FOMENTO Y OPERACIÓN DEL SUBSISTEMA DE … · ... sobre el enraizamiento In vitro de ......

INSTITUTO TECNOLÓGICO

Superior de Apatzingán

RESIDENCIAS PROFESIONALES

“Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del Centro Nacional de Recursos Genéticos del INIFAP”

José Antonio Ramírez Sánchez

Ingeniería Bioquímica

Dra. Esmeralda Judith Cruz Gutiérrez

Biol. María Elisa Villaseñor Zamorano

Apatzingán Michoacán; Diciembre del 2015

NOMBRE DE LA CARRERA

PROYECTO

ALUMNO

ASESOR EXTERNO

CENTRO NACIONAL DE RECURSOS GENÉTICOS

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES

FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS

ASESOR INTERNO

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Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del Centro Nacional de Recursos Genéticos del INIFAP

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1

1.1 Megadiversidad ............................................................................................................. 1

1.2 Erosión genética ............................................................................................................. 3

1.3 Conservación de recursos fitogenéticos. ....................................................................... 3

1.4 Subsistema de Recursos Genéticos Forestales (REGEFOR) ........................................... 4

1.5 Especie de importancia para el subsistema REGEFOR: Terminalia amazonia .............. 6

2. JUSTIFICACIÓN....................................................................................................................... 7

3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 8

3.1 Objetivo general............................................................................................................. 8

3.2 Objetivos específicos ..................................................................................................... 8

4. PROBLEMAS A RESOLVER ...................................................................................................... 9

5. METODOLOGÍA .................................................................................................................... 10

5.1 Recepción ..................................................................................................................... 10

5.2 Análisis de pureza ........................................................................................................ 11

5.3 Evaluación de la integridad física con el equipo de Rayos X ............................................ 11

5.4 Análisis de crecimiento fúngico y extracción de alas y testa. .......................................... 11

5.5 Desinfección superficial y establecimiento in vitro. ......................................................... 12

5.6 Enraizamiento in vitro ...................................................................................................... 14

5.7 Fase de aclimatación ........................................................................................................ 15

6. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS ............................................................... 15

7. RESULTADOS ....................................................................................................................... 18

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7.1 Desinfección superficial y establecimiento In vitro. .................................................... 18

7.2 Enraizamiento. ............................................................................................................. 20

7.3 Aclimatación. ............................................................................................................... 22

8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................................................. 23

9. COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS. ........................................................... 24

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES ...................................................................... 25

ANEXOS ....................................................................................................................................... 31

LISTA DE CUADROS ...................................................................................................................... iiii

LISTA DE DIAGRAMAS ................................................................................................................. ivv

LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... ivv

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Riqueza de especies para distintos grupos taxonómicos en México ....................... 22

Cuadro 2. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y

germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. ............................ 19

Cuadro 3. Germinación y contaminación de semillas de T. amazonia introducidas al cultivo In

vitro. ........................................................................................................................................... 20


germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. ............................ 21

Cuadro 5. Efecto de concentraciones de sales en el medio de cultivo, sobre el enraizamiento

In vitro de brotes de T. amazonia. ............................................................................................ 22

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LISTA DE DIAGRAMAS

Diagrama 1. Diagrama de flujo para el desarrollo de un protocolo de establecimiento,

multiplicación y aclimatación de especies forestales In vitro. .................................................. 10

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Contaminación y germinación in vitro. ....................................................................... 31

Tabla 2. Número de raíces y longitud promedio de tratamientos para enraizamiento in vitro. 31

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1. INTRODUCCIÓN

1.1 Megadiversidad

México es un País Megadiverso, considerado entre los 17 Países con esa categoría, ocupa el

4° lugar mundial en biodiversidad, con un 10% del total de especies vivientes registradas en

la actualidad. Lo anterior, no solo es motivo de orgullo Nacional, sino que también significa

una grave responsabilidad, de cara al acelerado proceso de erosión genética que se ha

experimentado a nivel global. El nivel de esta responsabilidad se magnifica si consideramos el

hecho de que México es lugar de origen de géneros y especies animales y vegetales de

importancia económica, social, ambiental y cultural (INIFAP, 2012).

Su territorio alberga fauna y flora de dos regiones biogeográficas (neoártica y neotropical). Es

un país tropical montañoso con un elevado número de endemismos, y presenta ambientes

marinos templados en el Pacífico y tropicales en el Golfo de México y Caribe, lo cual significa

que nuestro territorio es privilegiado en cuanto a la variedad de ecosistemas y variación

genética en las especies. Asimismo, el país concentra entre 10 y 15% de las especies

terrestres en sólo 1.3% de la superficie ambiental. México ocupa el segundo lugar mundial en

cuanto al número de especies de reptiles, el cuarto lugar en anfibios, el segundo lugar en

mamíferos, el undécimo en aves y posiblemente el cuarto lugar en angiospermas (plantas

con flores). Además de ser una de las mayores del mundo, la biodiversidad de México cobra

también importancia mundial, ya que muchas de las plantas cultivadas por el hombre son de

origen mexicano (Plascencia et al., 2011).

La diversidad mexicana se resume en el Cuadro 1.

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Cuadro 1. Riqueza de especies para distintos grupos taxonómicos en México

Fuente: SEMARNAT, 2005.

