Fermentación continua de lactosa por Clostridiumacetobutylicum-

Evaluación de la energia y rendimiento de los productos de la acidogénesis.

Fabio Napoli, Giuseppe Olivieri, María Elena Russo, Antonio Marzocchella *, Piero Salatino

Departamento de Ingeniería Química, UniversitàdegliStudi di Napoli Federico II, P.le V. Tecchio n. 80, 80125 Nápoles, Italia

RESUMEN

Una evaluación de l crecimiento y el metabolismo de las células acidogénicasClostridiumacetobutylicum DSM 792 se informa en el documento. Las pruebas se llevaron a cabo en un reactor de mezcla bajo condiciones de pH controlado.Los cultivos se llevaron a cabo utilizando un medio semi-sintético suplementado con lactosa como fuente de carbono.

Los ácidos y disolventes, que representan productos del proceso de ABE, se han añadido deliberadamente en cantidades controladas al medio de cultivo para investigar sus efectos sobre los rendimientos del producto. La masa fraccionalYelrendimiento de la biomasa y productos se expresaron como una función de la tasa de crecimiento específico teniendo en

teniendo en cuenta el modelo PIRT. El máximo rendimiento de ATP y el mantenimiento resultó 29,1 GDM / molATP y 0,012 molATP / h GDM, respectivamente.

Las características cuantitativas del modelo de crecimiento de C. acetobutylicum estaban enbuena concordancia con los resultados experimentales. El modelo se propone como una herramienta para estimar la masa fraccional de producto, incluso para las fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones típicas de la solventogenesis.

Palabras clave:

ABE, Clostridiumacetobutylicum, Cultivo continuo , ATP Y modelo de Crecimiento.

1. INTRODUCCIÓN

La producción de biocombustibles a lo largo de la ruta biotecnológica está ganando la consideración generalizada debido principalmente a su ecosostenibilidad.

El biobutanol surge como un potencial excelente Y candidato como combustible y el disolvente [1]. Sin embargo, la investigación adicional y esfuerzo por el desarrollo se requieren para apoyar la ampliación ydemostración de la producción industrial de biobutanol por via fermentativa de clostridios para producción de acetona-butanol-etanol (via ABE) .

Villadsen [2] indica el proceso ABE como un ejemplo de viabilidad de un proceso de beneficio con unenfoque fundamenta basado en los procesos de desarrollo. Como se señaló en Napoli

et al. [3], los beneficios en el diseño de biorreactores, ampliación y optimización así como la caracterización de ambos patrones y comportamiento bifurcaciional dinámico de biorreactores pueden derivarse de modelos no estructurados, através de, relaciones simples con variables clave.

Como se ha revisado por Jones y Woods [4],se ha identificado dos vías para el metabolismo de las cepas de clostridios para el proceso de fermentación ABE.

La primera via es la acidogénesis, caracterizado por la conversión de sustrato en ácidos (ácidos acético y butírico) por células móviles.

La segunda via es la solventogenesis, caracterizado por la conversión de sustrato a disolventes (ABE) .

Por otra parte, las experiencias en cuanto a la producción continua de disolventes por medio de cepas de clostridios han mostrado que la producción de solventes y ácidos puede tener lugar

simultáneamente, de modo que la presencia simultánea de células acidogénicas y solventogenicas

en el medio de cultivo debe tenerse en consideración [5-8].

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La presencia contemporánea de células en crecimiento (células acidogénicas) y que no crecen (solventogenicas) durante la producción de disolvente,dificulta una evaluación rigurosa de ATP y de los rendimientos de los productos.

Sin embargo, la complejidad del sistema se puede reducir si el proceso en general se divide en dos etapas (acidogénesis y solventogenesis) y superposición de los efectos se desprecia.En consecuencia, la evaluación de los rendimientos en la etapa de acidogénesis se puede llevara cabo bajo un amplio intervalo de condiciones de operación, incluidos La producción típica de disolventes.

La evaluación de los disolventes y los rendimientos se pueden lograr teniendo en cuenta también la contribución de las células acidogenica que aún esten activas durante la producción de disolventes.

El enfoque experimental de Napoli et al. [3] es aún más amplio en el presente trabajo para investigar la energía y los rendimientos del producto por células acidogénicas de ClostridiumacetobutylicumDSM 792.

La evaluación de los rendimientos de biomasa y producto son unrequisito previo para el diseño optimizado de biobutanol industrial en procesos de producción.

La relevancia de la metodología adoptada en el análisis del crecimiento de clostridios en lactosa puede ser útil , para el bajo costo de recursos renovables como sustratos [9-11] y en las nuevas configuraciones del reactor [12,13].

…….

The present study addresses biomass and products yields for acidogenic cells of C. acetobutylicumDSM 792 growing on lactose as carbon source. The ascertained complexity of the metabolic pathways coupled with the aim to get an unstructured kinetic model …….have suggested to investigate the behavior of acidogenic cells as afirst step of the complete process, being acidogenic cells still workingduring solvents production. Biomass and acid concentrationsmeasured during continuous cultures were worked out to assesstheYATP, in agreement with the Pirt model. The effect of the concentrationof acids (acetic and butyric) and solvents (acetone, ethanolandbutanol) and of the pH on YATP of C. acetobutylicumunder acidogenesisstate was investigated. A model is proposed to describe thebehavior of acidogenic cells even under high ABE concentrationstypical of solventogenic conditions, a mandatory step in the characterizationofC. acetobutylicum. Data measured during batch tests[14] have also been analyzed in the light of the proposed model.2. Materials and procedure2.1. Microorganism and culture mediaC. acetobutylicumDSM 792 was supplied by DSMZ. Culture growths were carriedout in a semi-synthetic culture medium supplied with 5 g/L yeast extract (YE) andd-lactose as carbon source [14].2.2. ApparatusThe tests were carried out in a continuous stirred tank reactor equipped withtemperature and pH controller. It consisted of 1 L jacketed vessel (Pyrex®), a thermostaticwater bath, a pump system. The culture mixing was achieved by a magneticallydriven stirrer. Nitrogen was sparged (10 nL/h) at the bottom of the reactor to preservethe anaerobic condition.The pH was adjusted at the desired value by a controller (Applikon Bio ControllerADI 1030) equipped with 1 M NaOH solution tank.2.3. Analytical methodsThe analysis of culture samples withdrawn from the chemostat provided

biomass concentration, lactose and metabolite concentration and total organic carbon(TOC) in the liquid phase. Cell density was measured as optical absorbance at…..

