Fitoplâncton de Água Doce

5/24/2018 Fitopl ncton de gua Doce

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NORMA TCNICA L5.3034 EdioOutubro 2012

24 pginas

Fitoplncton de gua doce: Mtodos qualitativo e quantitativo

Title in English:

Freshwater phytoplankton: qualitative and quantitative assays

Resumo:

Descreve os principais mtodos de preservao e de anlises qualitativas e quantitativas para acontagem de organismos fitoplanctnicos de gua doce, como tambm os mtodos de contagem declulas de cianobactrias. O estudo do fitoplncton de gua doce uma ferramenta importante naavaliao da estrutura e funcionamento dos ecossistemas aquticos. Alm disso, a comunidade temsido utilizada como indicadora de qualidade de gua principalmente em lagos e reservatrios, e suaanlise permite avaliar alteraes ambientais e eventuais problemas que possam surgir quanto ao usoda gua.

Palavras chave

Anlise da gua, gua doce, Fitoplncton,Cianobactrias, comunidade fitoplanctnica, algas.

Key words

Analysis of water, Freshwater, phytoplankton,cyanobacteria, phytoplankton, algae

Companhia Ambiental do Estado de So PauloAvenida Professor Frederico Hermann Jr., 345

Alto de Pinheiros CEP 05459-900 So Paulo SPTel.: (11) 3133 3000 Fax: (11) 3133 3402 http://www.cetesb.sp.gov.br

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(CETESB / L5.303 / outubro / 2012)

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Primeira EdioDezembro/1977, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. n. 002/1978/ DDPET, de 10/01/1978.

Segunda EdioAgosto/1991, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. n. 100/91/P/ N, de 28/08/1991.

Terceira EdioDezembro/2005, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. n. 042/2006/E, de 23/03/2006.Publicada no Dirio Oficial do Estado de So Paulo Caderno Executivo I, v.116, n. 74, de20/04/2006, Poder Executivo, Seo I, pg. 27.

Quarta EdioOutubro/2012, homologada pela Deciso de Diretoria D.D. n. 171/2013/E, de 21/05/2013. Publicadano Dirio Oficial do Estado de So Paulo Caderno Executivo I, v.123, n. 97, de 24/05/13, PoderExecutivo, Seo I, pg. 52 a 56.

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permitida a reproduo total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte. Direitosreservados de distribuio.

Sumrio pgina

01 Introduo 0202 Objetivo 0403 Documentos complementares 0504 Definies 0505 Equipamentos e reagentes 06

06 Procedimento de coleta, preservao e preparao de amostras 0707 Execuo do ensaio 0808 Expresso dos resultados 1609 Controle laboratorial e estocagem 1610 Registro de dados e apresentao dos resultados 1611 Referncias bsicas para identificao do fitoplncton de gua doce 1712 Referncias 18

Anexo A-Figuras dos acessrios para anlise de fitoplncton 20Anexo B-Exemplo de ficha de anlise para contagem de clulas de cianobactrias 22Anexo C-Exemplo de ficha de anlise de fitoplncton 23Anexo D-Exemplo de boletim de anlise de fitoplncton 24

1 Introduo

Fitoplncton a comunidade de organismos microscpicos fotossintetizantes que flutuam livrementenas diversas camadas dos corpos dgua e que constituda principalmente por algas microscpicas:clorofceas, diatomceas, euglenofceas, crisofceas, dinofceas, xantofceas e tambm cianobactrias(anteriormente denominadas cianofceas).

O termo alga considerado um termo popular, utilizado para designar organismos clorofilados quepodem se distinguir em funo de sua morfologia, reproduo, fisiologia e ecologia. Entretanto, segundoalguns autores, algas so organismos vegetais unicelulares ou multicelulares que fazem parte da

comunidade produtora primria de um ecossistema aqutico, podendo constituir a base da cadeiaalimentar desse ambiente. Utilizando a energia solar transformam nutrientes minerais em matriaorgnica, fenmeno conhecido como fotossntese.


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Em geral, guas limpas e pobres em nutrientes apresentam uma comunidade fitoplanctnica poucoabundante, com alta diversidade, enquanto guas ricas em nutrientes apresentam grande nmero deorganismos, pertencentes a poucas espcies.

Alm da quantidade de nutrientes presentes na gua, outros fatores influenciam a composio edistribuio espacial e temporal da comunidade fitoplanctnica, tais como: correntes, estratificao

trmica, circulao, hora do dia, profundidade de penetrao da luz, intensidade luminosa, temperaturae presena de substncias txicas.

Mananciais que recebem despejos domsticos, industriais ou de fontes agrcolas difusas, tendem aapresentar altas concentraes de nutrientes, principalmente fsforo e nitrognio. Este fenmeno dedesequilbrio ecolgico, conhecido como eutrofizao ou enriquecimento das guas, favorece aproliferao rpida de algas e cianobactrias, fato que pode acarretar vrios problemas no ambienteaqutico, tais como: flutuaes extremas da concentrao de oxignio dissolvido e pH; dificuldade depenetrao de luz na coluna dgua pelo acmulo de algas na superfcie, prejudicando odesenvolvimento de outras formas de vida; mudanas de colorao; conferir odores e saboresdesagradveis e toxicidade gua. Estas situaes so indesejveis, principalmente em mananciaisutilizados para abastecimento pblico e recreao, pois dificultam e oneram o processo de tratamento

de gua.

Alguns organismos fitoplanctnicos, principalmente do grupo das diatomceas, podem provocarentupimento de filtros com consequentes problemas em estaes de tratamento.

Certas espcies de algas e cianobactrias podem ainda contribuir para acelerar a corroso de concretosubmerso e estruturas de metal, tanto diretamente nos locais onde crescem aderidas, quanto poralteraes fsicas e/ou qumicas da gua.

O exame dos componentes do fitoplncton, sua identificao e quantificao so de grande interessepara avaliar as condies ecolgicas de um ecossistema aqutico, prevenir ou controlar situaesindesejveis ou incompatveis com a finalidade de utilizao de um determinado manancial e, inclusive,para o desenvolvimento de culturas de interesse econmico, como a piscicultura.