Grupo taxonómico Número de Especies

Invertebrados

Artrópodos 85,740

Crustáceos 4,600

Insectos 77,900

Arácnidos 3,240

Subtotal 171,480

Vertebrados

Peces 2,122

Anfibios 361

Reptiles 804

Aves 1,250

Mamíferos 478

Subtotal 5,015

Plantas

Angiospermas 22,351

Gimnospermas 145

Pteridofitas 1,026

Briofitas (musgos y hepáticas) 1,480

Algas (macroalgas) 945

Subtotal 25,947

Hongos 6,000 – 120,000

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1.2 Erosión genética

El término “erosión genética”, en ocasiones, se utiliza en un sentido estricto, es decir, para

hacer referencia a la pérdida de genes o alelos. También se usa en un sentido más amplio,

para referirse a la pérdida de variedades. De este modo, mientras que la erosión genética no

implica necesariamente la extinción de una especie ni de una subpoblación, sí representa

una pérdida de variabilidad y, por lo tanto, una pérdida de flexibilidad (FAO, 2011).

De acuerdo con el plan de acción del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos para

las Especies Subvaloradas y Subutilizadas (ETSS), se requiere un esfuerzo global que permita

la revalorización y detenga la pérdida de estos recursos, con acciones concretas como

recabar y compartir información, definir prioridades de atención, promover la producción y

el uso, mantener la diversidad, acompañar la cadena de valor, fortalecer vinculaciones y

capacidades, desarrollar políticas efectivas y mejorar la conciencia en la población (IPGRI,

2002).

1.3 Conservación de recursos fitogenéticos.

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), define a

los Recursos Fitogenéticos como: Cualquier material de origen vegetal, incluido el material

reproductivo y de propagación vegetativa que contiene unidades funcionales de la herencia,

y que tiene valor real o potencial para la alimentación y la agricultura. Abarca también

aquellas plantas que tienen valor real o potencial por sus propiedades medicinales, que son

de importancia para la industria forestal (recursos genéticos forestales), o que son

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empleados como especias, hortalizas, para usos artesanales, fabricación de muebles o como

plantas ornamentales (Maselli, 2013).

Los recursos fitogenéticos son la base de la subsistencia de la humanidad. Suplen las

necesidades básicas y ayudan a resolver problemas como la pobreza y el hambre. Debido a

su sobre explotación estos recursos se han ido agotando. Dada su vital importancia es

necesario conservarlos para beneficio de las generaciones futuras y presentes.

Los recursos fitogenéticos se pueden conservar dentro o fuera de su hábitat natural, o

combinando ambas alternativas. Fuera de su hábitat natural, los recursos fitogenéticos se

conservan en bancos y colecciones de germoplasma (Jaramillo et al., 2000).

1.4 Subsistema de Recursos Genéticos Forestales (REGEFOR)

En México el Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG) resguarda recursos genéticos

agrícolas, forestales, pecuarios, acuáticos y microbianos. Cuenta con un banco de

germoplasma de semillas ortodoxas que resguarda 24100 accesiones de especies agrícolas y

forestales, mientras que el Banco de Tejidos Propagados in vitro cuenta con 390 accesiones y

9500 unidades de germoplasma. Asimismo, se resguardan 8200 muestras de ADN en el

Laboratorio de Genómicas, se conservan en el Área de Criogenia, 23600 unidades de

germoplasma pecuario y acuático y de la misma manera se resguardan 2000 cepas

microbianas de interés agrícola (INIFAP, 2012).

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Al mismo tiempo la Comisión Nacional Forestal (CONAFOR) cuyo objetivo es desarrollar,

favorecer e impulsar las actividades productivas, de conservación y restauración en materia

forestal, así como participar en la formulación de los planes, programas, y en la aplicación de

la política de desarrollo forestal sustentable, produce y distribuye semilla y material

vegetativo de procedencia conocida para la producción de planta de calidad y para el

programa de reforestación, además de fomentar la conservación, tanto in situ como ex

situ de los recursos genéticos forestales.

Ambas instituciones (CNRG y CONAFOR) implementaron el subsistema de Recursos

Genéticos Forestales con el objetivo de realizar protocolos de establecimiento,

multiplicación y aclimatación de 39 especies forestales (19 coníferas y 20 latifoliadas), a

partir de material vegetativo y semillas obtenidas de árboles plus con mayor diversidad

genética representantes de cada especie dentro del cual se está realizando la multiplicación

masiva mediante diferentes técnicas con el fin de obtener clones que mantengan su

integridad genética para la reforestación en los diferentes estados de la Republica.

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1.5 Especie de importancia para el subsistema REGEFOR: Terminalia amazonia

Entre las especies forestales nativas de México, Terminalia amazonia (Gmel.) Excell

(sombrerete, tepesuchil, amarillón, guayabo volador,) ha generado mucho interés por su

gran potencial de rápido crecimiento, adaptabilidad a condiciones difíciles, como colinas y

planicies costeras, suelos rojos o amarillos, lateríticos profundos, derivados de materiales

aluviales o ígneos, características que la convierten en una especie clave para los programas

de reforestación (Russo y Speranza, 2001). En México esta especie está restringida a la

vertiente del golfo, desde el centro de Veracruz y norte de Oaxaca, al sur de la sierra, hasta

el norte de Chiapas y la selva lacandona, así como en la región de los Chimalapas. Es una de

las especies dominantes de la selva alta perennifolia. Su madera se emplea localmente para

construcciones pesadas como puentes o vigas de casas (Pennington y Sarukhán, 2005). A

pesar de que esta especie produce semilla sexual, presenta algunos inconvenientes como

baja existencia de árboles semilleros, bajo porcentaje de germinación, largo periodo de

germinación y semilla vana (Montero y Kanninen, 2005); en viveros la germinación comienza

a los 20 días después de la siembra y se prolonga hasta los 55 días, obteniendo hasta un 14%

de germinación, aplicando el tratamiento pregerminativo de sumersión de las semillas

durante 24 horas en agua (Escuela Nacional de Ciencias Forestales, 2003).

