i

ANÁLISE COMPREENSIVA DE MARCADORES STR NO CROMOSSOMO X HUMANO:

APLICAÇÕES NA GENÉTICA MÉDICA E FORENSE

FILIPE BRUM MACHADO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

JUNHO DE 2008

ii

iii

ANÁLISE COMPREENSIVA DE MARCADORES STR NO CROMOSSOMO X HUMANO:

APLICAÇÕES NA GENÉTICA MÉDICA E FORENSE

FILIPE BRUM MACHADO

Dissertação apresentada ao Curso de

Pós-Graduação em Biociências e

Biotecnologia da Universidade Estadual

do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como

parte das exigências para obtenção do

título de Mestre em Biociências e

Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

JUNHO DE 2008

iv

ANÁLISE COMPREENSIVA DE MARCADORES STR NO CROMOSSOMO X HUMANO:

APLICAÇÕES NA GENÉTICA MÉDICA E FORENSE

FILIPE BRUM MACHADO

Dissertação apresentada ao Curso de

Pós-Graduação em Biociências e

Biotecnologia da Universidade Estadual

do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como

parte das exigências para obtenção do

título de Mestre em Biociências e

Biotecnologia.

Aprovada em 5 de junho de 2008

Comissão Examinadora:

___________________________________________________________________

Profª. Ana Beatriz Garcia (Doutora, Genética Molecular de Plantas), UENF.

___________________________________________________________________

Profª. Regina Célia de Souza Campos Fernandes (Doutora, Doenças Infecciosas e Parasitárias), FMC. ___________________________________________________________________

Profª. Telma Nair Santana Pereira (Doutora, Melhoramento de Plantas), UENF.

__________________________________________________________________

Prof. Enrique Medina-Acosta (Doutor, Parasitologia Médica e Molecular), UENF (Orientador).

v

“Para descobrir caminhos é necessário sair dos trilhos” (Albert Einstein 1879-1955)

“Todo o interesse na doença e na morte é apenas uma outra forma de interesse pela

vida” (Thomas Mann 1875-1955)

vi

Dedico este trabalho ao meu amigo e

mestre Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta

vii

Agradecimentos

Agradeço a Deus por ter me concedido saúde e por iluminar o meu caminho. Aos meus pais Ioni e Celso, por não medirem esforços pela minha felicidade. Aos meus irmãos Fabrício e Carolina e toda minha família pelo apoio sempre. A Manuela pelo companheirismo, cumplicidade, carinho e compreensão mesmo nos momentos difíceis. Ao Meu amigo e mestre Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta, o qual eu dedico este trabalho, pelo exemplo de cientista e ser humano. Aos meus amigos do NUDIM: Jonilda, Antônio, Eduardo, Luana, Hazel,Esther, Laís, Cláudia, Luciana, Yvilin, Eliane pelo convívio harmonioso. Especialmente a Maria, Marília, José Eduardo e Rosângela que me receberam de braços abertos quando cheguei neste Núcleo em abril de 2006. A todos os meus amigos, em especial aos amigos do LBT e da turma de Ciências Biológicas 2006. A UENF, pela oportunidade concedida Ao hospital Escola Álvaro Alvim pela confiança e apoio na realização deste trabalho. Aos assistidos e responsáveis legais que doaram amostras como voluntários, em benefício da ciência. Aos colaboradores, que referenciaram o NUDIM e permitiram o enriquecimento científico desta dissertação. Ao revisor, Prof. Dr. Victor Flores pelas sugestões e pela amizade. Aos membros da banca Profa. Dra.Regina Célia Fernandes, Profa. Dra. Telma Nair e Profa. Dra. Ana Beatriz Garcia pelo aceite do convite. E a todos aqueles que acreditam e investem na ciência brasileira.

