat de caséine, de 30gL de sucrose, de 2 mg/L de

kinétine, de 0,5 mg/L d'acide a-naphtalèneacétique à pH 5,8 et de 8,5 g/L de Phytagar (Gibco-

BRL). Les cultures de cals sont maintenues a l'obscurité a 25°C et repiquées aux 4 semaines

sur des d e u x fiais. Des suspensions cellulaires peuvent être produites en transférant des cals

non différenciés dans un milieu liquide sans Phytagar. Les suspensions cellulaires sont placées

sur un agitateur rotatif à une vitesse de 100 rprn à l'abri de la lumière, à 25OC et repiquées à

chaque 2 semaines (Cormier et al., 1995; Dufiesne et al., 1 997).

2.2.1.4 Utilisations

L'épice de safian (les stigmates et une petite portion du style) est la seule partie de la plante qui

semble pouvoir être utilisée. L'utilisation du sahn la plus commune est en cuisine et en

pâtisserie pour ses propriétés colorantes et aromatisantes. Il est également utilisé dans des

boissons alcoolisées et non alcoolisées. Le safian sert égaiement de colorant textile, mais de

façon moins courante (Rios et al., 1996).

Le safkm est u t W en médecine traditionnelle pour soulager les menstruations douloureuses,

les douleurs lombaires et pour soigner la dyspepsies atonique, la toux, les spasmes branchiaux,

l'asthme et les problèmes dentaires. Il est également utilisé comme excipiant dans les

préparations pharmaceutiques. Au niveau thérapeutique les constituants actifk du safhm

pourraient potentieilemnt être utilisis comme agent antitumeu, contre I'hypolipidie et au

niveau de l'augmentation de I'oxygénation des tissus (Rios et al., 1996).

2.2.2 Composition chimique

La composition des stigmates de safran séchés et purs est décrite au tableau 2. Cette

composition a été établie a h de pouvoir déterminer I'adultération du &an (Pfander et

Rychener, 1982). Le sahn contient les vitamines riboflavine et thiamine, alors que plusieurs

composés volatiles ont été détectés par exemple le safkinai, I'isophorone et six dérivés

triméthyle-cyclohexyle (Sampathu et of ., 1984). Les composés phytoène, phytofluène,

tétrahydrolycopène, p-carotène et zéaxanthine, des précurseurs possibles de la crocétine, ont

été isolés de Crocus sativus (Pfander et Schurtenberger, 1982).

Tableau 2. Composition des stigmates séchés du safran (Crocus safivus) (Pfander et Rychener,

1982).

Constituants I (%)

Matière minérale I 5-7

1

Lipides 1 5-8

Eau

Protéines l 12-13

10-12

Sucres réducteurs I 20

Pentosans I 6-7

Gommes et dextrines I 9-10

Huiles essentielles 1 0.3

Le plus important des principes amers du s h est h picrocrocine. L'hydrolyse acide de ce

glucoside permet d'obtenir le s a h d (dehydro-P-cyclocitral) et l'hydrolyse enzymatique d o ~ e

I'oxysahnol (figure 10). Ces substances sont responsables du parfum caractéristique du s a h n

(Rios et al., 1 996).

OH PICROCROCISE

b ta-glueosidrx OH- or H+ cbrleur

HO Glucose

CHO

HO CH, C II,

Figure 1 0. Conversion chimique et enzymatique de la picrocrocine en o x y ~ a n o l

et safianal (Adapté de L o m o et al., 1999).

Le matériel colorant du sahm contient des composés phannacologiquement actifs. Les

p~cipaux sont le caroténoïde a-crocétine et ses formes glucosyIées et les digentiobiosyle

(croche), diglucosyle, gentiobiosyle-glucosyle, monogentiobiosyle et monoglucosyle esters de

la crocétine. Le safian contient également d'autres caroténoïdes: la p-crocétine (monométhyle

ester), la ysrocétine (diméthyle ester), l'a-carotène, le p-carotène, le lycopène et la

zéaxant hine (Sarnpat hu et al., 1 984). L'isomère 1 3-cis-crocetine (Sperenza et al., 1 984)' de

même que le 13-cis-digentiobiosyle ester et le 13-cis-gentiobiosyle-glucosyle ester de la

crocétine (Van Calsteren et al., 1997) ont également été identifiés chez le h-

Récemment, plusieurs nouveaux constituants du sahn ont été isolés et identifiés. Straubinger

et collaborateurs (1997) ont purifié les molécules suivantes: les f3-Dglucosides de ( 4 R ) 4

hydroxy-3,5,5-triméthylcyclohex-Zenone, le (4S)4hydroxy-3,5,5-triméthyl-cyclo-hex-2-

enone et le (4S)-4-(hydroxyméthyI)-3,5,5-triméthylcycIohex-2-enone et le P-Dgentiobiosy le

ester do 2-méthyl-6-oxohepta-2,4 acide diénoïque. Un nouveau glucoside de la crocétine a

également été identifié chez le s a h n (Crocus sativus L.), le (P-gentiobiosyle) (B- nézpolitanosyle) ester de la crocétine (Pfister et al., 1996).

2.2.3 La crocétine

La crocétine est un caroténoïde a courte chaîne insoluble en milieu aqueux et soluble en milieu

alcalin. Elle possède des propriétés ami-cancer par sa structure fortement insaturée. La

crocétine peut être synthétisée par voie chimique, mais sa biosynthèse dans les tissus végétaux

n'a pas encore été élucidée.

2.2.3.1 Synthèse chimique

La synthèse chimique de la crocétine demande un matériel chimique de départ d'une grande

pureté. Quinkert et al. (1977) ont décrit deux schémas de synthèse du diméthyle ester de la

crocétine. La synthèse se fait en trois étapes, le 2-méthyle phénol ou le 4-bromo3,6-diméthyle

phénol, selon le schéma, et le (E)-1,4-dibromo-2-ène servant de matériel de départ. Le clivage

photochimique induit par la lumière du soleil p e m t les réactions de conjugaison et

d'isomérisation menant à la formation du diméthyle ester de la crocétine.

Dans un autre schéma de synthèse, le palladium sert de catalyseur (réaction de Heck) pour le

couplage d'un 6agment halogenide bivinylique central et de deux alcools tertiaires suivi d'une

déshydratation acide. Cette méthode permet d'obtenir le ficarotène, le lycopène et le diméthyle

ester de la crocétine (Bienaymé, 1994).

2.2.3.2 Synthèse biologique

Deux voies différentes ont été proposées pour la biosynthèse de la crocetine (figure 11):

1 - Une dégradation oxydative d'un caroténo'ae à quarante carbones comme la zéaxanthhe.

2- Une dimérisation de deux composés à dix carbones, comme le géranylpyrophosphate, suivie

d'une déshydrogénation et d'une oxydation.

2.2.3.2.1 Dégradation oxydative

La voie de la dégradation oxydative de la zéaxanthine en crocétine. proposée iI y a plus de

soixante ans par Kuhn et Winterstein, est appuyée par l'absence de précurseurs à 20 carbones

qui mèneraient à la voie de dimérisation. De plus, le P-carotène et la zéaxanthine. de même que

leurs précurseurs le phytoène, le phytofluène et le tétrahydrolycopène ont été isolés d'un extrait

de safian (Pfander et Schurtenberger, 1982). La dégradation oxydative de la zéaxanthine est

également supportée par la présence de deux produits de réaction, la picrocrocine et le safianal

dans le d i a n puisque la picrocrocine possède la même stéréochimie que la zéaxanthine. Par

contre, la picrocrocine et le sahnal ne semblent pas être présents chez les autres crocus

capables de synthétiser la crocétine (Dufiesne, 1998; communication personnelle). Les P-D- glucosides de (4R)-4-hydroxy-3,5,5-triméthylcyclohex-2-enone, (4s)-4-hydroxy-3,5,5-

t rirnét hylcyclohex-2-enone et (4R)-4-(hydroxymét hyI)-3,5,Strimét hylcyclo hex-2-enone

retrouvés dans le safhn par Straubinger et cokborateurs (1 997) pourraient provenir du clivage

oxydatifde la c M e de la zéaxanthine sur la double liaison en position 7'8 et 7',8'. L'enzyme

hypothétique cataiysant ce clivage serait la 7,s-caroténase. Le clivage oxydatif de la

zéaxanthine à ces positions mènerait au 8,8'-diapocarotendiale qui devrait à son tour être oxydé

pour former la crocétine (Figure 1 1).

L'absence de précurseurs C20 ainsi que de y-carotène ou de lycopène dans i'extrait de safkn

utilisé par Pfander et Schurtenberger (1982) pourrait être causée par l'âge et l'origine de

l'échantillon La dimérisation de deux géranylpyropbosphates en digéranyle subie de la

désaturation entre les carbones 4 et 5, 8 et 9, et 12 et 13 puis de l'oxydation des groupements

méthyles terminaux en intermédiaires dihydroxy de la crocétine et Wement en intermédiaires

aldéhydes pourrait être nmilaire à la réaction décrite pour la biosynthèse des carotémïdes

t rit erpénoïdes chez Strepiococcw faecium et SiaphyZococcus aureus (Davies et Taylor, 1 982).

OHC

Figure 1 1. Voie possible de la formation de la crocétine (Adapté de Pfander et Schurtenberger.

1982).

2.2.4 Giycosides de ia crocétine

Divers glycosyle esters de la crocétine (acide 8,8'-diapocarotène-8,8'-dicarboxylique) ont été

isolés des stigmates de saf ian (Crocus sutius L.) et identifiés par des méthodes

spectroxopiques. La figure 12 présente ces différents giycosyle esters. Tout-tram-croche, le

di@-D-gentiobiosyle) ester de la crocétine lc, est le pigment majeur des stigmates du Aian et

des f i t s de Gardenia jasminoides. Tout-~ns-f3-D-gentiobiosyle-~-D-glucosyk ester de la

crocétine 1 d, tout-hansdi(f3-D-glucosyle) ester de la crocétine le, tout-irans-mono(f3-D-

gentiobiosyle) ester de la crocétine If et tout-trans- mono(P-D-glucosyle) ester de la crocétine

l g ont également été identifiés chez ces deux plantes (Van Calsteren et al., 1997; Sperenza et

al., 1984; Pfmder et Wittwer, 1975). Les isomères 13-cis de la crocine 2c et du P-D-

gentiobiosyle-P-0-glucosyle ester de la crocétine ont également été identifiés (Van Calsteren et

al., 1997; Sperenza et al., 1984). Dew nouveaux glycosyle esters de la crocétine ont été

découverts chez le crocus de jardin (Crocus vemus L.). Ces glycosides possèdent un

t risacc haride rare, le néapolitanose (O-P-D-gluco pyranosyle-( 1 +2)-O-[(3-D-gluco pyranosyle-

(1 +6)]-D-glucose (Figure 12) (Ryechener et al., 1984). Un pigment mineur du s a f h a été

isolé et identifié comme étant le (3-D-néapolitanosyle-f3-D-gentiobiosyle ester de la crocétine 1 b

(Pfister et al., 1996). La voie de biosynthèse des glycosides de la crocétine n'a pas encore été

identifiée, mais une hypothèse a été proposée. Pour ce qui est de la synthèse par voie chimique

de ces glycosides, elle se fait diflicilement et demande des molécules de départ d'une grande

pureté.

2.2.4.1 Synthèse chimique

La glucosylation se fait difficilement par voie chimique. Toutefois, Pfander et Wittwer (1979)

rapportent ia synthèse du di-(B-D-glucosyle) ester de la crocétine suite a la réaction du di-

imidazolide de la crocétine ou du di-(1,2,4-triamiide) de la crocétine avec le P-D-glucose dans

la pyridine en présence d'une base. L'estérification du sucre se fait exclusivement au carbone

anornérique avec production du f3-anomère.

La synthèse chimique de la crocine n'a pas été rapportée jusqu'à maintenant.

