FISH‐анализ как методFISH анализ как метод определения хромосомных б й (аберраций (возможности и области применения)р )

Пилип Л.Я.Пилип Л.Я. (зав. лабораторией цитогенетики, Клиника 

Репродуктивной Медицины «Надия»)

• FISH (fluorescence in situ hybridization) молекулярно‐цитогенетический метод; был разработан в 1980‐х для определения наличия или отсутствия последовательностей ДНК на хромосоме 

Преимущества FISHПреимущества FISH

Эффективность, быстрота и относительная простота метода FISHотносительная простота метода FISHделают его полезным инструментом для 

йдиагностики хромосомных аномалий как в постнатальном, так и в пренатальномпериоде, включая предимплантационный

Типы проб для FISH• Центромерные ‐ CEP• Центромерные ‐ CEP• Теломерные ‐ Tel• Пробы на всю хромосому‐WCP

Centromeric (satellite) probesПробы на всю хромосому WCP

• Локус‐специфические ‐ LSIprobes

Locus specific pprobes

Whole chromosomeWhole chromosome painting probes

Области применения FISHОбласти применения FISHПредимплантационная

генетическая диагностика Пренатальная диагностика Постнатальная диагностика

•Предимплантационныйгенетический скрининг (определение 

й

•Скрининг основных анеуплоидий некультивированных 

й

•Уточнение/верификация результатов стандартного цитогенетического исследованияанеуплоидий хромосом 

13,15,16,17,18,21,22,X,Y)•Предимплантационнаягенетическая диагностика (

клеток амниотической жидкости

•Уточнение/верификация результатов стандартного 

исследования•Скрининг анеуплоидий сперматозоидов

•Исследование сегрегации й(исследование 

дериватных хромосом у носителей хромосомных перестроек)

цитогенетического исследования

хромосом у носителей структурных перестроек

•Исследование природы маркерных хромосом

•Исключение сложных перестроек  ‐ тройных и более сложных транслокаций, инсерций

•Исследование хромосомных перестроек в онкогематологии

•Диагностика солидных Д допухолей

Пример использования FISH в онкологии

• Характеристика чувствительности рака молочной железы к химиопрепаратам (герцептин)

Хромосома 17Ген Her2Her2

Нормальная клетка Клетка с полисомией177

Амплификация диагностируется при

соотношении количества копий гена Her2 к

количеству центромер(хромосом) 17

Клетка с амплификацией Her2центромер(хромосом) 17

>2,2© Клименко C.В., Захарцева Л. М., 2011

Паттерны гибридизации с пробами Her2/CEP17

A CB

D FE

© Клименко C.В., Захарцева Л. М., 2011

Хромосомные перестройки у супружеских пар с бесплодиемТранслокации – наиболее частые  структурные хромосомные перестройки, 

Типы транслокаций

определяемые у супружеских пар с бесплодием, поскольку фенотипически не проявляются у носителей

рРобертсоновские транслокации Реципрокные транслокации

46,XY,der(13;14)(q10;q10) 46,XY,Yqh‐,t(2;17)(q31;p13)Частота 0 12 %* Частота 0 14%*Частота 0,12 % Частота 0,14%

*Nielsen, J. and Wohlert, M. (1991) Chromosomes abnormalities found among 34 910 newborn children: results from 13‐year incidence study in Aarhus, Denmark. Hum. Genet., 87, 81–83.

Схема распределения хромосом в гаметах носителей транслокаций

В мейозе I дериватныехромосомы и их 

нормальные гомологи могут сегрегировать с 

бобразованием несбалансированных 

гамет 

Последствия:•Бесплодие

•Невынашивание•Невынашивание•Мертворождение или 

ранняя детская смертность•Рождение детей сРождение детей с хромосомными аномалиями

Huret JL, Leonard C, Savage JRK . Chromosomes, Chromosome Anomalies. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. May, 2000 

Подтверждение/уточнение результата кариотипирования

• Пациент 1970 г.р.

