FITOESTEROLES

Los fitoesteroles pertenecen a la familia de los triterpenos. Tienen una estructura qumica muy similar a la del colesterol. Son de origen vegetal y se encuentran en los frutos, semillas, hojas y tallos de prcticamente todos los vegetales conocidos, por lo que los incorporamos de forma habitual al organismo a travs de la dieta.

Aunque se han identificado ms de 25 estructuras diferentes, tan slo tres se encuentran en mayor proporcin (-sitosterol, campesterol y estigmasterol); entre los tres constituyen el 95-98% de los fitoesteroles identificados en extractos vegetales.

Numerosas evidencias cientficas han demostrado que los fitoesteroles tienen un importante efecto hipocolesterolmico (debido a la diferencia estructural en la cadena lateral de los fitoesteroles respecto al colesterol).

En este sentido, los fitoesteroles son capaces de:

Reducir tanto los niveles de colesterol total como los de colesterol ligado a protenas de baja densidad (LDL). Inhibir la absorcin intestinal de colesterol (tanto el procedente de la dieta como el endgeno) debido a su mayor hidrofobicidad (compiten con el colesterol y lo desplazan de las micelas de absorcin); dosis elevadas de fitoesteroles son capaces de reducir la absorcin de colesterol un 30-50%. Actuar como inmunomoduladores, siendo muy beneficiosos en la prevencin del cncer de colon, cncer de mama, control de la hiperplasia prosttica benigna y en el dao tisular asociado a la inflamacin.

Estudios recientes sugieren que una dieta rica en fitoesteroles puede ser fuertemente protectora frente a estos tipos de cncer, desencadenando respuestas tales como: inhibicin del crecimiento tumoral, promocin de la apoptosis, aumento de la respuesta celular de los linfocitos T, promocin de la expresin y de la actividad de factores endgenos inhibidores de la angiognesis, accin antimicrobiana, antifngica y antibacteriana.

Actualmente, los fitoesteroles ms importantes (-sitosterol, campesterol y estigmasterol) se obtienen mediante un proceso extractivo de la materia prima vegetal.

EXTRACCIN DE FITOESTEROLES

Encontr dos mtodos de extraccin de fitoesteroles:

1. ANLISIS DE LA FRACCIN DE FITOESTEROLES POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRA DE MASAS (CG-EM).

2. PRODUCCIN Y EXTRACCIN DE FITOESTEROLES EN CULTIVOS DE CLULAS VEGETALES IN VITRO.

1. ANLISIS DE LA FRACCIN DE FITOESTEROLES POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRA DE MASAS (CG-EM).

1.1. Obtencin de la materia insaponificable.

Se realiz la extraccin y cuantificacin de la materia insaponificable del aceite de las semillas de Vitis labrusca L. (uva Isabella) de acuerdoa la norma ICONTEC 235-2 (126).

1.2. Separacin de la fraccin de fitoesteroles.

La separacin de la fraccin de fitoesteroles de la materia insaponificable se hizo por separacin en fase slida, empleando la columna Restek, Silica, SPE fase normal, volumen 3ml, de 500mg. Se acondicion la columna con 3 mL de Hexano, luego se llevo a sequedad con aire y posteriormente se aplic la muestra. Para lograr las mejores condiciones de separacin de la fraccin de fitoesteroles se ensayaron dos sistemas de elucin, en los cuales la muestra era soluble.

Sistema 1.(Hexano: Acetato de Etilo 9:1)

Se eluyeron, la fraccin 1 (F1) con 1.5 ml de Hexano: Acetato de Etilo 9:1 y la fraccin 2 (F2) con 2ml de Acetato de Etilo; para un volumen total de elucin de 3.5ml.

Sistema 2.(Hexano: Diclorometano 6:4)

Se eluyeron, la fraccin 1 (F1) con 5ml de Hexano: Diclorometano 6:4 y la fraccin 2 (F2) con 2ml de Diclorometano; para un volumen total de elucin de 7ml.

Se us como control la cromatografa en capa delgada (CCD), las fracciones obtenidas de la separacin en fase slida se sembraron en placas de vidrio con Slica gel 60de 7.0 x 2.5 cm, se emple como fase mvil Hexano: ter etlico: cido Actico (8: 2: 0.1) utilizado previamente por otros autores para el estudio de esteroles, y se emple como patrn, colesterol (P). (122). Se utilizaron como reveladores Vapores de Yodo y Acido fosfomolbdico al 10% en etanol absoluto

1.3. Preparacin del derivado de la fraccin de fitoesteroles.

La fraccin de fitoesteroles separada se derivatiz adicionando 125 L del reactivo (N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamida-trimetilclorosilano), disponible bajo la denominacin (Silyl-991(BSTFA-TMCS)) 99:1 y 125 L de piridina. La mezcla se agit en vortex por 10 segundos y fue incubada en bao a 70 C por 20 minutos, se dej enfriar para su posterior anlisis cromatogrfico.

