FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE. GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE.
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FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE
GENERAZIONE DI MUTANTI
MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE
MUTAGENESI CHIMICA può essere condotta direttamente sui semi.
MUTAGENI
chimici
radiazioni
esteri dell’acido etilmetansulfonico (EMS)
caffeina, nicotina
UV, raggi X radiazioni
EMS alchila le G la G alchilata si appaia con T invece che con C
Agenti alchilanti
MUTAGENESI PER INSERZIONE: TRASPOSONI , T-DNA
Vengono utilizzati semi maturi, con gli embrioni completamente sviluppati.
Si trattano i semi con il mutageno
Mutazioni a carico di una cellula producono una linea clonale di cellule mutate, durante il successivo sviluppo post-embrionale con il conseguente sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. (M1)
Solo se i settori mutati includono lo strato L2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno (autofecondazione) il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante.
MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI
confronto tra mutagenesi chimica e mutagenesi per inserzione
MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE
IL GENE VIENE “ETICHETTATO”
(GENE TAGGING), PERMETTEDONE
UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE
Strategia di isolamento di mutanti
• Analisi dei mutanti Kan resistenti• Propagazione delle piante
T2Analisi in vitro delle plantuleKan resistenti
Ks
KrRaccolta semi T2
Autoimpollinazione
Selezione in serradei trasformanti T1
Raccolta semi T1Trasformazione con
T-DNA
T0
T-DNAgene x gene x
Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito
PCR inversa
primers
T-DNA o DS
Digestione con EcoRI
Recupero del plasmide
GENE
EcoRIEcoRI
RB LBOri KanR
T-DNA
EcoRI
RB LBpBR322 KanR
EcoRI
T-DNA
RB LBpBR322 KanR
EcoRI
T-DNA
EcoRI
Su terreno selettivo contenente Kanamicina cresceranno solo le colonie che hanno
acquisito il plasmide
Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo
Ligazione
Trasformazione E. coli
Recupero del plasmide
Mutanti MONOPTEROS (MP)
•La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la regione apicale
•Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni sono disorganizzati
•Embrioni dI mutanti mp non formano il procambio nella parte basale dell’embrione globulare, la regione che dà luogo all’ipocotile e alla radice
I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE
STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS
I mutanti bodenlos e AXR6 hanno un fenotipo simile a monopteros
Funzione del gene MONOPTEROS
(formazione della radice embrionale)
il meristema radicale (cq, columella)in Arabidopsis origina da una singola cellula: l’ipofisi
L’ipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede l’espressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD)
I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula extraembrionale che si differenzierà in ipofisi
MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta all’auxina
MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF5) regolatori positividella risposta a IAA
BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA12) regolatori negativi della risposta all’auxina
Destino differenziativodelle due cellule del’embrionebicellulare
cellula basale
cellula apicale
Il meristema apicale della radice ha un’origine mista
Regolazione dell’espressione genica da parte dell’auxina
Geni di risposta primaria (geni precoci):
l’espressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti (non è necessaria sintesi proteica)(oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti)
Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano l’espressione dei
Geni di risposta secondaria (geni tardivi)
(Per l’espressione di tali geni e quindi per la risposta è necessaria nuova sintesi proteica)
5 classi principali di geni precoci la cui trascrizione è indotta da IAA
1. Proteine AUX/IAA
2. Proteine SAUR3. Proteine GH3
4. Glutatione S-trasferasi5. ACC sintasi
Le proteine AUX/IAA
auxin response factors: ARFauxin responsive elements: TGTCTC
Regolazione dell’ espressione genica da parte dell’auxina
IAA signaling: regolato dalla via del proteosoma /ubiquitina
Via del proteosoma/ubiquitina
E1 enzima attivante l’ubiquitina
E2 enzima coniugante l’ubiquitina
E3 enzima legante l’ubiquitina
IAA: induce la trascrizione dei geni precoci promuovendo la degradazione di repressori AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA
consentendo la formazione di dimeri ARF attivi
Feedback negativo: tra i geni precoci indotti da IAA ci sono le proteine AUX/IAA
TIR1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale)
E3: 4 subunità = Cullin1/Cdc53 Skp/ASK1 Rbx1/ROC1/Hrt1 F-box
Mutante TIR-1
In Arabidopsis:
23 ARF
28 AUX IAA
La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizionedi geni indotti da IAA
Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale
Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazionedelle proteine AUX IAA (proteosoma)
Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma
BODENLOS (IAA12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp
Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA12) (repressore della risposta all’auxina)
La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma eindotta dall’auxina che è necessaria per la risposta differenziativa
I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dell’ipofisi sebbene le proteinevengano espresse nelle cellule superiori adiacenti
Meccanismo non-cell autonomous
Cell to cell signaling
Modello per la formazione della radice embrionale:
L’auxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento
Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN1 nelle cellule adiacenti del proembrione
L’auxina è il segnale generato dall’interazione MP/BD
PIN1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD
TGTCTC GUS (or GFP)
The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin
response-level.
DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element
(AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription
factors (ARFs).
AuxRE
Hours of staining
Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA)
Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971.
Gene reporter
MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous
AUXINA (segnale primario nelle cellule adiacenti l’ipofisi)
Rilascio di un segnale secondario nell’ipofisi
AUXINA? (trattamenti con 2,4 D di bdl inefficaci)
fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros)
espressi nellle stesse cellule di MP e BDL:
TOM3 migra nell’ipofisi
MUTANTI AXR6
mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl
AXR6 codifica per CULLIN 1 del complesso E3
Mutanti GNOM
• Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni
• I difetti nell’embrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono per tutta l’embriogenesi
• I mutanti più estremi sono sferici• abolita completamente la polarità assiale
GNOM necessario per la determinazione della polarità assiale
WT
gnom
SVILUPPO DEL MUTANTE gnom
Il fenotipo dei mutanti gnom è simile
a quello dei doppi mutanti mpbdl
Ridotta capacità di risposta all’auxina?
In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può esserefenocopiato con inibitori del trasporto di auxina
Funzione del gene GNOM
GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole proteine G della classe ARF (ARF-GEF)
Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazionedel trafficking intracellulare delle vescicole
In Arabidopsis GNOM (EMB30) controlla la localizzazione del carrier per l’auxina PIN1durante l’embriogenesi
Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dell’auxina nell’embrione
Complessi GEF-ARF
ADP ribosilazione
Formazione di vescicole nel TGN
ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole
Modello per il trafficking di proteineIn Arabidospis
I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA
(proteine PIN)
PIN1
TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN
The PIN proteins are named for the pin-formed mutant
pin-formed, which has a mutation in the PIN1 gene,
makes some abnormal leaves and then a bare inflorescence.
Galweiler, L., Guan, C., Muller, A., Wisman, E., Mendgen, K., Yephremov, A., and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.
PIN auxin efflux carriers are encoded by a large gene family with cell-specific expression patterns
Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.
PIN
PIN proteins orient asymmetrically in plant cells
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119:
71-84.
PIN1 localizes to the lower
surface of root cortex cells
Root Apex
Root Base
PIN1 is responsible for auxin flow from shoot apex to
root apex.
PIN proteins orient differently
PIN2 localizes to the lower surface of root cortex cells and the upper surface of
epidermal cells.
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119:
71-84.
PIN2 is functions primarily in the redistribution of
auxin during root gravitropism
The distribution of PIN proteins contributes to the auxin gradients
Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.
PIN protein distributions contribute to auxin-mediated patterns
Reproduced with permission from Petrášek, J., and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136: 2675-2688.
Amongst other things, they specify the location of auxin
maxima necessary for embryonic patterning.
PIN proteins can move very dynamically within cells and tissues
Unlike the more stably-oriented ABCB proteins, PIN proteins can rapidly change their positions within cells.
Reprinted from Heisler, M.G., et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899–1911, with permission from Elsevier.
PIN proteins cycle between plasma membrane and endosome
PIN proteins continually cycle between the plasma membrane and endosomal compartments.
endosome
Plasma membrane
Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.
Brefeldin A blocks endocytosis and traps PIN proteins
Brefeldin A (BFA) prevents endosomes from fusing with the plasma membrane, trapping
PIN in the endosomal compartments.
Control BFA treatment
Redrawn and reprinted from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.
The phosphorylation state of PINs affects their distribution
PIN proteins are phosphorylated by the protein kinase PINOID (PID)
and dephosphorylated by the protein phosphatase PP2A.
P P PP2A
PID
PPPP
Sukumar, P., Edwards, K.S., Rahman, A., DeLong, A., and Muday, G.K. (2009). PINOID kinase regulates root gravitropism through modulation of PIN2-dependent basipetal auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiol. 150: 722-735. Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by
PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.
Control Staurosporine treated
Staurosporine inhibits protein
kinases
ABCB proteins may stabilize PIN proteins within membrane domains
Titapiwatanakun, B., and Murphy, A.S. (2009) Post-transcriptional regulation of auxin transport proteins: cellular trafficking, protein phosphorylation, protein maturation, ubiquitination, and membrane composition. J. Exp. Bot. 2009 60: 1093-1107, by permission of the Society for Expiremental Biology.
ABCB19 Plasma Membrane
protein
Orange = overlap
The ABCB proteins seem to stay in the plasma membrane, unlike the PIN proteins. An interaction between the two transporters may
contribute to stabilizing PINs.