O grupo das cianobactrias o mais problemtico do ponto de vista sanitrio. So organismosprocariotos, ou seja, com estrutura celular semelhante das bactrias, e possuem um sistemafotossintetizante semelhante ao das algas.

Esse grupo tem capacidade de crescimento nos mais diversos ambientes, porm ocorrepreferencialmente em pH variando entre 6,0 e 9,0, temperatura entre 15 e 30C e alta concentrao denutrientes, principalmente nitrognio e fsforo.

Todas as cianobactrias so consideradas potencialmente txicas, embora algumas espcies ainda no

tenham toxicidade comprovada. Existem relatos na literatura de casos de intoxicao de animais e deseres humanos causados pela ingesto de gua contaminada e pelo uso em clnicas de hemodilise ouindstria farmacutica de guas contendo espcies txicas e/ou toxinas liberadas pelas suas floraes.O nico relato comprovado de morte de seres humanos ocorreu em Caruaru PE (1996), quando umaclnica de hemodilise administrou gua contaminada com cianotoxinas por via endovenosa a seuspacientes. As toxinas de cianobactrias so conhecidas como cianotoxinas, e por seu efeito podem serclassificadas como neuro ou hepatotxicas.

Os gneros Dolichospermum (antiga Anabaena), Aphanizomenon, Oscillatoria, Cylindrospermopsis, entre outras, so produtores potenciais de neurotoxinas que podem causar insuficincia respiratria elevar morte de animais entre 2 e 30 minutos.

As hepatotoxinas apresentam uma ao mais lenta, causando o tipo mais comum de intoxicao eprovocando hepatoenterites. Alguns gneros produtores dessas toxinas so Microcystis,Dolichospermum (antigaAnabaena), Planktothrix, Oscillatoria, Radiocystis e Cylindrospermopsis. Alm


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do efeito agudo essas toxinas tambm podem causar efeitos crnicos, como por exemplo, odesenvolvimento de tumores.

O controle das cianobactrias em mananciais de abastecimento importante devido ao seu potencialtxico. A Portaria n 2914 do Ministrio da Sade (BRASIL, 2011), relativa s Normas de Qualidade paragua de Consumo Humano (Potabilidade), estabelece que os responsveis por estaes de tratamento

de gua para abastecimento pblico devem realizar monitoramento de cianobactrias nos mananciais econtrole de cianotoxinas. Tambm a Resoluo CONAMA n 357 (BRASIL, 2005) contempla omonitoramento destes organismos.

O estudo da comunidade fitoplanctnica pode ser til para:

1) Avaliar a estrutura e funcionamento dos ecossistemas aquticos;

2) Subsidiar aes de controle nas estaes de tratamento de gua para abastecimento pblico emrelao a alteraes de cor, turbidez, odores indesejveis, partculas visveis na gua, obstruo defiltros e aplicao de algicidas.Determinar a eficincia de vrios estgios do tratamento e auxiliar nadeterminao da dosagem de cloro a ser adicionada gua;

3) Identificar a origem de uma fonte de emisso ou efluente misturado na gua;

4) Subsidiar a interpretao de anlises qumicas, por exemplo, correlacionando a presena ouausncia de certas espcies com a deficincia ou excesso de determinados elementos no ambienteaqutico;

5) Detectar a presena de espcies potencialmente txicas em guas de abastecimento ourecreacionais,que possam causar impacto na sade humana, e fornecer subsdios para a tomada dedecises em programas de monitoramento e gerenciamento de reservatrios;

6) Indicar a natureza, extenso e efeitos biolgicos da poluio;

7) Detectar e acompanhar o processo de autodepurao em corpos dgua e o desenvolvimento esucesso de formas fitoplanctnicas em processos de tratamento de esgotos domsticos de lagoasde estabilizao;

8) Explicar os mecanismos de ao dos fatores biolgicos de guas residuais ou avaliar suaefetividade;

9) Documentar a curto e longo prazo a variabilidade na qualidade da gua, como conseqncia demudanas naturais e/ou provocadas pelo homem, especialmente por despejos ricos em nutrientes oucontaminados por metais;

10) Fornecer dados sobre o estado trfico de ecossistemas aquticos;

11) Acompanhar o desenvolvimento de culturas ou bioensaios com algas e cianobactrias;

12) Avaliar a eficincia de aes de manejo para melhoria e recuperao de corpos dgua;

13) Subsidiar investigao de mortandade de peixes ou outros animais.

2 Objetivo

Esta Norma descreve os principais mtodos de preservao e de anlises qualitativas e quantitativas deorganismos fitoplanctnicos de gua doce e tambm estratgias para contagem de clulas decianobactrias. Alm disso, indica referncias para os procedimentos de coleta.


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3 Documentos complementares

Os documentos relacionados a seguir contm disposies que constituem fundamento para esteprocedimento. As edies indicadas estavam em vigor no momento desta publicao. Como toda normaest sujeita a revises e alteraes, aqueles que realizam procedimentos com base nesta, devemverificar a existncia de legislao superveniente aplicvel ou de edies mais recentes das normas e

publicaes citadas.

Na aplicao desta norma sugere-se consultar:

BRANDO, C. J. et al. (Org.). Guia nacional de coleta e preservao de amostras: gua,sedimento, comunidades aquticas e efluentes lquidos.So Paulo: CETESB; Braslia: ANA, 2011.325 p. Disponvel em:.Acesso em: nov. 2012.

BICUDO, C.E.M.; BICUDO, D.C. (Org.).Amostragem em l imnologia. 2.ed. So Carlos: RiMa, 2004.

BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n 2914, de 12 de dezembro de 2011. Dispe sobre osprocedimentos de controle e de vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padrode potabilidade. Dirio Oficial da Unio: Repblica Federativa do Brasil,Poder Executivo, Braslia,DF, n. 239, 14 dez. 2011. Seo 1, p. 39-46. Disponvel em:.Acesso em: fev. 2013.

