CARIBBEAN FOOD CROPS SOCIETY

46 Forty-six

Annual Meeting 2010

Boca Chica, Dominican Republic Vol. XLVI

PROCEEDINGS

OF THE

46th ANNUAL MEETING

Caribbean Food Crops Society 46th Annual Meeting

July 11 -17 , 2010

Boca Chica, Dominican Republic

"Protected Agriculture: A Technological Option for the Competitiviness of the Caribbean "

Edited by

Wanda I. Lugo and Wilfredo Colon

Published by the Caribbean Food Crops Society

® Caribbean Food Crops Society 2011

ISSN 95-07-0410

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Proceedings of the Caribbean Food Crops Society. 46:111-116. 2010

DETECCIÔN DE FUSARIUM OXYSPORUM F. SP LYCOPERSICIRAZA 3 MEDIANTE PCR EN CULTIVO DE TOMATE (LYCOPERSICUM ESCULENTUM MILL.) EN REPÛBLICA DOMINICANA

Rosa Maria Méndez-Bautista, Daisy Pérez Brito y Juan Tomâs Camejo, Centro de Tecnologias Agricolas (CENTA), Instituto Dominicano de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (IDIAF), Repûblica Dominicana

RESUMEN: El tomate es una de las hortalizas de mayor importancia econômica en la Repûblica Dominicana. Las enfermedades relevantes de distribution mundial, como la marchitez de planta o fusariosis producida por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL), constituyen una limitante en la production y una de las principales causas de pérdidas en las âreas horticola del pais. La fusariosis es una enfermedad de difîcil diagnosis por la variabilidad patogénica del hongo. El diagnôstico preciso es la base para controlar eficientemente el patôgeno. El objetivo del trabajo fue determinar mediante PCR la raza de F. oxysporum présente en el cultivo de tomate. Los anâlisis se realizaron en el Laboratorio de Fitopatologia del CENTA-IDIAF. Se procediô a aislar el hongo a partir de tejido enfermo de plantas de tomate con sintomas de marchitez y pudriciôn de cuello, colectados en la provincia de Azua, mayor productora del cultivo en el pais. Se utilizaron 12 aislados, identificândose taxonômicamente como F. oxysporum. Para determinar la raza del hongo, se realizaron anâlisis moleculares mediante PCR, en los cuales las cepas se evaluaron con iniciadores especificos de FOL, siguiendo el protocolo propuesto por Cai et al. (2003). Los resultados obtenidos mediante la comparaciôn de las bandas de ADN amplificadas a partir de muestras de plantas enfermas, revelan que très de las cepas aisladas corresponden a F. oxysporum f. sp. lycopersici raza 3 (Jarvis y Shoemaker, 2004), fitopatôgeno no reportado en nuestro pais, por lo que este trabajo constituye el primer reporte de este patôgeno para Repûblica Dominicana.

Palabras Claves: diagnôstico molecular, enfermedades, tomate, Lycopersicum esculentum, patôgenos, Fusarium oxysporum

ABSTRACT: Tomato is one of the most economically important vegetables in the Dominican Republic. The global distribution of relevant diseases such as fusarium wilt produced by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) is a limiting factor in production and a major cause of losses in the horticultural areas of the country. Fusarium wilt is a disease difficult to diagnose because of pathogenic variability of the fungus. The accurate diagnosis is the basis to efficiently control the pathogen. The objective of this research was to determine Fusarium oxysporum race present in the tomato crop by PCR. Analyses were performed at the Laboratory of Plant Pathology-IDIAF at CENTA. We proceeded to isolate the fungus from diseased tissue of tomato plants with wilt and collar rot, collected in the province of Azua, which is the major tomato producer in the country. There were 12 isolates identified taxonomically as F. oxysporum. To determine the race of the fungus, molecular analysis was performed by PCR, in which the strains were evaluated using specific primers of FOL, following the protocol proposed by Cai et al. (2003). The results obtained by comparing the DNA bands amplified from samples of diseased plants, reveal that three of the isolates belong to F. oxysporum f. sp. lycopersici race 3 (Jarvis y Shoemaker, 2004), phytopathogen unreported in our country, thus this work is the first report of this pathogen for the Dominican Republic.