2.2.4.2 Bioconversion

Les suspensions cellulaires de &?an sont capables de convertir la crocétine en plusieurs

glycosyle esters quand I'aglycone est ajoutée a la culture sous forme encapsuléc ( Dueesne et

a RI=FU= k t a - D acapditanosyîe b R I , R2= kt.-û-acrpditaaasylc, beta-D-geatiobiosyk e RI=IU= bcta-ü-gcatiobiosyie d R I , R2= kt.-D-geatiobiasyk, kt.-D-glucosyle

RI=== kt.-D-glacosyle f R I , RT= k t r - ~ a t i o b i o s y î e , H g R I , R2= kt.-û-glucosyîe, H b RI=R2=H

:igue 12. Structure chimique de la crocétine et de ses glycosyles esters retrouvés dans le

safian. la dinéapolitanosyle ester, 1 b néapolitanosyle-gentiobiosyle ester. l e crocine ou

digentiobiosyle ester, Id gentiobiosyle-glucosyle ester, le diglucosyle ester, 1 f

monogentiobiosyle ester, lg monoglucosyle ester, 1 b crocétine, 2 13-cis-crocétine (Adapté de

Van Calsteren et al., 1997).

al., 1999). Le pigment majeur obtenu par la bioconversion a été identifié comme le

dinéapolitanosyle ester de la crocétine (figure 1 2 1 a). Les néapolitanosy le, gentio biosyle et

glucosyle esters de la crocétine ont également été formés. Ces pigments glycosylés sont

entreposés dans la vacuole. La croissance cellulaire n'est pas affectée jusqu'à une concentration

de 30 mg/mL de crocétine ajoutée au milieu. La capacité de bioconversion de la culture était la

plus élevée à la fin de ta phase exponentielle. La culture pouvait former jusqu'à 9 mg/g (base

sèche) de glycosyle esters de la crocétine avec 30 mg de substrat par 100 mL de culture.

L'activité des glucosyltransferases était augmentée par l'ajout de glucose et de 2,4-acide

dichlorophénoxy-acétique a une culture agée de 12 jours, sans augmentation de l'efficacité de

bioconversion.

2.3 Glycosyl transférase

2.3.1 Définition

Les giycosyltransfërases font partie de la classe des enzymes catalysant le transfert de groupes

glycosyles (substrats donneurs) vers un substrat accepteur (figure 13). Le substrat accepteur

peut être un autre résidu glycosyle, un polypeptide ou un lipide selon la spécificité de l'enzyme.

Le substrat donneur est un nucléotide-sucre. La partie nucléotidique est habitueliement un

diphosphonucléoside. L'uridine diphosphate (UDP) est le nucléotide du substrat donneur de

glucose, de galactose, de N-acétylgtucosamine, de N-acétylgalactosamine, de xylose et d'acide

glucuronique le plus efficace (Beyer et al., 1 98 1 ).

S u c r e n u c l i o l i d c

transfdrisc e R-O H R-O-sucre - n ucICoride

p lycos idase a sucre

Figure 1 3. Synthèse et hydrolyse des glycosides végétaux (Hosel 19% 1 ).

Les hexosyltransférases (EC 2.4.L) sont une sous-classe des glycosyltransférases. La

subdivision se fàit sebn la nature du sucre qui est transféré au substrat accepteur

(Nomenclature Cornmittee of the International Union of Biochemistry, 1984). En générai, les

réactions de transglycosylation peuvent être catalysées par des enzymes de la classe des

transférases (E.C. 2.4.-) et des glycosidases (E.C. 3.2.9). Dans ce dernier cas, l'eau serait le

substrat accepteur. Comme toutes les réactions biosynthétiques impliquant des métabolites

secondaires étudiées jusqu'ici sont catalysées par des transférases utilisant un nucléotide-sucre,

les glycosidases peuvent être considérées comme responsables de l'hydrolyse des glycosides.

Toutefois, un cas de glucosyltransfërases catalysant l'hydroiyse de glycosides a été rapporté

(Hosel, 1981). Une activité glucosyltransférase réversible a été observée dans des cultures

cellulaires de persil (Sutter et Grisebach, 1975).

Le lien glycosidique peut se faire entre un sucre et l'atome d'oxygène, de carbone, d'azote ou

de soufie des différents aglycones (Hosel, 1981). De plus le Lien entre l'atome d'oxygène du

substrat accepteur et le sucre peut être un ester ou un éther (Nomenclature Cornmittee of the

International Union of Biochemistry, 1984).

2.3.2 Spécificité

Les glycosyltransférases d'origine animale et végétale different par leur degré de spécificité.

Celles d'origine animale possèdent un degré de spécificité remarquable vis-à-vis du substrat

accepteur et au moins une transférase semble être nécessaire pour la synthèse de chaque Lien

glycosidique retrouvé dans la nature (Beyer et al., 198 1 ). La spéciIicité des glycosyltransférases

de plantes par rapport au substrat accepteur est par contre beaucoup plus large. Plusieurs

études montrent que les glycosyltransférases végétales sont spécifiques à une classe de

molécules ou un site de liaison plutôt qu'a une molécule en particulier (Hosel, 1981).

Une galactosy lt ransférase impliquée dans la biosynthèse du mo nogalactoside de la tomat idine

dans les feuiiles de tomate peut glycosyler une gamme étendue de stéroïdes hydroxylés en

position 3 (Zimowski, 1998). Shibata et al. (1995) ont purifié des glucosyltransférases qui

catalysaient la glycosylation de steviol et de glycosides de stéviol et ont montré que ces

enzymes utilisaient certains flavonols de tàçon aussi efficace. Une glucosyltransférase purifiée

de Chrysosplenium umericanurn serait responsable de l'attaque des positions 2' ou 5' de

flavonols partiellement méthylés (Latchinian et al., 1987). Les glycosyltransférases spécifiques

aux flavonoïdes sont très spécifiques quant à la position du groupement hydroxyle sur lequel le

sucre est transféré (Hosel, 1981). Deux glucosyltransférases agissant dans la régulation de la

composition en acides gras des triacylglucoses chez la tomate montrent des spécificités

différentes concernant la longueur de la chaine d'acide gras. L'une est plus spécifique pour les

chaînes courtes (4:O) et l'autre pour les chaînes de longueur moyenne (8:O et 12:O) (Kuai er al.,

1997). Par contre, I'UDP-g1ucose:acide salicylique glucosyltransférase purinée des racines

d'avoine est l'un des rares exemples de haute spécificité envers le substrat accepteur, l'acide

salicylique (Yalpani et al., 1 992).

La spécificité des glycosylttansférases en regard du nucléotide indique que les dérivés UDP

sont utiiisés le plus efficacement. Leur spécificité par rapport au sucre transfiré semble

également être très élevée (Hosel, 1 98 1 ).

2.3.3 Rôles

Plusieurs métabolites secondaires des végétaux sont accumulés et entreposés sous forme de

glycosides. Les produits glycosylés sont souvent considérés comme des produits

d'accumulation ou comme une forme physiologique inactive, leur hydrolyse iibèrant par la suite

des aglycones physiologiquement actik La glycosylation amène deux changements majeurs au

niveau de l'aglycow: elle rend la molécule plus soluble dans l'eau et diminue sa réactivité

chimique (Hosel, 1981).

Les rôles joués par les glycosyltransférases végétales sont nombreux. Elles peuvent agir au

niveau de la régulation de la quantité relative d'hormones de croissance, telles que l'acide

abscissique et l'acide indole-3-acét que, sous forme libre ou estérifiée (Zeevaart et Creelman,

1988). La réversibilité de la glucosylation-déglucosylation des stérols membranaires aurait un

effet régulateur sur les fonctions et l'organisation des membranes celiulaires végétales

(Wojiechowski, 1983). Les glucosyltransférases sont également impliquées dans la

détoxincation de xénobiotiques comme les herbicides (Yalpani et al., 1992) alors que certains

glycosides serviraient de défense contre les insectes et seraient toxiques pour les humains et les

animaux (Zimo wski, 1 998). Les glycosyltransférases catalysent la format ion des glycoprotéines,

des glycolipides et des polysaccharides (Waish, 1979). Elles participent également à la

biosynthèse des nombreux glycosides phénoliques, particulièrement des flavonoTdes, une

fonction souvent étudiée (Hosel, 198 1 ; Cormier, 1997).

2.3.4 Purification

Les glycosyltransférases sont présentes en faibles quantités dans les tissus animaux et sont liées

aux membranes intracellulaires. Des méthodes spéciales de solubitisation et de purification

doivent donc être utilisées (Beyer et al., 1981). Par contre. la plupart des glycosyltransférases

végétales sont cytosoliques. Il existe cependant quelques exemples de glycosyItransférases

végétales associées aux membranes. Des glucosyltransférases spécitiques aux stéroïdes ont été

purifiées chez Asparagus plurnosus (Paczkowski et al., 1990) et chez Solanum ruberosim

(S tapleton et al., 199 1 ; Zimowski, 1992). Wojciechowski ( 1983) indique que les

glycosyltransférases catalysant la glycosylation des stérols sont fortement liées aux membranes

et solubilisées à l'aide de détergents comme le Triton X-100 ou le déoxycholate et qu'eues

peuvent être partiellement purifiées a t'aide de techniques usuelles teiles la filtration sur gel,

l'échange ionique ou l'électrophorèse. Ces techniques sont également couramment utilisées

pour la purifkat ion des glycosyltransférases c ytosoliques. La chromatographie d'*té a été

utilisée comme méthode rapide de séparation de deux glucosyitransférases catalysant la

glucosylat ion de flavonoïdes. Des colonnes d'agarose avec I'UDP-acide giucuronique et le

colorant Brown40 comme ligands d'afhité ont permis la séparation de glucosyltransférases

extraites de Crysosplenium arnericanum (Latchinian et al., 1 987). De teiles réactions d'affinité

ont également été utiüsées pour la séparation des glucosyltransférases impliquées dans la

production des glycosides du sophoroside acide hydroxydocosanoïque (Breit haupt et L ight,

1982).

Le tableau 3 donne quelques exemples de glycosyltransférases qui ont été purifiées ainsi que

leurs caractéristiques. Hase1 (1981) et Cormier (1997) ont passé en revue la glycosylation des

phénols, des phénylpropanes, des flavonoïdes et des anthocyanes. La réaction catalysée par ces

glycosyltransférases est la formation d'un lien éther entre la partie glucide du nucléotide-sucre

et le groupement hydroxyle du composé phénolique ou du fiavonoïde étudié. Peu d'études ont

été réalisées sur les glycosyltransférases catalysant i'additioa du sucre par estérification de la

fonction carboxylique du substrat accepteur.

2.3.5 Gtucosyltransférases cataiysant h glucosyhtion de la fonction carbo~lique

Deux glucosyltmférases (Gtase 1 et IIB) agissant sur le stéviol et ses glycosides ont été

purifiées d'un extrait de feuiiles de Stevia reborudiuna Bertoni. La Gtase IIB agit à la fois sur

les fonctions hydroxyles et carboxyles du stéviol (Shibata et al., 1995); les caractéristiques de

ces enzymes sont données au tableau 3.

L'enzyme UDP-glucose:indole-3 acide acétique glucosyltransférase a été purifiée partiellement

à partir de grains de ma& sucré selon plusieurs méthodes: précipitation au polyéthylène glycol,

chromatographies d'échange anionique, de fiitration sur gel d'affinité à 1'üDP-acide

glucuronique et chromatofocusing. L'enzyme est un monomère de 46.5 kD, son point

isoélectrique se situe à pH 5.5 et elle possède une activité optimale à des pH de 7.3 a 7.6

(Leznicki et Bandurski, 1988).

Les UDP-g1ucose:acide gras glucosyltransférases catalysent l'activation par I'UDP-glucose des

acides gras pour former des 1-O-acyl-P-glucoses. Dew de ces glucosyltransférases ont été

séparées et partiellement purifiées à partir de f e de Lycopersicum pennellii (LA1 376) par

précipitation au polyéthylène glycol suivie d'étapes chromatographiques sur les colonnes

DEAE-Sepharose et Cihcron Blue 3GA-agarose. Les deux enzymes sont des monomères de

47 kD et montrent des spécificités différentes en regard de la longueur de la chaîne de l'acide

gras (Kuai el al., 1997).

Tiüblcau 3. Liste et caractéristiques de quelques glycosylt ransfiérases.