viii

SUMÁRIO

Página

Lista de figuras x

Lista de tabelas xi

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DA LITERATURA 4

2.1. O cromossomo X Humano 4

2.2. Microsatélites 5

2.2.1. Mecanismo de formação dos microsatélites 5

2.3. Aplicações das STR localizadas no cromossomo X na Genética Médica 8

2.3.1. Diagnóstico de aneuploidias 8

2.3.1.1. Síndrome de Klinefelter 8

2.3.1.2. Síndrome de Turner 9

2.3.2. Determinação e diferenciação sexual 10

2.3.2.1. Ambigüidade genital 11

2.3.3. Hemofilia 12

2.4. Aplicações Forenses das STR no cromossomo X 14

2.4.1. Desequilíbrio de ligação e haplótipos 16

CAPÍTULO I. Mineração de microsatélites no cromossomo X 17

3. OBJETIVOS 18

4. MATERIAL E MÉTODOS 19

4.1. Mineração de microsatélites nas regiões Xp e Xq 19

4.2. Critérios de seleção para locos potencialmente polimórficos 19

4.3. Validação in silico do polimorfismo 20

4.4. Desenho de Iniciadores 20

4.5. Construção de um mapa genético para STRs no cromossomo X 20

5. RESULTADOS 21

5.1. Abundância de microsatélites no cromossomo X Humano 21

5.2. Informatividade dos marcadores utilizados em Genética Forense 22

5.3. Busca de marcadores tetra e pentanucleotídeos 40

ix

5.4. Localização dos marcadores pentanucleotídeos validados in silico no

mapa genético do cromossomo X

45

6. DISCUSSÃO 48

7. CONCLUSÕES 52

CAPÍTULO II. Genotipagem de indivíduos com constituição alossômica

duvidosa

53

3. OBJETIVOS 54

4. MATERIAL E MÉTODOS 55

4.1. Material biológico 55

4.2. Aspectos éticos 55

4.3. Métodos 56

4.3.1. Extração de DNA 56

4.3.2. Amplificação de regiões polimórficas e monomórficas específicas dos

cromossomos sexuais

56

4.3.3. Quantificação de DNA genômico 56

4.3.4. Caracterização dos alelos amplificados 56

5. RESULTADOS 60

5.1. Caracterização molecular dos cromossomos sexuais em pacientes

com constituição alossômica duvidosa

60

5.2. Determinação da origem parental e meiótica da não disjunção

cromossômica em uma criança com dupla aneuplodia 48,XXY+21

70

5.3. Investigação molecular em menor hermafrodita verdadeiro

47,XX,+mar/47,XY,+mar/46,XX/46,XY

72

6. DISCUSSÃO 74

7. CONCLUSÕES 78

8. REFERÊNCIAS 79

ANEXOS

x

Lista de Figuras

Página

Figura 1 Ilustração esquemática do mecanismo de formação do polimorfismo, mediante o deslizamento (“slippage”) da polimerase durante a replicação do DNA

6

Figura 2 Eletroferograma dos produtos de amplificação de um microsatélite do tipo dinucleotídeo

7

Figura 3 Distribuição de elementos STR encontrados no cromossomo X humano segundo estringência da mineração

22

Figura 4 Validação in silico do loco DX6807 25

Figura 5 Relação entre a pontuação média e o poder de discriminação em mulheres

36

Figura 6 Relação entre a pontuação média e o Poder de Discriminação em homens

37

Figura 7 Informatividade de marcadores com o mesmo número observado de alelos

38

Figura 8 Relação entre a pontuação média e a taxa observada de mutação em marcadores autossômicos

39

Figura 9 Mapa de recombinação para o cromossomo X humano 46

Figura 10 Mapa genético do cromossomo X humano 47

Figura 11 Eletroferograma do perfil genético de paciente portador da síndrome de Klinefelter

69

Figura 12 Eletroferograma dos perfis genéticos para os marcadores D21S11e D21S226 evidenciando a origem materna da trissomia do cromossomo 21

71

Figura 13 Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador X22 demonstrando a origem materna da cópia extra do cromossomo X

72

Figura 14 Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador D13S305 (cromossomo 13) do núcleo familiar

73

Figura 15 Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador XHPRT (cromossomo X) do núcleo familiar

73

Figura 16 Possíveis mecanismos de geração de indivíduos 2n XX/XY com 2 componentes genéticos maternos e 1 paterno

77

xi

Lista de Tabelas

Página

Tabela 1 Caracterização dos 39 marcadores, atualmente utilizados em genética forense, localizados no cromossomo X referência NC00023

24

Tabela 2 Média do número de alelos em diferentes populações para marcadores STR X-específicos

26

Tabela 3 Heterozigosidade média para marcadores STR X-específicos em diferentes populações

28

Tabela 4 Poder de discriminação médio para marcadores STR X-específicos em mulheres de diferentes populações

30

Tabela 5 Poder de discriminação médio para marcadores STR X-específicos em homens de diferentes populações

32

Tabela 6 Validação in silico de marcadores pentanucleotídeos 41

Tabela 7 Informação sobre os marcadores alossômicos que foram utilizados para genotipagem de indivíduos

58

Tabela 8 Perfil alélico dos marcadores específicos para o cromossomo 21 estabelecido por QF-PCR para o trio familiar

70

Tabela 9 Perfil alélico dos marcadores específicos para os cromossomos sexuais estabelecido por QF-PCR para o trio familiar

71

xii

Resumo

Os microsatélites, denominados seqüências curtas repetidas em tandem STR

(Short Tandem Repeats), exibem considerável variação em seqüência e número de

cópias entre os indivíduos. Em humanos, eles perfazem quase 4% do genoma e

constituem uma das principais fontes de marcadores genéticos polimórficos

utilizados em Genética Médica e Forense. Os critérios atuais de escolha de

marcadores são centrados em motivos históricos. Até o presente nenhuma análise

rigorosa havia sido feita para microsatélites localizados no cromossomo X humano.