600 nm (OD600) using a spectrophotometer (Cary 50 – Varian). Calibration tests for C.acetobutylicumdried mass indicated that 1 OD600 = 0.4 gDM/L. The elemental analysis of dry biomass was performed by means of a C/H/N 2000 LECO® analyzer.The concentration of soluble species was measured in the liquid phase after cell harvesting by centrifugation. Lactose concentration was measured by means of an enzymatic kit (Biopharm). Metabolite concentrations were measured by means of a gas-chromatograph (Agilent 7890A GC) equipped with a FID and with a capillary column poraplot Q (25 m×0.32 mm), adopting external standards. The TOC wasmeasured by a Shimadzu TOC V-CSH analyzer.

2.4. Operating conditions and proceduresPre-cultures were prepared by inoculating 2 mL of the reactivated cells into 50 mL of lactose supplemented semi-synthetic medium and incubated for two days.The pre-cultures were inoculated into the reactor containing 0.6 L of semisyntheticmedium consisting of YE and lactose at fixed concentration. Typically,after 6 h of batch culture the lactose-bearing stream was fed to the reactor at the desired dilution rate (D). The culture was periodically sampled to measure biomass and metabolite concentrations until steady state conditions were reached. Under each set of operating conditions, the steady state was characterized in terms of concentration of lactose, cells and metabolites, averaged over a culture-time longer than 5–6 times the liquid space-time.Tests were carried out at 35 ◦C under anaerobic conditions. The lactose concentration in the inlet stream was set between 4 and 50 g/L. The set-point for the pH controller was fixed at values ranging between 4.0 and 7.0. The dilution rate was changed between 0.05 and 0.77 h−1.The reactor vessel and the medium were sterilized in autoclave (121 ◦C, 20 min). The gas stream was sterilized by filtration (cut-off 0.2 _m, Millipore).

Table 1 reports operating conditions adopted during tests. The run sets from Ito VI are characterized by the culture pH, the dilution rate and the lactose concentration in the feeding stream spanning over wide intervals, respectively, 4.0–7.0, 0.05–0.77 h−1, and 4.6–50 g/L. Some tests were carried out supplementing the feed stream with solvents (set VII–IX) in order to mimic the behavior of acidogenic cells

duringsolventsproduction.

El presente estudio aborda los rendimientos de biomasa y productos para las células de C. acidogénicasacetobutylicum DSM 792 crecen en lactosa como fuente de carbono. La complejidad comprobada de las vías metabólicas acoplados con el objetivo de obtener un no estructurados cinéticos del modelo

……………….han sugerido para investigar el comportamiento de las células como un acidogénicasprimer paso del proceso completo, que son las células acidogénicas sigue trabajandodurante la producción de disolventes. Biomasa y ácido concentracionesmedida durante cultivos continuos se elaboraron para evaluarel YATP, de acuerdo con el modelo PIRT. El efecto de la concentracióndeácidos (acético y butírico) y disolventes (acetona, etanoly butanol) y del pH sobre YATP de C. acetobutylicum bajo acidogénesisestado se investigó. Se propone un modelo para describir lacomportamiento de las células acidogénicas incluso bajo altas concentraciones de EBAtípico de las condiciones solventogenic, un paso obligatorio en la caracterizaciónde C. acetobutylicum. Los datos medidos durante ensayos discontinuos[14] También se han analizado a la luz del modelo propuesto.2. Materiales y procedimiento2,1. Microorganismos y medios de cultivoC. acetobutylicum DSM 792 fue suministrado por DSMZ. Crecimientos de cultivo se lleva aen un medio de cultivo semi-sintético suministrado con 5 g / L de extracto de levadura (YE) yd-lactosa como fuente de carbono [14].2,2. aparatoLas pruebas se llevaron a cabo en un reactor continuo de tanque agitado equipado contemperatura y controlador de pH. Consistía en recipiente con camisa de 1 L (Pyrex®), un termostáticabaño de agua, un sistema de bomba. El cultivo mezclado se consigue mediante un magnéticamenteimpulsado agitador. El nitrógeno se burbujeó (10 Nl / h) en la parte inferior del reactor para preservarla condición anaeróbica.Se ajustó el pH en el valor deseado mediante un controlador (ApplikonBioControllerADI 1030) equipado con un tanque de solución M de NaOH.2,3. Los métodos de análisis

El análisis de las muestras de cultivo retirados del quimiostato proporcionadoconcentración de biomasa, la lactosa y la concentración de metabolito y carbono orgánico total(TOC) en la fase líquida. La densidad celular se midió como la absorbancia óptica a600 nm (DO600) utilizando un espectrofotómetro (Cary 50 - Varian). Pruebas de calibración para C.acetobutylicum masa seca indicó que una DO600 = 0,4 gdm / L. El análisis elemental de la biomasa seca se realizó por medio de un C / H / N analizador LECO ® 2000.La concentración de especies solubles se midió en la fase líquida después de la cosecha de células por centrifugación. Concentración de lactosa se midió por medio de un kit enzimático (Biopharm). Las concentraciones de metabolitos se midieron por medio de un cromatógrafo de gases (GC Agilent 7890A), equipado con un FID y con una columna capilar de poraplot Q (25 m x mm 0,32), la adopción de estándares externos. El TOC wasmeasured por un Shimadzu TOC-V CSH analizador.