Source 1 Groupe 1 Spécificit6 (référence) Vitis vinifera

cell suspension (Do et el,, 1 995)

Alfalfa

I - (~eah et al., 1992) - 1 6-hvdroxvbentazone 1

Q ~ U C O ~ Y ~ ~

hydroxyle

(Parry et Edwards, 1994) Glycine max

hydroxyle

UDPG

Accepteur cyanidine, delphinidine

hydroxyle

Papaya fruit (Keil et Schreier, 1989)

m I 1

Sdanum tubemsum 1 hydroxyle 1 solanidine 1 UDPG

Donneur UDPG

pelargonidine, poenidine rnalvidine

Quercetine>coumestrole>

hydroxyle

(1.2 mM)

UDPG medicarpin~fomononetin

Kaempferol UDP- al UDPG

(Stapleton et al., 1991) Brassice napus L.

seedlings(Reed et el,, 1993)

Florets de chou-fleur (Grootwassink et al., 1994)

Arabidopsis thaliana

S

(Guo et Poulton, 1994) 3at roats (Yalpani et el., 1992)

. - . - - . . - . --. - - - -, I I 1

Sdsnum tuberosum 1 hydroxyle 1 sitosterol 1 UDPG

S groupes

sulfhydryles

Lithospemum erythmrhimn (Bechthdd et al., 1 991)

Avena sative NVamecke et Heine. 19941

Sodium 2-phenylacete thiohydroximate(0.05

mMI

essentiels hydroxyle

UDPG (0.46 mM)

thiohydroximate

thiohydroximate

hydroxyle

hydroxyle

(Zimowski, 1992) 1 Stevie rebeudi8ne 8. 11- hydroxyle

Poids moléculaire pH I I pl

UDPG

UDPG

acide salicylique

(Shibata et al., 1995)

Candida bogoriensis (Breithaupt et Light, 1982)

qwrcetine, 1 56 1 8,O 1 4.55

UDPG p-hydroxybenzoate

&&OIS

solanidine steviol, steviolmonoside,

UDPG

UDPG

UDPG UDPG

I IR carboxyle, hydroxyle hydroxyle

1

1 entre 55.5 et 57.8 1 1 4.8 et

sels

UDP HgC12,H2(CN)

2

I 1 1

UDP. UTP 1 50 1 5.5 1 5

quercet ine, kaem pferol steviol, steviolmonoside, steviol bioside, stevioside quercetine, kaempferot

acide hydroxydocosanoique

47

44.6 53 (sous-unit4 de 28)

entre 56 et 61

UDPG

UDPG

UDP

9

6.3 7.5

4.6 et 5.3

56

2 forme3 4.6-4.7

7.5

Les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de k croche n'ont pas été purifiées

jusqu'à présent. Toutefois, Dufiesne et al. (1997) rapportent quelques paramètres associés à

ces enzymes et aux réactions qu'elles catalysent:

-Un extrait enzymatique peut être préparé en homogénéisant trois fois pendant 30 secondes 1 g

de cals de &an broyés et lyophilysés avec 10 mL de tampon Tris-HCI 200 m . , pH 73,

contenant 10 mM de polyéthylène glycol 3400, 20 rnM de diéthyldithiocatbamate de sodium et

14 m . de P-mercaptoéthanol. Le mélange est ensuite incubé pendant 20 minutes avec agitation

constant à 4°C et centrifùgé 30 minutes a 37 800 x g toujours à 4OC. Le surnageant est désalé

(PD 1 O) et l'extrait enzymatique se retrouve dans un tampon Tris-HC1 100 rnM, pH 7,4.

-Le pH optimal de la réaction de glucosylation de la crocétine par un extrait enzymatique de

cals de safian se situe entre 7'0 et 7,6. L'activité n'a pu être mesurée à un pH inférieur à 7.0

parce que la crocétine n'était pas complètement soluble dans le milieu réactionel sous cette

valeur.

-L'UDP est de loin le meilleur nucléotide donneur de glucose, comparé au TDP alors que

I'ADP en présence de la crocétine et de l'extrait enzymatique de cals de &an ne mène à la

formation d'aucun produit.

-Quand l'extrait enzymatique est incubé en absence de crocétine et en présence d'un excès

d0UDP-glucose, I'UDP-gentiobiose n'est pas formé, indiquant que I'UDP-gentiobiose n'est pas

formé avant la glucosylation de la crocétine et que les unités de glucose sont attachées au

substrat les unes après les autres.

2.3.5.2 Hypothèse de la voie de biosynthèse des glycosides de la crocétine

La synthèse in vitro des glucosyle esters peut être faite par des extraits de cais de Crocus

satiws. La tout-pans-crocétine est glucosylée suite à l'addition séquentielle d'unités glucose de

l'uridine-diphosphoglucose (UDP-glucose). La figure 14 présente le pronl HPLC et

l'identification des différents glycosyles obtenus. Ainsi l'incubation d'un extrait de cal

25 30

Temps (min)

Figure 14. Profil HPLC et identincation des pics des produits de glucosylation après 150

minutes d'incubation du mélange de crocétine et d'UDP-glucose avec un extrait de cals de

safran. a croche, b gentiobiosyle-glucosyle ester, c diplucosyle ester, f monogentiobiosyle

ester, h monoglucosyle ester et I crocétine. d, e, g, i, j. k et m sont les dérivés cis de la

crocétine et de ses glycosylse esters (Adapté de Dueesne et al., 1997).

en présence de la crocétine encapsulée et d'UDP-glucose mène à la formation du

monoglucosyle ester, du monogentiobiosyle ester, du diglucosyle ester, du glucosyle-

gentiobiosyle ester et finalement du digentiobiosyle ester, la croche, après 2, 6, 20. 30 et 70

minutes respectivement (Dufiesne et al., 1997). L'encapsulation de Ia crocétine à l'aide du

maltosyle-B-cyclodextrine permet de solubiüiser le substrat et d'éviter l'utilisation du diméthyle

sulfoxyde qui est plus couramment utiiisé, mais qui a un effet inhibiteur sur la glucosylation

(Connier et al., 1995).

Une voie de biosynthèse en plusieurs étapes pour les glycosides de la crocétine a été proposée

(Dufiesne et al., 1997). Deux glucosy1transférases distinctes seraient impliquées dans la

formation des glucosyles et gentio biosyles esters de crocétine- Une enzyme, la GTASE 1, serait

responsable de l'addition d'une unité glucose aux groupements carboxyliques terminaux de la

molécule de crocétine. L'autre enzyme, la GTASE2, catalyserait i'addition 1-6 de glucose aux

groupes glucosyle esters avec formation des gentiobiosyle esters. La GTASEl et la GTASE2

participeraient toutes deux à la formation du glucosyle-gentiobiosyle ester de la crocétine. La

figure 14 résume la voie proposée. Les structures des glycosyles esters ont été présentées à la

figure 12.

diglucosy le ITI

I ester I

Figure 15. Voie proposée pour la biosynthèse par l'addition en plusieurs étapes de molécules de

glucose à la molécule de crocétine par un extrait de cals de safian. La GTASEl est la

glucosyltransférase responsable de l'addition de glucose aux groupements carboxyles terminaux

et la GTASE2 aux groupes glucosyle ester (Adapté de Dufiesne et al., 1997).

2.4 Problématique et objectifs

Les connaissances concernant les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de la crocine

sont limitées aux travaux de Dufiesne et coihborateurs (1997). II existe également peu de

travaux rapportant la purification de glucosyltransférases végétales catalysant la formation de

liens esters comme ceux catalysés par le GTASE 1.

A h de mieux connaître les eozymes impliquées dans la glucosylation de la crocetine en crocine

et de vériner l'hypothèse posée par Dufksne et coüaborateurs (1997), nous avons puriné

partiellement ces enzymes à partir d'un extrait d'une suspension cellulaire de shn. Cette

purification nous a permis de détenniwr certaines caractéristiques de la GTASEl. La

comaissance du poids moléculaire, du point isoélectrique, du pH optimal et de la température

optimale a permis de mieux co-tre cette enzyme et de faciliter la mise au point d'un

protocole de purification permettant la reparation des GTASEl et GTASE2. L'hypothèse de

Dufiesne et coilaborateurs (1997) a donc pu être vérifiée et confirmée.

Les glucosyItransférases végétales sont généralement reconnues comme ayant des spécificités

de substrat variables (Hosel, 1 98 1 ). Nous avons vérifié la spécificité de substrat de la GTASE 1

a h de déterminer si elle pouvait glucosyler d'autres substrats ayant un intérêt médical ou une

similarité de structure avec la crocétine. Cette enzyme s'est révélée être hautement spécifque

contrairement à la plupart des glucosyltransférases d'origine végétale purifiées jusqu'à

maintenant.

Les chapitres III et IV sont consacrés à la purification et à la caractérisation de la GTASE 1.

CHAPITRE III

PROPERTIES OF A GLUCOSYLTRANSFERASE fNVOLVED IN CROCIN

SYNTHESIS

(PROPRIÉTÉS D'UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE IMPLIQUÉE DANS LA

SYNTHÈSE DE LA CROCINE)

Properties of a glucosyltmnsferase invotved in crocin synthesis

France côté", François ormier*'', Christiane ~ufkesne' and Claude ~dlemot'

I Food Research and Development Center, Agriculture and Agi-Food Canada, 3600 Casavant

Blvd. West, St. Hyacinthe (Qc), Canada J2S 8E3

'~orticulture Research Centre. Department of Plant Science, Laval University, Ste. Foy (Qc).

Canada G I K 7P4

3 Present address: Colarôme Inc., Corby Building, 950 chemin des Moulins, Montreal (Qc),

Canada H3C 3 W5

*Corresponding author

Nous décrivons les propriétés de 1'UDP-glucose:crocétine 8,8'-glucosyltransférase (EC 2.4.1 .-)

partiellement purifiée et impliquée dans la synthèse de la croche. Cette enzyme participe à la

biosynthèse de la croche en formant des liens esters entre les groupes carboxyliques terminaux

de la crocétine et la partie glucose de I'UDP-glucose. L'enzyme a été purifiée 125 fois par

précipitation a l'acétone, chromatographies d'échange anionique et filtration sur gel. Le poids

moléculaire natif est approximativement de 47 kD, tel qu'estimé par fltration sur gel

analytique. La préparation la plus purifiée contient des isoformes entre les pH 4.4 et 4.8, tel que

déterminé par I'IEF. L'enzyme possède une activité maximale a 40°C et des valeurs de Km

apparents pour I'UDP-glucose et la crocétine de 0.72 rnM et 0.17 mM respectivement, ainsi

qu'une valeur Vmax de 30 pkatdmg.

ABSTRACT

The properties of a partially purified UDP-glucose:crocetin 8,8-glucosyltransferase (EC 2.4.1 .-)

involved in crocin synthesis are descnid. ïhe enzyme participates in the biosynthesis of crocin

by forming ester bonds between the carboxyl groups of crocetin and the glucose moiety of

UDP-glucose. The enzyme has been purified 125-fold through a multi-step process of acetone

fiact ionat ion, anion-exc hange, and gel mtrat ion chromatography. The native mo lecular weight

is in the range of 47 kD, as estimated by analyticai gel fïitration. The most purified preparation

showed isoforms between pH 4.4 and 4.8 when resolved by IEF. The enzyme had maximal

activity at 40°C, apparent Km values for UDP-glucose and crocetin of 0.72 mM and 0.17 rnM,

respectively, and a Vmax of 30 pkatdmg.

Keywords

SaBon, Crocus sativus, glucosy ltransferase, crocet in, g lycosylation, caro tenoids.

3.1 Introduction

Crocus su~ivus stigmata contain unusuai carotenoid glycosides which have a strong coloring

potential. These yeilow pigments consist of glucosyl and gentiobiosyl esters of crocetin, a 20

carbon carotenoid [1,2] (Fig. 1). The major pigment, crocin, contains two gentiobiose units

iinked to the t e n d carboxylic k t i o n s , which confer its high water solubility.

The high coloring strengch and the water solubility of crocetin glycosides make them good

candidates for applications in foods and pharmaceuticais. The glycosylation potential of d û o n

celi cultures toward crocetin has been demonstrated in cell-fiee extracts and in living ce& [3,4].

Exogenously-added crocetin encapsulated in maltosyl-B-cyclodextrin is taken up by the celis,

glycosylated and stored in vacuoles [4].

Plant glucosyltransferases are found in rnany dBerent sources. They generaiiy do not share

common characteristics and most are not specific for one single substrate or reaction [5,6].