BRASIL. Ministrio do Meio Ambiente. CONAMA. Resoluo n 357, de 17 de maro de 2005.Dispe sobre a classificao dos corpos de gua e diretrizes ambientais para o seu enquadramento,bem como estabelece as condies e padres de lanamento de efluentes, e d outras providncias.Dirio Oficial da Unio: Repblica Federativa do Brasil,Poder Executivo, Braslia, DF, n. 53, 18 mar.2005. Seo 1, p. 58-63. Disponvel em:.Acesso em: fev. 2013.

Referncias bsicas para identificao do fitoplncton de gua doce, citados no final desta Norma.

4 Definies

Para os efeitos desta Norma, aplicam-se as seguintes definies:

4.1 Biomassa

Quantidade de material vivo que pode ser expressa em peso, volume ou rea.

4.2 CianotoxinasToxinas produzidas por cianobactrias que causam efeitos adversos sade do homem e de algunsanimais.

4.3 EcossistemaUnidade de natureza ativa que combina comunidades biticas e fatores abiticos com os quais interage.Os ecossistemas apresentam grande variabilidade em relao s suas dimenses e caractersticas.

4.4 EutrofizaoProcesso de aumento da concentrao de nutrientes, principalmente nitrognio e fsforo, tendo como

consequncia o aumento da produtividade do ambiente aqutico.

4.5 Fitoplncton


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Comunidade vegetal microscpica que vive em suspenso nas diversas camadas de gua onde, graas presena de energia luminosa, promove o processo fotossinttico, principal responsvel pela base dacadeia alimentar no meio aqutico.

4.6 FloraoCrescimento intenso de algas ou cianobactrias, potencialmente txicas ou no, geralmente causado

por aumento de nutrientes como nitrognio e fsforo. Essas altas densidades de organismos podemocorrer em curtos perodos ou durante todo o ano.

4.7 FrstulaParede celular dura, silicosa, das diatomceas, constituda por duas partes que se assemelham spartes superior e inferior de uma caixa perfeitamente ajustada. Essas partes so chamadas de valvasouepiteca e hipoteca.

4.8 FotossnteseProcesso de converso de dixido de carbono para carbono orgnico (carboidrato) que ocorre noscloroplastos, pela ao da energia luminosa absorvida pelos pigmentos fotossintetizantes,especialmente a clorofila.

4.9 ProcariotoClula ou organismos destitudo de um ncleo distinto.

4.10 Unidade Padro de rea (UPA)Unidade aceita internacionalmente para quantificar o plncton em guas de abastecimento, com valorde 400m2.

5 Equipamentos e reagentes

Os equipamentos, reagentes, solues e demais materiais, necessrios para a anlise apresentam-selistados nos itens 5.1 e 5.2.

5.1 Equipamentos e materiais para execuo da anliseOs equipamentos e materiais utilizados na execuo do ensaio encontram-se listados abaixo:

a) Pipetas graduadas;

b) Contador manual de uma ou de vrias teclas;

c) Retculo de Whipple (Anexo A , figura 1);

d) Microscpio binocular comum, com ocular de aumento de 10X ou 12,5X e objetivas com aumentode 10X, 20X, 40X, 63X e 100X, com retculo de Whipple calibrado. Contraste de fase eepifluorescncia so recomendados para auxiliar na anlise;

e) Microscpio invertido (invertoscpio), com ocular de aumento de 10X ou 12,5X e objetivas comaumento de 10X, 20X e 40X (63X e 100X so opcionais), com retculo de Whipple calibrado.Contraste de fase e epifluorescncia so recomendados para auxiliar na anlise;

f) Cmaras de Utermhl (tambm chamadas de cmaras de invertoscpio ou cmaras desedimentao), com capacidade de 2, 5, 10, 25, 50 ou 100mL (Anexo A, figuras 2 e 3);

g) Cmaras de Sedgwick-Rafter com capacidade de 1mL (S-R). Estas cmaras apresentam 20mm

de largura por 50mm de comprimento e 1mm de profundidade (Anexo A, figura 4);

h) Lmina micromtrica (para verificar/calibrar o retculo);


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i) Lminas e lamnulas comuns e lamnula para cmara de Utermhl;

j) Ficha de anlise (Anexo B e C);

k) Pipetas Pasteur;

l) Cmara mida: recipiente fechado, umidificado, utilizado para manter a umidade das cmaras decontagem;

m) Centrfuga;

n) Balana com preciso de 0,1g;

o) Provetas graduadas.

5.2 Reagentes e SoluesOs reagentes e solues utilizados na execuo do ensaio encontram-se listados abaixo:

a) Formalina Formaldeido 40% neutralizado com tetraborato de sdio (20g/L) ou bicarbonato desdio (5g/L), chegando a uma concentrao final na amostra de 2%;

b) Soluo de lugol: dissolver 10g de iodo puro, 20g de iodeto de potssio, 20mL de cido acticoglacial em 200mL de gua destilada. Esta soluo deve ser armazenada em frasco escuro.Recomenda-se adicionar de 0,3 a 1,0mL/100mL amostra, dependendo da concentrao deorganismos;

c) Soluo Transeau: 6 partes de gua, 3 partes de lcool etlico 95GL e 1 parte de formalina;utilizada na proporo 1:1 com a amostra;

d) Glutaraldedo neutralizado com tetraborato de sdio (20g/L) ou bicarbonato de sdio (5g/L), emconcentrao final de 1 a 2%;

e) Hidrxido de Sdio (NaOH) ou de potssio (KOH) 0,1M. Utilizado na proporo de 1:1, de formaque a concentrao final seja 0,05M para o KOH e 0,075M para o NaOH ;

f) Tinta nanquim (para evidenciar bainhas e mucilagem de cianobactrias).

6 Procedimentos de coleta, preservao e preparao de amostras

A seguir sero apresentados os procedimentos de coleta, preservao e preparo das amostras.

6.1 Coleta de amostrasPara o planejamento amostral e detalhamento dos procedimentos de coleta, consultar o Guia Nacionalde Coleta e Preservao de Amostras (BRANDO et al., 2011), considerando sempre os objetivos doestudo e o tipo de anlise que ser realizada.

