Enero 2014 1

TRASTORNOS NEUROLÓGICOS POR

AMPLIFICACIÓN DE TRIPLETES

REPETIDOSPilar Mazzetti Soler y el Equipo de Investigadores

del Centro de Investigación en Neurogenética

Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas1

peru.neurogenetica@gmail.comgenetica@icn.minsa.gob.pe

Enero 2014 2

TRIPLETES REPETIDOS Genética mendeliana: mutaciones trasmitidas

establemente de padres a hijos Fenómeno de anticipación: de generación en

generación, menor edad de inicio de una enfermedad 1918: Fleischer, distrofia miotónica 1950 a 1990: Penrose, sesgo de observador, sesgo

de la familia 1991: gen responsable de XFRA con triplete repetido

inestable; expansión de unas docenas a más de mil en una generación => mutación dinámica, genética no mendeliana

Repeticiones encontradas: Trinucleótidos a pentanucleótidos o dodecámeros inclusive

Enero 2014 3

INESTABILIDAD DE TRIPLETES Mutaciones dinámicas: tendencia a aumentar,

ocasionalmente tripletes disminuyen Secuencias repetidas difieren en:

Tipo de secuencia, tamaño del elemento que se repite, localización (codante o no codante)

Paulson, AAN 2011

Enero 2014 4

INESTABILIDAD DE TRIPLETES Repeticiones en región codante: expansión pequeña

(enfermedades tipo 1) Repeticiones en región no codante: expansión masiva (enfermedades tipo 2)) Tamaño: tractos más grandes, mayores expansiones Inestabilidad somática

5’-UTR 3’-UTRIntrónExón Exón

Enfermedad de HuntingtonEnfermedad de Kennedy SCA tipos 1,2,3,6,7 y 17Atrofia dentorubropalidoluysianaDistrofia muscular oculofaríngea

Distrofia miotónicaAtaxia de Friedreich

TIPO I

TIPO II

Enero 2014 5

Características Región codante (1)

Región no codante (2)

Genes Diferentes genes, diferentes funciones, diferentes estructuras

Tipo de secuencia CAG GAA, CTGTamaño del elemento

Decenas de repeticiones

Centenas de repeticiones

Menores expansiones

Mayores expansiones

Impresión del genoma

Paterna Materna, menor fertilidad en varones con gran amplificado

Tejidos Uno, selectivo VariosFenotipo en común No hay manifestaciones durante

muchos añosA mayor amplificación del triplete, menor edad de inicio de la enfermedadA mayor amplificación del triplete, mayor severidad y tasa de progresión de la enfermedad

Enero 2014 6

MECANISMO Se hereda un gen

mutado (AD) o dos (AR)

Inicio y progresión de enfermedad determinada por la tasa de expansión del trinucleótido repetido en ciertas células del cuerpo de la persona afectada

Kaplan S, PLoS Comput Biol 2010

Enero 2014 7Kaplan S, PLoS Comput Biol 2010

Enero 2014 8

CURVA DE INICIO EXPONENCIAL

(G) Tasa de expansión de un alelo en un momento dado del tiempo es una función que se incrementa linealmente en relación con el númerode repeticiones sobre el umbral de inicio. (I) Curva de inicio disminuyeexponencialmente: a mayor número de repeticiones, menor edad de inicio.

Kaplan S, PLoS Comput Biol 2010

Enero 2014 9

RANGO DE EXPANSIÓN DE TRIPLETES REPETIDOS

Patológico

Normal

Premutación

Efecto sobreARN de otros

genesEfecto sobre

gen

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MECANISMOS DE EXPANSIÓN Desplazamiento durante la replicación del

ADN Alineamiento inadecuado y ulterior escisión y

reparación “Crossing over” desigual Repeticiones largas forman estructuras en

fragmentos Okasaki que luego bloquean la replicación de la horquilla de replicación y aumentan probabilidad de expansión

Secuencias normales con tripletes interrumpidos por otras secuencias con tripletes, CAT por ejemplo, estabilizan tractos; al faltar, contribuyen a inestabilidad

Enero 2014 11

IMPRESIÓN DEL GENOMA Expansiones grandes: mayores en meiosis

masculinas Alelos transmitidos por mujeres: incremento

modesto Especialmente claro para enfermedades con

triplete CAG (impresión paterna); espermatozoide: hasta seis divisiones más que ovocito