Glucosyltransferase activity for the formation of crocetin glucosyl and gentiobiosyl esters is

present in different parts of sprouting c o r n of &on and in calius culture but the enzymes

have neither been purified nor characterized. Glucosylation of crocetin into crocin is sequential

and may involve two distinct glucosyltransferases; one f o r h g ester bonds between crocet in

carboxyl groups and glucose rnoieties and the other catalyzing the format ion of glucosidic

bonds with the glucosy1 ester fùnctions at both ends of the molecule (31.

In order to better understand the glucosylation process in safion celi suspensions, a

glucosyltransferase involved in crocet in glucosides format ion was part ially purified for the fht

tirne. The present results are the fïrst report on the properties of a UDP-glucose:crocetin 8,8'-

g lucosyltransferase involved in the glucosylat ion of crocet in.

H O RI R2 Crocetia and i lvcaides HO H H craetin

kta-D-Gle H Glc moaoglucasyl ester C lc G le diglucosyl ester H geatiobiose moaogeotiobiosyl ester

Clc gentiobiose geotiobiayl-glucayl ester geatiobiose geatiobiose crocia

H O

HO H O

beta-D-gentiobiose

Fig. 1 Structure of crocetin and its glycosides

3.2 Materials and methods

3.2.1 Chernicals and reagents

Uridine-5'-diphosphoglucose (UDP-glucose) disodium salt, crocetin pyridine salt, reactive dye

ligand test kit consist ing of pre-packed 2.5 mL colurnns and uridine-5'-diphosphoglucuronic

acid cross-linked 4% beded agarose (UDP-glucuronic acid) were purchased fiom Sigma

C hemical Co. (St-Louis, Mo). Maltosyl-B-cyclodextrin was f?om Ensuiko Sugar Refining Co.

Ltd (Tokyo, Japan). Molecular weight and isoelectric markers, Ampholine PAGEplate gels (pH

4.0-6.5), PD1 O columns, Mono Q HR Y 5 colurnn and Superdex 200 prep grade gel were Eom

Pharmacia (Uppsala, Sweden). The Ci* Spherisorb-ODS2 10 pm column was purchased from

CSC (Montreai, Qc, Canada). All chemicais were analytical reagent grade.

3.2.2 Cell culture

Safion (Crocus sativus) cell suspension cultures were produced fkom weli established ceil h e s

[3]. The ceil suspension cultures were grown in Murashige and Skoog medium [7]

supplemented with More1 vitam* [8], 30 g/L sucrose, and 0.5 mg/L a-naphtaleneacetic acid

at pH 5.8. Ten-day-old cells were harvested by filtration and washed with deionized water prior

to l y o p b t i o n .

3.2.3 Extraction and purification of the UDP-glucose:crocetin 8,8'-

glucosyltransferase

The following buEers were used: A, 200 mM Tris-HCl (pH 7.4); B, 100 mM Tris-HCl pH 7.4;

C, 5 mM Bis-Tris pH 6.0; D, 20 rnM Bis-Tris pH 6.0; E, 20 mM Bis-Tris pH 6.0 + 1.0 M NaCl; F, 100 mM Tris-HC1 pH 9.0 + 1.5 M NaCl; C9 0.75M Bis-Tris propane pH 7.1. Ail

buffen used in chrornatography were filtered through a 0.45 Pm nher and degassed before use.

3.2.3.2 Extraction

Fresh c e k were fiozen in Liquid nitrogen and lyophilized. Dried ceUs were pooled, ground and,

stored at room temperature away fiom Lght and hurnidity. AU procedures for extraction and

purification were carried out at 4OC or on ice. For enzyme extraction, each gram of ground

lyophilized cells was mixed with 10 mM polyethylene glycol 3 400 and 10 mM

rthylenediarninetetraacetic acid in 15 mL of extraction buffer A. After 30 min of incubation

with continuous stirring, the mixture was centrifùged at 10,000 g for 30 min. The supernatant

was tiltered on Miracloth (Interrience, Markham, Ont, Canada) and passed thrcugh PDlO

columns (Sephadex G-25, Phamÿicia, Uppsala, Sweden) equilibrated beforehand with buffer B.

Proteins were precipitated with 20% (v/v) acetone at -10°C. The resulting pellet was

resuspended in buffer C and concentrated using a rotary vacuum evaporator foilowed by

ultrafiltration with a Mini-ultrasette unit (exclusion lirnit 30 kDa) (Filtron, Northborough, MA);

the buffer was replaced by bufler D using PDlO columns. Glycerol was added to the

concentrated enzyme extract at this and the following steps of purification to a final

concentration of 10%.

3 .2.3.3 Ion exchange chromatography

The concentrated enzyme extract wit h glucosy ltransferase act ivity was subjected to anion-

exchange chromatography on a Mono Q column using the APPS system (Waters, Mississauga,

Ont, Canada). The column was equili'brated with buffer D and 2.5 mL aiiquots of concentrated

extract containhg 3 - 3.5 mg of protein were injected ont0 the column m e r washing the

column with 10 mL of buffer D, the enzymes were eluted with a linear gradient of NaCl (O - 500 mM) with b a e r E at 1 mC/& C o k t e d hctions of eluent (2.5 mL) were immediately

desalted using PD10 columns equili'brated beforehd with b a e r A and glucosyltransferase

act ivity was tested in each hction. Fractions with glucosyltransferase act ivity of several

chromatographie nins were pooled, concentrated by u l t d ï h t i o n using the Mini-ultrasette and

assayed for protein and enzyme activity (see below).

3.2.3 -4 Gel penneation

Gel filtration chromatography on Superdex 200 prep grade column (2.6 cm X 56.5 cm) was

perfonned using the APPS System (Waters). Aliquots of 2.5 mL (0.5 - 1.5 mg of protein) of

concentrated enzyme Eom ion exchange chromatography were injected ont0 the column and

eluted with buffer A at a flow rate of 2.5 rnL/rnin. The three most active fiactions of each run

were pooled, concentrated using a Macrosep centrifuga1 concentrator (exclusion Limit 30 kDa)

(Filtron. Northborough, MA). and assayed for protein and glucosyltransferase activity.

The substrate, crocetin, was encapsulated in maltosyl-B-cyclodexttin as described by Cormier et

al [9]. Optimal conditions for enzyme activity were determined. The standard reaction mixture

consisted of 150 pL buffer G, 1 mM crocetin, 2.5 m M UDP-glucose (1 0 mM for the kinetic

study) and 50 pL (100 PL for the pdca t ion table) enzyme extract (10-15 pg protein), in a

final volume of 400 ML. The reaction was initiated by adding enzyme extract. The reaction

velocity was linear with tirne for at least 90 min. The mixtures were incubated for 60 min at

40°C. The reaction was stopped by adding 400 pL ethanol. Samples were nui in duplicate. The

reac t ion products of crocet in glucosylation were separated and quant i!ïed by reverse-phase

HPLC @eckman, San &unun, CA) on an 0DS2 ( C i g ) column eluting with a linear gradient

fiom 1% (v/v) acetic acid in water to 100% methanol (HPLC grade), at a 1 mL/min flow rate

and monitoring at 440 nrn [8]. Peaks were integrated for quantitative determination of crocetin

monoglucosy1 ester production. Reaction products were identined by cornparison with

previously identsed ones [IO]. Enzyme activity was defined as pmole of crocetin monoglucosyl

ester produced per s (pkatal) under the assay conditions.

3.2.3 -6 fbGlucosidase assay

The B-glucosidase activity was determined according to a rnethod based on those of Dekker

[ I l ] and Bergmeyer et al [12]. One hundred pL of the enzyme extract was mixed with 900 pL

of 2 mM 4-nitrophenol-P-D-glucopyranoside in water and incubated at 50°C for 10 min. The

reaction was stopped on ice by adding 4 mL of 0.25 M sodium bicarbonate. The amount of 4-

nitrophenol (PNP) formed was rnonitored at 401 nm. One unit (U) of P-glucosidase is defined

as the amount of enzyme required to produce 1 pmole of PNP per Mnute at 50°C.

3.2.3.7 Protein assays

Protein concentration was estimated according to Bradford [ 1 31 using the Bio-Rad reagent and

y-globuiin as standard protein.

3.2.4 Other purification methods tested

3.2.4. f Dye columns

Yeiiow 86, Blue 4, Blue 72, Green 19, Brown 10, Yeiiow 3, Cibacron blue, Red 120 and

Green 5 columns (2.5 mL volume) were screened to find those that gave the best purification.

Sarnpies of the crude desalted extract containing 2 mg proteins were applied on each column

equilibrated beforehand with buffer B. The columns were washed with two colurnn volumes of

buffer B and proteins with glucosyltransferase activity were eluted with buffer F. Afkity of the

anion-exchange purified extract was also tested on Cibacron blue column. Protein and

gluco sy ltransferase activity were assayed in each 5 mL fraction.

3.2.4.2 Afk i ty with UDP-glucuronic acid

A 5 mL column was prepared with UDP-glucuronic acid agarose as ligand and pre-equiiiirated

with buEer B. Ten dgrarns protein of the desaited crude extract were applied ont0 the

column After washing the column with b d e r B until no protein was detected, the column was

eluted with a step gradient fkom 0.5 M to 2.0 M NaCl in b d e r B. Fractions of 2.5 mL were

collected and tested for glucosyItransferase activity and protein content.

3.2.5 Characterization of tbe glucosyltransferase

The variation in enzyme activity with temperature was detennined with an extract partidy

purified by acetone precipitation and gel filtration chromatography. A preparation eluted fiom

anion-exchange was used to determine enzyme kinetics. Enzyme puritied by gel filtration was

used to estimate molecular weight and isoelectric point.

3.2.5.1 Effect of temperature

Glucosyltransferase activity was assayed under standard conditions at pH 7.0 and at

temperatures varyhg fiom 20 to 55°C for the acetone extract and fiom 30 to 50°C for the gel

filtration extract. Results are the means of triplicates.

3.2.5.2 Isoelectric point (pl)

The isoelectnc point of the enqme was detennined by separating the proteins fiom gel

filtration chromatography on an Ampholine PAGplate in the pH range of 4.0-6.5 (Pharmacia)

at 2000 V, 25 mA and 125 W at 18°C for 2h30 min. The portion of the gel where standards

were applied was silver stained and the rest of the gel was cut into bands of 0.5 cm. For each

portion, the gel was separated fiom the plastic backing and incubated with 500 pL of standard

reaction mixture at 4°C overnight. Glucosyltransferase activity was measured in the supernatant

incubated at 40°C for 4 h. Low pI protein standards (Pepsinogen (pI 2.80), amyloglucosidase

@I 3.50), methyl red (pI 3.73, glucose oxidase @I 4.15), soybean trypsin inhibitor (PI 4-55),

9-lactoglobulin A @I 5.20), bovine carbnic anhydrase B @I 5.85) and human carbonic

anhydrase B (pI 6.55)) were used as markers to estirnate the pI of the partiaily purified enzyme.

3.2.5.3 Estimation of molecular weight

The native molecular weight was determined by gel permeation HPLC on an Ultrahydrogel 500

column in series with an Ultrahydrogel 250 colurnn running with b a e r A, at 1 mL/min and

m o n i t o ~ g at 28OQ 10 nm. Blue dextran 2000 (2 000 kD), bovine serum albwnin (67 kD),

ovalbumine (43 kD), carbonic anhydrase (29 kD) and chymotrypsinogen A (25 kD) were used

as gel filtration low molecular weight standards.

3.2.5.4 Enzyme kinetics

Apparent K,,, and V, values were determined fiom slope and intercept replots of initial rate

data. The e-e extract was incubated with various concentrations of crocetin in ranges of

final concentration of O. 125- 1.50 rnM for crocetin and 0.25-2.5 mM for UDP-glucose.

The effect of P-mercaptoethanol additions during extraction of glucosyltransferase was

determined by comparing glucosyltransferase specific activity in crude extracts fiom 1 g of

ground lyophilized cells mixed with 10 mM P-mercaptoethanol.

3.3 Results and Discussion

3.3.1 Enzyme purification

Glucosyltransferases transfer glucosyl groups fiom the donor to hydroxyl or carboxyl fùnctions.