6.2 Preservao da amostraPara anlise quantitativa necessrio que a amostra seja preservada, uma vez que os organismos doplncton presentes na amostra possuem mobilidade, prejudicando as contagens.

A amostra poder ser preservada com formalina, lugol ou soluo Transeau, preferencialmente at 24horas aps a coleta. Para a identificao de determinados grupos de cianobactrias e flagelados,

necessria a observao do material antes da preservao, para verificao de movimento e deestruturas s visveis no organismo vivo. Havendo necessidade de observao dos organismos vivos, aamostra deve ser transportada do local de coleta ao laboratrio em ambiente resfriado.


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Na tabela 1encontram-se descritas as vantagens e desvantagens de cada conservante.

Tabela 1 Descrio das vantagens e desvantagens de cada conservante

TIPO VANTAGENS DESVANTAGENSLUGOL Preservao de flagelos e aumento

do peso especfico das clulas,facilitando a sedimentao.

Dissolve frstulas de diatomceas mais delicadas

e escamas de silicoflagelados.No possvel utilizar a epifluorescncia emamostras preservadas com lugol.

FORMOL Pode ser estocado por vrios anose no muda a colorao das algas.

Distorce a forma da clula de flagelados nus,provoca perda de flagelos; apresenta toxicidade sade humana.

TRANSEAU Mantm as caractersticas dasclulas como flagelos e plastos.

Grande volume utilizado.

Fonte: APUD CETESB (2005), modificado.

6.3 Cuidados na preparao da amostraPara a preparao da amostra necessrio que se realizem os seguintes procedimentos:

importante que a temperatura da amostra e a do ambiente estejam a mais prxima possvel paraevitar a formao de bolhas no preenchimento da cmara, para no haver alterao de volume;

Homogeneizar delicadamente a amostra cerca de dez vezes para promover a distribuio uniformedos organismos;

O local para a preparao e sedimentao dos organismos nas cmaras de contagem deverapresentar superfcie plana e estar abrigado da luz direta, vento e movimentos.

A avaliao quantitativa de amostras para anlise de fitoplncton de gua doce requer, com grandefrequncia, que os organismos nelas presentes sejam concentrados. Vrias tcnicas de concentraoforam desenvolvidas, todas elas apresentando vantagens e desvantagens, e cada qual deve seraplicada de acordo com o objetivo do estudo. Os mtodos de concentrao mais utilizados so o decentrifugao e o de sedimentao (item 7.2).

importante considerar que para cada etapa deste procedimento, diferentes fatores de conversodevero ser calculados e aplicados para a obteno do resultado final.

7 Execuo do ensaio

A seguir sero apresentados os mtodos de preparo da amostra para a realizao do ensaio e o

procedimento de anlise.

7.1 Princpio do mtodoO mtodo a ser utilizado para anlise do fitoplncton de gua doce depende do objetivo que sepretende alcanar. Algumas anlises tm o objetivo de determinar a composio da comunidadefitoplanctnica e avaliar suas concentraes relativas. Em outros casos, suficiente a identificao daespcie dominante que pode estar causando problemas, como por exemplo, produo de sabor e/ouodor desagradveis na gua de abastecimento ou obstruo de filtros em estaes de tratamento.Nestas situaes, uma avaliao qualitativa suficiente.

Em estudos de monitoramento, de diagnstico ou ecolgicos, quando se deseja comparar locais oudiferentes pocas do ano, importante uma anlise quali-quantitativa.

Informaes sobre a temperatura da gua, turbidez, pH, oxignio dissolvido e nutrientes so valiosas epodem facilitar a interpretao dos resultados sobre a comunidade fitoplanctnica propriamente dita.


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7.2 Concentrao das amostrasNormalmente amostras para anlise de fitoplncton de gua doce precisam ser concentradas. Noentanto, isso no necessrio para amostras provenientes de ambientes que apresentam grandequantidade de algas, como lagoas de estabilizao.

Para rios ou corpos dgua que apresentem muito material em suspenso pode ser necessrio diluir a

amostra e, se a concentrao fitoplanctnica for baixa, analisar vrias subamostras e proceder aosclculos correspondentes.

7.2.1 Concentrao das amostras por centrifugaoEste mtodo d uma resposta mais rpida, porm pode causar perda de organismos, alterao de seuaspecto e rompimento de clulas. O volume a ser centrifugado ir depender da concentrao dosorganismos na amostra, pois se a concentrao final para a anlise for muito elevada, a contagem sermais trabalhosa e demorada.

Se em funo da capacidade da centrfuga, houver necessidade de dividir a amostra em dois volumes,procede-se da seguinte forma: para 100mL, por exemplo, aps a centrifugao de cada um dos doistubos de 50mL referentes mesma amostra, so desprezados os 45mL dos sobrenadantes.

Homogenezam-se os 5mL restantes de um dos tubos e verte-se ao outro, obtendo-se desta forma10mL de amostra concentrada 10 vezes. As amostras devem ser centrifugadas a 2500rpm durante 20minutos.

A anlise do material centrifugado pode ser feita em cmaras de Sedgwick-Rafter ou utilizando-se umamicropipeta e adicionando uma gota de volume definido em lmina normal de microscpio com lamnulaselada. Este ltimo mtodo recomendado apenas na ausncia do anterior, uma vez que devido aopequeno volume utilizado pode ocorrer perda de material.

7.2.2 Concentrao das amostras por sedimentaoOutro mtodo de concentrao de amostra o de sedimentao de organismos em cmaras deUtermhl, nas quais a amostra preservada colocada na cmara de sedimentao e levada a umacmara mida, onde permanece durante 12 horas ou mais. Alguns autores recomendam 2 horas derepouso da amostra para cada centmetro de altura da coluna, enquanto outros sugerem de 3 a 4 horaspor centmetro.

Quando a amostra estiver preservada com formalina, o tempo necessrio para sedimentao ser odobro do estabelecido para outras amostras.