Como el éxito de las plantaciones forestales radica en la producción de maderas de

excelente calidad y al igual que toda actividad agrícola, la siembra de material genético

sobresaliente es el factor más decisivo en los resultados finales del proceso. Por lo tanto, la

tendencia de la forestería moderna está dirigida hacia la siembra y cultivo de especímenes

de alto rendimiento adaptados a ambientes específicos que permitan obtener los mayores

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rendimientos. La aplicación de técnicas biotecnológicas en este campo ha favorecido la

producción masiva y el establecimiento de plantaciones de algunas especies forestales

(Suárez, 2006).

La micropropagación, utilizando material seminal como punto de partida, permite la

producción de plantas con características genéticas similares (pero no idénticas) a la planta

que les dio origen, contribuyendo así a que se mantenga la variación genética necesaria para

la biodiversidad. Siendo además la micropropagación in vitro una de las técnicas más

factibles de utilizar a corto plazo en el sector forestal pues permite un rápido aumento en el

número de plantas, la producción de plántulas durante todo el año y la obtención de plantas

con elevada calidad sanitaria (Scherer, 2006).

2. JUSTIFICACIÓN

Los recursos genéticos son un patrimonio invaluable para los países que los poseen,

pues constituyen la base biológica de sus actividades económicas como la agricultura

y producción forestal. La pérdida de ellos tendría grandes implicaciones para el

desarrollo económico, social y cultural de un país.

Mantener la biodiversidad disponible para futuras generaciones, es de vital

importancia debido al desgaste del planeta y lo es más en cuestiones de recursos

forestales, debido a que estos tardan mayor tiempo en alcanzar el nivel fisiológico de

madurez.

Colaboración en la producción, protección y restauración de los recursos forestales

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3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Realizar un protocolo de establecimiento, multiplicación y aclimatación de la especie forestal

Terminalia amazonia a partir de material vegetativo y semillas obtenidas de árboles plus

representantes de la especie, realizando la multiplicación masiva mediante diferentes

técnicas con el fin de obtener clones que mantengan su integridad genética para la

reforestación en los diferentes estados de la Republica.

3.2 Objetivos específicos

Realizar protocolos de establecimiento, multiplicación y aclimatación de la especie

Terminalia amazonia.

Determinar el método apropiado para la desinfección y el establecimiento de la

especie T. amazonia proveniente de material seminal y de material vegetativo.

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4. PROBLEMAS A RESOLVER

4.1 Contaminación en la micropropagación: Uno de los problemas principales en la

generación de protocolos de establecimiento in vitro es la contaminación del medio de

cultivo destinado al desarrollo de los tejidos vegetales. Es por esto que se debe

determinar el método adecuado para la desinfección, seleccionando los desinfectantes,

el tiempo de desinfección según las características de la especie a tratar.

4.2 Enraizamiento del tejido vegetal: La micropropagación es uno de los métodos más

eficientes para la producción masiva de especies vegetales, sin embargo el desarrollo del

tejido radical in vitro de algunas de las especies es muy escaso o nulo (tal es el caso de las

coníferas), es por ello que se deben realizar pruebas para seleccionar adecuadamente los

medios de cultivo, sus concentraciones y complementar si fuera necesario con

fitohormonas.

4.3 Aclimatación de los explantes. Los explantes desarrollados en condiciones in vitro son

muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el

proceso dependerá de la aclimatación. Es necesario formular un protocolo a seguir para

la aclimatación y desarrollo ex vitro de los explantes.

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5. METODOLOGÍA

Diagrama 1. Diagrama de flujo para el desarrollo de un protocolo de establecimiento,

multiplicación y aclimatación in vitro de especies forestales.

5.1 Recepción

La recepción son las actividades relacionadas con la llegada y entrada de las accesiones de

semilla al Laboratorio Agrícola Forestal Sección Semillas Ortodoxas. El registro es la

asignación de un número de identificación único llamado número de accesión que permite

ubicar cada muestra de semilla recibida en un banco de germoplasma y distinguirla de las

demás (Rao et al., 2007).

.

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5.2 Análisis de pureza

En el análisis de pureza; se determina el porcentaje de semilla pura (sin daños físicos),

porcentaje de material inerte y el porcentaje de otras semillas en la muestra. Para ello, se

pesó y registró la muestra total, se separó la semilla pura de la materia inerte (semillas

dañadas físicamente, cortadas, picadas, quebradas y residuos de cascarillas), se registraron y

pesaron ambas muestras. Una vez pesadas, la materia inerte se desechó y la semilla pura se

almacenó para sus análisis posteriores (Rao et al., 2007).

5.3 Evaluación de la integridad física con el equipo de Rayos X

Las semillas se sometieron a un análisis de integridad física mediante rayos X. Se colocaron

de 30 piezas en la cámara de rayos X; la integridad se evaluó mediante las imágenes

obtenidas, las cuales se observaron en la pantalla de una computadora y se clasificaron entre

semillas llenas, semillas vacías, semillas dañadas físicamente y semillas dañadas por insecto.

Al final se seleccionaron solo las semillas llenas y se desecharon las vacías (ISTA, 2014).