Esta dissertação é apresentada em dois capítulos. No capitulo I procuramos

responder as seguintes questões baseados na informatividade dos microsatélites

conhecidos: O que é um bom marcador? Um bom marcador poderia ser predito por

uma análise in silico? Por meio de uma análise comparativa e compreensiva para

microsatélites em três seqüências referência para o cromossomo X humano foram

identificados e validados in silico 94 marcadores pentanucleotídeos, que serão úteis

no diagnóstico genético de aneuploidias, caracterização dos cromossomos sexuais e

investigação de parentesco. Na região Xq28, associada com hemofilia A, a análise

foi de alta resolução, obtendo-se um repertório 5,8 vezes maior do que o número de

elementos STR di-, tri- e tetranucleotídeos conhecidos, o que facilitará o diagnóstico

indireto da doença. Esses achados foram utilizados para gerar mapas físicos e

genéticos, úteis em estudos de análise de ligação. No capítulo II relatamos a

genotipagem, utilizando STR estabelecidos no diagnóstico genético, de indivíduos

com suspeita constituição alossômica e de dois casos raros; um indivíduo com as

síndromes de Down e Klinefelter combinadas e um indivíduo de provável origem por

diploidização de um embrião triplóide. A tipagem foi inequívoca no estabelecimento

do sexo genético e dosagem dos marcadores. Concluímos que a informatividade de

um marcador STR pode ser predita pela análise in silico e que os critérios de

escolha de um bom marcador dependerão da finalidade, se na Genética Médica ou

Forense. Os STR dinucleotídeos amplamente utilizados em citogenética molecular, e

que apresentam perfis eletroforéticos de difícil interpretação, devem ser substituídos

por STR pentanucleotídeos e tetranucleotídeos. A estratégia de mineração e

validação de marcadores polimórficos informativos descritos também será adequada

para a definição de critérios de predição de novos marcadores tanto para

autossomos quanto para o cromossomo Y.

xiii

Abstract

Microsatellites, also termed short tandem repeats (STR), exhibit considerable

variation in sequence and copy number among individuals. In humans, they make up

almost 4% of the genome and constitute one of the main source of polymorphic

genetic markers used medical genetics and forensics. Today’s selection criteria of a

good marker are centered in historical reasons. To this point, no rigorous analysis

had been carried out for microsatellites located on human X chromosome. This

dissertation is presented in two chapters. In chapter I, we intended to respond the

following questions based on the informativeness of known microsatellites: What is a

good marker? Could a good maker be predicted by an in silico analysis? By means of

a comparative and comprehensive analysis of microsatellites in three reference

sequences for the human X chromosome 94 pentanucleotide markers were identified

and validated in silico, which will be useful in genetic diagnosis of aneuploidies, sex

chromosome characterization and kinship analysis. In region Xq28, associated with

haemophilia A, the analysis was at high-resolution, yielding a 5.8-fold increase in the

repertoire of known di-, tri- and tetranucleotide STR, which will facilitate the indirect

diagnosis of the disease. These findings were used to create physical and genetic

maps, useful in studies of linkage analysis. In chapter II we report on the genotyping,

using STR already established for genetic diagnosis, of individuals with suspected

allosomic constitution and two rare cases, one individual with combined Down and

Klinefelter syndromes, and one individual likely originated by diploidization from a

triploid embryo. Typing was unequivocal in the establishment of the genetic sex and

markers amounts. We concluded that the informativeness of a given STR marker

may be predicted from the in silico analysis and that selection criteria of a good

marker will depend on the purpose of use, whether medical genetics or forensics.

The dinucleotide STR widely used in molecular cytogenetics, which present profiles

of difficult interpretation, ought to be substituted by pentanucleotide and

tetranucleotide STR. The strategy here described for mining and validation

informative and polymorphic will be adequate also for defining criteria of prediction of

new makers in both autosomes and the Y chromosome.

1

1. INTRODUÇÃO

Os microsatélites são seqüências de DNA curtas (1-6 nucleotídeos) repetidas

em tandem, isto é, em série, que exibem considerável variação em seqüência e

número de repetição entre os indivíduos. Os microsatélites, também denominados

seqüências curtas repetidas em tandem STR (Short Tandem Repeats), constituem

uma das principais fontes de marcadores genéticos polimórficos amplamente

utilizados nas áreas forense, antropologia evolutiva e genética médica. A crescente

disponibilidade de enormes bancos de dados de seqüências de DNA humano

acelerou estudos genoma abrangentes e compreensivos quanto à origem e função

dos microsatélites na procura de novas aplicações.

Vários marcadores microsatélites têm sido utilizados tanto no campo da

Genética Médica quanto na Genética Forense. Devido à individualidade do perfil

genético gerado pela genotipagem de microsatélites, este tipo de marcador

polimórfico possibilita não apenas o diagnóstico de aneuploidias, mas também a

determinação da origem parental e meiótica da cópia única ou extra cromossômica

em indivíduos portadores de aneuplodia. A origem parental da cópia extra do

cromossomo X em pacientes com Síndrome Klinefelter ou da cópia única em

pacientes com Síndrome de Turner interfere no quadro clínico desses pacientes

(Stemkens et al., 2006; Sagi et al., 2007). Outra aplicação na Genética Médica é a

genotipagem de microssatélites que segregam em desequilíbrio de ligação, ou seja,

em conjunto com genes importantes como o F8, cujas alterações resultam em

hemofilia A. Os genótipos de locos que segregam em conjunto formam haplótipos.