Dependendo da quantidade de algas presentes na amostra, utilizam-se cmaras de volumes diferentes,sendo as mais comumente empregadas de 2,5 e 10mL (Anexo A, figuras 2 e 3), podendo variar at 50ou 100mL.

Para a preparao de uma cmara de Utermhl deve-se proceder da seguinte forma:

Colocar a cmara em posio plana e horizontal;

Homogeneizar delicadamente a amostra preservada e retirar, com auxlio de uma pipeta, umasubamostra em quantidade suficiente para preencher o volume da cmara de Utermhl;

Com a lamnula, recobrir cuidadosamente a cmara, evitando a formao de bolhas;

Levar a subamostra preparada a uma cmara mida onde deve permanecer durante o temponecessrio para sedimentao dos organismos.

Se no houver disponibilidade de um microscpio invertido ou centrfuga,tambm possvel sedimentara amostra em proveta e desprezar o sobrenadante.


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Observao 1: Todo o material utilizado, principalmente as cmaras de Sedgwick-Rafter e Utermhl,deve estar limpo, isento de poeira ou gordura.

7.3 Procedimento de anliseDependendo da quantidade de organismos, a subamostra ser analisada integralmente ouparcialmente, por meio da contagem de transectos ou campos aleatrios, com o auxlio do retculo de

Whipple calibrado. Para auxiliar na visualizao de estruturas hialinas, como flagelos, por exemplo,pode ser utilizado o contraste de fase, e para distinguir as cianobactrias de pequenas dimenses debactrias que no devem ser quantificadas na amostra, pode-se usar epifluorescncia (exceto paraamostras preservadas com lugol). O uso de nanquim para visualizao de bainhas, principalmente paraas cianobactrias, tambm recomendado.

7.3.1 Calibrao do retculo de WhippleO microscpio binocular comum e o invertoscpio, ao serem utilizados para contagem demicrorganismos, devem estar equipados com retculo de Whipple (Anexo A, figura 1) na ocular. Oretculo de Whipple dever ser previamente calibrado, com o auxlio de um micrmetro (rguamicromtrica), para a objetiva e a ocular que sero utilizadas durante o exame. Para se realizar acalibrao, o micrmetro colocado na platina do microscpio e superposto a um dos lados do retculo

de Whipple. Procura-se um ponto de correspondncia entre as graduaes do retculo e do micrmetro,a fim de que seja medido o lado do retculo. Encontrado o ponto de correspondncia, pode-se calcular ovalor da menor diviso do retculo e a rea do mesmo.

Exemplo: Em um microscpio binocular comum, usando-se objetiva com aumento de 20X e ocular comaumento de 10X, superpondo-se o retculo de Whipple e o micrmetro, verificou-se que houvecorrespondncia de escalas no quinto quadrado do retculo e a medida no micrmetro foi 190m. Assim,dez quadrados que compem o lado do retculo de Whipple equivalem a 380m, um quadrado equivalea 38m e a menor subdiviso do retculo, a 7,6m.

Observao 2: importante salientar que essa calibrao deve ser feita para cada equipamentoindividualmente, e este procedimento deve ser repetido aps as manutenes do microscpio.

7.4 Mtodo para contagem de organismos e clulasDependendo do objetivo, a anlise da comunidade fitoplanctnica, pode ser realizada contandoorganismos e/ou clulas de cianobactrias.

7.4.1 Contagem de organismosOs organismos fitoplanctnicos podem ser unicelulares, multicelulares, filamentosos ou coloniais.Assim, pela variedade de formas e configuraes, a contagem pode ser um problema para o analista.Por exemplo: uma clorofcea com 4 clulas, como Scenedesmus, contada como um organismo. Jpara as diatomceas, como por exemplo uma Asterionella, conta-se cada clula como um organismo,pois os indivduos esto unidos apenas por espinhos ou por mucilagem .

No uso do retculo para a contagem de organismos, necessrio estabelecer alguns critrios paracontagem: por exemplo, quando os indivduos no esto totalmente dentro da grade, como mostrado noesquema a seguir, pode-se estabelecer que se o organismo estiver com mais de 50% da sua rea forado retculo, este no dever ser contado, e se estiver com mais de 50% da sua rea dentro, dever sercontado (Figura 1).


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Figura 1 Exemplo de contagem de organismos no Retculo de Whippe

No contar

este

organismo

Contar este

organismo

Fonte: APUD CETESB (2005).

Observao 3: O aumento ideal para a contagem em microscpio invertido de 400X.

Dependendo da concentrao de organismos, a subamostra ser analisada integralmente ouparcialmente por meio da contagem de transectos ou campos aleatrios, com o auxlio do retculo deWhipple calibrado, como esquematizado na figura 2.

Figura 2 Esquema de contagem por transecto ou por campos


7.4.2 Contagem de clulas de cianobactriasPara atender Portaria MS n 2914 (BRASIL, 2011) e Resoluo CONAMA n 357 (BRASIL, 2005),as estaes de tratamento de gua devem providenciar a contagem de clulas de cianobactrias para omanancial de abastecimento. A metodologia descrita nessa Norma Tcnica foi desenvolvida com basenas orientaes descritas em Lawton et al. (1999) e Chorus e Bartram (1999).

O grupo das cianobactrias possui formas filamentosas, coloniais e solitrias. Para a contagem declulas das colnias e filamentos, podem ser utilizados os seguintes mtodos:

a) Formas coloniais As clulas de cianobactrias coloniais so agregadas por bainhas oumucilagens. Para facilitar a contagem de clulas, quando estes organismos so dominantes, porexemplo, em floraes, recomendvel dissolver estas mucilagens e desmembrar as colnias emclulas soltas.