• Олигоастенотератозооспермия

• У супружеской пары одно спонтанное Кариотип –

у ру р дпрерывание беременности в 12 нед. 45,ХУ,der(5;15)t(?q35.3;?q10)

C‐banding

GTG‐banding

Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с использованием метода FISHиспользованием метода FISH

T l5 SO

Tel5p

Tel5qTel5p SO

CEP15 (satellite III) SOCEP15 (α‐satellite) SA

Tel5p SO

5 Tel5qSG5

15 der(5;15)

Tel5qSGTel5qSG

515

der(5;15)der(5;15) CEP15

Результат стандартного цитогенетическогоисследования ‐45,ХУ,der(5;15)t(?q35.3;?q10)

45,ХУ,der(5;15)t(q35.3; q10)

Подтверждение/уточнение результата кариотипирования сиспользованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)р ( , y )

153

12

88

12220 20

15

3

317

17

12

21

21

1616

1

19

1313

15 119

6 X

22

14

4

18

10 10

5

7

6

6

X

X

1111

9

9 22

14

4

18

185 X9 22 4 5

7

Подтверждение/уточнение результата кариотипирования сиспользованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)

10 10

5

7 10

q24

57

13

13

22

20 20

q14

13

46,XX,t(10;13)(q24;14)46,XX,?t(10;13)

X

Подтверждение/уточнение результата кариотипирования сиспользованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)

q13.3

19

q27

46,Х,t(X;19)(q27;q13.3)46,XX,der(19)?t(19;?)

Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с использованием WCP‐проб р р р

(OctoChrome,Cytocell)

Кариотип пациента:

46,XY,?t(6;10)

911

9 2222

d (6)11

der(6)

77

5

10

510

10der(11)

der(6)

der(10)

X

Y 6

Установление происхождения маркерных хромосом

Маркерная хромосома представляет собой изохромосому по коротким плечам с центромерным участком 21 хромосомы.

Многоцветная FISH в постанатльной и пренатальнойдиагностике позволяет (с учетом результатовдиагностике позволяет (с учетом результатов 

стандартного цитогенетического исследования)

й й• подтвердить наличие хромосомной перестройки; исключить наличие более сложной перестройки у носителей реципрокных транслокаций;р ц р р ц ;

• выявить или подтвердить хромосомы, вовлеченные в перестройку;

• уточнить точки разрыва хромосом;

• определить происхождение маркерных хромосом;р д р д р р р

Использование метода FISH для исследования уровня анеуплоидий сперматозоидов

Х1818

анеуплоидий сперматозоидов

Y

1818Х

Y‐ несущий сперматозоид

Х – несущий сперматозоидсперматозоид сперматозоид

Анеуплоидные сперматозоиды

1818Х

ХYY

XX YYYY

1818Х1818

1818

1818

18,Х,Y 18,Y,YДисомия хромосом 18,Х

С й ( 350)Скрининг анеуплоидий хромосом сперматозоидов (n=350)

Результаты спермограммы К‐во пациентов с повышенным уровнем анеуплоидий сперматозоидов,%

нормозооспермия 6,5%

астенозооспермия 23,8%

олигоастенотератозооспермия 78,3%

Пациентам с повышенным уровнем анеуплоидий рекомендовано проведение ИМСИрекомендовано проведение ИМСИ (интрацитоплазматическая инъекция морфологически отобранных сперматозоидов)

x200 x6300ICSI IMSI

Исследование сегрегаций хромосом у носителей структурных перестроек методом FISH

Уровень хромосомных аномалий у носителей транслокаций варьирует от 18 до 82%,в зависимости от типа перестройки и хромосом, вовлеченных в перестройку

Кариотип пациента46,XY,Yqh‐,t(2;17)(q31;p13)

2 17 der(2) der(17)

27,3% сбалансированных сперматозоидов ‐ прогноз для проведения цикла ICSI/IMSI/PGDСигнал % сперм а

тозоидовХромосомный дисбаланс (ожидаемый)

д

AOOG 2,17 или der(2), der(17)

27,3 Сбалансированный набор

AOG 17, der(2) 23,9 Делеция 2q31‐2qter, дупликация 17р13‐17pter

AOOOG 2 der(17) 16,2 Дупликация 2q31‐2qter, делеция 17р13‐17pterAOOOG 2, der(17) 16,2 Дупликация 2q31 2qter, делеция 17р13 17pter