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Keywords: molecular diagnostics, diseases, tomato, Lycopersicum esculentum, pathogens, Fusarium oxysporum

INTRODUCTION

El tomate es una de las hortalizas de mayor importancia econômica en la Repûblica Dominicana. En el pais se siembra aproximadamente 10,000 ha/ano. Las principales âreas de producciôn son las provincias de Azua y Peravia. En dicha actividad participan mâs de 4,000 parceleros de la Reforma Agraria y se producen alrededor de 80,000 empleos directos e indirectos en campos e industrias del sur, suroeste, noroeste y norte; y mâs de 500 mil personas son beneficiarios (www, panoramadi ari o. com).

El cultivo es afectado por enfermedades importantes de distribution mundial como las producidas por F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) y las producidas por F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL). La marchitez vascular del tomate conocida como Fusariosis constituye una de las principales causas de pérdidas en âreas horticolas del pais. El FOL es un hongo muy agresivo; se puede encontrar en cultivo de campo abierto y protegido, en regiones de clima câlido, como también en zonas templadas. En caso severo, la marchitez de plantas por F. oxysporum puede reducir los rendimientos del cultivo de tomate en mâs de un 50%.

Figura 1. Plantaciones de tomate afectadas por la fusariosis en condiciones de campo abierto y protegido, en zonas productoras de la Repûblica Dominicana.

Fusarium oxysporum es uno de los patôgenos que aparece con mayor frecuencia causando danos severos en etapa de semillero y al cultivo de tomate. Es mâs severo que los demâs hongos vasculares.

Sintomatologia y Desarrollo de la Enfermedad

En etapa de semillero provoca adelgazamiento a nivel del cuello, marchitez y muerte de plântulas. En plantas adultas se puede observar clorosis y amarillamiento de las nervaduras y hojas inferiores (Figuras 2 a, b y c), achaparramiento, marchitez y necrosis de hojas y tallos jôvenes, desfoliaciôn y desprendimiento de frutos y muerte de la planta. En un corte longitudinal de la base del tallo, se observa en el interior necrosis vasculares que se tornan color café. La presencia de este patôgeno puede destruir el cuello y la raiz de la planta y en consecuencia reduce considerablemente los rendimientos del cultivo.

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Figura 2. Sintomas tipicos de la fusariosis en tomate, estado de plântulas y en plantas desarrolladas.

El hongo sobrevive en el suelo, pénétra en la planta por las raices, causa obstruction de los tejidos vasculares y necrosis de tallo. Produce toxinas que son transportadas a las hojas, las cuales se tornan amarillas y/o anaranjadas. En cultivo con dano en la base del tallo, el agua procedente de las raices no alcanza las hojas superiores, se seca y décolora el tejido interno; las plantas se marchitan y mueren (Agrios, 1997).

El género Fusarium comprende un gran nûmero de especies conocidas desde hace tiempo como importantes patôgenos de plantas (Pietro et al., 2003); por tal razôn es un hongo de difîcil diagnosis por la variabilidad patogénica del mismo. Actualmente estas formas especiales son determinadas por Test de Patogenicidad, técnica laboriosa que requiere de bastante tiempo, lo que dificulta su detection oportuna. En el pais, los estudios de identification racial son escasos. Debido a que las técnicas moleculares son metodologias râpidas y eficaces, el objetivo de este trabajo fue determinar mediante la técnica molecular PCR, la raza de FOL présente en muestras de tomate con sintomas caracteristicos de la marchitez vascular o fusariosis con el fin de contribuir a controlar efectiva y oportunamente esta enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Durante la temporada de verano 2009 se recibieron en la Unidad de Micologia del Laboratorio de Protection Vegetal del IDIAF en el CENTA, plantas de tomate provenientes de plantaciones ubicadas en la Region Sur del pais, con sintomatologia correspondiente a Fusariosis. Estas manifestaciones consistian en marchitez, necrosis y danos en la raiz, asi como también decoloration de tejido interno, caracteristica tipica del hongo F. oxysporum.

Se procediô a aislar el hongo a partir de la zona de avance del tejido enfermo de plantas de tomate con sintomas de marchitez y pudriciôn de cuello, colectados en la provincia de Azua, mayor zona productora del cultivo en el pais. Estos aislados se identificaron taxonômicamente como F. oxysporum. Para confirmar la presencia de la forma especial, se obtuvieron cepas puras del hongo, aislado de las muestras de tomate de Azua, y se incluyeron otras cepas de muestras procedentes de la provincia de San Francisco de Macoris, a las cuales se les extrajo el ADN y posteriormente se realizô la prueba mediante el uso de técnicas moleculares, especificamente PCR.