2,4. Condiciones de funcionamiento y procedimientosPre-culturas se prepara inoculando 2 ml de las células reactivadas en 50 ml de lactosa complementado medio semisintético y se incubaron durante dos días.Los cultivos previos se inocularon en el reactor que contiene 0,6 L de semisyntheticmedium que consiste de YE y lactosa en concentración fija. Típicamente, después de 6 h de cultivo discontinuo la corriente de lactosa-cojinete se alimentó al reactor a la tasa de dilución deseada (D). El cultivo se tomaron muestras periódicamente para medir las concentraciones de biomasa y metabolitos hasta que las condiciones de estado estacionario se alcanzaron. Debajo de cada conjunto de condiciones de operación, el estado estacionario se caracteriza en términos de concentración de lactosa, las células y los metabolitos, como promedio durante un largo tiempo de cultivo de 5-6 veces el líquido de espacio-tiempo.Los ensayos se llevaron a cabo a 35 ◦ C en condiciones anaeróbicas. La concentración de lactosa en la corriente de entrada se fijó entre 4 y 50 g / L. El punto de referencia para el regulador de pH se fija en valores que oscilan entre 4,0 y 7,0. La tasa de dilución se cambió entre 0,05 y 0,77 h-1.El recipiente del reactor y el medio se esterilizó en autoclave (121 ◦ C, 20 min). La corriente de gas se esterilizó por filtración (corte de 0,2 _m, Millipore).

Tabla 1 reporta las condiciones de funcionamiento adoptadas durante las pruebas. La ejecutar conjuntos de I a VI se caracterizan por el pH del cultivo, la tasa de dilución y la concentración de lactosa en la corriente

de alimentación que abarca más de los amplios intervalos de, respectivamente, 4.0-7.0, 0.05-0.77 h-1, y 4.6-50 g / L . Algunos ensayos se llevaron a cabo complementando la corriente de alimentación con disolventes (establecido VII-IX) con el fin de imitar el comportamiento de las células acidogénicasdurante la producción de disolventes.……………

Table de nomenclatura

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3. Theoretical framework

Characterization of biomass and product yields during fermentationis based on mass and ATP balances. It has long beenshown how a fermentation process may be usefully characterizedin terms of ATP yields (YATP), expressed as the amount ofdry weight of microorganism produced per g mol of ATP in agreementwithBauchop and Elsden[15]. They proposed that YATP isabout 10.5 gDM/molATP, whatever the microorganism. Stouthamer[16] estimated the YATP on theoretical basis taking into accountthe ATP involved both in the formation of the biomass and in theactive transport across cell membrane. Accordingly, the maximumvalue of the ATP yield (YMAXATP ) was found to range between 28.6and 32.1 gDM/molATP for microorganisms growing on glucose and

mineral salts. Later, it was shown that the YATP of a given microorganismmay change with the specific growth rate as well as withthe media composition [17,18].Pirt[19] proposed a relationship between YATP and the specificgrowthrate (_):

wherem is the maintenance coefficient, expressed as mole of ATPconsumed for mass unit of dry biomass. The maintenance coefficientwas defined “as the energy necessary for the turnover ofsubstance and other cell components and for the preservation ofthe right ionic composition of the cells”[16]. In particular, Eq. (1)assumes that the consumption of energy (m) is constant and thatit does not depend on the specific growth rate. However, experimentalinvestigation pointed out that departures from Eq. (1) werefound when the culture was energy sufficient [20]. Accordingly, Pirt[21] proposed that the maintenance energy depends on the specificgrowthrateaccordingto:

…

3. marco teóricoCaracterización de la biomasa y los rendimientos de producto durante la fermentaciónse basa en balances de masa y ATP. Desde hace tiempo semuestra cómo un proceso de fermentación puede ser útilmente caracterizaen términos de rendimientos de ATP (YATP), expresado como la cantidad depeso seco del microorganismo producido por g mol de ATP de acuerdoconBauchop y Elsden [15]. Propusieron que es YATPaproximadamente 10,5 GDM / molATP, cualquiera que sea el microorganismo. Stouthamer[16] estima la YATP sobre base teórica teniendo en cuentael ATP implicados tanto en la formación de la biomasa y en latransporte activo a través de la membrana celular. En consecuencia, el máximovalor de la producción de ATP (YMAX

ATP) se encontró que oscilan entre 28,6y el 32,1 GDM / molATP para los microorganismos que crecen en glucosa ysales minerales. Más tarde, se demostró que la YATP de un microorganismo dadopuede cambiar con la tasa de crecimiento específico, así como conla composición de los medios de comunicación [17,18].PIRT [19] propuso una relación entre YATP y lo específicotasa de crecimiento (_):

donde m es el coeficiente de mantenimiento, expresado como moles de ATPconsumida por unidad de masa de biomasa seca. El coeficiente de mantenimientoSe define "como la energía necesaria para la facturación desustancia y otros componentes celulares y para la preservación dela composición de la derecha iónico de las células "[16]. En particular, la ec. (1)se supone que el consumo de energía (m) es constante y queque no depende de la tasa de crecimiento específico. Sin embargo, experimentalindicaron que las desviaciones de la ecuación. (1) fueronencontró que la cultura era suficiente energía [20]. En consecuencia, PIRT[21] propuso que la energía depende del mantenimiento específicotasa de crecimiento de acuerdo con:

….

where_max is the maximum specific growth rate, m0 and m1 themaintenance coefficients at _ equal to _max and 0, respectively.The Pirt relationships Eqs.(1) and (2) are still taken nowadays asreference expressions in the assessment of YATP.Fig. 1 shows the metabolic pathway of lactose by acidogeniccells of C. acetobutylicum, in agreement with Jones and Woods [4].Lactose diffuses in the cells and is cleaved by _-galactosidase inglucose and galactose. The comparison of the oxidization steps ofglucose and galactose to pyruvate highlights that the two pathways

are equivalent in terms of mass and energy balances. For this reason,the bioconversion of 1 mol of lactose may be assumed to correspondto the conversion of 2 mol of glucose. 4 mol of pyruvate and 4 molof ATP are produced and 4 mol of NAD+ are reduced per mole oflactose consumed along the glycolytic step.The pathway of glucose conversion by C. acetobutylicumhasbeen widely studied [4]. Pyruvate is converted to acetyl–CoAby pyruvate–ferrodoxinoxidoreductase producing CO2 and H2.With reference to acidogenic pathway, acetyl–CoA may be convertedto acetic and/or butyric acids coupled with production ofATP [4].

donde _max es la tasa máxima de crecimiento específico, m0 y m1 lacoeficientes de mantenimiento en _ igual a _max y 0, respectivamente.El PIRT relaciones NCA. (1) y (2) todavía se toman hoy en día comoexpresiones de referencia en la evaluación de YATP.La figura. 1 muestra la vía metabólica de la lactosa por acidogénicacélulas de C. acetobutylicum, de acuerdo con Jones y Woods [4].Difunde la lactosa en las células y se escinde por _-galactosidasa englucosa y galactosa. La comparación de los pasos de oxidaciónglucosa y galactosa a piruvato destaca que las dos víasson equivalentes en términos de balances de masa y energía. Por esta razón,labioconversión de 1 mol de la lactosa se puede suponer que correspondenpara la conversión de 2 mol de glucosa. 4 mol de piruvato y 4 molde ATP se producen y 4 mol de NAD + se reduce por mol delactosa consumida a lo largo del paso glicolítica.El camino de la conversión de la glucosa por C. acetobutylicum tienesido ampliamente estudiados [4]. El piruvato se convierte en acetil-CoAporoxidorreductasapiruvatoferredoxina producción de CO2 y H2.Con referencia a la vía de acidogénica, acetil-CoA se puede convertira los ácidos acético y / o butírico, junto con la producción deATP [4].……………

….

The ATP produced during both glycolysis and acids productionis employed for growth and maintenance of cells. Accordingly, thebiomass yield, YATP, may be experimentally assessed taking into

account the biomass and metabolites produced, provided that thestoichiometric relationship between metabolites and mole of ATPproduced is known.Fermentation of lactose by acidogenic cells of C. acetobutylicumfollows the stoichiometry of three main reactions:

where the biomass composition has been assumed to correspondto the formula C4H7O2N, characterized by: molecular weight

MWX = 101 g/mol; carbon fraction _C = 0.475; reductance degree_ = 4. The elemental composition of the biomass has been assumedaccording to a previous investigation carried out by Zeng[22] onC. butylicum.Aceticacidformation

Butyricacidformation

Molecular hydrogen is produced by oxidation of reduced ferrodoxinunder the assumption that all NADH2 in excess is cleaved toH2.

……..

The ATP produced during both glycolysis and acids productionis employed for growth and maintenance of cells. Accordingly, thebiomass yield, YATP, may be experimentally assessed taking intoaccount the biomass and metabolites produced, provided that thestoichiometric relationship between metabolites and mole of ATPproduced is known.Fermentation of lactose by acidogenic cells of C. acetobutylicumfollows the stoichiometry of three main reactions:

donde la composición de la biomasa se ha supuesto que correspondena la fórmula C4H7O2N, caracterizado por: peso molecular

MWX = 101 g / mol; _C fracción de carbono = 0,475; reductancia grado_ = 4. La composición elemental de la biomasa ha sido asumidode acuerdo con una investigación previa realizada por Zeng [22] enC. butylicum.Formación de ácido acético

Formación de ácidobutírico

El hidrógeno molecular se produce por oxidación de ferredoxina reducidabajo la suposición de que todos NADH2 en exceso se escinde paraH2.…..

ATP production coupled with acids formation combines contributionsof the glycolytic pathway and of the acids formationpathway from acetyl–CoA. The energetics is dictated by the courseof Eq. (3). Therefore, the ratio (YX/A) between the biomass and acidsproduction rates provides a measure of the YATP. The value of thespecific growth rate _ and of the YX/A ratio may be assessed workingout data measured during either continuous or batch culturesofC. acetobutylicum.Batch cultures are characterized by exponential growth of cellsandEqs. (6) and (7) hold:

Producción de ATP junto con la formación de ácidos combina las contribucionesde la vía glicolítica y de la formación de ácidos

vía a partir de acetil-CoA. La energética está dictada por el cursode la ecuación. (3). Por lo tanto, la relación (YX / A) entre la biomasa y ácidoslas tasas de producción proporciona una medida de la YATP. El valor de latasa de crecimiento específico? y de la YX / relación de A puede ser evaluado de trabajopor los datos medidos durante cualquiera de cultivos continuos o por lotesde C. acetobutylicum.Cultivos discontinuos se caracterizan por el crecimiento exponencial de las célulasy las ecuaciones. (6) y mantener (7):