5.4 Análisis de crecimiento fúngico y extracción de alas y testa.

Se eligieron 20 semillas al azar y se visualizaron bajo un estereoscopio cortes internos y

externos para analizar el porcentaje del posible crecimiento de hongos, y así seleccionar el

mejor pretratamiento de desinfección. Una vez determinado un alto porcentaje de

crecimiento fúngico (80%) en las muestras se optó por retirar ala y testa componentes de la

semilla de Terminalia amazonia, para así reducir su carga microbiana.

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5.5 Desinfección superficial y establecimiento in vitro.

Para determinar el mejor método de desinfección superficial, se evaluó el efecto de un

tratamiento control absoluto consistente de un enjuague con agitación constante de

detergente Útil® a una concentración de 5 g L-1 en agua bidestilada estéril por 10 minutos,

seguido de una inmersión con agitación constante en el fungicida selectivo comercial

Amistar® a una concentración de 3 g L-1 suplementados con 5 gotas de Tween 20® L-1.

Posteriormente se evaluó el efecto en la germinación y contaminación a dos tiempos (15 y 24

días) en 20 repeticiones y ocho tratamientos de desinfección, el control de contaminación y

un control de germinación el cual se llevó a cabo colocando la semilla en cajas Petri de

plástico con papel absorbente humedecido con agua bidestilada a razón de 5 semillas por

caja. La exposición de las semillas con los reactivos fue en constante agitación y en

condiciones asépticas en el interior de una cámara de flujo laminar, después de la utilización

de cada reactivo se realizaron dos enjuagues con agua bidestilada estéril. Los tratamientos de

desinfestación utilizados se muestran a continuación.

Tratamiento 1.

a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L-1 durante 20

minutos.

b) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.

Tratamiento 2.


minutos.


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Tratamiento 3.


minutos.

Tratamiento 4.


minutos.


Tratamiento 5.


minutos.


Tratamiento 6.

a) a) Inmersión en NaClO al 25% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L-1 durante 20

minutos.

Tratamiento 7.

a) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.

Tratamiento 8.

a) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.

El material seminal tratado fue establecido en medio de cultivo descrito por Lloyd y McCown,

(WPM) (1980) al 100 % de fuerza iónica, complementados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L-1

de Plant Preservative Mixture (PPM)TM (Plant Cell Technology, Washington DC, USA), 1 g L-1

de Polivinil Pirrolidona (PVP)TM (Sigma, St. Louis, MO, USA) y solidificados con 7.5 g L-1 de

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AgarTM. El pH de los medios se ajustó a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121˚ C, 18

psi, durante 15 min). Cada semilla fue establecida en tubos de vidrio de 40 mL de capacidad

conteniendo aproximadamente 5 mL de medio de cultivo a razón de una por tubo;

posteriormente los tubos fueron cubiertos con tapas de plástico, sellados con Parafilm®, su

rango de temperatura ideal está entre los 21 a 24 °C (Torres, G., Luján, R y Barca, S. A. 2002)

es por ello que fueron almacenados a una temperatura de 24°C ± 1 con una intensidad

lumínica de 40 µmol m-2 s-1 por un período de 16 horas diarias suministrada con lámparas de

luz blanca fluorescente.

5.6 Enraizamiento in vitro

Una vez germinado y evaluado el material seminal, los explantes fueron transferidos a

condiciones ambientales similares pero en un medio control absoluto WPM y tres diferentes

porcentajes de fuerza iónica (100%, 50% y 25%) adicionados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L-

1 PPMTM, 1 g L-1 de PVPTM y solidificados con 7.5 g L-1 de AgarTM. El pH de los medios se ajustó

a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121 C, 18 psi, durante 15 min). Los tratamientos

fueron distribuidos utilizando un diseño completamente al azar y después de tres semanas

de cultivo, se registró el número de explantes que produjeron raíces y el número promedio

de raíces producidas por cada explante.

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5.7 Fase de aclimatación

Después de ser evaluada la etapa de enraizamiento, las plantas enraizadas fueron

trasladadas hacia una cámara de aclimatación, donde se destaparon los frascos y se removió

el agar de las raíces con agua corriente. Las plántulas fueron transferidas al azar a charolas de

germinación de plástico con 48 compartimentos, conteniendo cada compartimento 30 g de

sustrato estéril y húmedo compuesto de una mezcla de tres partes de peat moss, una parte

de agrolita y una parte de vermiculita. Cada plántula trasplantada, se cubrió con un frasco de

plástico (10 cm3) transparente para después almacenarse en la cámara a una temperatura

de 26°C ± 1 y una humedad relativa del 70 % y a los siete días se removió el frasco. La

aclimatación, se evaluó en el porcentaje de supervivencia y el desarrollo de las plantas.

6. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS

Análisis de Pureza: Se realizó el análisis de pureza en las especies Terminalia amazonia y

Pseudotsuga menziesii. En este paso, se pesa la muestra inicial o accesión, con la ayuda de un

diafanoscopio se separan en semilla pura, material inerte y otras semillas. Se registraron los

resultados en formatos propios del CNRG.

Evaluación de la integridad física mediante rayos X: Se usó un equipo de rayos X Faxitron®

con la siguiente configuración; tiempo: 300 s; kV: 20. La mayoría de las semillas de las

especies forestales tuvieron un tamaño medio y se colocaron en la tercera rejilla de la

cámara de rayos X.

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Elaboración y esterilización de medio de cultivo Lloyd y McCown, (WPM) (1980)

Se elaboró medio de cultivo Lloyd y McCown, (WPM) (1980) a diferentes porcentajes de

fuerza iónica (150, 100, 50 y 25%) complementados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L-1 de

Plant Preservative Mixture (PPM)TM (Plant Cell Technology, Washington DC, USA), 1 g L-1 de

Polivinil Pirrolidona (PVP)TM (Sigma, St. Louis, MO, USA) y solidificados con 7.5 g L-1 de AgarTM.