Na genética Forense, os microssatélites são utilizados na identificação de indivíduos,

tanto no campo de investigação de vínculo de parentesco como na identificação de

criminosos.

Os STR dinucleotídeos são amplamente utilizados para diagnóstico, embora

apenas o marcador DXS1214 foi validado para identificação de indivíduos. Este tipo

de marcador possui como característica intrínseca, um perfil eletroforético de difícil

interpretação devido à formação de stutters que são produtos de amplificação que

diferem do produto real e são inferiores a estes. A taxa de formação de stutter é

inversamente proporcional ao tamanho da unidade de repetição (Fan e Chu, 2007).

2

Notamos que os critérios na escolha de novos marcadores são falhos e que a

sua utilização tem sido baseada em motivos históricos. Até o presente nenhuma

análise criteriosa havia sido feita para as STR localizadas no cromossomo X

amplamente utilizadas pelos laboratórios e cujas análises constituem a maior banco

de dados de freqüências de alelos, haplótipos e taxas de recombinação. Nenhum

marcador pentanucleotídeo localizado no cromossomo X tem sido utilizado, sendo

que as propriedades combinadas de alto poder de discriminação, poucos

microvariantes e baixos níveis de produtos stutter fazem deste tipo de marcador STR

ideal para análise forense (Bacher e Schumm, 1998). Na presente dissertação

propomos trabalhar com uma técnica desenvolvida na década de 90, a Reação

Quantitativa Fluorescente em Cadeia da Polimerase (QF-PCR), que é de baixo custo

e os resultados podem ser entregues em menos de 24 horas.

Nesta dissertação procuramos responder as seguintes questões baseados na

informatividade dos marcadores STR conhecidos: O que é um bom marcador? Um

bom marcador poderia ser predito por uma análise in silico? Essas informações

serão úteis na estratégia da confecção de kits para diagnóstico de doenças ligadas o

cromossomo X e de investigação de vínculo de parentesco.

No Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular (NUDIM) implementamos

e validamos a metodologia para diagnóstico da trissomia livre do cromossomo 21

como teste único (Alves da Silva, 2007), a qual é utilizada na rotina nos casos de

suspeita clínica. Pelo nosso conhecimento, no Brasil, não há outro serviço de

citogenética molecular por QF-PCR. Buscando ampliar o atendimento para

comunidade regional que carece de serviço especializado na área de Genética

Humana, que no estado do Rio de Janeiro é restrito á capital, implementamos

também um teste rápido para a caracterização dos cromossomos sexuais nos

pacientes com constituição alossômica duvidosa (Turner, Klinefelter, genitália

ambígua, Homem XX, Mulher XY).

A dissertação está dividida em dois capítulos. O primeiro capítulo abrange a

estratégia de mineração e validação de novos sítios de microsatélites presentes no

cromossomo X humano. O segundo capítulo descreve a genotipagem de indivíduos

com constituição alossômica duvidosa e dois casos raros, um indivíduo com as

3

síndromes de Down e Klinefelter combinadas, e um indivíduo mosaico com provável

origem por diploidização de um embrião triplóide.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. O cromossomo X humano

A origem dos cromossomos sexuais X e Y em humanos parece ser

autossômica, com a aquisição por um dos pares autossômicos de um loco de

determinação sexual como o fator de determinação testicular (TDF-Testis

Determining Factor). O acúmulo de alelos específicos masculinos selecionou a

repressão da recombinação criando uma região específica de X e de Y. A exclusão

da recombinação levou a rápida degradação da região específica masculina

restando somente uma pequena região pseudo-autossômica nas regiões

teloméricas do par sexual (Graves, 2006).

Aproximadamente 155 megabases (Mb) compõem o cromossomo

submetacêntrico X. O conteúdo de 39% G+C é mais baixo que a média do genoma

(41%). Foram anotados 1098 genes (7,1 por Mb), uma das mais baixas densidades

gênicas comparada a outros cromossomos. Os éxons dos 1098 genes

correspondem apenas 1,7% da seqüência completa do cromossomo X e 33% da

seqüência é transcrita. O comprimento médio de um gene no cromossomo X é de 49

Kilobases (Kb). Contudo, o cromossomo X possui o maior gene conhecido do

genoma humano, o da distrofina (DMD) localizado em Xp21.1, que se expande por

2.220.223 bp (Ross et al., 2005).

O cromossomo X possui muitas características que são únicas no genoma

humano. Mulheres herdam um cromossomo X de cada um dos pais, enquanto os

homens herdam somente o cromossomo X materno. Foram anotados 54 genes no

cromossomo X que possuem homólogos funcionais no Y. Embora o cromossomo X

contenha somente 4% de todos os genes humanos, quase 10% das doenças com

padrão de herança mendeliana têm sido atribuídas ao cromossomo X (Ross et al.,

2005).