Expansiones muy grandes en regiones no codificantes: evidencias de impresión genómica con transmisión materna

En DM1 amplificación grande en varones se asocia a baja fertilidad mientras que en mujeres se mantiene fertilidad

Enero 2014 12

IMPRESIÓN GENÓMICA

i: 63 años

i: 41 años

i: adolescencia

i: desde elnacimiento

57 tripletes

90 tripletes 82 tripletes

Impresión del genoma por líneaMaterna: enfermedad de Steinert

i: adolescencia

Impresión del genoma por línea Paterna: enfermedad de Huntington

Enero 2014 13

PATOGÉNESISRegión del gen con repeticiones

Efecto primario de la expansión

Efecto secundario

Enfermedades

No codificante

Pérdida de función de la proteína

Control traslacional, señalización, funciones mitocondriales

FRAXA, FRAXE, FRDA

No codificante

Alteración de funciones del ARN

Interacciones aberrantes entre ARN y proteína

DM1, DM2, FXTAS

Codificante Alteración de funciones de la proteína

Transcripción HD, SCAs, SBMA, DRLPA

Enero 2014 14

ENFERMEDADES TIPO 1 Ocurren en regiones del gen que codifican

para proteínas con propiedades nuevas neurotóxicas

La mayoría = tripletes CAG, codifican para tractos poliglutamina en proteína; repeticiones de corta extensión, herencia AD

Enfermedades progresivas neurodegenerativas con inclusiones intraneuronales, a menudo intranucleares

Tipos: AD: Huntington, DRPLA, SCA 1,2,3,6,7 y 17 Ligada a Xr: atrofia muscular bulbar y espinal

(enfermedad de Kennedy) Distrofia muscular óculo-faríngea: expansión de

GCG con tracto de polialanina en proteína

Enero 2014 15

INESTABILIDAD DE TRIPLETES Y ENFERMEDAD Mecanismos:

Interrupción de secuencia CAG Mecanismos de reparación diferentes Elementos que flanquean la secuencia Metilación CpG Posicionamiento del nucleosoma y del punto de origen de la

replicación Diagnóstico de recuento de tripletes repetidos anormales en

sangre periférica: No toma en cuenta existencia de secuencias intermedias No toma en cuenta amplificación diferente en tejido cerebral

Enfermedad en triplete con escaso margen de amplificación = escaso margen para cambio en proteína, proteína más patológica => más letalidad

Enfermedad en triplete con amplio margen de amplificación = proteína con mayor tolerancia a variación => menor letalidad.

Enero 2014 16

ENFERMEDADES TIPO 2 Expansiones de CTG, GAA, GCC, CAG o CGG

en región no codificante. Ocasionan enfermedad por diferentes

mecanismos: Procesamiento aberrante del ARN,

silenciamiento de genes adyacentes (Steinert) Asociación de hipermetilación que lleva a que el

gen no sea transcrito (FRAXA, FRAXE, epilepsia mioclónica tipo 1)

Tipos: AD: CTG en Steinert o distrofia miotónica tipo 1;

CTG en SCA 8; CAG en SCA 12. AR: GAA en ataxia de Friedreich. Ligada a Xr: GCC en FRAXA; CGG en FRAXE

Enero 2014 17

ENFERMEDAD DE FRIEDREICH Ataxia recesiva más frecuente, triplete GAA en

cromosoma 9; inicio en adolescencia, ataxia y polineuropatía; demencia, miocardiopatía, escoliosis asociado a amplificaciones mayores

Maring, J. Physical Therapy, 2007

Enero 2014 18

Exón 1 Exón 2

GAA

66 - >15006 - 40

•Gen FRDA, proteína frataxina, secuencia repetida GAA con 6 a 40 repeticiones; ataxia con expansiones de 66 a más de 1,000 genera deficiencia de proteína.•Frataxina: proteína mitocondrial esencial que liga hierro.•97% con expansión de los dos alelos.•3% expansión de un alelo + mutación puntual asociada.