El pH de los medios se ajustó a 5.8 utilizando concentraciones de ácido sulfúrico e hidróxido

de sodio, ambas soluciones a 0.1 y 0.01 N, la esterilización se llevó a cabo en autoclave

automática a 121˚ C y 18 psi durante 15 min.

Desinfección superficial y establecimiento de material vegetal in vitro: Para la desinfección

superficial se utilizó un tratamiento control absoluto para todas las muestras consistente en

lavado con detergente comercial Útil® y posteriormente una inmersión en el fungicida

selectivo Amistar®. Posteriormente se evaluó el efecto de diferentes tratamientos de

desinfección para identificar el más adecuado para cada muestra, todos en cámara de flujo

laminar. Se utilizaron dos concentraciones de cloro comercial (20 y 25% v/v) a un tiempo y en

combinación con dos concentraciones de etanol (70 y 90% v/v). Para el establecimiento se

utilizaron tubos de vidrio (10 cm3) con medio WPM previamente elaborados y esterilizados,

en donde se colocaron las semillas a razón de una por tubo, posteriormente se sellaron con

Parafilm® y se rotularon, todo lo anterior en ambiente aséptico dentro de una cámara de

flujo laminar.

Subcultivos de explantes cultivados in vitro a nuevos medios: Cuando un tejido cultivado in

vitro alcanzaba su fase de explante y llegaba al tope del recipiente en el que se encontraba

era momento de cortarlo y pasarlo a medio de cultivo nuevo, esto se hacía extrayendo el

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explante y cortando todas sus partes nodales, posteriormente cada parte nodal se colocaba

en un nuevo tubo con medio para continuar con su desarrollo, todo esto en cámaras de flujo

laminar.

Esterilización de material contaminado: Semanalmente se extraía de las cámaras de

almacenamiento de tejido in vitro todo el material que no paso la prueba de desinfección y

se contaminó, bien fuera por hongo o por bacteria; se colocó todo el material en el autoclave

y se le dio un ciclo de esterilización a 121°C y 18psi durante 25 minutos. Posteriormente

fueron desechados los residuos y se pasó al lavado del material.

Limpieza del material utilizado: Cada vez que se dejaba de utilizar, se lavó el material de

cristalería y material de laboratorio.

Registro de resultados: Los resultados de las pruebas evaluadas durante los 4 meses de

estancia de residencias profesionales, se registraron en tablas de Excel y se presentan en el

apartado de anexos mismos que se resumieron en los gráficos que se presentan en el

apartado de resultados.

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7. RESULTADOS

Durante el análisis de la semilla de T. amazonia bajo el estereoscopio, se encontró que

presentaban un endocarpio fibroso, además de que en un 90% de las semillas se observó

crecimiento de tejido fúngico (hifas, micelios y esporangios), es por esto que se optó por

retirar los endocarpios fibrosos y utilizar un fungicida sistémico ya que éste afecta al hongo

en varias etapas de su desarrollo, reduciendo así la carga microbiana antes de pasar a In

vitro. En éste estudio se utilizaron cloro y etanol como desinfectantes en diferentes

concentraciones ya que han probado ser muy efectivos para la eliminación de hongos y otros

microorganismos (CIAT, 1991).

7.1 Desinfección superficial y establecimiento In vitro.

La semilla de T. amazonia se encuentra en el centro del endocarpio separado de éste por una

delgada capa de aire, misma que brinda el espacio idóneo para la formación de ciertos tipos de

hongos endógenos difíciles de eliminar si no se retira el mismo endocarpio. Esta característica

particular de la especie hace suponer que en estado natural, en la estructura externa de la

semilla se encuentran libres hongos y bacterias que la desintegran facilitándole el paso a la

humedad, por lo tanto, si se extraen e inoculan en condiciones asépticas podrían germinar y

desarrollarse in vitro sin peligro de contaminación. Sin embargo, carente de la protección que

le brinda el endocarpio, la desinfección con agentes desinfectantes como el cloro puede afectar

en el desarrollo y la germinación normal de la semilla. Los datos se analizaron con el paquete

estadístico de SAS (SAS Institute Inc. 2013).

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germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo in vitro.

FV GL CONT GER

TRATAMIENTO

(TE)

9 0.957777** 1.538333**

ERROR 190 0.03210526 0.18710526

C.V. (%) 223.9743 77.93814

FV = Fuentes de variación; GL = Grados de libertad; CONT= Porcentaje de

contaminación; GER = Porcentaje de germinación; *, ** = Significativo con Pr ≤ 0.05 y

con Pr ≤ 0.01, respectivamente; ns = No significativo.

Entre los tratamientos de desinfección evaluados (Cuadro 2), se encontró una diferencia

altamente significativa en cuanto a contaminación de la semilla (Probabilidad estadística (Pr)

< 0.0001), donde los tratamientos más efectivos fueron en los que se utilizó solo Hipoclorito

de Sodio a concentraciones 20 y 25% y solo etanol al 70 y 90% (T3, T6, T7 y T8) ya que

permitieron el menor porcentaje en contaminación y el mayor porcentaje en cuanto a

germinación (Cuadro 3), los demás tratamientos (T1,T2,T4 y T5) presentaron diferencia

altamente significativa en cuanto a contaminación; sin embargo, no presentaron significancia

ante la germinación .