Whiie reports on the purification of glucosyItransfenises catalyzhg the glucosylation of

hydroxyl group of compounds like flavonoids and phenols are abundant [5,6], only few

glucosyltransferases involved in the glucosyktion on carboxyl groups were purified and

characterized [14, 151. In a previous study, it was s h o w that safEon c d u s extracts, in the

presence of UDP-glucose, convened crocetin into related glycosyl esters in the following

sequence: monoglucosyl ester, monogentiobiosyl and diglucosyl esters, gentiobiosylglucosyl

ester. and M y crocin (F-ig. 1)[3]. The formation of these glycosides involved the

glucosylation of the carboxylic groups of crocetin and of hydroxyl groups of the glucose

already Linked to the aglycone. The characterization of these enzymes has until now not been

reported.

To characterize the glucosyltransferase involved in the transfer of glucosyl moieties ont0 the

carboxyl ends, UDP-glucose:crocetin 8,8'-glucosyltransferase has k e n purified about 125-fold

fiom safion ceil suspensions. Purification was achieved by acetone precipitation anion-

exchange chrornatography on a Mono Q column, and gel permeation on a Superdex 200

column (Table 1). Desalting the crude extract doubled the specinc activity and the percentage

of recovery. This step removed inhibitors present in the crude extract. Indeed, mixing the crude

and desalted extracts gave lower glucosyltransferase activity than the surn of each extract

activity separately. Precipitation of glucosyltransferase activity in 20% acetone eliminated P- glucosidase activity which totally pecipitate in 30 % acetone and might hydrolyze newly formed

glycosides and therefore interfere with crocin synthesis (results not shown). Active fiactions

corresponding to only 0.3% of the crude extract protein were eluted fiom Mono Q column

between 0.3 and 0.4 M NaCl (Fig. 2). Fractions eluted fiam the gel filtration column between

72 and 82 minutes corresponding to molecular weights between 40 and 60 D a contained

glucosyltransferase activity (Fig. 3). At the end of the process, the enzyme preparation was

purilied -125 fold. The overail purification process led to 2% recovery. Migration of the

54

enzyme on SDS-PAGE indicated the presence of several distinct proteins (Fig. 4).

Table 1. Purification of UDP-g1ucose:crocetin glucosyltransferase fiom Crocus sativus L. ceil

suspension culture. Pudication is as described in "Materials and Methods".

Purilkat ion steps To ta1 protein Specific act ivity Purification Recovery

(mg) @kat m g ) (n- fo Id) (%)

Cnide 1040 0.48 1 1 O0

Desalted (PD 10) 1018 0.92 2 188

Acetone fiactionation 26.4 3.70 8 20

Anion-exc hange 3 -25 14.8 3 1 10

Gel filtration 0.18 59.8 125 2

Afçiity chromatography has been kluded in the purification protocol of several plant

glucosy luansferases. Latchinian et al. [ 161 used the afnnity columns UDP-glucuronic acid

agarose and Reactive Brown-IO agarose for hsî Bavonoid glucosyhransferases purification.

A£iïnity chromatography with dyes and UDP-glucuronic acid was tested and resulted in lower

purincation efficiency t han gel filtration chromatography (resuhs not shown). The UDP-

g1ucose:crocetin glucosy1transferase bound and eluted fiom al1 the dye columns tested, but

showed higher purification with the dyes Green-5, Cibcron Blue and Red-120 (results not

shown). The addition of a dye afEnity step to the purification protocol did not result in any

change in the protein band profile on SDS-PAGE gel with the exception of Cibracron blue.

When chrornatography on a Cibacron blue column was added to the purification protocol, the

band at 27 kD was eliminated, leaving the band at 26 kD as the major band, but other bands

were stih detected (Fig. 5). Elution of glucosyltransferase activity fiom the Cibacron blue

column with 10 m M UDP-glucose solution failed. Affinity chromatography d e s use of the

highiy specific binding sites of enqmes, thus ailowing their separation according to the* ability

to bind to a particular ligand. Since the target enzyme did not discriminate between the dyes.

the interactions between enzyme and dyes were probably electrostatic rather than specsc to the

binding site. The inability of UDP-glucose to release the enzyme fiom the column supports this

conclusion. Moreover the 125-fold puritied preparation did not bind to the UDP-glucuronic

acid agarose column, as shown for glucosyltransferases fiom leaves of Sievia rebaudiana using

steviol as substrate[l4], or fiom wild tomato glucosylating fatty acids [15].

ElutMo time (min)

Fig. 2 Anion-exc hange chrornatography of UDP-glucose:crocetin glucosyltransferase ushg a

Mono Q FPLC column. The bound proteins were eluted using a linear gradient (0-0.5 M) of

NaCl (----). Fractions (2.5 mL) were coiiected and assayed for enzyme activity against 1 .O m M

crocetin (solid bars). The protein content (-) in each hction was monitored at 280 nm.

O 10 20 3 0 4 0 9 60 70 80 90 F r a c t i o n n u m b e r

Fig. 3 Elution profle o f proteins (-) and glucosyltransférase activity against 1 .O rnM crocetin

(solid bars) afier gel permeation FPLC on a Superdex 200 prep grade column. The protein

content in each 2.5 rnL £+action was mnitored at 280 nm.

Fig. 4 SDS-PAGE of the 125-fold purified extract &et gel permeation FPLC on Superdex

200 prep grade column (Lane 1) and molecuiar weight markers (Lane 2). The stacking eel was

4.0%, the separating gel was 12% ushg Tris-HCl buffer at pH 8.8. The sarnple b d e r

contained SDS and P-mercaptoethawl. The gel was staiwd with silver nitrate.

Fig. 5 SDS-PAGE of the glucosyhransferase preparations From d o n ceUs afler pufication

by afhity with Cibacron Blue column after anion-exchange chromatograpgy on a Mono Q

column. The stacking gei was 4.0%, the separating gel was 10Y0 using Tris-HCI buffer at pH

8.8. The sampie b a e r contained SDS and P-mercaptoethanol. The gel was stained with silver

nitrate.

This is the first report on the characteristics of a glucosyltransferase involved in crocetin

glyco sy lat ion [3]. Numerous g luco syltransferases purified eom plant sources are acidic proteins

[15, 17, 181. The 125-fold purilied preparation is no exception to this and contains several

protein bands on IEF gel with giucosyltransferase activity between pH 4.4 and 4.8 (results not

shown), which suggests the presence of two or more isoform of UDP-g1ucose:crocetin 8,8'-

glucosyltransferase. The purified enzyme has a native molecular weight in the range of 47 kD

(Table 2 and Fig. 3). Glucosyhransferase activity could not be detected on SDS-PAGE gel

because the reducing agent B-mercaptoethanol interfered with glucosyltransferase activity

(Table 2). Plant glucosyltransferases were shown previously to consist of either one or several

subunits [5,6]. The major band at 26 kDa suggests that the enzyme is formed of two subunits

which is in agreement with the native molecular weight estimated by gel filtration

chromatography, i-e., 47 kDa.

Safion contains glucosyltransferases invo lved in the synthesis of various glycosides. CeU

cultures of Crocus sarivus contains enzymes catalyzing the formation of quercetin and

isohamnetin glucosides 1191. Another study showed crocetin glucosylation by a

glucosyltransferase extracted fiom Vitis vinijéra callus. The enzyme was able to catalyze the

glucose transfer on the carboxyl group of crocetin but not the formation of crocin [3],

suggesting that more than one glucosyltransferase may catalyze the glucose transfer on crocetin

in vitro. Two temperature optima appeared in the acetone precipitated enzyme preparation at

30°C and 40°C (Fig. 6a). The 125-fold pwified preparation had a single temperature optimum

at 40°C (Fig. 6b). The presence of two temperature optima suggests that more than one

glucosyltransferase catalyzed the glucosylation of crocetin. The purification rnay have

eliminated more labile iso f o m of UDP-glucose:crocetin 8,8'-glucosyltransferase, as O bserved

during the purification of isoperoxidase fiom oranges [SOI.

Table 2. Propert ies of the UDP-glucose:crocetin glucosyltransferase in Crocus sutivus L. ceU

suspension culture.

PI' 4.4 - 4.8

Native molecukr weight' in the range of 47 kDa

&, crocetb? 0.17 m M

K, U D P - ~ ~ U C O S ~ ~ 0.72 rnM

Relative activity m crude extract 100%

1 O mM ~-merca~toethanol~ 69%

i Determined d e r gel 6itration

' Determined afier anion-exchange; results are the mean of triplkates

Presence of the reducing agent in the extraction buffer

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Temperature (OC)

Fig. 6 a)Act ivity o f part ially purified glucosyltransferase after acetone precipitat ion at

temperatures ranging from 20 to SS°C. b) Activity of partially purified glucosyltransferase after

gel permeation FPLC at temperatures ranghg f?om 30 to 4S°C. Activity was measured with 1

mM crocetin and 2.5 rnM UDP-glucose as substrates. Resuits are the means of triplicates.

The K, and V,, were detennined with concentrations of crocetin and UDP-glucose between

0.2- and 10-fold their K,,, [21]. The enzyme showed higher &ty for the substrate crocetin

than for UDP-glucose. For crocetin, apparent K, and V, were cdculated as 0.17 mM and 30

pkatdmg respectively. For UDf -glucose, apparent K, was calculated as 0.72 mM.

We pstrtialiy characterized for the first time a UDP-glucose:crocetin 8,8'-glucosyltransferase,

one of the few glucosyltransferases studied cataiyzing the transfer of glucose on carboql

groups. We propose that two glucosyltransferases could be involved in the glucosylat ion of

crocetin into crocin, one for the formation of glucosyl esters (glucosylation of carboxylic ends

of crocetin) and the other catalyzing the glucosylation of hydroxyl groups of the glucose

already linked to the agiycone with formation of gentiobiosyl esters; both enzymes catalyzing

the synthesis of the gentiobiosylglucosyl ester [3]. In the present study both enzymes could not

be separated even though the puritication method resulted in 125-fold enrichment.

3.4 Acknowledgements

The Canadian Department of Extemal Af%àirs and International Trade has contributed

financially to this study, within the scope of a research collaboration with San-Ei Gen F.F.1 Inc.

of Osaka, Japan. We are gratefùi to D. Bélanger for his work on gel permeation HPLC. The

financial support of F. Côté by a Fonds pour la Formation de Chercheurs et l'Aide à la

Recherche graduated student fellowship is gratefiiiiy acknowledged.

3.5 References

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CHAPITRE IV

A HIGHLY SPECIFIC GLUCOSYLTRANSFERASE IS INVOLVED IN THE

SY NTHESIS OF CROCETIN GLUCOSYL ESTERS IN Crocus sativus CULTURED

CELLS

(UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE HAUTEMENT SPÉCIFIQUE EST IMPLIQUÉE

DANS LA SYNTHÈSE DES GLUCOSYLES ESTERS DE LA CROCÉTINE DANS

DES CULTURES CELLULAIRES DE Crocus sativus)

A highly speeific glucosyltransferase is involveà in the syntbesis of crocetin g l u c q l esters

in Crocus safivus cultured cells

France côté? François c ormier'-", Christhe ~ u l k m e ' , and Claude wdemot2

' ~ o o d Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 3600 Casavant

Blvd. West, St. Hyacinthe (Qc), Canada J2S 8E3

'~ort iculture Research Centre. Department of Plant Science, Laval University, Ste. Foy (Qc).

Canada G 1 K 7P4

'~resent address: Coiarôme inc., Corby Building, 950 chemin des Moulins. Montreal (Qc).

Canada H3C 3 WS

Les stigmates du safiran (Crocus sativus) contiennent des caroténoïdes rares qui sont solubles

dans l'eau, principalement la croche, le digentiobiosyle ester de crocétine. Des études

précédentes ont indiqué que deux glucosyltransfémses seraient impliquées dans la formation des

glucosyle et gentiobiosyle esters de la crocétine pufiesne et al., 1997, Planta Med., 63: 1 50-

1533. Une UDP-G1c:crocétine 8'8'-glucosyltransférase, impliquée dans la synthèse des

monoglucosyle et diglucosyle esters de la crocétine, a été extraite d'une culture cellulaire de

safian et purinée 300 fois par Btration sur gel et électrophorèse IEF préparative avec un

rendement de 13%. La préparation enzymatique purifiée est hautement spécifique envers la

crocétine et forme des liens esters entre la partie glucose de I'UDP-Glc et les fonctions

carboxyliques de la crocétine. L'extrait brut désalé du même matériel est moins spécifique et

forme des glucosyle esters avec d'autres composés tels l'acide abscissique et l'acide rétinoïque.