4

As doenças recessivas ligadas ao X afetam principalmente homens devido ao

caráter de hemizigose para a maioria dos genes. Outras desordens ligadas ao sexo

podem exibir características atípicas que resultam do processo de inativação do

cromossomo X e de conseqüências de mosaicismo em alguns tecidos, o que

significa na ocorrência de células com constituição cromossômica variada (Ballabio

et al., 2006).

2.2. Microsatélites

As seqüências de DNA em tandem, isto é, em série, ocorrem na forma de

unidades de um único a milhares de nucleotídeos. Mono-, di-, tri- e tetranucleotídeos

são os principais tipos de microsatélites, e no conjunto são conhecidas como

seqüências curtas repetidas em tandem (“Short Tandem Repeats”, STR). Repetições

de cinco (penta) ou seis (hexa) nucleotídeos geralmente também são classificadas

como microsatélites. Repetições de unidades mais longas são denominadas de

minisatélites ou, no caso extremo, de DNA satélite (Ellegren, 2004).

Dependendo dos parâmetros utilizados o genoma humano pode apresentar

3,9% de nucleotídeos em microsatélites (Leclercq et al., 2007). Uma comparação do

recém seqüenciado genoma diplóide humano revelou 4.1 milhões de variantes de

DNA entre os genomas haplóides, perfazendo 12.3 Mb. Estas variantes incluem

3.213.401 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), 53.823 substituições de bloco

(2–206 pb), 292.102 eventos de inserção/deleção (indels) (1-571pb) onde estão

representadas as STR (Levy et al., 2007). Desse total, 1.288.319 são variações

novas.

Os microsatélites são predominantemente encontrados em íntrons ou em

seqüências intergênicas. Microsatélites que são usados como marcadores genéticos

normalmente encontram-se nessas regiões. Repetições de trinucleotídeos que estão

associadas com doença em humano incluem uma classe especial de microsatélites

em DNA codificante devido à sua importante associação com patologia em humanos

(Ellegren, 2004; Collins et al., 2003).

5

2.2.1. Mecanismo de formação dos microsatélites.

O mecanismo para expansão e contração de microsatélites é o

desacoplamento, e realinhamento errôneo da DNA polimerase durante a replicação

do DNA. (figura 1). Desta forma, o número de repetições no local pode ser diminuído

ou aumentado a cada replicação. Como conseqüência, surge novos alelos.

As taxas de mutação de contração de alelos estão relacionadas de maneira

exponencial com o tamanho do alelo (Xu et al., 2000) e seqüências longas tendem a

encurtar para prevenir crescimento infinito (Ellegren, 2000). Estudos em

Saccharomyces cerevisiae demonstraram que o limiar para que ocorra mutação

dinâmica nos sítios de microsatélites é mais consistente com o número de

nucleotídeos do que com o número de repetições. O limite mínimo de 8 nucleotídeos

para mono-, di- e tetranucleotídeos foi estabelecido para este modelo (Rose e

Falush, 1998).

Os deslizes da polimerase perante as repetições de DNA são claramente

manifestadas nos produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR, “polymerase

chain reaction”) que podem consistir, além da amplificação do alvo principal, de

mutações de inserção ou deleção que diferem da seqüência alvo original por

múltiplas unidades de repetição (Figura 2) (Shinde et al.,2003). Esses produtos com

menor representação quantitativa são conhecidos como “stutter”. As taxas de

mutação in vitro são maiores que as encontradas in vivo devido ao sistema de

reparo da replicação do DNA. Portanto, a taxa de mutação observada depende da

freqüência de deslizes da polimerase e da eficiência no mecanismo de reparo (Fan e

Chu, 2007).

A taxa de mutação e formação de “stutter” é inversamente proporcional ao

tamanho da unidade de repetição. Locos com imperfeições nessas unidades tendem

a ser menos mutáveis (Fan e Chu 2007). Mutações pontuais também estão

presentes nos microsatélites, embora o mecanismo de deslizamento da polimerase

exceda o número deste tipo de mutação por uma a duas ordens de grandeza

(Pumpernik et al., 2008).

Outro possível mecanismo na origem dos microsatélites é a recombinação

meiótica; porém, como a taxa de mutação em marcadores presentes na região não

6

recombinante do cromossomo Y é similar à observada em locos autossômicos, a

recombinação parece não ser um mecanismo predominante na geração de

variabilidade de STR (Fan e Chu, 2007).

Figura 1. Ilustração esquemática do mecanismo de formação do polimorfismo,

mediante o deslizamento (“slippage”) da polimerase durante a replicação do DNA

(Adaptado de Fan e Chu, 2007).

7

Figura 2. Eletroferograma dos produtos de amplificação de um microsatélite do tipo

dinucleotídeo. Os produtos stutter correspondem aos picos -2,-4, e -6 pares de

nucleotídeos do pico real com 164 pares de base de comprimento (Figura elaborada

de amostra de DNA doada ao NUDIM).