El índice de contaminación para los tratamientos con mayor efectividad se considera

aceptable con respecto al control de contaminación (T9), sin embargo, con respecto al análisis

Tukey en el programa estadístico SAS nos da como resultado que el mejor tratamiento con

mayor índice de germinación y menor índice de contaminación fue el numero 7 (etanol 70%).

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Cuadro 3. Germinación y contaminación de semillas de T. amazonia introducidas al cultivo

in vitro.

Tratamiento Semillas Semillas Germinadas Contaminadas (%) (%)

T1 (CLORO 20+ALCOHOL 70) 30 d 0 a

T2 (CLORO 20+ALCOHOL 90) 35 d 0 a

T3 (CLORO 20) 75 a 0 a

T4 (CLORO 25 +ALCOHOL 70) 30 d 0 a

T5 (CLORO 25 +ALCOHOL 90) 25 d 5 d

T6 (CLORO 25) 70 a 0 a

T7 (ALCOHOL 70) 80 a 0 a

T8 (ALCOHOL 90) 85 a 5 a

CONTROL CONTAMINACIÓN 30 70

CONTROL GERMINACIÓN 95 0

(Pr < 0.0001)

7.2 Enraizamiento.

Para las diferentes especies forestales se reportan diferentes concentraciones óptimas de

macroelementos, microelementos y hierro. En Pinus counterei se observó un mayor índice en

formación de brotes radicales con 1.5X la concentración normal de sales MS, mientras que

en P. taeda este óptimo se alcanza con 0.5X (Bonga y Durzan 1985). En cipresillo

(Prumnopitvs standleyi) su crecimiento no se vio afectado al inocularse en el medio MS con

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1X, 0.5X ó 0.25X la concentración de sales (Gamboa y Gamboa 1997). Esto confirma que

muchas especies forestales requieren de una concentración específica de sales inorgánicas.

En ésta etapa del proyecto, se determinó el efecto de la concentración de sales inorgánicas en

el medio de cultivo sobre el enraizamiento del material. Se tomó como control el tratamiento

con 0% WPM. Este se comparó con los tratamientos en que se aumentó la concentración de

sales en el medio de cultivo, conforme éste se hizo más pobre en elementos minerales (Cuadro

5), el valor de las variables evaluadas disminuyo, obteniéndose una diferencia altamente

significativa (Pr < 0.0001) en el número de raíces y su longitud promedio de los diferente

tratamientos (Cuadro 4).


germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro.

FV GL N RAIZ LONG

TRATAMIENTO

(TE)

4 5.920000** 3423.66027**

ERROR 45 0.66666667 51.04037

C.V. (%) 39.25464 15991.45764

FV = Fuentes de variación; GL = Grados de libertad; N RAIZ= Número de raíces; LONG =

Longitud promedio por raíz.*, ** = Significativo con Pr ≤ 0.05 y con Pr ≤ 0.01,

respectivamente; ns = No significativo.

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Cuadro 5. Efecto de concentraciones de sales en el medio de cultivo, sobre el

enraizamiento in vitro de brotes de T. amazonia.

CONCENTRACIÓN MEDIO

WPM (%)

RAÍCES/BROTES

(#)

LONGITUD PROMEDIO DE

RAÍCES(mm)

T4 (150) 3 a 45.241 a

T3 (100) 2.6 a 42.302 a

T2 (50) 2.2 a 42.085 a

T1 (25) 1.4 b 37.715 a

C (0) 1.2 b 0.98 b

Pr < 0.0001

7.3 Aclimatación.

Los inhibidores o los cambios dramáticos en el pH del sustrato a donde se van a transferir los

explantes enraizados in vitro pueden afectar adversamente el desarrollo de las raíces y el éxito

en el trasplante, es por eso que uno de los sustratos más utilizados es el Peat Moss, mezclado

con otros materiales que se degradan menos con el tiempo ya que su pH tiene menor

variación (Chen, 1992-1993).

Utilizando la mezcla 3:1:1 Peat Moss, vermiculita y agrolita respectivamente, se obtuvo un

90% de supervivencia en condiciones de invernadero, lo cual indica que fueron capaces de

superar los cambios del lugar in vitro (condición heterótrofa) a las condiciones naturales de ser

autótrofas. Aunque la aclimatación fue gradualmente acondicionada al invernadero, también

existe el uso de micorrizas para optimizar su aclimatación (Alarcón et al. 2001).

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23


8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El tratamiento más efectivo para el establecimiento in vitro, con un efecto negativo

mínimo en el índice de germinación y controlando la contaminación, consistió en

retirar los endocarpios, lavar con detergente Útil® 5g L-1 durante 5 minutos, inmersión

en Amistar® a una concentración de 3 g L-1 suplementados con 5 gotas de Tween 20®

L-1 durante una hora y sumergir en etanol 70% por 1 min seguido de 2 enjuagues en

agua bidestilada estéril, todo en constante agitación y en cámara de flujo laminar.

El mayor número de raíces por explante y longitud promedio por raíz, se presentaron

a mayor concentración de medio WPM. Para un enraizamiento rápido la mejor

concentración fue de 150% la concentración normal del WPM.

El 90% de las plántulas enraizadas in vitro lograron adaptarse a condiciones de

invernadero utilizando una mezcla de Peat Moss, vermiculita y agrolita 3:1:1

respectivamente.

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9. COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS.