1.4. Anlisis cromatogrfico del derivado obtenido de la fraccin de fitoesteroles.

El anlisis del derivado obtenido de la fraccin de fitoesteroles, se realiz en un cromatgrafo de gases acoplado a espectrometra de masas (CG-EM) marca Shimadzu QP2010, las condiciones de anlisis se basan en estudios anteriores y estn descritas en la tabla 1.

Tabla 1. Condiciones de anlisis de fitoesteroles del aceite de las semillas de Vitis labrusca L. (uva Isabella) por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (CG-EM).

CONDICIONESFITOESTEROLES

CROMATGRAFOShimadzu QP2010

COLUMNARtx-5sil MS Crossbond 30m =0.25mm Espesor de particula = 0.25m

DETECTORMasas

TEMPERATURA DE INYECTOR310C

PROGRAMA T(1) T(1)150C/2min

RATA (1)8C/min

T(2)320C/6min

GAS DE ARRASTREHelio

FLUJO0.7 mL/min

MODO DE INYECCIONSplitless

MODO DE ADQUISICIN DE DATOSESCAN

VOLUMEN DE INYECCION1.0 L

POTENCIAL DE IONIZACIN (PI)70eV

2. PRODUCCIN Y EXTRACCIN DE FITOESTEROLES EN CULTIVOS DE CLULAS VEGETALES IN VITRO.

El grupo de investigacin Protemica y genmica funcional de plantas de la Universidad de Alicante ha desarrollado un novedoso procedimiento que incrementa la produccin y extraccin de fitoesteroles en cultivos de clulas vegetales in vitro. Para ello, se adiciona al medio de cultivo ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de metilo. Tras su cultivo en determinadas condiciones, se obtienen esteroles vegetales con rendimientos superiores a las actuales tcnicas de extraccin a partir de la materia prima vegetal. Este mtodo permite obtener una produccin de fitoesteroles estable, independiente de factores geogrficos, estacionales y ambientales, con requerimientos de especio reducidos y con un proceso de purificacin y escalado industrial ms sencillo.

2.1. DESCRIPCIN

Con el objetivo de superar las limitaciones de los mtodos clsicos de extraccin a partir de la materia prima vegetal, se va a recurrir al cultivo de clulas vegetales in vitro, un rea emergente y con gran potencial de crecimiento en la sntesis de compuestos bioactivos con valor aadido. En este sentido, se ha desarrollado un procedimiento novedoso para producir y extraer fitoesteroles con un rendimiento elevado. Este procedimiento comprende las siguientes etapas:

1) Aadir ciclodextrinas al medio de cultivo (las ciclodextrinas se seleccionan del grupo que comprende ciclodextrina metilada aleatoriamente o ciclodextrina hidroxipropilada) y, opcionalmente, jasmonato de metilo.

2) Poner en contacto clulas potencialmente productoras de fitoesteroles (pueden provenir de hojas, races, semillas, flores, pistilos, anteras, vainas, polen, embriones, protoplastos, clulas meristemticas, vulos, callos, o clulas de cualquier lnea celular capaz de producir fitoesteroles, bien de forma natural o tras modificacin gentica) con el medio de cultivo obtenido en el punto anterior. Estas clulas proceden de plantas de gneros que se seleccionan de la lista que comprende: Rosa, Daucus, Capsicum, Lactuca, Catharanthus, Lycopersicon, Taxus y Vitis.

3) Incubar la composicin obtenida en el punto anterior bajo unas determinadas condiciones de temperatura, humedad y tiempo (el fotoperiodo se ajusta entre 12-16 horas de luz y 8-12 horas de oscuridad).

4) Separar los fitoesteroles obtenidos del medio de cultivo.

Con este novedoso procedimiento se consigue un incremento en la produccin y extraccin de fitoesteroles a partir de cultivos de clulas vegetales con rendimientos elevados.

PRINCIPALES VENTAJAS DE LA TECNOLOGA

Los cultivos de clulas vegetales in vitro son independientes de: factores geogrficos, estacionales y ambientales.

Son sistemas de produccin estables (aseguran una obtencin continua de compuestos con calidad y productividad uniforme).

Los requerimientos de espacio para el desarrollo de la produccin son reducidos.