2.3 . Aplicações das STR localizadas no cromossomo X na Genética Médica

2.3.1. Diagnóstico de aneuploidias

Estima-se que de 10 a 30% dos óvulos humanos fertilizados tenham um

número errado de cromossomos, sendo na maioria dos casos, trissômicos ou

monossômicos. Isto tem profundas conseqüências clínicas: aproximadamente um

terço de todos os abortamentos são aneuplóides. Entre concepções que chegam a

termo, a aneuploidia é a principal causa genética de morbidade e retardo mental

(Hassold e Hunt, 2001).

Diversas metodologias têm sido utilizadas para o diagnóstico de aneuploidias.

A principal metodologia continua sendo a cariotipagem, seguido da Hibridação in situ

fluorescente (FISH, “Fluorecent in situ hybridization”) e da reação quantitativa

fluorescente em cadeia da polimerase (QF-PCR, quantitative fluorescence PCR),

sendo esta última utilizada principalmente em testes no pré-natal. É importante notar

que até mesmo no cariótipo por bandeamento G de alta resolução, deleções ou

duplicações <5 Mbp normalmente permanecem indetectáveis. A implicação é que

uma proporção de anormalidades cromossômicas que podem ser associadas com

8

inaptidões física e mental não é diagnosticada habitualmente, até mesmo com este

teste padrão-ouro (Hultén et al., 2003).

2.3.1.1. Síndrome de Klinefelter

O termo Síndrome de Klinefelter descreve um grupo de desordens

cromossômicas no qual há pelo menos um cromossomo X adicional ao cariótipo

masculino normal, 46,XY. A forma clássica é a mais comum desordem

cromossômica, na qual há um cromossomo X extra, resultando no cariótipo 47,XXY.

(Visootsak et al., 2006). Stemkens e colaboradores (2006) encontraram que

pacientes com o cromossomo X extra de origem paterna tinham mais problemas

motores e na fala que aqueles que portavam o X materno. Observaram também um

significante aumento no tamanho corporal no grupo com o X paterno, que concorda

com os dados que o crescimento é influenciado por genes derivados paternalmente.

Os dados sugerem que ocorre imprinting genômico do cromossomo X em homens

com constituição alossômica XXY. O imprinting genômico é um processo de herança

independente da herança mendeliana, pelo qual certos genes são expressos

seguindo um padrão de origem parental específico, o que resulta na modificação

herdada e reversível de um alelo que não altera a seqüência de nucleotídeos

determinada pelo sexo do genitor (Pasternak, 2005). Assim sendo, os genes sujeitos

à imprinting genômico são expressos somente a partir do alelo herdado da mãe ou

do alelo paterno.

A freqüência de nascidos vivos com Síndrome de Klinefelter é

aproximadamente 1 em 1000 meninos. A origem parental do cromossomo X

adicional em homens acometidos pode ser tanto paterna (50 a 60%) quanto materna

(40 a 50%). É possível a ocorrência de dupla aneuploidia em um mesmo indivíduo.

As freqüências de dupla aneuplodia, com exceção de 48,XXY,+21, são mais baixas

que o esperado, provavelmente por causa da forte seleção contra tais gravidezes.

Acometidos por dupla aneuplodia 48,XXY,+21 geralmente possuem mães com idade

superior a 35 anos e poucos estudos têm estabelecido a origem parental e meiótica

da não disjunção nestes casos (Kovaleva et al., 2005)

9

2.3.1.2. Síndrome de Turner

A Síndrome de Turner, também conhecida como Ullrich-Turner, pode ser

definida como a combinação de características físicas e a completa ou parcial

ausência do segundo cromossomo X, com ou sem mosaicismo celular. É uma

desordem cromossômica comum que afeta 1 a cada 2000 meninas nascidas vivas

(Saenger et al., 2001).

Todos os indivíduos com suspeita de Turner devem ser cariotipados. Células

suficientes devem ser contadas para identificação de possível mosaicismo. Embora

o cariótipo de sangue periférico seja geralmente adequado, se há forte suspeita

clínica da síndrome, apesar do cariótipo normal, um segundo tecido tal como pele

deve ser genotipado (Saenger et al., 2001). A determinação de derivativos do

cromossomo Y em pacientes com cariótipo 45,X é importante para o manejo dessas

pacientes devido ao aumento de risco de gonadoblastoma. Baixo nível de

mosaicismo do cromossomo Y pode não ser detectado por métodos citogenéticos

convencionais (Semerci et al., 2007).

Cerca de 60 a 80 % das pacientes Turner retém o X materno. Sagi e

colaboradores (2007) encontraram que malformações renais foram exclusivamente

encontradas em pacientes com o X materno retido. Anomalias oculares foram mais

comuns nas pacientes que possuíam o X paterno retido. Os dados sugerem um

potencial efeito de um indeterminado “imprinting” genômico no cromossomo X. Deve

ser enfatizado que indivíduos com Síndrome de Turner podem ser saudáveis, felizes

e serem membros produtivos da sociedade (Saenger et al., 2001).