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Figura 3. Condiciones de las muestras de tomate al llegar al Laboratorio de Micologia para anâlisis.

Caracterizaciôn Fenotipica de los Aislados

La determination de las caracteristicas fenotipicas de los aislados se hizo a base de los criterios taxonômicos de la clave de Barnet (1998) y del Commonwealth Mycologial Institute (CMI, 1972), detallados a continuation: 1. Preparation de medios de cultivo a base de papa, dextrosa, agar (PDA) y 'Carnation-leaf agar'

(CLA ο agar de hojas de clavel), distribuidos en platos de Petri, en los cuales se sembrô tejido enfermo y se incubô a 28° C.

2. Estudio de los caractères culturales (crecimiento de la colonia, color y forma del micelio). 3. Morfologia de estructuras reproductivas (micro y macroconidias, clamidosporas).

Figura 4. Proceso de aislamiento y purification del hongo; aislados del hongo en medio PDA.

La identification de los aislados se hizo utilizando marcadores IGS e iniciadores (primers) CNL12 y CNS1, de acuerdo al protocolo propuesto por Cai et al. (2003); los pasos son los siguientes:

1. Extraction de ADN a partir del micelio del hongo. 2. Amplification por PCR de la region IGS - CNL12 y CNS1 3. Visualization de los resultados y anâlisis del producto amplificado.

Amplificaciôn por la técnica PCR (Reacciôn en Cadena de la Polimerasa)

1. Se utilizaron marcadores IGS; los iniciadores de ADN fueron CNL12 y CNS1, amplificados en un termociclador PTC - 200

2. Secuencias de iniciadores Fwd 5' ggaagtaaaagtcgtaacaagg 3' rev_3' tcctccgcttattgatatgc 5'

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Los productos de la PCR se corrieron en electroforesis en gel de agarosa al 1%, tenido con bromuro de etidio. La visualization del producto se realizô en un transluminador.

RESULTADOS

Identificaciôn de los aislamientos utilizando marcadores IGS, CNL12 y CNS1

Los resultados obtenidos con la técnica de PCR, mediante la cual se hizo la comparaciôn de las bandas de ADN amplificado a partir de muestras de plantas enfermas, revelan que très de los aislados del hongo (MT1, MT2, MT3) se corresponden con F. oxysporum f . sp. lycopersici raza 3 (Jarvis y Shoemaker, 2004). Este fitopatôgeno no ha sido reportado en nuestro pais, por lo que este trabajo constituye el primer reporte de este patôgeno para la Repûblica Dominicana.

1 2 3 4 5 6 MM

Figura 5. Representation de los IGS de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 3. Las lineas 2, 3 y 4 (MT1, MT2 y MT3) son positivas para FOL raza 3. Las lineas 1 y 6 representan los marcadores de 1 Kb.

CONCLUSIONES

Los caractères fenotipicos fueron suficientes para identificar taxonômicamente a F. oxysporum. La secuencia nucleôtida de la region IGS, CNL12 y CNS1 del ADN nuclear permitiô identificar mediante la prueba molecular PCR, la forma especial del hongo.

Los aislados MT1, MT2 y MT3 se corresponden con F. oxysporum f. sp. lycopersici raza 3. Este es el primer reporte de la presencia de dicho patôgeno asociado al cultivo de tomate en la Repûblica Dominicana.

RECOMENDACIONES

Continuar con la identification de las especies razas del género Fusarium en el cultivo de tomate. Aumentar el nûmero de aislados y extender el estudio a otras regiones del pais. Establecer una metodologia que permita realizar un diagnôstico diferencial entre las especies y razas de Fusarium.

AGRADECIMIENTOS

Al equipo de Biologia Molecular PV - CENT A, y al Grupo GemBio del CICY, México.

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REFERENCIAS

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Castano, J. 1994. Principios bâsicos de fitopatologia. 2 ED., Escuela Agricola Panamericana, El Zamorano Honduras, 193 pp.

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FAO (Organization de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentation, IT). 1985. Manual para patôlogos vegetales. Santiago, Chile. 438 pp.

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