El proceso de purificacin del compuesto de inters es ms fcil (se pueden optimizar y ajustar los parmetros de crecimiento celular para facilitar su liberacin al medio de cultivo).

La produccin de fitoesteroles se puede realizar a gran escala en biorreactores se forma sencilla y barata, pudiendo alcanzar niveles econmicamente rentables para su comercializacin.

Existe la posibilidad de obtener productos nuevos que no son sintetizados por las plantas de forma natural.

Existen otros factores que permiten incrementar la productividad (por ejemplo, la elicitacin del cultivo celular).

PRODUCCIN BIOTECCNOLOGICA, RECUPERACIN Y PURIFICACIN

1. SISTEMA DE EXPRESIN

Una de las mayores fuentes de fitoesteroles para producir alimentos funcionales o suplementos alimenticios es el aceite de pino. El aceite de pino se utiliza en el proceso de elaboracin de papel y contiene una mezcla de fitoesteroles y fitoestanoles que han llamado la atencin, y por consecuencia se ha incrementado el numero de patentes de procesos de extraccin de fitoesteroles de aceite de pino. Por otro lado, otras fuentes mayores de fitoesteroles incluyen el destilado de desodorizacion, un residuo proveniente de la refinacin de aceites vegetales (principalmente el aceite de soya). La fuente que usaremos para ejemplificar su proceso de recuperacin y purificacin es el aceite de pino, los contaminantes que generalmente se presentan en el aceite son una composicin compleja compuesta de : acidos grasos, tocoferoles hidrocarburos, aldehdos y cetonas que van a requerir de las distintas etapas de purificacin para ser removidos del suplemento y obtengamos de la manera mas pura posible la recuperacin de los fitoesteroles.

2. RECUPERACIN Y PURIFICACIN

Se propone un proceso para la produccin industrial de selenometionina. Este consiste en el cultivo de S. cerevisiae en un reactor con agitacin continua a 25C en condiciones aerobias. El medio es suplementados con selenito de sodio durante la fase logartmica de crecimiento de la levadura y el cultivo es retirado al llegar a la fase estacionaria. Se recolecta la biomasa del reactor y se somete a centrifugacin para recuperar el precipitado conteniendo las clulas enriquecidas con seleniometionina que deben ser lavados para eliminar los restos de selenio.

La biomasa es pasteurizada para la eliminacin de trozos de levadura que pudieran enterferir con la vida de anaquel del producto, se sugieren tiempos de 45 minutos a 85C. el producto, aun con cierto porcentaje de humedad, es secado en un secador de tambor donde se reduce la humedad hasta un 5% y finalmente es encapsulado.

FORMULACIONES

En los ltimos aos, se ha puesto mucho esfuerzo en el desarrollo de varios tpos de formulaciones para fitoesteroles y estanoles. La primera generacin de productos de fitoesteroles se enfocaba en esteroles o estanoles formulados en alimentos con alto contenido en grasas tales como margarinas, aderezos, queso crema, leche, mayonesa, queso, pasta, yogurt, snacks, bebidas, aceite de cocina, y mas. Mentras que la segunda generacin de productos de esteroles/estanoles se basan principalmente en formulaciones bajas en grsas, como tabletas.

El primer productor fortificado con fitoesteroles que se vendio fue una margarina, benecol, que contiene estanoles provenientes de semillas de colza esterificados con acidos grasos, se comercializo en 1995 en Finlandia y al 2002 se haban vendido 150 millones de porciones diarias, posteriormente la empresa comercializo quesos, snacks, aderezos y yogurts, el consumo recomendado por la empresa es de 2g/dia de estanoles. En el ao de 1999 Unilever lanzo un aderezo para ensaladas y margarina enriquecida con esteroles de plantas con el nombre de TakeControl.

Otro de los primeros productos de fitoesteroles es el Cytellin, el cual contiene fitoesteroles libres como el sitosterol. De dicho producto se recomendaban altas dosis de 25g/dia o mas, y su eficacia reduciendo niveles de colesterol en el plasma no era confiable, probablemente debido a que los fitoesteroles libres no se encontraban adecuadamente dispersos. Cientficos de Proctor and Gamble (sic) surgieron que prmero se debera esterificar los fitoesteroles a acidos grasos para hacerlos solubles en matrices a base de grasas como aceites vegetales, pero fracasaron al generar el producto comercial. Mas adelante Raisio se dedico a hacer margarinas enriquecidas con fitoesteroles.

En la tabla 2 se muestran las formulaciones de algunos alimentos funcionales y suplementos alimenticios.

