fismiktugas
-
Upload
rahmiaminimahardik -
Category
Documents
-
view
216 -
download
0
description
Transcript of fismiktugas
7/17/2019 fismiktugas
http://slidepdf.com/reader/full/fismiktugas 1/1
5. Teknik yang digunakan untuk menguji
membran menargetkan dan penyisipan
Teknik yang digunakan untuk menguji
penargetan dan penyisipan membran dapat
dijelaskan secara in vivo dan in vitro. Teknik ini
digunakan sebelum mempelajari dan
menggambarkan membran protein secara intensif
Pendekatan genetik digunakan untuk
mengidentifikasi sensitive- suhu dan sekresi sensitif
-dingin yang dapat merusak mutan E. coli dan
menghasilkan beberapa gen Sec. Contohnya, pada
mutasi sensitif- suhu menghasilkan Sec a dan secY
dan mutasi sensitif – dingin menghasilkan secE,
sec, sec! dan sec" . Seca, SecE,dan protein SecY
berfungsi untuk ekspor protein dan yang Sec, Sec!
dan Sec" memfasilitasi ekspor.
Untuk menguji reaksi kinetic dalam penyisipan
membran, dilakukan secara percobaan in vivo
pulse-chase. translokasi Membran dari
domain hidrofilik dapat diuji dengan
menambahkan protease sel-sel E. coli yang telah
diobati dengan lisoim untuk
mengkonversikannya ke spheroplasts. !al ini
memungkinkan"kses protease ke permukaan luar
membran dalam.
sistem vitro telah dikembangkan oleh Muller dan
#och untuk mempelajari kebutuhan protein
dalam penargetan dan penyisipan membran
protein. $endekatan in vitro digunakan untuk
mengidentifikasi protein yang berfungsi sebagai
perantara dalam penyisipan membran dengan
metode m%&" ' cross-linking.
alam pendekatan ini, sebuah m#$% dipotong
pengkodean protein membran yang dihasilkanyang
tidak memiliki terminasi kodon yang biasanya
melepaskan protein dari ribosom dan protein berhenti
sintesis.
(leh karena itu, dengan menggunakan
pendekatan m%&" dipotong, semua ukuran
protein membran yang baru akan tetap sama
ditambatkan ke ribosom sebagai peptidil-t%&".
)ika vesikel terbalik membran protein dapat
terjebak dalam proses penyisipan membrane.
&uller dan 'och untuk mempela(ari
kebutuhan protein untuk protein menargetkan
dan membran penyisipan. Sistem ini melibatkan
transkripsi dan translasi sistem sel-bebas di
mana Seca ) SEC*, !!+, .S #$% dan !tsY
benar-benar habis oleh studi subfractionationluas /01. Puri- fied Seca, SEC*, !!+, !tsY
dan .S #$% dapat ditambahkan ke sistem
untuk menyelamatkan kekurangan faktor protein
) #$%. Selain itu, vesikel membran terbalik
yang telah habis dari SecE atau komponen
membran lainnya dapat ditambahkan.
&enargetkan untuk membran dapat diperiksa
menggunakan alat tes membran flotasi.
Penyisipan protein membran men(adi terbalik
vesikel membran dapat diu(i oleh generasi
fragmen tahan protease karena fragmen
dimasukkan men(adi membran-dilindungi.
Pendekatan lain in vitro yang kuat dalam
mengidentifikasi protein yang memediasi
membran penyisipan adalah truncat- ed m#$% )
cross-linking metode /21. alam pendekatan
ini, sebuah m#$% dipotong pengkodean protein
membran adalah gener-
diciptakan yang tidak memiliki terminasi kodon
yang biasanya melepaskan protein dari ribosom
dan protein berhenti sintesis. 3leh karena itu,
dengan menggunakan pendekatan m#$%
dipotong, semua ukuran protein membran yang
baru lahir yang sama tetap ditambatkan ke
ribosom sebagai peptidil-t#$%. 4ika terbalik
vesikel membran ditambahkan ke sistem
ter(emahan, protein membran dapat ter(ebak
dalam proses &embran penyisipan. *ifunctional
agen silang dapat ditambahkan pada tahap ini
untuk kovalen menghubungkan protein
membran protein terdekat yang mengkatalisismembran protein penyisipan /51. Pendekatan
ini menun(ukkan bah6a membran yang baru
lahir teins pro berinteraksi dengan bakteri
komponen S#P !!+ dalam sitosol dan dengan
SecYE dan YidC dalam membran 70//5/81.