2.3.2 Determinação e diferenciação sexual.

A história das idéias sobre a origem do sexo masculino e feminino tem pelo

menos três mil anos. As explicações bíblicas para a origem de Eva e as opiniões dos

filósofos da Grécia antiga relacionam-se de forma surpreendente com as idéias

atuais. Pode-se dizer que o estudo científico da determinação do sexo iniciou-se no

século XVII com a descoberta dos espermatozóides, mas sua origem e função foram

desvendadas em 1841. Somente no primeiro quarto do século XX que a

10

determinação do sexo por controle ambiental deu lugar à determinação

cromossômica do sexo (Mittwoch, 2005).

Os eventos de determinação sexual e diferenciação sexual podem ser

entendidos em 4 etapas: Determinação do sexo cromossômico, que é estabelecida

na fertilização; a diferenciação das gônadas em testículos ou ovários; a

diferenciação dos genitais internos e externos masculinos ou femininos a partir de

estruturas indiferenciadas presentes no embrião, que é dependente da presença ou

ausência de testículos; e as diferenciações secundárias, em resposta à vários

hormônios produzidos pelas gônadas para completar o fenótipo sexual (Mello et al.,

2005).

O gene SRY (“Sex-determining Region on Y chromosome”) codifica um fator

de transcrição que é membro da família de proteínas do grupo de alta mobilidade

que se ligam ao DNA. Mutações neste gene em indivíduos com constituição

alossômica XY resultam em mulheres que apresentam disgenesia gonadal. A

translocação de parte do cromossomo Y contendo este gene para o cromossomo X

pode resultar em homens XX (Anderson et al., 1986). Em cerca de 80% dos homens

XX detecta-se a presença do gene SRY. Como os genes responsáveis pela

espermatogênese estão no braço longo do cromossomo Y, que homens XX não

possuem, esses pacientes são inférteis. No entanto, a caracterização do gene SRY

não esclareceu totalmente o problema da determinação gonadal, porque ficou

aparente que outros genes nos cromossomos sexuais ou em autossomos também

estão implicados nesse processo que foi se revelando muito mais complexo do que

imaginado inicialmente (Damiani et al., 2001).

2.3.2.1 Ambigüidade genital

Dentre as várias situações que podem configurar uma emergência pediátrica

do recém nascido, as ambigüidades genitais são de importância enorme tanto do

ponto de vista imediato, já que algumas etiologias (hiperplasia adrenal congênita,

síndromes malformativas) colocam a vida do neonato em risco, como em longo

prazo, em que uma situação mal definida quanto ao sexo acarretará prejuízos

irreparáveis ao bem-estar psico-social do indivíduo. Os problemas relacionados ao

11

determinismo gonadal abrangem o Hermafroditismo Verdadeiro, a disgenesia

gonadal mista, Homem XX, Pseudo-Hermafroditismo Feminino (PHF) e Pseudo-

Hermafroditismo Masculino (PHM) (Damiani et al., 2001).

O perfil etiológico em pacientes com genitália ambígua em um centro de

referência na Índia mostrou que 27% dos casos eram devido a PHF com hiperplasia

adrenal congênita, sendo 76,7% destes sob a forma perdedora de sal. A freqüência

de PHM foi de 52,3% em pacientes que tinham como principal categoria a síndrome

de insensibilidade a andrógenos (28%) e à deficiência na enzima 5 alfa-redutase

(23%) (Joshi et al., 2006).

Homens XX SRY+ geralmente possuem genitália masculina. Homens XX

SRY- possuem genitália ambígua ou normal e mostram gradação diversa (Rajender

et al., 2006). São raros os relatos de pacientes na faixa etária pediátrica de homens

XX, e o diagnóstico é feito nos casos com ambigüidade genital ou ginecomastia. A

constituição alossômica discordante, em alguns casos só é aparente ao exame

citogenético. Por exemplo, um homem XX foi detectado pela citogenética para

confirmação da Síndrome de Down, já que sua genitália externa não era ambígua,

podendo tratar-se de coincidência dessas duas situações clínicas ou haver alguma

relação entre elas ainda desconhecida (Damiani et al., 2005).

Como mencionado, além do SRY outros genes estão envolvidos na

diferenciação sexual. A ocorrência de cromossomo 13 em anel pode levar a

ambigüidade genital. A banda q34 está sempre ausente nos casos de genitália

ambígua com anormalidades do cromossomo 13, sugerindo que 13q34 possui

genes envolvidos no desenvolvimento genital (Sankar e Phadke, 2006).

Um caso de genitália ambígua em um dos irmãos gêmeos, sendo o outro

fenotipicamente masculino, chamou atenção de pesquisadores que constataram que

citogenética e molecularmente os gêmeos eram quimeras, e apresentavam ambos

os componentes maternos, porém um único componente paterno, suportando assim

a existência de um novo tipo de gemelaridade (Souter et al., 2007).

As propostas terapêuticas, no caso de neonatos portadores de genitália

ambígua, têm focado na definição sexual com o objetivo de minimizar os possíveis

traumas na criança ou, por outro lado, a resolução do dilema médico. O aspecto

12

psico-social da doença, das relações familiares, da aceitação da criança portadora

por ela mesma e pela família, tem sido em alguns serviços renegados a um segundo

plano em detrimento a gravidade do quadro (Silva et al., 2006). Estudos com pais de

portadores de genitália ambígua mostraram que os dois aspectos que se

destacaram nas falas dos pais foram o medo e a ansiedade. As principais formas de

enfrentamento foram a projeção, a negação/fuga e a racionalização (Silva et al.,

2006).