En la actualidad la tendencia del mercado de nutraceuticos se centra en el consumo de suplementos en forma de capsulas, por ejemplo el suplemento fitoesteroles de GNC de 800g, el proveedor establece que ayuda a mantener niveles sanos de colesterol y bloquea la absorcin del colesterol proveniente de la dieta, adems del contenido de fitoesteroles contienen excipientes como el carbonato de calcio que le provee la calidad de consistencia necesaria, celulosa que actua como agente de separacin de compuestos, se especifica que se mantega en un lugar frio y seco.

Otro suplemento que se comercializa actualmente es por parte de physiologics con el nombre de Phytosterol Complex 1000mg en forma de capsulas de gel que contiene un complejo de fitoesteroles de 1000mg de los que 840mg son beta-sitoesterol, campesterol, stigmasterol. Los excipientes reportados por el proveedor son gelatina que ayudan principalmente al aumento de viscosidad y forma parte del envolteorio, glicerina para aportar en el soporte. El proveedor recomienda que se tomen 2 capsulas diariamente antes de la comida.

Una de la preocupacin con respecto a la estabilidad de los fitoesteroles se relaciona con la estabilidad oxidativa ya que los esteroles como compuestos grasos insaturados son susceptibles a la oxidacin, aunque se tiene poca informacin con respecto al efecto biolgico de la oxidacin de los fitoesteroles se cree que los oxidos de esteroles pueden estar vinculado a una serie de enfermedades humanas, ejerciendo un efecto perjudicial sobre el metabolismo lipdico y la funcin celular.

La formacin de especies de aceites vegetales enriquecidos con fitoesteroles se evaluo simulando el uso en casa (144C para calentar 600g de papas), se realizo un anlisis analtico (GC/MS) que indico que no se formaron especies oxidativas significativas durante el calentamiento.

FITOESTEROLES EN ALIMENTOS

Se encuentran en casi todos los tallos, frutos y hojas vegetales.

Las principales fuentes son los aceites vegetales, semillas oleaginosas, en cereales, legumbres, frutos secos.

No son sintetizados por el organismo y son escasamente absorbidos por el intestino. Pueden estar en forma cristalina y como compuestos conjugados, en los cuales el grupo 3b-OH del esterol est esterificado de cidos grasos libres, cidos fenlicos en su mayora y en menor proporcin glicosilados.

La ingesta diaria, es variable, ya que depende de los hbitos alimentarios, encontrndose en un rango de 160 a 500 mg/da. La dieta occidental, ofrece unos 100-300 mg de fitosteroles al da, con un consumo en el norte de Europa de 200-300 mg/da, mientras que los japoneses y los vegetarianos consumen alrededor de 300-450 mg/da. Los fitoestanoles, en la dieta occidental contiene entre 20 y 50 mg por da.

El contenido de fitoesteroles vara mucho entre los alimentos, siendo mayor en las nueces y aceites. En cereales: maz (178 mg/100g) y trigo (69 mg/100g), coles, esprragos (24 mg/100g), lechuga (10 mg/100g), cebolla (15 mg/100g).

En frutas: manzana (12 mg/100g), fresa, pltano (16 mg/100g). Es abundante en frutos secos: sacha inchi (75,49 mg/100g de estigmasterol y 74,56 mg/100g de -sitosterol), cacahuate (220 mg/100g), almendras (143 mg/100g), nuez (108 mg/100g) y ms abundante an, en aceites de maz (850 mg/100g), girasol (350 mg/100g), soya refinada (340 mg/100g) y crtamo (444 mg/100g), aceite de semilla de calabaza (162.142.63 de -sitosterol, 42.051.24 Campesterol, 1.680.01 Stigmasterol, 27.240.86 Stigmastenol mg/100g)

En ostiones sin coral (7,822,35 de -sitosterol, 5,491,72 de campesterol y 16,261,57 de stigmasterol) y con coral (4,930,58 de -sitosterol, y 15,462,56 de stigmasterol mg/100g). En ambos tipos de muestras, destaca el alto contenido de fitoesteroles, un componente habitualmente no evaluado en muestras de animales marinos.

Investigaciones con el aceite de semilla de adormidera (Papaver sommniferum L.) determin la concentracin total de esteroles, desde 1099.84 mg/kg a 4816.10 mg/kg, con un valor medio de 2916.20 mg/kg. El principal esterol fue el -sitosterol, que vari desde 663.91 a 3244.39 mg/kg; el campesterol, que vari desde 228.59 a 736.50 mg/kg; y el 5-avenasterol, que vari desde 103.90 a 425.02 mg/kg.