………….wheret0 and t are the beginning and a generic instant of theexponential growth phase, X0, X, A0 and A the cell and the acidsconcentrations at t0 and t, respectively.Continuous cultures. With reference to an acidogenic culturecarried out in a chemostat fed with sterile medium, the biomassbalance under steady state conditions reduces to:

donde t0 y t son el comienzo y un instante genérico de lafase de crecimiento exponencial, X0, X, A0 y una célula y los ácidosconcentraciones en t0 y t, respectivamente.Cultivos continuos. Con referencia a una cultura acidogénicallevó a cabo en un quimiostato alimentaron con medio estéril, la biomasaequilibrio bajo condiciones de estado estacionario se reduce a:

………whereD is the dilution rate. The YX/A yield may be assessed as:

whererX and rA are the mass production rate of biomass and acids,respectively, X the biomass concentration in the reactor, A and A0the acids concentration in the reactor and in feeding, respectively.The stoichiometric molar uptake rate of lactose (r˙ L) for acidogeniccells may be determined in agreement with Eqs. (3)–(5) and

reads:

wherer˙i is the molar production rate of the generic specie “i”. Withreference to a continuous culture operated under steady state conditions,working out Eq. (10) yields the stoichiometric amount ofconsumedlactose (_Lst):

where_AA, _BA and _X are the differences between the concentrationsof acetic acid, butyric acid and biomass in the effluentand in the feed streams of the chemostat, respectively, and MWiisthe molecular weight of the specie “i”. The difference between thestoichiometric value (_Lst) and the measured value (_L) of lactoseconsumed under steady state conditions has been expressedin terms of the relative deviation parameter ε:

4. Results and discussionMain results of the tests are reported in Table 1. The run sets Ithrough VI regarded the effects of the culture pH, dilution rate andthe lactose concentration in the chemostat feeding. The run setsVII through IX regarded the effects of solvents on acidogenic cellsduring solvents production. The value of the deviation parameter εassessed for all run was typically smaller than 10%, confirming thesoundness of the theoretical framework.Fig. 2 reports the molar ratio between butyric and acetic acidsas a function of the dilution rate. The average molar ratio is 1.5(mass ratio 2.2) with a standard deviation of 0.17, in agreement

with data measured during tests carried out under batch conditions[14]. Accordingly, it is possible to describe acids production withonly one reaction, linear combination of Eqs. (4) and (5):Acidsformation

Analysis of Eq. (13) suggests that:•the molar fractional yield ATP/lactose is 6.5;•the molar ratio H2/CO2 is 1.25;•the mass of acids produced per mole of ATP produced (YA/ATP) is29.5 gacids/molATP.•According to the reported results, the value of YATP was assessedin the present study as:

whereYX/A was calculated from the measured production rate ofdry biomass and acids.Data collected during the sets of runs I through IX in Table 1 wereworked out in agreement with Eqs. (8), (9) and (14) to determinethe values of YATP. Set I refers to continuous cultures carried out atpH 5.0 under a wide interval of dilution rates and lactose concentrations.The computed values of YATP were assumed as the referenceto infer the parameters of models proposed by Pirt[19,21].Fig. 3 shows the plot – dashed line – of Eq. (1) based onthe assumption that the maintenance coefficient was constantwith respect to the specific growth rate [21]. In particular, YMAX

ATPandm were assumed as the averages of values reported in literature:23.4 gDM/molATP and 0.0087 molATP/h gDM, respectively[23,24]. The comparison between the plot and the data suggeststhatPirt model [19] with the selected parameters is inadequate tofit experimental data corresponding to large values of _. The regressionofYATP data according to Eq. (1) yields YMAXATP = 40 gDM/molATP,a value which is not acceptable because it is larger than the maximumtheoretical value [16].If the modified version of the Pirt[21] model is considered, andassumingm0 negligible, the combination of Eqs. (1) and (2) yields:

A best fitting procedure applied to YATP data matched against Eq.(15), with _max = 1.06 h−1 as indicated in Napoli et al. [12], yields:YMAX

ATP=29.1 gDM/molATPm1 =0.012 molATP/gDMh. (16)Fig. 3 reports the plot (continuous line) of Eq. (15) adopting theparameters(16). The agreement between the experimental dataand the model is satisfactory and supports the validity of the proposedmodel.

4.1. Effects of pH and solvents on YATP

Run sets II through IX (Table 1) refer to tests aimed at investigatingthe effects of pH and of the concentration of solvents onYATP. The value of pH ranged between 4.0 and 7.0. Pre-set amountsof acetone, butanol and ethanol were supplemented to the lactosebearingstream during selected tests.The values of YATP obtained by working out experimental dataare plotted in Fig. 4 as a function of the specific growth rate. Theagreement between experimental data and the plot of Eq. (15)adopting the parameters (16) is satisfactory. It is noteworthy thata correlation between YATP and the specific growth rate could beestablished, irrespectively of other operating conditions like pH andsolventsconcentration

4.2. Products fractional yieldAssuming that the ATP produced along with acids production isconsumed for biomass formation, a fermentation equation may beproposed by working out the ATP balances. In particular, the linearcombination of Eqs. (3) and (13) yields:

According to Eq. (15), fractional yields expressed by Eqs.(19)through(21) depend only on the specific growth rate.Data reported in Table 1 have been worked out to assess the

fractional yields of biomass (YX/L), butyric acid (YBA/L) and aceticacid (YAA/L) holding during the experiments. Results have beenreported in Fig. 5 as a function of the specific growth rate. The theoreticalvalues of the yields estimated according to Eqs. (19)–(21)with parameters specified in (16) are reported for comparison inFig. 5. The agreement between the experimental data and the estimatedvalues of the yield is fairly good, with average relative errorsof 6, 7 and 10% for YX/L, YBA/L and YAA/L, respectively. The agreementbetween experimental and theoretical values confirms thesoundness of theoretical framework and the reliability of parametersreported in Eq. (16). Due to the breadth of the range of operatingconditions under which the validity of Eqs. (15), (19), (20) and (21)has been positively tested, this model might be confidently used forthe assessment of the yields of the metabolism of acidogenic cellseven under operating conditions typical of solvents production