La préparation purifiée est active entre les pH 4.4 et 4.6. Une bande majeure à 26 k D apparait

sur le gel d'éIectrophorèse en conditions dénaturantes tandis que la poids moléculaire déterminé

par filtration sur gel se situe entre 49 et 55 kD. Cette étude renforce l'hypothèse que plus d'une

glucosyltransférase est impliquée dans la biosynthèse des glycosyle esters de la crocétine chez le

safan.

ABSTRACT

Safion (Crocus sativus) s t i p t a contain rare water-soluble carotenoids and the major one is

crocin, the crocet in digentiobiosy 1-ester. Previous studies indicated that two

glucosy Itransferases might be involved in the formation of crocet in glucosyi- and gentiobiosj-1-

esters pufiesne et al., 1997, Planta Med., 63: 150-1531. A UDF-G1c:crocetin 8,8'-

glucosyltransferase involved in the biosynthesis of crocetin monoglucosyl- and diglucosyl-esters

was extracted fiom &on cell cultures and was purified 300-fold by gel filtration

chromatography and preparative TEF electrophoresis, with a recovery of 13%. The purified

enzyme preparation was highly specific for crocetin and formed ester bonds between the

glucose moiety of UDP-Glc and the fiee carboxyl hct ions of crocetin. The enzyme did not

add other glucose units to the glucosyl-esters to form crocetin gentiobiosyl-esters. A crude

desalted extract of the same material was less specific and formed glucosyl-esters with several

other compounds, including abscisic and retinoic acids. The purified preparation was active

between pH 4.4 and 4.6. SDS-PAGE revealed a major band at 26 k D while the native

molecular mass detennined by gel filtration was in the range of 49 to 55 kD. The study

provides concrete evidence for the hypothesis that more than one glucosyltransferase are

involved in the biosynthesis of crocetin glycosyl-esters in di ion.

Footnotes 1 The Canadian Department of Extemal M a i r s and International Trade has contnbuted

financiaily to this study within the =ope of a research collaboration with San-Ei Gen F.F.I. Inc.

of Osaka, Japan.

Abbreviat ions: GTASE 1 and GTASE2, glucosyltransferases transfering glucose moiet ies fkom

UDP-Glc to the carboxyl ends of crocetin and to the glycosyl-esters of crocetin, respectively.

4.1 Introduction

S&on (Crocus sativus) stigmata are of great interest for the food industry because of their

unique aroma mainiy amiuted to sahnal, their bitter taste due to picrocrocin, and their

powerful coloring properties owing to hydrosoluble carotenoid pigments. These pigments are

glucosyl- and gentiobiosyl-esters of crocetin, mainly crocin, ail-pans-crocetin di (P-D-

gent io bio sy1)- ester. Crocet in g lycosides are also present in Gardenia jasminoides h i t s (Van

CaIsteren et QI., 1997), and in the stigmata of garden crocusen (Rychener et al., 1984)- Their

fiinction as an attractant for pouinating insects and anunals has been lost with tirne in some

stenle geophytes like Crocus sofiws, and their main role is probably protection against

oxidation (Bart Iey and Scolnik, 1 995).

The structure of severai crocetin glycosides has been described (Pfander, 1976; Van Calsteren

et al.. 1997). New glycosides, Le., trisaccharyl-esters, were recently produced (Dufiesne et al..

1999) and identiiied (Pfister er al,, 1996). However, little information is available about the

biosynthesis of crocetin and its glycosylated forms. Two pathways for the formation of crocetin

have been proposed: dirnerization of two C,,-terpenoid compounds, such as

gerany lpyrop hosphate foliowed by dehydrogenation and oxidat ion; and oxidat ive degradat ion

of a Ca,-carotenoid such as zeaxanthin (Pfander and Schurtenberger, 1982).

Information about carotenoid glucosylation is scarce. The formation of crocetin glycosides has

k e n studied in Crocus saiivus L. callus cultures. Dufiesne et al.. (1 997) detected glycosylation

activity in dinerent parts of sprouting c o r n of d o n . The authors proposed that crocetin was

enzymatically glucosyIated by a multi-step pathway involving two distinct glucosyltransferases

(Fig. 1). One enzyme (GTASEI) wouM cataiyze the addition of glucose rnoieties to the

terminal carboxyl ends of crocetin with formation of the monoglucosyl- and diglucosyl-esters.

The other glucosyltransferase (GTASE2) would transfer glucose moieties to glucosyl groups

forming crocetin monogentiobiosyl- and digentio biosyi-esters. Côté et uf. (submitted)

characterized a partidy purified UDP-G1c:crocetin glucosyltransferase (GTASE 1 ) fiom Crocus

sutivus ceil suspensions. The enzyme preparation showed optimal activity at 40°C and a pI in

the range of pH 4.4 and 4.8. The enzyme may consist of two subunits o f 26 kD. The

purifcat ion method did not separate GTASE 1 and GTASEZ act ivit ies.

Figure 1. Multi-step pathway proposed for crocetin glycoside biosynthesis by addition of

glucose moieties to crocetin: GTASE 1 and GTASE2 are responsible for the addition of glucose

moieties to a terminal carboxyl group and to a glucosyl group, respectively (adapted from

Dufiesne et al., 1997).

Mammalian glucosyltransferases are highly specific for the substrate accepting the sugar moiety

(Beyer et al., 198 1). Most plant glucosyltransferases which have k e n purified catalyze the

glucosyiation of hydroxyl group of flavonoid and phenolic compounds and have a broad range

of substrate specificity (Hosel, 198 1; Cormier, 1997). Few enzymes catalyzing the glucosyl

transfer on carboxylic fûnction have been studied. Shii ta et al. (1995) purified

glucosyltransferases fiom Stevia rebaudiana involved in the glycosylat ion of stevioi and

neviol-glycosides and fomiing ester and ether bonds. A glucosyltransferase purified fiom

Lycopersicum pennellii LA 1 3 76 leaves sho wed specificity to ward the carboxyiic h c t ion O f

short-chah fatty acids (Kuai et al., 1 997).

The present study airned at determinhg the substrate specificity spectrum of GTASEI. We

report on the 300-fold purification and characterization of a highly specific UDP-G1c:crocetin

8 ,8 ' - g lucosy l t r f e r and on the separation of GTASE 1 which transfers glucose to the

caboxyl ends of crocetin, fkom GTASEZ, which forms of glucosidic bonds and crocin. We bring

further evidence that the glucosylation of crocetin into crocin involves at least two enzymatic

steps.

4.2 Materials and methods

1.2.1 Plant Material and Chemicals

4.2.1.1 Ceil Culture

SafEon (Crocus sativlls) cells were produced fiom weli estabkhed ce11 suspension cultures

(Dufiesne et al., 1997). The c e k were grown in Murashige and Skoog medium (Murashige

and Skoog, 1962) supplernented with More1 vitamins (Morei, 1 WO), 30 g/L sucrose. and 0.5

mg/L a-naphtaleneacetic acid at pH 5.8. Ten-day-old celis were harvested by tiltration and

washed with deionized water prior to lyophilization.

4.2.1.2 Chemicals

UDP-Glc and UDP-Ga1 disodium saits. crocetin pyridine salt, valeric acid. 2-methyl valeric

acid. 4-met hyI valeric acid, pans-2-met hyl-2-pentenoic acid, pans-2-pentenoic acid, trans-2,4-

pentadieno ic acid, dl-tram-ret ino ic acid. 1 3 -cis-retinoic acid. and ail-trans-abscisic acid were

purchased fiom Sigma Chernical Co. (St. Louis, Mo). Bixin was f?om Extrasynthèse (Genay.

France). Maltosyl- B-cyclodextrin was fiom Ensuiko Sugar Re fining Co. Ltd (Tokyo, Japan).

All chernicals were analytical reagent grade.

4.2.2 Enzyme Purification

4.2.2.1 Extraction

AU procedures for extraction and purification were carried out at 4°C or on ice. For enzyme

extraction, each gram of ground lyophilized cells was mixed with 10 m~ PEG 3 400 and 10 nu

EDTA in 10 mL extraction buffer (200 m~ Tris-HCI pH 7.4). M e r 45 min of incubation under

continuous stirring, the mixture was centrifùged at 10,000g for 30 min. The supernatant was

fltered on Miracloth and desaited on PD10 columns (Sephadex G-25, Phannacia, Uppsala,

Sweden) pre-equilhted with the extraction buffer. Glycerol was added to the enzyme extract

at this stage and to the following steps of purification to a final concentration of 10% (v/v).

L2.2.2 Gel Filtration

Gel filtration chrornatography was performed on Superdex 200 prep grade column (2.6 X 56.5

cm) using the 650E Advanced Protein Purification System (Waters, Mississauga, Ont, Canada).

Fractions of 2.5 rnL (3540 mg of protein) of concentrated enzyme preparation were injected

onto the column and eluted with the extraction b a e r at 2.5 ml/mh flow rate. The protein

elution profile was monitored at 280 nm. The three most active hctions of each run were

pooled, concentrated using a Macrosep centrifuga1 concentrator (exclusion limit 30 kD) and

assayed for protein content and glucosyltransferase activity.

4.2.2.3 Preparat ive IEF

Preparative IEF was performed on a Multiphor II electrophoresis unit (Pharmach). The most

active fiactions isoiated fiom the gel tiltration chrornatography (2.5 mL) were applied on an 1

mm-thick Arnpholine PAGplate in the pH range of 4.0-6.5 (Phamiacia). The running conditions

were 200 V, 25- and 125 W at 18OC for 2 h 30 min. The gel was sectioned into 5 mm

bands. For e x h segment, the gel was separated fkom the plastic backing and proteins were

eluted in Tris-glycine buffer (25 m~ Tris-base + 192 m~ glycine) using an electro-eluter (Mode1

442, Bio-Rad). Fractions (600 pl each) containing GTASE 1 activity were pooled and stored at

-80°C. Protein content was rneasured as described below.

4.2.3 Enzyme and Protein Assay

GTASEl activity was routinely determined in a reaction mixture containing 75 pL reaction

buffer (0.75 M Bis-Tris propane pH 7.1 ), 1 m~ crocet in encapsulated in malto~l-P-cyclodextrin

(Cormier et al., 1995), 2.5 m~ UDP-Glc, and 25 pL enzyme extract (15-20 pg protein) in a

final volume of 200 pL. The mixtures were incubated for 60 min at 40°C. The reaction was

initiated by adding enzyme extract and was stopped by adding 200 pL ethanol. AU samples

were run in duplicate. The reaction products of crocetin glucosylation were separated and

quantified by reversephase HPLC (Beckman Gold System, San Ramon, Ca, USA) on a

SpherisorbODS2 (Cig) column (lOpm, 0.46 x 25 cm, CSC, Montreai, Que, Canada); the

products were eluted with a linear gradient fkom 1% (v/v) acetic acid in water to 100%

methanol (HPLC grade), at a 1 mL/min flow rate and monitored at 440 nm (Dufresne et al.,

1997)- Reaction products were identined by NMR and mass spectroscopy (Van Calsteren et

al.. 1997). Peak areas were integrated for quantitative determination of crocetin rnonoglucosyl

ester production Enzyme activity was defined as pmole of crocetin monoglucosyl ester

produced per s @katal) under the assay conditions.

Pro tein concentration was est imated using the Bradford dye- binding procedure (protein assay,

Bio-Rad) and y-globulin as standard protein.

4.2.4 Enzyme Characterisation

4.2.4.1 SDS-PAGE and Native Molecular Weight Determination

SDS-PAGE was carried out under reducing conditions using 10% Tris-HC1 precast gels (Ready

gel SDS, Bio-Rad) and calibrated with molecular weight standards in the range of 14.4 to 94

k D (Pharmacia). Proteins were visuaiized by silver staining. The range of native molecular mass

of GTASEl was estirnated d e r the preparative gel filtration chromatography on the Superdex

200 column using reference proteins of known molecular weights (13.7 to 2.000 kD.

P harmacia) .