Uma das metodologias de dissoluo da mucilagem a hidrlise alcalina. Adiciona-se hidrxido depotssio (KOH) ou de sdio (NaOH) 0,1mol/L na amostra, na proporo de 1:1, de forma que aconcentrao final seja 0,05M para o KOH e 0,075M para o NaOH. Colocar a soluo em estufaentre 80C e 90C por 30min (o recipiente dever ser tampado para evitar a evaporao da amostra).Aps este perodo, colocar numa cmara de Utermhl e visualizar no microscpio invertido paraconfirmar se toda a mucilagem foi dissolvida. Em caso positivo, contar as clulas soltas. Se amucilagem ainda no estiver completamente dissolvida ou a amostra estiver muito densa, pode serdiluda outras vezes, sempre lembrando de multiplicar o resultado da contagem pelo nmero dediluies para se obter a concentrao final.

Aps o procedimento de dissoluo de mucilagem, a amostra pode ser preparada em cmaras deSedgwick-Rafter ou em cmaras de Utermhl para quantificao. Com este mtodo no possvelidentificar os organismos.

Transectos

Campo


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Outra metodologia consiste em utilizar o retculo de Whipple (figura 3) como auxiliar na contagem declulas de formas coloniais. Pode-se contar quantas clulas ocupam cada quadrado do retculo,calcular a mdia dos resultados obtidos para 10 a 30 quadrados e multiplicar esse nmero pelonmero de quadrados ocupados pela colnia.

Figura 3 Ilustrao do Retculo de Whipple


b) Formas filamentosas As cianobactrias filamentosas so formadas por clulas conectadas porparede celular, formando os filamentos que, envoltos pela bainha, so denominados tricomas. Asclulas podem ser cilndricas, quadrticas, mais longas que largas, mais largas que longas ouesfricas, dependendo da ordem, famlia ou gnero a que pertenam.

A contagem de clulas de cianobactrias filamentosas pode ser feita de duas maneiras. Em caso deamostras com filamentos de comprimento uniforme, contam-se as clulas dos primeiros trintafilamentos e calcula-se uma mdia de clulas por filamento para cada espcie, valor queposteriormente ser multiplicado pelo nmero de filamentos contados. No caso de amostras com

filamentos de comprimento muito varivel, pode-se contar o nmero de clulas por quadrado doretculo e multiplicar pelo nmero de retculos que os filamentos ocupam.

c) Amostras mistas com formas coloniais e filamentosas Em amostras com colnias e filamentosnas quais no seja possvel a dissoluo da mucilagem, pode-se utilizar o retculo de Whipple paraauxiliar na contagem. Caso as colnias sejam muito densas, e levando-se em conta que estaspodem possuir vrias camadas de clulas, pode-se multiplicar o nmero de clulas contado em cadaquadrado do retculo por 2, ou pelo nmero de camadas existentes, para obter uma estimativa maisprecisa.

Quanto s filamentosas, caso no seja possvel a visualizao das clulas em aumento de 40X, podeser medido o comprimento do tricoma e, com auxlio de bibliografia especializada, verificar o

comprimento celular e assim estimar o nmero de clulas por tricoma.

7.4.3 Clculo para contagens realizadas em cmara de Sedgwick-RafterA contagem de organismos de uma faixa horizontal corresponder ao nmero de organismos contidosno retngulo cuja largura ser delimitada pelo retculo de Whipple (que igual a 380m, ou 0,038cm, noexemplo citado no item 7.3.1) e o comprimento ser o da prpria cmara (5cm). A rea desse retngulodo exemplo ser igual a 0,19cm2. Como a rea da cmara de Sedgwick-Rafter (Anexo A, figura 4) de10cm2 e a rea examinada de 0,19cm 2, dividindo-se a primeira pela segunda, obter-se- o fator decontagem para esse microscpio.

(1)

Onde:

F = fator de contagem

Colnia

Filamento

F=A/a


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A = rea da cmara

a = rea de faixa horizontal

Observao 4: As duas reas devem ser expressas na mesma unidade, no caso em cm.Exemplo: F = 10 / 5 x 0,038 = 52,63

Para a contagem de organismos numa faixa vertical, utiliza-se o mesmo raciocnio. Neste caso, o fatorde contagem obtido com a mesma frmula acima, porm o comprimento da cmara 2 cm.

(1)

Onde:

F = fator de contagem

A = rea da cmaraa = rea da faixa vertical

Exemplo: F = 10/2 x 0,038 = 131,58

Multiplicando-se o nmero de clulas ou organismos de um mesmo gnero ou espcie encontrados emuma faixa da cmara pelo fator de contagem, obter-se- o nmero de clulas ou organismos destegnero ou espcie contidas em 1mL da amostra preservada com lugol. Se a amostra foi concentrada 10vezes, o fator de contagem ser dividido por 10 antes de se calcular o nmero de organismos por mL.O fator de contagem de organismos em 1 ou mais campos obtido dividindo-se a rea da cmara pelarea total dos campos delimitados pelo retculo de Whipple.

(2)

Onde:

F= Fator de contagem

A = rea da cmara

n = nmero de campos analisados

a = rea do retculo de Whipple

Exemplo: Se forem analisados 10 campos, o fator ser

F = 10/10 x (0,038)2= 692,52

Quando se tem uma densidade muito elevada de organismos por campo (10 ou mais), a contagem porcampos aleatrios, utilizando-se uma rea menor, mais indicada do que a por transectos, quedemanda maior tempo e esforo. O nmero de campos ir depender da densidade da amostra e daacuracidade desejada.

O nmero de organismos/mL ou clulas/mL calculado multiplicando-se o nmero de unidadescontadas pelo fator de contagem. Quando a amostra fixada com formol 2%, este representa 5% dovolume total da amostra, e nesse caso, o fator deve ser dividido por 0,95.

F = A/ n . a

F=A/a


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7.4.4 Clculo para contagens realizadas em cmara de UtermhlEm microscpio invertido pode-se fazer a contagem da cmara por transectos correspondentes aodimetro da cmara, e multiplicar pelo fator de concentrao, obtendo-se o nmero de organismos. Adeterminao do fator de concentrao feita dividindo-se a rea da cmara pela rea total dostransectos lidos.