4.3. Effect of supplemented acids on the fermentation processThe conversion pathway of acids into acetone, butanol andethanol under operating conditions characterized by solvent productionis well-established in the literature, as reviewed by Jonesand Woods [4]. Accordingly, the stoichiometry of the conversionsresults into a molar ratio between acids converted and acetoneproduced equal to 1. On the other hand, results reported in theliterature regarding the conversion rate of acids to solvents arecontradictory. Ruchir et al. [25] reported that the rate of aceticacid conversion is three times faster than the conversion rate ofbutyric acid in vitro. Mermelstein et al. [26], instead, reported thatthe conversion rate of butyric acid is faster than that of acetic acid.The analysis of the reported observations and of data reportedin literature [14,24] suggests that the molar ratio between butyricand acetic acids under solventogenesis conditions may depart fromthe value 1.5 which is typical of the acidogenesis conditions. This

results from differences in the conversion rate of acids not balancedby their production rates. As pointed out in the Introduction section,the assessment of the acid conversion under solventogenesis conditionsis complicated by their parallel production. To overcome thislimitation, a few tests were specifically designed so as to shed lighton the effects of departure of the butyric/acetic acids ratio from 1.5on acids production. In these tests, lactose fermentation was carriedout supplementing the feeding with either acid (Table 1, runsets X and XI).Under the operating conditions of sets X and XI the directassessment of the acids yields YX/A was uncertain. In fact, the measurementof the concentration increment due to production ofthe acid that had been supplemented in the feeding was poorlyreliable because the increment was frequently close to the measurementerror. An indirect assessment of YX/A was thereforeadopted. Assuming that the ratio of the production rates of theacids was unaffected by acids addition and equal to 1.5, YX/A wasestimated as:

Fig. 5.Fractional mass yield of cells and produced acids as a function of _. Lines areplots of the theoretical values computed according to Eqs. (19)–(21)

for tests carried out supplementing butyric acid (set XI), and as

for tests carried out supplementing acetic acid (set X). AA and BAinEqs. (22) and (23) are the mass concentrations of acetic acid andbutyric acid produced under steady state conditions, respectively.The values of YATP corresponding to the run sets X and XI –assessed by Eqs. (14), (22) or (23) – are reported in Fig. 6 as afunction of the specific growth rate. The expected value of YATP

calculated in agreement with Eqs. (15) and (16) is also reported inFig. 6. The agreement between expected and experimental valueofYATP is satisfactory. Accordingly it can be inferred that thebutyric/acetic acids molar ratio is still 1.5 as far as production ratesare taken into account, and that this ratio is not affected by additionof either acid to the feeding.The invariance of the butyric/acetic acids production ratiotogether with the stoichiometry related to the acids conversion toacetone provide a valuable support for the assessment of the aceticand butyric acids conversion during solvents production.

4.4. Batch testsTable 2 reports data measured during batch tests carried out atinitial lactose concentrations ranging between 10 and 110 g/L [14].The specific growth rate, assessed in agreement with Eq. (6), didnot change significantly because the initial lactose concentration isfar larger than the saturation constant (1 g/L) of the growth Monodmodel[12]. The value of YATP determined from Eqs. (7) and (14) arereported in Fig. 6 as a function of the specific growth rate.The ability of Pirt’s model Eqs.(15) and (16) to reproduce theexperimental data may be considered satisfactory. Even thoughsome data are characterized by a departure larger than 30%, the successfulextension of the model – with parameter based on results ofcontinuous cultures – to batch tests is a further proof of the sound-ness of the proposed framework. In any case, further investigationshould be carried out to improve the reliability of the proposedmodel, even under batch conditions

5. ConclusionsThe growth of C. acetobutylicumDSM 792 under acidogenesisconditions using lactose as substrate was successfully investigatedin a CSTR operated at constant pH. Effects of pH, acetic acid,butyric acid, ethanol, acetone and butanol on microorganism productyields were investigated.A simplified stoichiometry of the growth process was proposedaccording to the maintenance model proposed by Pirt[21]. It representsa tool to assess the mass fractional yield of biomass and acidsas a function of the specific growth rate, even under operating conditionstypical of the solventogenic phase. The agreement betweenthe theoretical and experimental yields was fairly good.

….

donde D es la tasa de dilución. El YX / rendimiento A puede ser evaluada como:

dondeRx y AR son la tasa de producción en masa de biomasa y ácidos,respectivamente, X la concentración de biomasa en el reactor, A y A0la concentración de ácidos en el reactor y la alimentación, respectivamente.La tasa de absorción molar estequiométrica de lactosa (r ˙ L) para acidogénicacélulas puede ser determinado de acuerdo con las ecuaciones. (3) - (5) ydice lo siguiente:

donde˙ r i es la tasa de producción molar de la especie genérico "i". conla referencia a un cultivo continuo operado bajo condiciones de estado estacionario,la elaboración de la ecuación. (10) se obtiene la cantidad estequiométrica delactosaconsumida (Lst?):

donde? AA,? BA y? X son las diferencias entre las concentracionesdeácido acético, ácido butírico y biomasa en el efluente

y en las corrientes de alimentación de la chemostat, respectivamente, y es MWiel peso molecular de la especie "i". La diferencia entre lavalorestequiométrico (? Lst) y el valor medido (? L) de lactosaconsumido bajo condiciones de estado estacionario se ha expresadoen términos de la desviación ε parámetro relativo:

4. Resultados y discusiónPrincipales resultados de las pruebas se presentan en la Tabla 1. La carrera que estableceVI a través de considerarse los efectos de la cultura pH, la tasa de dilución yla concentración de lactosa en la alimentación quimiostato. La ejecutar conjuntosVII a IX consideró que los efectos de los solventes en las células acidogénicasdurante la producción de disolventes. El valor del parámetro ε desviaciónevaluó para todos corrida fue típicamente menor que 10%, lo que confirma lasolidez del marco teórico.La figura. 2 informes de la relación molar entre los ácidos butírico y acéticocomo una función de la tasa de dilución. La relación molar promedio es 1,5(relación de masa 2,2) con una desviación estándar de 0,17, de acuerdo

La figura. 2. Relación molar entre los ácidos butírico y acético medida durante el estado estacionario cultivos bajo condiciones acidogénicas. Véase la Tabla 1 para las condiciones de funcionamiento de las pruebas.

con los datos medidos durante las pruebas llevadas a cabo bajo condiciones de proceso por lotes[14]. Por consiguiente, es posible describir la producción de ácidos consolamente una reacción, combinación lineal de ecuaciones. (4) y (5):Ácidos formación

Análisis de la ecuación. (13) sugiere que:•el rendimiento fraccional molar ATP / lactosa es de 6,5;• H2/CO2 la relación molar es de 1,25;•la masa de los ácidos producidos por mol de ATP producido (YA / ATP) es29,5 gacids / molATP.• De acuerdo con los resultados observados, el valor de YATP se evaluóen el presente estudio como:

donde YX / A se calcula a partir de la tasa de producción de medidabiomasa seca y ácidos.Los datos recogidos durante los conjuntos de I corre a través de IX en la Tabla 1 fueronelaborado de acuerdo con las ecuaciones. (8), (9) y (14) para determinarlos valores de YATP. Conjunto I se refiere a cultivos continuos realizados enpH 5,0 bajo un amplio intervalo de velocidades de dilución y concentraciones de lactosa.Los valores calculados de YATP se asumió como la referenciapara inferir los parámetros de los modelos propuestos por PIRT [19,21].La figura. 3 muestra la gráfica - línea discontinua - de la ecuación. (1) sobre la base dela suposición de que el coeficiente de mantenimiento fue constantecon respecto a la tasa de crecimiento específico [21]. En YMAX particular,ATPy m se asumieron como los promedios de los valores reportados en la literatura:23,4 GDM / molATP y 0,0087 gMSmolATP / h, respectivamente[23,24]. La comparación entre la trama y los datos sugieren

modelo que PIRT [19] con los parámetros seleccionados es inadecuada paraajustar los datos experimentales correspondientes a valores grandes de _. la regresiónde datos YATP acuerdo con la ecuación. (1) los rendimientos YMAXATP=40 gdm / molATP,un valor que no es aceptable debido a que es mayor que el máximovalor teórico [16].Si la versión modificada de la PIRT [21] El modelo se considera, ym0 suponiendo despreciable, la combinación de las ecuaciones. (1) y los rendimientos de (2):

Un mejor procedimiento de ajuste aplicado a los datos YATP comparan con la ec.(15), con _max = 1,06 h-1, como se indica en Napoli et al. [12], se obtiene:YMAXATP = 29,1 GDM / molATP m1 = 0,012 molATP / gdm h. (16)La figura. 3 informes de la parcela (línea continua) de la ecuación. (15) la adopción de laparámetros (16). El acuerdo entre los datos experimentalesy el modelo es satisfactorio y apoya la validez de la propuestamodelo.

4,1. Efectos del pH y disolventes en YATPEjecutar establece II al IX (Tabla 1) se refieren a las pruebas destinadas a la investigaciónlos efectos del pH y de la concentración de los solventes enYATP. El valor de pH osciló entre 4,0 y 7,0. Pre-set cantidadesde acetona, butanol y etanol fueron suplementados para el lactosebearingcorriente durante las pruebas seleccionadas.Los valores de YATP obtenido mediante la elaboración de los datos experimentalesse representan en la figura. 4 como una función de la tasa de crecimiento específico. laconcordancia entre los datos experimentales y la trama de la ecuación. (15)la adopción de los parámetros (16) es satisfactorio. Es de destacar queuna correlación entre YATP y la tasa de crecimiento específico podría serestablecidas, independientemente de otras condiciones de funcionamiento tales como el pH ydisolventesconcentración

4,2. Productos rendimiento fraccionalSuponiendo que el ATP producido junto con la producción de ácidos seconsume para la formación de la biomasa, una ecuación de fermentación puede serpropuesto por la elaboración de los balances de ATP. En particular, el linealcombinación de las ecuaciones. (3) y los rendimientos (13):

De acuerdo con la ec. (15), los rendimientos fraccionarios expresado por las ecuaciones. (19)a través de (21) sólo depende de la tasa de crecimiento específico.Los datos reportados en la Tabla 1 se han elaborado para evaluar larendimientos fraccionarios de biomasa (YX / L), ácido butírico (YBA / L) y ácido acéticoácido (YAA / L) la celebración durante los experimentos. Los resultados han sidonotifica en la figura. 5 como una función de la tasa de crecimiento específico. El teóricovalores de los rendimientos estimados de acuerdo con las Ecs. (19) - (21)con los parámetros especificados en (16) se presentan para comparación enLa figura. 5. El acuerdo entre los datos experimentales y los estimados delvalores del rendimiento es bastante bueno, con errores relativos promediode 6%, 7 y 10 para YX / L, YBA / L y L YAA /, respectivamente. El acuerdoentre los valores experimentales y teóricos confirman lasolidez del marco teórico y la fiabilidad de los parámetros

informaron en la ecuación. (16). Debido a la amplitud de la gama de funcionamientocondiciones en las que la validez de las Ecs. (15), (19), (20) y (21)Se ha probado positivamente, este modelo podría ser utilizado con confianza parala evaluación de los rendimientos del metabolismo de las células acidogénicasincluso bajo condiciones de operación típicas de la producción disolventes