AO der(17) 5,9 Делеция 2pter‐2321, делеция 17р13‐17pter

GOO 2 6,8 Моносомия 17

GO der(2) 1,7 Делеция 17p13‐17qter, делеция 2q31‐2qter

A 17 0,9 Моносомия 2

Другие комбинации

Другие комбинации

17,3 Другие несбалансированные наборы

Исследование сегрегаций хромосом у носителей количественных аномалий методом FISHколичественных аномалий методом FISH

Кариотип 47,XYYОлигоастенотератозооспермия

Х Y XY YY XX XXY XYY

47,XYY 43.7 44.8 0.88 4.7 0.3 0.1 ‐

11.5% аномалий половых хромосом + ~3% диплоидных сперматозоидов

Результаты ПГД; кариотип супруга 47,XYY

Цикл IMSI/PGDET 2‐х эмбрионов

Прогноз: 14% анеуплоидных сперматозоидов

Эмбрион пол 13 18 21 комментарии

ET 2 х эмбрионовНаступила беременность ‐ двойня

1 ХХ 2 2 2 Normal ET

2 ХХ 2 2 2 Normal ET 

3 ХХ 2 1 1 18,21 monosomy

4 XY 2 2 2 Normal Cryo

5 XX 2 2 3 21 t i5 XX 2 2 3 21 trisomy

6 XX 2 2 2 Normal Cryo

7 XXX 3 3 3 triploidp

Использование метода FISH в предимплантационнойгенетической диагностике

• На сегодня ПГД – единственный возможный способвыявления хромосомных нарушений у эмбрионоввыявления хромосомных нарушений у эмбрионов.

• 56% морфологически нормальных эмбрионов женщинпосле 35 имеют хромосомные аномалии.после 35 имеют хромосомные аномалии.

Показания для проведения предимплантационной

Показания для проведения предимплантационнойгенетической диагностики (PGD)

предимплантационногогенетического скрининга (PGS)

• Наличие подтвержденных

• Возраст женщины, проходящей IVF, более 37 лет

йподтвержденных структурных хромосомных перестроек

• Бесплодие неустановленной этиологии

• Многократные неудачные попытки перестроек

IVF• Привычное невынашивание

беременности невыясненной рэтиологии

• Высокая частота анеуплоидий сперматозоидов (тяжелые формысперматозоидов (тяжелые формы мужского бесплодия)

• Наличия в анамнезе беременности или рождения ребенка сили рождения ребенка с хромосомной патологией

¾ циклов ПГД – скрининг анеуплоидий¾ циклов ПГД  скрининг анеуплоидий

Вопросы:

1. Что биоптировать?

2 Как фиксировать?2. Как фиксировать?

3. Сколько хромосом анализировать?3. Сколько хромосом анализировать?

4. Как учитывать результаты?

5. Какие зонды использовать?

Что биоптировать и сколько?

• Биопсия 1 и 2 полярного тельца 

• Биопсия бластомера (6‐8 клеток, 3‐е сутки)3 е сутки)

• Трофэктодермальная биопсия бластоцисты (5‐6 сутки)бластоцисты (5 6 сутки)

Биопсия бластомераБиопсия бластомера

Е б б б ОДНОГО б !!!Если биопсия бластомера  ‐ биопсия ОДНОГО бластомера !!!

Сколько хромосом анализировать?Сколько хромосом анализировать?

Наиболее частые анеуплоидии на стадии 8 клеток

22, 16, 21, 15

«Синдромальные» анеуплоидиианеуплоидии

13, 18, 21, XY

Минимальный стандарт 8 хромосом:хромосом: 

13,15,16,18,21,22,XY

ESHRE PGD consortium best practice guidelines for fluorescence in situ hybridization –based PGD //Human Reproduction. ‐ 2010

Варианты преимплантационного генетического скрининга методом FISH

5 (13 18 21 XY)5 хромосом (13,18,21,XY) 

• 28‐31% анеуплоидий 9 хромосом 

(13,15,16,17,18,21,22,XY)  • 70‐72% анеуплоидий70 72% анеуплоидий

12 хромосом (8,13,14,15,16,17,18,20,21,22,XY) 

• 79‐80% анеуплоидий

Munne s. et al. Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes // Fertility Sterility 2010. – Vol. 94

Как учитывать результаты FISH исследования на одной клетке?