4.2.4.2 I~oelectric focusing

IEF was perfonned on Ampholine gels (pH 4.0 to 6.5, Pharmacia), calibrated with standard

proteins (Low pI protein standards, pI 2.80 to 6.55, Pharmacia). The portion of the gel

containhg the standards was silver stained, and the rest of the gel was sectioned into bands of 5

77

mm. Elution of proteins was carried out as mentioned above. The GTASE1 activity and protein

content were measued in each section,

4.2.4.3 Effects of the Enzymatic Extract on Glycoside Composition of SaflEion Pigment

Safiion stigmata were ground and pigments were extracted by stirring in water at room

temperature. The extract was fltered on Whatman No 2 paper and the pigments were cleaned

uing Prep Sep Cis extraction columns (Fisher). The yeUow pigments were eluted with

rnethanol and dissolved in water d e r methanol evaporation. Fifty pL fiactions of the crude

desalted (two- fo Id purified) and preparative IEF (300-fold purified) enzymat ic extract were

incubated with 70 PL pigment extract, 75 pL 0.75 M Bis-Tris propane pH 7.1 buffer, and 5 pL

100 mi UDP-Glc at 30°C for i or 3 hours. The reaction was terminated with 200 pL ethanol.

The reaction products were separated and quantified by HPLC using the same method as

described for the enzyme assay.

4.2.4.4 Substrate Specifiçity

Substrate specificity toward the sugar donor of GTASE 1 was tested with the 300-fold p d e d

extract as described for the standard enzyme assay usine 2.5 mM UDP-Ga1 or 2.5 mM UDP-

Glc.

The GTASE 1 specificity toward the sugar acceptor was determined with the cmde desalted (2-

fold) and 300-fo1d purified extracts. The glucosylation rate of crocetin was compared with that

of other molecules. Substrates with terminal caboxylk f'unction were chosen on the basis of

structural dserences in chah length, methyl group and double bond position, and stereo-

chemistry. The chernical structures of the substrates are shown in Figure 2. Valeric acid, 4-

met hyl vaIeric acid, 2-methy l valeric acid, tram-2-pentenoic acid, frans-2-met hyl-2-pentano ic

acid, aii-tram-abscisic acid, and crocetin were solubiiized with 0.1 % CHAPS solution at 0.25

mg/mL concentration AU-~ns-retinoic acid, 1 3-cis-retinoic acid, and bixïn were solubilized in

DMSO at 2 mg/rnL concentration. Norbixin was obtained by saponincstion of bixin in CHAPS

0.1% in presence of NaOH. B k and norbixin structures were co-d by HPLC-MS.

Trans-2,4-pentadienoic acid was encapsulated in rnaltosy CB-cyclodextrin in a 1 :2 molar ratio

with a substrate concentration of 0.25 mg/mL. Preliminary experiments showed that DMSO,

CHAPS or maltosyl-fbcyclodextrin did not affect noticeably the reaction at the concentration

used. The reaction mixture consisted of 200 m~ substrate, 2.5 m~ UDP-glucose, 280 m~ Bis-

Tris propane pH 7.1 buffer, and 50 pL two-fold or 300-fold purified enzyme preparation in a

final volume of 200 PL. The mixtures were incubated at 30°C for 1 or 3 h and the reaction was

stopped by adding 200 pL ethanol. Reactions were also carried out with substrate preparations

at 5 mg/mL concentration. A 4 M substrate concentration was used for the reactions using

short-chah fatty acids as substrates. These reaction products were analyzed by TLC.

Carotenoids and neoformed reaction products were separated and analyzed by reverse-phase

HPLC on a Spherisorb-0DS2 (Cis, 10 pm) column (CSC) monitored using a diode array

detector. Products of crocetin and dl-pans-abscisic acid glucosylation were separated using a

iinear gradient fiom 1% (vlv) acetic acid in water to 100% methanol, at 1 &/min flow rate and

scanning between 250 and 500 nm for crocetin, and between 200 and 400 nrn for abscisic acid.

Quantification of crocetin and abscisic acid reaction products was carried out using peak area

integration at 440 nm and 262 nm respectively. Reaction products of bixin, n o r b m and

retinoic acid gIucosylation were separated using a iinear gradient from 1% (v/v) acetic acid in

water to 100% acetonitrile, at I W m i n flow rate monitored between 250 and 520 nm.

Quant scat ion was performed by peak area integration at 460 nrn for bixin and n o r b k and at

3 5 O for ret inoic acid. Truns-2-rnethyl-2-pentenoic acid react ion products were also separated

by HPLC with a linear water acetonitrile gradient scanning between 190 and 326 nm with

detection at 230 nm.

Short -chah fatty acids (valeric acid, 2-methyl valeric acid, 4-me thy 1 valeric acid, trans-2,4-

pentadienoic acid, irans-2-pentenoic acid, and trans-2-methyl-2-pentenoic acid) react ion

products were separated by TLC on LKSF l 5 0 k 250 Fm silica gel plates (Whatman) with

chloroform:methanol:water:acetic acid (70: 12:OS:O.S) and detected with the a-naphtol reagent

(Kates, 1986).

Figure 2. Chemicai structure of the substrates tested with the glucosyltransferase extract. a-

valeric acid, b. Cmethyl valeric acid, c. 2-methyl vaienc acid, d. îmns-2-pentenoic acid. e.

mns-2,4-pentadienoic acid f'. trons-2-metS.1-2-pentenoic acid, g. aii-trons-retinoic acid, h. 13-

cis-retinoic acid, i. all-mns-abscisic acid, j. bixin, k norbixïn, 1. crocetin.

4.3 Results

4.3.1 Purification and Properties

GTASEl was purified 300-fold fiom Crocus sativils ce11 suspension cultures using the

procedure summarized in Table 1. The initial dedting step with PD10 columns removed 49 %

of the protein fiom the crude extract. The preparative gel filtration on Superdex 200 provided

the most significant purification step and substanciaily reduced the total amount of protein

(Table 1) but both GTASE activities were stU present. M e r preparative IEF, GTASE 1 was

purified 300-fold with a recovery of 13% and separated firom GTASE2 activity. The enzyme

had a specinc activity of 180 pkatal/mg-' protein and showed a major band on SDS-PAGE in

the range of 26 kD, with three minors bands at 40,6 1, and 65 kDa (Fig 3A). Attempts to assay

g lucosyltransferase activity in SDS-PAGE gel were unsuccessful because P-mercaptoethano 1

interfers with the GTASE 1 activity assay (Côté et al., submitted). The native molecular weight

of the three most active fiactions eluted fiom Superdex 200 prep grade column was in the

range of 49 to 55 kD. The 300-fold purified extract was subjected to IEF and gave three active

GTASEl bands at pH 4.4,4.5, and 4.6 (Fig. 3B).

4.3.2 Specificity

No galactosides were formed fiom the sugar donor UDP-Ga1 (Table II). The 2-fold purified

extract reacted with several substrates, in order of decreasing affinity: trans-2-methyI-2-

pent eno ic acid, crocet in, norbixin, trans-abscisic acid, 1 3 -cis-ret inoic acid, tram-retino ic acid.

and bixin. The 300-fold purified extract was specific for crocetin (Table II).

Three different methods were used to solubilize the substrates tested in the specificity study.

Encapsulation of crocetin in cyclodextrin circwnvents the use of DMSO which inhibits

glucosyltransferase activity in a concentration dependent way (Connier et al., 1995).

Solubïiization of crocetin in 0.1% CHAPS was as efficient as encapsulation and gave simiiar

results (not shown). CHAPS solubilized some of the substrates. However, DMSO was used to

solubilize bixin and retinoic acid, which were very soluble in a minimal volume of DMSO while

Table 1. Purification of UDP-G1c:crocetin glucosyltransferase nom Crocus s a t i w L. ceU

suspensions. Resuits are the means of duplicates. Enzyme activity was assayed with 1 .O r n ~

crocetin and 2.5 m~ UDP-glucose.

Tot al To ta1 Specific

Purification step protein ac t ivity activity Purscat ion Recovery

(mg) @kat al) (pkat ailmg) (n- fo Id) (%)

Cnide extract 1130 678 0.6 1 1 O0

DesaIted (PD 1 0) 574 746 1.3 2 110

Gel filtration 9.0 243 27.0 45 36

IEF 0.5 90.1 180 300 13

Figure 3. Analysis of the 300-fold purified glucosyltransferase extract from satnon cell. A.

SDS-PAGE of protein extract afler preparative IEF, stained with silver nitrate. B, IEF of highly

purified GTASE 1, stained with silver nitrate.

Table II. Substrate specificity of GTASE 1 p d e d 2- or 300-fold.

Reactions were assayed with 2.5 m~ of each glycosyl donors, and with 200 m~ of each

glucosyl acceptors. Results are the means of duplicates.

Glucosy ltransferase relative activity (%)

2-fold purification 3 00-fo ld purification

Glucosvl donora

UDP-Glc

UDP-Ga1

crocet in

bwn

norbixin

pans-abscisic acid

rrans-ret inoic acid

1 3-cis-retinoic acid

rrans-2-methyl-2-pentenoic acid

valeric acid

2-met hy 1 valeric acid

4-methy l valeric acid

n-ans-2-pentenoic acid

rrans-2,4-pentadienoic acid

n.t. Not tested

a Glycosyl acceptor: 1 .O r m crocetin b Glucosyl donor: 2.5 m~ UDP-Glc

both other methods failed. DMSO at very low concentration did not interfere noticeably with

the reac t io n.

4.3.3 Separation o f GTASEl and GTASE2 activities

The 300-fold purified enzyme preparation catalyzed the transfer of a glucose moiety fiom

UDF-Glc to crocetin with the formation of only crocetin monoglucosyl-ester and a d

amount of crocetin diglucosyl-ester (Table III). One hour incubation of crocetin and UDP-Glc

in the presence of the crude desalted or the gel filtered extracts led to the formation of crocetin

monoglucosyl-, monogentiobiosyl-, diglucosyl-, and gentiobiosylglucosyl- esters. In

cornparison with the crude desalted preparation, the gel fiitrat ion extract catalyzed the

formation these crocetin glycosides at a slightly lower rate. Incubation at room temperature of

the IEF (300-fold) purified extract with with very low concentration of crocetin produced more

than 20% of diglucosyl-ester and more than 50% of monoglucosyl-ester of crocetin; no other

glycosides were detected, even d e r ovemight incubation. The act ivity of GTASEZ, responsible

for the synthesis of monogentiobiosyl- and digentiobiosyl-ester of crocetin, was lost during the

last purification step, preparative IEF, which separated OTASE 1 fiom GTASEZ.

4.3.4 Glucosylating and Deglucosylating Activitia in the Crude Desalted Extract

Bioconversion of encapsulated crocetin by a Crocus sarivus ceil culture produced novel

gIycosides, crocetin di-neapolitanosyl- and neapolitanosyl-gentiobiosyl-esters (Dufiesne er al..

1999). In order to determine whether an enzymatic extract fiom saftion celi suspension cultures

catalyzed the formation of these glycosides the crude desalted and the 300-fold purified

ext racts were incubateci with &on st igmata pigments. The crude desalted extract modified

the composition of safnon pigments and the most important changes occurred d e r only one

hour of incubation (Table IV). There was a 40% increase in peak area of the neapolitanosyl-

gentiobiosyl-ester of crocetin nom 2.5 to 4.2. No crocetin di-neapolitanosyl-ester was

observed. Little further modification was observed after 3 h of incubation. The peak area of

crocet in gentiobiosyl-glucosyl-ester decreased whiie tbat of crocet in gentiobiosyl-ester

increased by an equivalent amount. The &on pigment composition was not rnodifïed by 3

hours of incubation with the 300-fold purified extract.

Table III. Glucosylation proue following 60 min incubation of crude desaited (PD1 O), gel

fltration-purifed and preparative IEF-purified enzyme preparations with 1 .O rnM crocetin and

2.5 mM UDP-Glc. Reaction products have been identified by NMR and mass spectroscopy

(Van Calsteren et al., 1997).

Crocetin and its glycosyl esters (%)

enzymat ic crocetin glucosyla gentb glu-g luc gent-&"

extract

PD10 67 25 2.3 2.1 0.4

GF' 73 22 2 1.2 0.2

IEF 76 22 n-d. 0.8 nad.

b d ' Monoglucosyl. Monogentiobiosyl. ' Diglucosyl. Gentiobiosyl-glucosfi

Gel filtration

n.d. Not detected.