4,3. Efecto de los ácidos suplementados en el proceso de fermentaciónLa vía de conversión de los ácidos en acetona, butanol yetanol bajo condiciones de funcionamiento caracterizado por la producción disolventeEstá bien establecido en la literatura, como crítica por Jonesy Woods [4]. Por consiguiente, la estequiometría de las conversionesresultados en una relación molar entre los ácidos convertidos y acetonaproducido igual a 1. Por otra parte, los resultados reportados en laliteratura con respecto a la tasa de conversión de los ácidos a los disolventes soncontradictoria. Ruchir et al. [25] informaron de que la tasa de acéticoconversión del ácido es tres veces más rápido que la tasa de conversión deácido butírico in vitro. Mermelstein et al. [26], en cambio, informó quela tasa de conversión de ácido butírico es más rápida que la del ácido acético.El análisis de las observaciones descritas y de los datos reportadosen la literatura [14,24] sugiere que la relación molar entre butíricoy los ácidos acético bajo condiciones solventogenesis puede apartarse deel valor de 1,5, que es típico de las condiciones acidogénesis. esta

La figura. 5. Rendimiento de masa fraccional de las células y los ácidos producidos como una función de _. Las líneas songráficos de los valores teóricos calculados de acuerdo con las Ecs. (19) - (21)

resulta de las diferencias en la tasa de conversión de los ácidos no balanceadaspor las tasas de producción. Como se señala en la sección de Introducción,la evaluación de la conversión de ácido en condiciones solventogenesises complicado por su producción paralela. Para superar estelimitaciones, algunas pruebas se han diseñado específicamente para arrojar luzsobre los efectos de la salida de la relación butírico / ácidos acético a partir de 1,5en la producción de ácidos. En estas pruebas, la fermentación de lactosa se realizóSalida que complementa la alimentación con ácido (Tabla 1, ejecuteconjuntos X y XI).Bajo las condiciones de operación de los conjuntos de X y XI de la directaevaluación de los rendimientos de los ácidos YX / A era incierto. De hecho, la mediciónel incremento de la concentración debido a la producción deelácido que se había complementado en la alimentación era deficienteconfiable debido a que el incremento se cierran con frecuencia para la mediciónerror. Una valoración indirecta de YX / A era por lo tantoadoptado. Suponiendo que la relación de las tasas de producción de laácidos no fue afectado por la adición de ácidos e igual a 1,5, YX / A eraestima como:

para las pruebas realizadas se completa el ácido butírico (conjunto XI), y como

para complementar las pruebas realizadas ácido acético (juego X). AA y BAen las ecuaciones. (22) y (23) son las concentraciones en masa de ácido acético y seácido butírico producido bajo condiciones de estado estacionario, respectivamente.Los valores de YATP correspondiente a la ejecución de conjuntos de X y XI -evaluado por las Ecs. (14), (22) o (23) - se notifican en la figura. 6 como unafunción de la tasa de crecimiento específico. El valor esperado de YATPcalculado de acuerdo con las ecuaciones. (15) y (16) también se informa enLa figura. 6. El acuerdo entre el valor esperado y experimentalde YATP es satisfactoria. Por consiguiente se puede inferir que labutírico / acético relación de ácidos molar es todavía 1,5 hasta velocidades de producciónse tienen en cuenta, y que esta relación no se ve afectada por la adiciónya sea de ácido a la alimentación.La invariancia de la relación de producción butírico / ácidos acéticojunto con la estequiometría en relación con la conversión de ácidos aacetona proporcionar un apoyo importante para la evaluación de la acéticoyácidos butírico conversión durante la producción de disolventes.

4,4. pruebas por lotesLa Tabla 2 presenta datos medidos durante las pruebas realizadas en lotesconcentraciones iniciales de lactosa que oscilan entre 10 y 110 g / L [14].La tasa de crecimiento específico, evaluada de acuerdo con la ec. (6), hizono cambia significativamente debido a que la concentración inicial de lactosa esmucho mayor que la constante de saturación (1 g / L) de la Monod crecimientomodelo [12]. El valor de YATP determina a partir de las Ecs. (7) y son (14)notifica en la figura. 6 como una función de la tasa de crecimiento específico.

La capacidad de las ecuaciones del modelo de PIRT. (15) y (16) para reproducir eldatos experimentales pueden considerarse satisfactorios. aunquealgunos datos se caracterizan por una desviación mayor que 30%, el éxitoextensión del modelo - con parámetros basados en los resultados decultivos continuos - a las pruebas por lotes es una prueba más de que el sonido-dad del marco propuesto. En cualquier caso, una investigación másdeben llevarse a cabo para mejorar la fiabilidad de la propuestamodelo, incluso bajo condiciones de proceso por lotes

5. ConclusionesEl crecimiento de C. acetobutylicum DSM 792 bajo acidogénesiscondiciones utilizando lactosa como sustrato fue investigado con éxitoen un CSTR funcionar a pH constante. Efectos del pH, ácido acético,ácido butírico, etanol, acetona y butanol en producto microorganismolos rendimientos fueron investigados.Una estequiometría simplificado del proceso de crecimiento se propusode acuerdo con el modelo de mantenimiento propuesto por PIRT [21]. representauna herramienta para evaluar el rendimiento de masa fraccional de biomasa y ácidoscomo una función de la tasa de crecimiento específico, incluso bajo condiciones de operacióntípica de la fase solventogenic. El acuerdo entrelos rendimientos teóricos y experimentales era bastante bueno.