• Критерии:

1. Размер сигналаОбязательно 2 исследователя

2. Интенсивность сигнала

3. Расстояние между сигналами

X 21XX

21

18

Y13

13

Использование NRR (no result rescue)

NRR – дополнительный раунд гибридизации с использованием пробы для той же хромосомы, но другого типа, желательно, другого цвета

NRR позволяет снизить частоту сомнительных результатов с 7 5% доNRR позволяет снизить частоту сомнительных результатов с 7,5% до 3,1%

Технические ограничения метода FISH при проведении ПГСпроведении ПГС 

– Ограниченное количество флуорохромовОграниченное количество флуорохромованализ ограниченного количества хромосом ( до 9‐12,  “gold standard”)  (13,15,16,17,18,21,22,X,Y)

– Наслоение сигналов, расщепление сигналов, низкая , р щ ,эффективность гибридизации, нарушения процесса фиксации бластомеров                       до 6‐10% эмбрионовббез диагностики

– Отсутствие возможности определить мозаицизм при работе с одной клеткой 

34

Исспользования метода многоцветной FISH в пренатальной диагностике

1. уточнение/подтверждение результатов стандартного цитогенетического д р цисследования;

2. «скрининговый» экспресс‐анализ анеуплоидий хромосом 13,18,21,XY на интерфазных ядрах некультивированныхинтерфазных ядрах некультивированных клеток амниотической жидкости;

Использование метода FISH для экспресс‐скринингаанеуплоидий в пренатальной диагностикеанеуплоидий в пренатальной диагностике

21 Сроки стандартного кариотипирования – 21 день*

2113

Сроки стандартного кариотипирования 21 деньНа практике – 10‐14 дней

2113

XAneuVysion Vysis X

Y 1818

AneuVysion ,VysisLSI 21 SO, LSI 13 SG

Скрининг анеуплоидий хромосом  13,18,21,X,Y 

AneuVysion ,VysisCEP 18 SA, CEP X SG, CEP Y SO

(80% хромосомной патологии, определяемой пренатально)  методом FISH – 24‐48 часов.

, ,

*МОЗ України. Стандарти аналізу препаратів хромосом людини (методичні рекомендації). – Київ 2003

Пренатальная диагностика микроделеционных синдромов методом FISH

К CATCH 22Комплекс сндромов CATCH 22(DiGeorge/Velo‐Cardio‐Facial/ShprintzenSyndrome)

микроделециямикроделеция

Ограничение метода: диагностика проводится на конкретную патологию, и не позволяет исключить аномалию в неисследуемых участках. Для качественной у у Ддифференциальной диагностики требуется значительная библиотека зондов

Использование метода FISH для исследования анеуплоидий клеток ворсин хориона неразвивающихся 

беременностейСтандартное кариотипирование

беременностей

Патологии не обнаружено

Патология кариотипа

Низкая митотическая активность культуры клеток/  ~35%обнаруженокариотипа отсутствие жизнеспособных 

клеток ‐‐‐‐‐кариотип не получен~ 45%

~20% 

Привычное невынашиваниебеременности

FISH (8 хромосом)13,15,16,18,21,22,XY беременности

Анеуплоидии не

Обнаружено анеуплоидии хромосом

~40%~60%

Исследование кариотипа

не обнаружено

анеуплоидии хромосом 13,15,16,18,21,22,XY

кариотипа родителей aCGH

ЗаключениеЗаключение

FISH служит полезным инструментом для диагностики хромосомных аномалий д ркак в постнатальном, так и в пренатальномпериоде, включая доимплантационныйр д д ц

Современный уровень развития метода FISHпозволяет быстро и с высокой точностью идентифицировать  практически любые аномалии кариотипа

Н FISH й• На сегодня FISH –метод, позволяющий проводить скрининг предимплантационных эмбрионов по наиболее частым анеуплоидиям.наиболее частым анеуплоидиям.

• Предимплантационная генетическая диагностикаПредимплантационная генетическая диагностика методом FISH позволяет проводить исследование анеуплоидий хромосом, но не дает полного представления о кариотипе и не позволяет исключить мозаицизм.

Спасибо за внимание

www.ivf.com.ual.pylyp@ivf.com.ua