Exemplo: Um invertoscpio com objetiva de 40X e ocular de 10X, equipado com retculo de Whippleque mede 192m de lado. A rea interna de uma cmara de invertoscpio corresponde de um crculocujo dimetro igual a 2,6cm.Portanto:

(3)

Onde:

A= rea da cmara de Utermhl

R= raio da cmara de Utermhl

= 3,1416

A= 3,1416 x (1,3)2= 5,3093cm2

O transecto ter 0,0192cm de largura (lado do retculo de Whipple) por 2,6cm de comprimento (dimetroda cmara).

Assim:

(4)

Onde:

F = Fator de concentrao

A = rea da cmara de Utermhl = 5,3093cm2

a'' = rea de um transecto = 0,0192 x 2,6 = 0,0499cm2

v= volume da cmara (mL)

Em uma cmara com volume de 2mL para a qual foram lidos dois transectos, teremos:

a = 0,0499 x 2 = 0,0998

F =2

0998,0/3093,5= 26,5997= 26,60

Multiplicando-se o fator assim obtido pelo nmero de organismos ou clulas encontrados nos doistransectos, ter-se- o nmero de organismos ou clulas por mL de amostra preservada com lugol. Alocalizao de um transecto na cmara feita pelo retculo de Whipple, superpondo-o a borda da

cmara. A partir deste ponto, inicia-se o exame at que o retculo atinja o outro lado da cmara. Quandoa amostra preservada com formol 2%, este representa 5% do volume total da amostra. Neste caso,para o clculo do fator, deve-se subtrair 5% do volume da cmara.

A = R2

F = A /a''v


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Observao 5: Transectos facilitam a contagem pela maior rapidez e porque minimizam os efeitos dadistribuio no-homognea dos organismos na amostra, j que raramente a sedimentao totalmente homognea, tendendo a concentrar organismos mais na borda ou no centro. Devem sercontados tantos transectos quanto forem necessrios para se atingir o nmero mnimo deorganismos/clulas, definido pelo limite de erro aceitvel; portanto, devem ser calculados fatores deconcentrao que reflitam o nmero de transectos lidos.

7.5 Estimativa de biomassa: clculo de UPAEm exames de gua para abastecimento, alm da contagem e identificao, pode ser calculada a reade cada organismo, sendo adotada para isso uma unidade padro de rea (UPA), cujo valor 400 2.

Utiliza-se um fator de correo para o retculo de Whipple do microscpio, para a unidade padro 400 2.Por exemplo, se o quadrado menor do retculo de Whipple medisse 20 de lado, sua rea seriaexatamente a de 1UPA. Como difcil adaptar o microscpio de tal forma que a rea do quadradomenor seja de 1UPA, calcula-se o fator de correo da seguinte maneira: para um retculo que possua380 de lado, o quadrado menor ter 7,60 de lado. A rea deste quadrado menor ser de 57,76 2.

Dividindo-se 4002 por 57,76 2 verifica-se que a rea deste quadrado 6,93 vezes menor que 1UPA,

portanto 6,93 ser o fator de correo.

Durante o exame, cada alga superposta aos quadrados pequenos do retculo de Whipple, anota-se onmero de quadrados que ela ocupa. Como no exemplo acima, cada quadrado tem uma rea 6,93vezes menor que 1UPA. Dividindo-se o nmero de quadrados ocupados por uma alga por 6,93, tem-seo nmero de UPA que ela realmente ocupa.

7.6 Estimativa do erro na contagemNa determinao do nmero de organismos fitoplanctnicos presentes em uma amostra procura-se,para assegurar a representatividade da mesma, que o nmero quantificado seja o mais prximopossvel do tamanho da populao natural. No entanto, em funo dos erros inerentes ao mtodo,procura-se avaliar a probabilidade de que o valor medido se encontre, dentro de certos limites, em tornodo valor verdadeiro. Ao se iniciar a contagem, essencial avaliar o nvel de preciso requerido para adeterminao em questo. importante verificar se a distribuio dos organismos no fundo da cmara aleatria, e caso no seja, preciso fazer uma nova cmara.

Para um limite de confiana de 95%, o erro de contagem expresso em porcentagem pode ser estimadopela frmula:

(5)

Onde N o nmero de unidades contadas (organismos ou clulas).

7.7 Identificao dos organismos fitoplanctnicos O nvel de identificao depende dos objetivos do estudo e do treinamento dos analistas. O treinamentode tcnicos para a contagem de fitoplncton, mesmo com experincia anterior em microscopia econhecimento prvio de morfologia celular, demorado, at para identificao apenas em nvel de gnero.

As espcies dominantes, ou problemticas, devem ser avaliadas em nvel especfico.

Para estudos mais gerais e monitoramento de estaes de tratamento pode-se utilizar identificao emnvel de gnero, porm estudos ecolgicos requerem identificao em nvel especfico.

Conforme discutido no item 6.2, para a correta identificao de espcies de cianobactrias filamentosas,diatomceas e flagelados, importante a observao prvia da amostra no preservada, pois o tipo demovimento pode ter carter taxonmico e a forma e colorao podem ser alteradas na preservao.

erro de contagem (%) = x 100 % 2N


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Aps reconhecimento da amostra viva, procede-se a preservao, identificao e contagem dosorganismos.

Para a identificao dos organismos deve ser utilizada bibliografia especializada (Referncias bsicaspara identificao do fitoplncton de gua doce).

8 Expresso dos resultados

A seguir sero apresentadas as maneiras de expresso dos resultados.

8.1 Exame qualitativo e semi-quantitativoO resultado do exame da comunidade fitoplanctnica de um manancial pode ser expressoqualitativamente, por meio da listagem dos txons observados na amostra analisada, ou semi-quantitativamente, pela frequncia ou abundncia relativa dos organismos presentes na amostra,quando no h condies de avaliar o volume da amostra. Neste ltimo caso a quantidade deorganismos presentes na alquota contada convertida para frequncia de ocorrncia, segundo aexpresso:

(6)

Onde:

Spi= espcie i

Ni= nmero de organismos da espcie i

N = nmero total de organismos na alquota.