LOCALIZZAZIONE DI PIN1 e PIN7
Stadio precoce
Stadio globulare
IAA
IAA
Localizzazione di PIN1 e PIN7nello stadio precoce globulare e correlazione con la concentrazione di auxina
Localizzazione dell’auxina nel mutante gnom
Mutanti GURKE
Plantule omozigoti gurke sono prive dei cotiledoni mentre rimangono l’ipocotile e la radice
Le plantule assomigliano a dei piccoli cetrioli (gurke)
(pasticcino3)
Funzione del gene GURKE
Il gene GURKE codifica per la acetil-CoA carbossilasi 1 (citosolica)
I mutanti gurke possono essere complementati dall’aggiunta di malonato
Complementazione della mutazione acc1 (gurke like) con malonato
embrioni immaturi di arabidopsis espiantati dalla siliqua e coltivati in vitro
3 mM malonato
Sviluppo di embrioni del mutante pasticcino3 (gurke like) durante la germinazione
complementazione da malonato
1mM malonato
ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO2
2 forme: citosolica (omodimerica): allungamento acidi grassi >20C plastidiale (eteromerica): sintesi acidi grassi
Biosintesi degli acidi grassi
malonilCoA sintetasi
malonato + CoA
malonilCoA
I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi
La ACC1 (citosol) serve alla biosintesi degli acidi grassi a lunghissima catena (VLCFA =>20)
Contenuto di acidi grassi di semi di arabidopsis WT e mutanti
Le mutazioni acc1-1; acc1-2; gurke; pas3 sono alleliche
I mutanti hanno un accumulo ridotto di VLCFA nei semi
Nei mammiferi è stato visto che gli sfingolipidi
interagiscono col colesterolo per formare domini raft-
like ed hanno un ruolo nella regolazione della
divisione cellulare
LIPID RAFTS:microdomini di membrana ricchi di colesterolo
Dal 1972 (modello del mosaico fluido) si riteneva che fosfolipidi e proteinefossero simmetricamente distribuiti nelle membrane cellulari
Nel 1988 K Simons (EMBL) e G van Meer (Utrecth) ipotizzarono l’esistenza di microdomini arricchiti in colesterolo, glicolipidi e sfingolipidi
Alcune proteine associate a processi di signaling sembrano localizzarsi preferenzialmente nei lipid rafts
doubly-acylated tyrosine kinases of the Src family
ACILAZIONE
Alcune di queste proteine si associano ai LR solo quando sono nello stato attivato B cell receptors (BCRs), T cell receptors (TCRs)
Mutanti FACKEL:
Le mutazioni nel gene FACKEL determinano la delezione della parte centraledel’asse apicale-basale
Mutanti fackel hanno i cotiledoni uniti direttamente alla radice
Funzione del gene FACKEL (FK):
Codifica per una sterolo C-14 reduttasi
biosintesi degli steroliIn arabidopsis
i livelli di sitosterolocampestrolo, stigmasteroloe brassinolide sono ridottinei mutanti fk
0 10 50 100 mg/ml fenpropimorph
mutante fk
Le mutazioni fk possono essere fenocopiate
dal fenpropimorph, un inibitore della C-14 reduttasi
Mutazioni fk non sono complementate dall’aggiunta di brassinolidi
gli steroli ( CH, ER, ST,) che si accumulano nei mutanti fk responsabili degli effetti?
trattamenti con CH, ER, ST dovrebbero FENOCOPIARE i mutanti fk
Non hanno difetti embrionali pur avendo livelli ridotti di steroli
Mutanti BR sono complementati da BRs Mutanti fackel no
STEROLI
Componenti della membrana cellulare influenzano permeabilità e fluidità della membrana e l’attività di proteine
animali: colesterolopiante: sitosterolo, campestrolo
Precursori degli ormoni steroidei
animali: androgeni, estrogeni, glucocorticoidi
piante: brassinosteroidi
STEROLI ANIMALI
Essenziali per lo sviluppo embrionale
COLESTEROLO
Negli animali evidenze che sia coinvolto in vie di trasduzione del
segnale che controllano la formazione del pattern (Hedgehog (Hh)
transduction pathway: proteine Hh secrete , modificate da colesterolo
promuovono interazioni con altre proteine per la trascrizione dei geni
delle cicline E e D)
Nelle piante PHABULOSA (PHB) è un fattore di trascrizione Leucin –Zipper Homeodomain possiede un domain di binding per steroli/lipidi. E’ implicato nelcontrollo della formazione del pattern radiale nel germoglio
NELLE PIANTE GLI STEROLI POSSONO AVERE UN RUOLO NELL’EMBRIOGENESI?