Table IV. Modification of the profile of a &on stigmata pigment extract d e r 1 and 3 hours

of incubation with a crude desalted (PD1 O) extract of Crocus sativus ceil suspensions. Results

are the means of duplicates.

peak areas

Incubation nea-gent' gent-gentb gent-gluc glu-glud gente glucosyl' nocetin

tirne (h)

O 2.5 89 40 1.7 1 1 0.6 0.2

1 2.8 86 7.5 0.2 39 0.7 1.2

3 4.2 83 6.0 0.2 42 0.8 1.8

'Neapolitanosyl-gentiobiosyl ester of crocetin. bDigentiobiosyl ester of crocetin or d crocin. 'Gentiobiosyl-glucosyl ester of crocetin. Diglucosyl ester of crocetin.

f 'Monogentiobiosyl ester of crocetin. Monoglucosyl ester o f crocetin.

4.4 Discussion

The present study is part of a research project aimed at elucidating the pathway leading to the

synthesis of hydrosoluble carotenoids in &on (Crocus sativus). In a previous study, Dufiesne

et al. (1997) showed that enzymatic extracts of d o n calli were able to transfonn dl-tram-

crocetin into its related glucosyl- and gentiobiosyl-esters in the presence of UDP-Glc. They

concluded that the formation of glycosides was deemed to be a step-wise addition of glucose

moieties on the fiee carboxyl functions of crocetin and on the glucosyl fiuictions of crocetin

monoglucosyl- and diglucosyl-esters. Based on dflerences in enzyme kinetics, it was suggested

that two distinct glucosyltransferases were involved in the synthesis of crocin, ie . , GTASE 1

and GTASE2 (Fig. 1). The involvement of two glucosyltransferases in crocin biosynthesis was

supported by the differential activity of the enzymes in safion plant organs. While both

enzymes were constitutive, GTASEl activity was higher in c o r n while GTASE2 was more

active in sprouts.

GTASE 1 was partialiy purified and characterized (Côté et al., submitted). However, the two

putative glucosyltransferases, GTASEl and GTASE2, could not be resolved by gel filtration

cbromatography and, therefore, substrate specificity could not be studied. The purification

method used in this new study is sirnpler and leads to more extensive purification (300-fold)

and higher recovery ( 1 3%). Moreover, the preparative IEF purification step separated

GTASEl fiom GTASES, as evidenced &y the absence of crocetin gentiobiosyl-esters. even

d e r prolonged incubation. The results are evidence that native GTASEI, with a molecular

mass of 50 kD, consists of two subunits of 26 kD (Fig. 3A), in line with o u . previous results

(Côté et al., submitted). Analyticd IEF showed three bands which might be isoforms of

GTASEl (Fig. 3B).

The specificity study demonstrates that, similady to mammalian glucosyltransferases (Beyer et

al., 1 98 1 ), GTASE 1 has strict substrate requirements. Indeed, the 300-fold purified enzyme

preparation used only UDP-Glc as the sugar donor and fded to use UDP-GaL Furthemore,

GTASEI catalyzed the transfer of the glucose moiety only to the fiee carboxyl f ic t ion of

crocet in and to the crocetin monoglucosyl-ester. It fded to glucosylate closely relat ed

substrates such as norbixin, a polyene chah extended by two carbons on each side, with the

first methyi group on carbn y rather than a (Fig. 2). This experiment demonstrates the high

specificity of GTASE 1 for crocetin A callus extract of Vitis vin@ra was also able to catalyze

the glucosylation of crocetin (Dufiesne et al., 1997). GTASEl might be responsible for that

g lucosylating activity, although other glucosyltransferases with a broader specincity spectrum

rnay be involved.

The crude desalted preparation included several glucosyltransferase activities that were

eliminated during purincation. It contained enzymes that could glucosylate crocetin, imns-2-

met hyl-2-pentenoic acid, norbixin, bixir~, h-ans-abscisic acid, pans-retinoic acid, and 1 3-cis-

retînoic acid. To our knowledge, this is the first report of retinoic acid glucosylation. The

glucosyf-ester of abscisic acid has been isolated and quantifieci in Ieaves of Xanthium and

spinach (Boyer and Zeevaart, 1982; Zeevaart, 1983); an enzyme catdyzing the glucosylation of

abscisic acid was purified fiom Macleaya microcarpa celi suspension cultures (Lehmann and

Schütte, 1980). S a o n ceU cultures cataiyze the production of quercetin and isorhamnetin

glucosides (Kokubo et al., 199 1).

The major modification of the profile of Crocus sativus stigmata pigments after incubation with

a crude desalted enzyme extract was a decrease in crocetin gentiobiosyl-glucosyl-ester, with an

equivalent increase in the monogentiobiosyl-ester (Table IV). This might be attni ted to the

hydrolytic activity of a B-glucosidase activity or of an esterase, the former having been detected

in the crude desalted enzyme extract (Côté et al., subrnitted). A reverse activity of the

glucosyltransferase, similar to that shown in parsley ceU cultures (Sutter and Grisebach, 1975),

was precluded because this conversion did not occur with the 300-foId purified safnon enzyme

preparation. The crude desalted extract also contains a glucosyltransferase adding a glucose

mo iety to C2 of a gentiobiosyl-ester group to fom a trisacchary 1 (neapoiitanosy1)-ester group.

Crocet in di-neapoütanosy 1-ester was the major product formed by incubation of &on who le

c e h with exogenous crocetin (Dufieme et al., 1999). This glucosyltransferase was absent in

the 300-fold purined d o n enzyme preparation.

In cornparison with the crude desalted extract, the 300-fold purification elirninated the enzymes

that modified the profle of d o n stigmata pigments. The concentration of crocetin in the

mixture of &on stigmata pigments, a water soluble extract, was too low for cataiytic activity

of GTASE 1 and production of crocetin monoglucosyl-ester.

In conclusion, we have dernonstrated that the glycosylation of crocetin into crocin involves

more than one glucosyltransferase. GTASE 1 catalyzes the glucose transfer on bo th carbxylic

ends of crocetin and GTASE2 catalyzes the formation of glucosidic bonds with formation of

gentiobiosyl esters. These two activities were separateci foliowing preparative IEF. GTASEI,

responsible for the formation of crocetin monoglucosyl and diglucosyl esters. has k e n

c haracterized. Unlüce rnost O ther plant glucosyltransferases, it is highly specific for crocet in and

will not accept substrates that are structurdy closely similar.

4.5 Acknowledgements

We wish to thank B. Stewart for his work on HPLC-MS. The hancial support of F. Côté by a

graduated student feiiowship of the Fonds pour la Formation de Chercheurs et l'Aide à la

Recherche is gratefùlly acknowledged.

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CHAPITRE V

5.1 Conclusion générale

Les glyco syltransférases catalysant la glycosy lation de la fonction hydroxyle de nombreux

métabolites secondaires végétaux ont été très étudiées. Par contre, l'information disponibk sur

la glycosylation enzymatique de la fonction carboxylique est peu abondante. surtout dans le cas

des caroténoïdes.

Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur la biosynthèse des glycosides de la crocétine

ainsi que sur l'hypothèse proposée par Dufiesne et al. (1997), à savoir que la glucosylation de

la crocétine en crocine était catalysée par deux glucosyltransférases distinctes. L'étude s'est

concentrée sur la première glucosyltransférase impliquée dans la glycosylation de la crocétine

en crocine a partir de suspensions cellulaires de &an (Crocus sativus L.), la GTASEI, qui

catalyse le transfert d'un glucose à partir d'üDP-glucose sur les fonctions carboxyüques de la

crocétine.

Les objectifs de cette thèse étaient de purifier, de séparer et de caractériser les

glucosyltransférases impliquées dans la glucosylation de la crocétine en crocine.

Les méthodes de purification par chromatographie d'échange ionique, filtration sur gel, afnnité

a divers Ligands, précipitation et électrophorèse ont été testées. La purification partielle et la

caractérisation d'une des glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de la crocine ont

permis d'estimer la température d'activité optimale, le poids moléculaire, le pl, les valeurs Km

pour la crocétine et I'UDP-glucose ainsi que la valeur Vmax. Ces informations sur cette

enzyme sont originales et ont aidé au développement d'une nouvelle méthode de purification.

L' isoélectro focusing préparatif a permis d'isoler la glucosyltransférase qui agit sur les fonctions

carboxyliques de la crocétine et de la séparer de l'activité favorisant la formation des

gentiobiosyles esters de crocétine. Nos résultats démontrent que la glucosylation de la crocétine

en croche est catalysée par au moins deux glucosyltransférases et une différence au niveau de

leurs points isoélectriques permet la séparation de ces activités. L'étude de la spécificité de

substrat a démontré que l'UDF-glucose:crocéte 8,8'-glucosyltransférase (GTASE 1 ) était

spécifique envers la crocétine comme substrat accepteur et qu'elle utilisait uniquement I'UDP-

glucose et non I'UDP-galactose. Cette enzyme est donc un des rares exemples de

glycosyltransférases végétales hautement spécifiques retrouvées dans la littérature. La

purification et la caractérisation d'une UDP-g1ucose:crocétine 8'8'-glucosyltransférase n'avait

jamais été rapportée jusqu'a maintenant.

La spécificité de I'UDP-glucose:crocétine 8,8'-glucosyltransférase envers la crocétine est un

exemple de plus montrant que certaines glycosyltransférases sont aussi spécifiques que celles

d'origine animale. La crocétine n'est pas une molécule ubiquiste, mais ses glycosides

représentent une partie importante des caroténoïdes des stigmates du safran et des h i t s de

gardénia. Le concept d'une enzyme-un lien s'appiique probablement plus dans ce cas que dans

celui de molécules végétales ubiquistes. Cependant, plusieurs études de spécificités ont été

faites avec des extraits qui pouvaient contenir plusieurs glycosyltransférases capables de

glycosyler le substrat étudié. Certaines glycosyltransférases végétales réputées comme non

spécifiques s'avèreraient probablement spécinques à un lien ou à une molécule uniquement

après une purification plus poussée.

L'extrait enzymatique de suspensions cellulaires de d i a n , partiellement purifié, contient

d'autres activités de glucosyltransférases capable de glucosyler des acides gras à courtes

chaîîes de même que I'acide abscissique et l'acide rétinoïque. A notre connaissance, la

glucosylation de ce dernier composé n'a jamais été rapportée dans des cultures cellulaires

végétaies.

L'extrait enzymatique de suspensions ceilulaires de &?an otne donc un potentiel intéressant

pour l'industrie alimentaire ou pharmaceutique étant donné l'intérêt croissant pour les

caroténoïdes hydrosolubles. Le rôle bénéfique du rétinol (vitamine A) dans la protection contre

le cancer et d'autres maladies est bien connu. La crocétine, par ses propriétés antioxydantes, est

également reconnue comme ayant un effet ant i-cancer. La g lycosy lat ion de ces molécules

permettrait leur ajout dans des préparations aqueuses éliminant ainsi des procédés coûteux de

soIubiiisation et élargissant la gamme de produits dans lesquels elies seraient ajoutées.

Les principaux objectifs de cette thèse ont été rencontrés. L'isolation de 1'UDP:glucose:

crocétine 8.8'-glucosyltransfé~ démontre l'implication de plusieurs enzymes. Sa

caractérisation a permis de pdaire nos connaissances sur la biosynthèse des glycosides de la

crocétine.

La localisation des enzymes impliquées dans la glycosylation de la crocétine constitue une

avenue intéressante pour la poursuite de la recherche. Bien que les propriétés d'antioxydant de

la crocétine et de ses glycosides soient connues, le rôle exact de ces molécules dans le &an

demeure encore obscur. L'activité de glucosylation de la crocétine dans le safian a été détectée

ailleurs que dans les stigmates (Dufiesne et al., 1997), alors que la crocine s'y concentre

principalement. Cette activité de glucosylation de la crocétine est-elle associée a I'UDP-

gluco se:crocét ine 8'8'-glucosyltransférase seulement ou à d'autres glucosy ltrans férases

possédant une spécificité de substrat plus élargie?

Il serait intéressant de poursuivre l'étude de la glycosylation de la crocétine en isolant et en

purifiant l'enzyme qui catalyse l'addition de glucoses sur les glucosyle esters pour former les

gentiobiosyle esters de la crocétine. Le clonage des gènes codant pour ces enzymes ainsi que la

transformation d'un microorganisme ou d'une plante à l'aide de ces gènes permettrait de

produire la crocine en quantité industrielle et de façon rentable.

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