8.2 Exame quantitativoO resultado do exame de fitoplncton em mananciais expresso geralmente em nmero deorganismos/mL. O resultado do exame de fitoplncton em guas para abastecimento pode serexpresso, alm do nmero de organismos/mL, em nmero de UPA/mL ou de clulas, como cls./mL.

Observao 6: Certos tipos de organismos, quando excedem determinado nmero de UPA/mL ounmero de clulas, podem causar problemas de sabor e/ou odor, obstruo de filtros e/ou toxicidade nagua.

9 Controle laborator ial e estocagem

Para uma eventual necessidade de re-ensaio ou exame complementar, sugere-se que umasubamostra seja mantida em um frasco devidamente etiquetado. A etiqueta deve conter todas asinformaes necessrias para a pronta identificao da amostra. recomendado manter um registrode todas as amostras analisadas e estocadas. A estocagem, especialmente de amostras preservadascom lugol, deve ser no escuro, com reposio peridica do conservante que tem durao de at 3meses. O prazo de estocagem depende do preservativo utilizado e do armazenamento adequado, epode variar de meses (amostras preservadas com lugol) a alguns anos (amostras preservadas comformol).

10 Regist ro de dados e apresentao dos resultados

% Spi =

Nix 100N


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O laboratrio deve manter um sistema informatizado, com possibilidade de backup, para fazer oregistro e armazenamento dos dados analisados. O sistema deve permitir que os resultados sejamapresentados na forma de Boletim de Anlise impresso ou eletrnico (Anexo D).

11 Referncias bsicas para identi ficao do fitoplncton de gua doce

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.../Anexo A


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Anexo A Figuras dos acessrios para anlise de fitoplncton

Figura 1 Retculo de Whipple.


Figura 2 Cmaras de Utermhl de 2 mL

Fonte: Araujo (2012).


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Figura 3 Cmaras de 10 mL e 5 mL


Figura 4 Cmara de Sedgwick Rafter


.../Anexo B


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Anexo B Exemplo de ficha de anl ise para contagem de clulas de c ianobactrias

No. da amostra: _____________ Data da Anlise :_______________________Local de Coleta: _______________________________ Preservao:___________________________

Fator de Concentrao (F.c): Erro de Contagem:N

2X100 = _______________

Analista: ___________________

CONTROLES: Ausncia de bolhas: Distribuio homognea: Boa sedimentao:

SEDIMENTAO Incio:________ LEITURA Campos : TRANSCRIO: Data:__________Trmino:______ Transectos : VERIFICAO: Data:_________

CIANOBACTRIAS(1) No. Cls. (2) TOTAL (1) x (2) x F.c.Aphanizomenon 1

Cuspidothrix

Aphanocapsa 1

Aphanocapsa 2

Dolichospermum-Anabaena 1

Dolichospermum - Anabaena 2

Cylindrospermopsis raciborskii

Cylindrospermopsis/Raphidiopsis

Geitlerinema amphibium

Microcystis 1 = 20

Microcystis 2 = 16

Microcystis 3 = 12

Microcystis 4

Sphaerocavum 1 = 20

Sphaerocavum 1 = 16

SphaerocavumFonte: Adaptado do formulrio interno da CETESB (2012).Nota: Exemplo meramente ilustrativo, os formulrios internos esto sujeitos a alteraes .

.../ Anexo C


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Anexo C Exemplo de ficha de anlise de fi toplnctonNo. da amostra: _____________ Data da Anlise :_______________________Local de Coleta: __________________________Preservao:_______________________

Fator de Concentrao (F.c): Erro de Contagem:N

2X100 = __________

Analista: ___________________

CONTROLES: Ausncia de bolhas: Distribuio homognea: Boa sedimentao:

SEDIMENTAO Incio:________ LEITURA Campos: TRANSCRIO:Data:__________

Trmino:______ Transectos : VERIFICAO: Data:__________

Fonte: Adaptado de formulrio interno da CETESB (2012).Nota: Exemplo meramente ilustrativo, os formulrios internos esto sujeitos a alteraes.

.../Anexo D

Cd. Alga CIANOBACTRIAS No. Organismos No. UPA

DIATOMCEAS No. Organismos No. UPA

CLOROFCEAS No. Organismos No. UPA

FITOFLAGELADOS No. Organismos No. UPA

DINOFLAGELADOS No. Organismos No. UPA

XANTOFCEAS No. Organismos No. UPA

Observao:


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Anexo D Exemplo de bolet im de anl ise de fi toplnctonSIGLA/ Nro./Ano

BOLETIM DE ANLISESFITOPLNCTON CONTAGEM DE CLULAS DE CIANOBACTRIAS

N Amostra: 122222 N da O.S.: 22.222.222 Descrio da amostra: B1-gua Doce

Data Coleta: 02/02/12 Data Entrada: 02/02/12 Data Emisso: 12/02/12

Dados do Cliente:Nome: CETESBEndereo: Av. Professor Frederico Herman Jr n345Municpio: So Paulo UF: SP

Dados de Campo:Manancial: Reservatrio Principal Cdigo Ponto:Local: So PauloColetor: Jos

Fator de concentrao: 58.34RESULTADOS ANALTICOS

Grupo Identificao NORG/mLCIANOBACTRIAS

Aphanizomenon gracile 58Aphanocapsa delicatssima 350

CLOROFICEAS

Desmodesmus comunis 117Chlorella sp. 58

DIATOMACEAS

Aulacoseira granulata 117

FITOFLAGELADOS

Trachelomonas volvocina 58

TOTAL: 758

Nmero estimado de clulas de CIANOBACTRIAS = 820 CL./ML

Observaes:OS DADOS DESTE BOLETIM NO SO REAIS.

Metodologia:

______________________ ____________________BILOGO RESPONSVEL GERENTE DE SETORCRBio: CRBio:REG: REG:

Este Boletim de Anlise s pode ser reproduzido por inteiro e sem nenhum alterao.Os resultados desta anlise referem-se to somente amostra encaminhada.

Fonte: Adaptado do Boletim da CETESB (2012).Nota: Exemplo meramente ilustrativo, os formulrios internos esto sujeitos a alteraes.

Fitoplâncton de Água Doce

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