EXPANSIÓN GAA RESPONSABLE DE ATAXIA DE FRIEDREICH

Enero 2014 19

ENFERMEDAD DE FRIEDREICH

Padre y Madre no afectadosPortadores

JorgeAtaxia y neuropatíasensitiva

Ana Maríaataxia, neuropatíassensitiva, diabetes,escoliosis, demencia

15/135 19/148

756/500 198/243

1. ¿Cuál es el patrón de herencia?2. ¿Qué cuadro clínico presentan los portadores?3. ¿Como aplicar el concepto de Anticipación en este caso?4. ¿Qué riesgo hay para los descendientes de los afectados?

Enero 2014 20

ENFERMEDAD DE STEINERT

Cuadro:Cataratas

Cuadro:Calvicie, miotoníay debilidad, BAV1

Cuadro:Miotonía y Debilidad marcada,retardo mental, Hipersomnia, miocardiopatía

Jorge, el abuelo

Oscar, el padre

Lucía y Ramón, los hijos?

i: 63 años

i: 41 años

i: infancia

En edad de inicio:cada vez menor

En cuadro clínico: cada vez más importante M

ayor

cua

dro

clín

ico

Men

or e

dad

de in

icio

Fotos con autorización

• ¿Qué sucede con la edad de inicio en esta familia?

• ¿Qué sucede con el cuadro clínico?

• ¿Qué podría pasar con el niño por nacer en la cuarta generación?

Enero 2014 21

ENFERMEDAD DE STEINERT Disminución de síntesis de la miotonincinasa

no explica cuadro clínico amplio Mecanismo de toxicidad del ARN DM1 (DMPK) y DM2 (ZNF9) tienen similitudes

bioquímicas y clínicas pero los genes respectivos no tienen relación funcional aparente

ARN forma inclusiones nucleares con tractos expandidos

Asociación de splicing alternativo anormal en relación con proteina muscleblind like (MBNL)

Desarrollo de modelo animal en ratones

Enero 2014 22

ATAXIAS AUTOSÓMICAS DOMINANTES Amplificación anormal de tripletes

repetidos en muchas mutaciones SCA. Secuencias CAG dan lugar a secuencia

poliglutamina en proteína. Poliglutamina en exceso: adquisición de

nueva función tóxica. Proteína anormalmente plegada que

genera depósitos (cuerpos de inclusión) en citoplasma o núcleo de neuronas.

Desencadena estrés oxidativo o apoptosis prematura (función nueva y tóxica de la proteína).

Enero 2014 23

5’UTR Exón codante 3’UTR

(CAG) (CAG) (ATTCT) (CTG)SCA12 Ataxias PoliQ SCA10 SCA8

(SCA 1-3, 6, 7, 17)

EXPASIONES RESPONSABLES DE ATAXIAS DOMINANTES

Enero 2014 24

ATAXIAS AUTOSÓMICAS DOMINANTES Diagnóstico genético disponible para 11

cuadros SCA de las 27 existentes. Diagnostican el 75% de casos

familiares. Disponibles comercialmente: SCA 1, 2,

3, 6, 7, 8, 10, 12, 14, y 17, DRPLA. También disponible FA. Servicio de Neurogenética INCN: SCA 3,

SCA1, SCA6 Ataxia dominante más frecuente en el

Perú: SCA10

Enero 2014 25

SCA 3 (MACHADO- JOSEPH) Expansión de un tracto CAG, MJD1 locus 14q32.1; de

56 a 86 repetiones relacionado con enfermedad Dos haplotipos ancestrales:

TTACAC: Islas Flores, relacionado con el 70% de casos

GTGGCA: Portugal Ataxia dominante más común en el

mundo

Proteína ataxina 3

Takiyama et al 1993; Kawaguchi et al 1994

Enero 2014 26

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE SCA3

40 repeticiones, límite superior normal

Pacie

nteAlelo normal

Alelo patológico

Controlessanos

Enero 2014 27

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Herencia autosómico

dominante Efecto fundador: mutación en

gen de la Huntingtina en el cromosoma 4, con triplete repetido CAG (glutamina).

Efecto tóxico de la Huntingtina con exceso de glutamina.

Movimientos involuntarios, demencia subcortical, trastornos psiquiátricos.

Valle de Cañete

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• Expansión anormal del triplete CAG, exón 1 del gen HD, brazo corto del cromosoma 4.