En el siguiente listado se mencionan las competencias desarrolladas y aplicadas durante el

periodo del proyecto “Fomento Y Operación Del Subsistema De Recursos Genéticos

Forestales Dentro Del Centro Nacional De Recursos Genéticos Del INIFAP ” en el Laboratorio

Agrícola Forestal Sección cultivo de tejido in vitro y criopreservación, los cuales engloban

temas de distintas materias como: Estadística, Aseguramiento de la Calidad, Química a

Analítica, Taller de investigación, Biología, Microbiología, Bioquímica, Instrumentación y

Control, Fisicoquímica, entre otras.

Preparación de soluciones porcentuales

Consulta a fuentes de información primaria y secundaria.

Manejo de gravimetría y volumetría.

Manejo de temperaturas, luz, humedad absoluta y humedad relativa en quipos de

laboratorio y tejido vegetal.

Control microbiológico.

Conocimiento en fisiología de tejido vegetal.

Conocimiento de calidad de semillas y recursos genéticos.

Diseños Experimentales y análisis estadístico de resultados.

Buenas prácticas de laboratorio.

Asepsia en el área de trabajo.

Manejo de equipo de rayos X e interpretación de imágenes.

Manejo de equipos de disección en cámaras de flujo laminar.

Bioquímica de la respiración y metabolismo del tejido vegetal.

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10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES

Alarcón, M. C., R. González Chávez, R. Ferrera Cerrato, A. Villegas Moter. 2001. Efectividad de

Glomus fasciculatum y Glomus etunicatum en el crecimiento de plántulas de Vitis vinifera L.,

obtenidas por micropropagación. Tierra Latinoamericana, núm. 19, vol. 1, 2001, pp. 29-35.

Bonga, M.; Durzan, D. 1985. Tissue culture in forestry. Vol. 2. Martinus Nijhoff Publishers,

Netherlands. 420 p.

Chen B, W H Chen, L Yang, G D Wu (1992-1993). Effect of planting media on the growth of

Anthurium seedlings. Taiwan Sugar Research Institute. Annual Report 1992-1993. pp: 26-27

Escuela Nacional de Ciencias Forestales. (Marzo de 2003). GUIAS SILVICULTURALES DE 23

ESPECIES FORESTALES DEL BOSQUE HUMEDO DE HONDURAS. Siguatepeque, Comayagua,

Honduras. Obtenido de:

http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/training_material/docs/Guias%20silviculturales

%20de%2023%20especies.pdf

FAO. 2011. Segundo Informe sobre el Estado de los Recursos Fitogenéticos para la

Alimentación y la Agricultura en el Mundo. Comisión de Recursos Genéticos para la

Alimentación y la Agricultura. pp. 15-16.

http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/training_material/docs/Guias%20silviculturales%20de%2023%20especies.pdf

http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/training_material/docs/Guias%20silviculturales%20de%2023%20especies.pdf

I.T.S.A. __________________________________________________________________________________________________________________

26


Gamboa, J.P.; Gamboa, K. 1997. Estudios conducentes al establecimiento in vitro de ciprecillo

(Prumnopitys standleyi) y pitón (Hyeronima alchorneoides), especies nativas de Costa Rica.

Informe de Investigaci6n, Vicerrectoría de Investigación y Extensión, Instituto Tecnológico de

Costa Rica. 40 p.

García, C. O. (2011). Fenología de dos especies arbóreas nativas de la selva tropical en

Chiapas, México. LACANDONIA , 5, 81-86.

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de

Recursos Genéticos (2012). Consulta 20 de Marzo del 2015. Disponible en:

http://www.inifap.gob.mx/SitePages/centros/cnrg.aspx

IPGRI. 2002. “Neglected and Underutilized Plant Species: Strategic Action Plan of the

International Plant Genetic Resources Institute”, International Plant Genetic Resources

Institute, Rome, Italy.

Iriondo J. M. 2001. Conservación de germoplasma de especies raras y amenazadas.

Investigación Agraria. Producción y protección vegetales. PP. 5-24 Disponible en:

http://www.inia.es/gcontrec/pub/germoplasma_1161158274546.pdf

International Seed Testing Association (ISTA). 2014. International Rules for Seed Testing.

Rules 2014.

http://www.inifap.gob.mx/SitePages/centros/cnrg.aspx

http://www.inia.es/gcontrec/pub/germoplasma_1161158274546.pdf

I.T.S.A. __________________________________________________________________________________________________________________

27


Jaramillo S. y M. Baena. 2000. Material de Apoyo a la Capacitación en Conservación ex situ de

Recursos Fitogenéticos. Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos, Cali, Colombia.

Lloyd, G. & McCown, B.H. (1980). Commercially-feasible micropropagation of mountain

laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Comb. Proc. Int. Plant Propagators Soc. 30:

421-427.

Magnitskiy S.V. y Plaza G. A. 2007. Fisiología de semillas recalcitrantes de árboles tropicales.

Agronomía Colombiana 25(1), 96-103.

Maselli C, S. 2013. Recursos fitogenéticos: elementos clave para el desarrollo y la seguridad

alimentaria. Universidad de Valle de Guatemala. Revista 26. pp 56-59.

Montero M. M. y Kanninen, M. (2003). Índice de sitio para Terminalia amazonia (Gmel.)

Excell en Costa Rica. Revista Agronomía Costarricense, 7(1), 29-35. Recuperado de:

http://www.mag.go.cr/rev_agr/v27n01_029.pdf

Moreno A, J. E. (2014). Estudio de la diversidad genética de cebada Hordeum vulgare L. En la

colección del iniap usando marcadores moleculares SSR. Carrera de Ingeniería en

Biotecnología. Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE. Sede Sangolquí, Ecuador.

http://www.mag.go.cr/rev_agr/v27n01_029.pdf

I.T.S.A. __________________________________________________________________________________________________________________

28


Mroginski, L.A.; Roca, W.M. 1991. Establecimiento de cultivo de tejidos in vitro: Cultivo de

tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Ed. por Roca W.M. y Mroginski L.A.