• Proteína huntingtina, secuencia de poliglutamina creciente.

• Mutación que da ganancia de función con pérdida de las neuronas espinosas del estriado.

Exón 1 Gen EH (67 exones)

> 3936-39< 36

Mutación CompletaPre-mutaciónNormal

N O

Neurodegeneración selectiva

Poliglutamina•Disfunción cadena respiratoria •Radicales libres•Excitoxicidad •Alt. ubiquitina-proteosoma Apoptosis

Imágenes TAC y corte: Departamento de Neuropatología, INCN

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON

Enero 2014 29

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON

12 27 35 36 39 40Sanos

Poblacion en

Riesgo*

Premutació

n

Mutación

No Portadores (Sanos) Portadores (Enfermedad)+

+

No afectado 12-35 repeticiones CAG

*Población Reservorio en Riesgo 27-35 repeticiones CAG

Premutación (Penetrancia Reducida) 36-39 repeticiones CAG

Mutación (Penetrancia Completa) ≥40 repeticiones CAG

Semaka A y Col. American Journal of Medical Genetics . 2009

Enero 2014 30

CORRELACIÓN ENTRE EDAD DE INICIO Y ALELO MAYOR

3040

5060

70

0 20 40 60 80edad_inicio

alelo_mayor Fitted values

N=153R = -0.6919, P=0.00

Valor ajustado

Correlación inversa es significativa, a mayor numero de tripletes, la edad de inicio es más precoz

Registro de EH Servicio de Neurogenética INCN

Núm

ero

de R

epet

icio

nes

CA

G

Enero 2014

CAMBIO DE CONDICIÓN CLÍNICA POR GÉNERO

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

0 20 40 60 80analysis time

F M

Kaplan-Meier survival estimates, by sexo

31

N=78

N=75

p=0.02

Femenino Masculino

Curva de sobrevida de Kaplan-Meier

El cambio de condición clínica es significativamente mas temprano en varones que en mujeres

Registro de EH Servicio de Neurogenética INCN

Enero 2014 32

DISTRIBUCIÓN DE PERSONAS PORTADORAS SEGÚN SU NACIMIENTO

Amazonas 0.5

%

Ucayali 0.5

%

Loreto 0.5

%

M. de Dios 0.5

%

Piura 0.5

%

Cusco 0.5

%

Lima 34.4 %

Cañete 21.6 %

Junín 9.4 %

Huancavelica 5 %

La libertad 5 %

Ancash 4.4 %

Ayacucho 4.4 %

Cajamarca 3.3 %

Apurimac 2.2 %

Arequipa 2.2 %

Tacna 1.6 %

C. de Pasco 1.1 %

Ica 1.1 %

Registro de EH Servicio de Neurogenética INCN

Enero 2014 33

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON

Cuadro: Coreai: 52 años

Cuadro: Psicosis,i: 40 años

Parkinsonismo, corea yretardoi: 07 años i: 15 años

Corea, Psicosis,demenciai: 32 años

Corea, Psicosis,i: 37 años

42 tripletes

57 tripletes47 tripletes

45 tripletes 90 tripletes 82 tripletes

1. ¿Cuál es el patrón de Herencia?2. ¿Hay anticipación en este caso?

Enero 2014 34

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON

Cuadro: Coreai: 52 años

Cuadro: Psicosis,i: 40 años

Parkinsonismo, corea yretardoi: 07 años i: 15 años

Corea, Psicosis,demenciai: 32 años

Corea, Psicosis,i: 37 años

42 tripletes

57 tripletes47 tripletes

45 tripletes 90 tripletes 82 tripletes

1. ¿Siempre hay aumento en el número de tripletes? 2. ¿Cuándo se presentan casos infantiles o juveniles?

Enero 2014 35

ORIENTACIÓN GENÉTICA Problema particular:

Inicio luego de tener descendenciaAnticipación e impresión de genomaAusencia de centros especializados y de

seguimiento sistematizadoDesorganización familiar

Necesidad sentida por familias, en especial generaciones más jóvenes y con acceso a información

“para saber”, “para no pasarle esto a mis hijos”, “para saber si los voy a poder cuidar”

Enero 2014 36

¡¡Muchas Gracias !!