CIAT, Cali, Colombia. p. 19-40.

Painting, K.A., Perry M.C., Denning, R.A. y Ayad, W.G. 1993. Guía para la Documentación de

Recursos Genéticos. Consejo Internacional de Recursos Fitogenéticos, Roma.

Pennington, T.D Y J. Sarukhán, 2005. Árboles Tropicales de México. Manual para la

identificación de las principales especies. 3ª edición. Editorial Fondo de Cultura Económica,

UNAM, México. P. 522.

Plascencia, R. L., Castañón Barrientos, A. y Raz-Guzmán, A. (2011). La biodiversidad en

México su conservación y las colecciones biológicas. Ciencias, 101: 36-43.

Rao, N.K., J. Hanson, M.E. Dulloo, K. Ghosh, D. Novell y M. Larinde. 2007. Manual para el

Manejo de Semillas en Bancos de Germoplasma. Manuales para Bancos de Germoplasma.

No. 8. Bioversity International, Roma, Italia.

Russo, R., y Speranza, M. (2001). Terminalia arjuna (Combretaceae) y otras especies del

género: mitos, realidades y oportunidades en la terapia cardiovascular. Rev. Costarric.

Cardiol, 3(3).

I.T.S.A. __________________________________________________________________________________________________________________

29


Sarukhán, J., Koleff, P., Carabias, J., Soberón, J., Dirzo, R., Llorente-Bousquets, J., Halffter, G.,

González, R., March, I., Mohar, A., Anta, S., De la Maza, J. 2009. Capital natural de México.

Síntesis: Conocimiento Actual, Evaluación y Perspectivas de Sustentabilidad. Comisión

Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO), México.

SAS Institute, Inc. (2013). SAS User’s guide: Statistics, Edición 2013. Cary, NC: SAS Institute,

Inc.

Scherer, J. 2006. Oxidação fenólica, tipo de explante e meios de cultura no estabelecimento

in vitro de canafístula (Peltophorum dubium (SPRENG.). Ciência Florestal, Santa Maria, 16(4),

381-390.

Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (Semarnat). 2005. Capítulo 4.

Biodiversidad. Consulta: 05 de Junio del 2015. Disponible en:

http://app1.semarnat.gob.mx/dgeia/informe_04/04_biodiversidad/index_biodiversidad.html

Serrada, R. 2000. Apuntes de Repoblaciones Forestales. Generalidades sobre semillas

forestales. FUCOVASA. Universidad Politécnica de Madrid.

Suárez, I. E. 2006. DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA PROPAGACION IN VITRO DE ROBLE

(Tabebuia rosea)( Bertol DC). Temas Agrarios, 52-62.

http://app1.semarnat.gob.mx/dgeia/informe_04/04_biodiversidad/index_biodiversidad.html

I.T.S.A. __________________________________________________________________________________________________________________

30


TORRES, G; LUJÁN, R y BARCA, S. A. 2002. Especies forestales nativas para la reforestación en

las regiones Brunca y Pacífico Central de Costa Rica. En: Taller seminario de especies

forestales nativas. Universidad Nacional, INISEFOR. Heredia, Costa Rica. 160 p.

Varela S. A., Arana V., Martínez A. 2011. ¿Qué hacer luego de la recolección?: Manipulación

del fruto y la semilla de especies forestales. Silvicultura en vivero cuadernillo No 2. Bariloche

Argentina.

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ANEXOS

Anexo 1. Resultados de tratamientos de establecimiento y enraizamiento in vitro.

Tabla 1. Contaminación y germinación in vitro.

Tratamientos Contaminación (%) Germinación (%)

1 0 30

2 0 35

3 0 75

4 0 30

5 5 25

6 0 70

7 0 80

8 5 85

CONTROL CONTAMINACIÓN 70 30

CONTROL GERMINACIÓN 0 95

Tabla 2. Número de raíces y longitud promedio de tratamientos para enraizamiento in

vitro.

Tratamiento Repetición Número de raíces Longitud promedio (mm)

Control 1 1 1.91

Control 2 1 0.85

Control 3 1 0.52

Control 4 1 1.10

Control 5 1 0.40

Control 6 1 1.73

Control 7 2 0.79

Control 8 1 1.34

Control 9 1 0.72

Control 10 2 0.44

1 1 2 32.75

1 2 2 28.56

1 3 1 41.48

1 4 1 17.14

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1 5 2 40.65

1 6 1 21.72

1 7 1 51.39

1 8 1 46.52

1 9 1 58.85

1 10 2 38.09

2 1 2 35.57

2 2 2 41.12

2 3 2 43.24

2 4 3 48.68

2 5 4 42.35

2 6 1 50.24

2 7 2 39.15

2 8 2 33.57

2 9 2 39.61

2 10 2 47.32

3 1 4 49.40

3 2 3 45.75

3 3 3 37.06

3 4 2 44.28

3 5 3 41.10

3 6 3 35.20

3 7 3 44.00

3 8 2 41.64

3 9 2 40.31

3 10 1 47.28

4 1 6 36.84

4 2 2 42.49

4 3 3 48.48

4 4 2 46.43

4 5 4 46.28

4 6 2 49.51

4 7 3 48.38

4 8 3 47.94

4 9 2 52.88

4 10 3 36.18

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