2.3.3. Hemofilia

No passado, muitas culturas compreenderam que alguns distúrbios humanos

tendem a ocorrer em famílias e responderam com tradições médicas e culturais para

acomodar este fenômeno até então inexplicável. O Judaísmo, por exemplo, requer a

circuncisão dos meninos, que é feita 8 dias após o nascimento. Entretanto, a lei do

Talmud, estabelecida a mais de 1.500 anos, criou exceções específicas. Se duas

irmãs perderam um filho como resultado de sangramento excessivo após a

circuncisão, nem elas nem outras irmãs teriam de submeter os filhos subseqüentes

ao procedimento. Embora não totalmente exatos, esses preceitos religiosos tornam

a herança da hemofilia recessiva ligada ao cromossomo X, um dos mais antigos

distúrbios genéticos registrados (Pasternak, 2005).

A hemofilia A (OMIM 306700) é a desordem hemorrágica mais comum e

severa em humanos, causada por qualquer inversão patológica nos íntrons ou por

quase 1700 mutações recorrentes de diferentes tipos (deleções, inserções, parada e

perda de sentido e mutações nos sítios de “splicing”), todas no gene (F8), do fator de

coagulação VIII. (Goodeve and Peake 2003, Kemball-Cook 2005, Oldenburg, et al.,

2004), que codifica uma glicoproteína fundamental de uma rede funcional de

proteínas estruturais e enzimas que integram a cascata de coagulação sanguínea.

O gene F8 humano está localizado na banda Xq28, com 186 kb de extensão

e compreende 26 éxons (Gitschier et al., 1986). A análise direita de mutação no

gene F8 em famílias com acometidos pela hemofilia A não é prática e tem um custo

que não permite sua realização, particularmente em países do terceiro mundo,

devido à natureza heterogênea das mutações patogênicas, pelo grande tamanho e

13

complexidade do gene F8. Ao invés disto, a análise genética de ligação (ver item

2.4.1.) com marcadores polimórficos F8 intragênicos e/ou extragênicos localizados

próximo ao gene, tais como os marcadores STR, é uma estratégia aceita para um

diagnóstico indireto e aconselhamento genético em famílias de portadores

(Harraway et al., 2006).

O número de elementos STR validado para este fim tem sido limitado a 14,

das quais 13 são dinucleotídeos, que apresentam perfis de difícil interpretação. Um

desses marcadores havia sido mapeado erroneamente e foi relocado para o loco

correspondente (Machado e Medina-Acosta, 2008a). No presente trabalho também

foram definidos novos sítios de microsatélites que serão úteis na identificação de

mulheres portadoras do gene mutante e no aconselhamento genético (Machado e

Medina-Acosta, 2008b).

2.4 Aplicações Forenses das STR no cromossomo X.

A idéia fundamental de utilizar marcadores do cromossomo X na prática

forense veio de experiências feitas na segunda metade do século passado no

campo da genética clínica (Szibor, 2007). A genotipagem de marcadores do

cromossomo X pode complementar a análise de autossomos e marcadores Y muito

eficientemente, especialmente em casos complexos de parentesco.

A característica especial da tipagem do cromossomo X em casos de

deficiência de indivíduos na análise de vínculo de parentesco pode ser explicada

pelos fatos seguintes: A tipagem do cromossomo X em homens com constituição

alossômica típica XY revela automaticamente seu haplótipo; homens transmitem seu

cromossomo X inteiro para suas filhas; todas as irmãs de pai biológico comum

compartilham o haplótipo X paterno; todos os alelos não compartilhados por irmãs

devem ser de origem materna e a genotipagem de dois ou mais irmãos indica

grande parte do genótipo materno. Além disso, é muito provável que haplótipos de

grupos de ligação permaneçam estáveis ao longo de muitas gerações (Szibor et al.,

2003d).

As investigações de rotina em que se aplica o teste de paternidade

compreendem trios (suposto pai, mãe e criança) ou duos (suposto pai e criança). As

14

inconsistências podem ser devido à mutações ou o verdadeiro pai ser parente

próximo do suposto pai testado, especialmente um irmão. Quando há poucas

inconsistências (< 2), a análise de marcadores STR do cromossomo X é importante

na resolução de casos envolvendo pai e filha (Silveira et al., 2007) e somente

poucos marcadores são requeridos para fornecer uma boa evidência em casos de

suposta meia-irmandade entre filhas (Hering et al., 2001). O teste também é útil em

casos de incesto ou onde os supostos pais são pai e filho e em casos de estupro

para complementar a investigação no pré-natal (Szibor,2007)

Vários locos têm sido validados para aumentar o painel de marcadores do

cromossomo X (Edelmann et al., 2003) e nos últimos anos vários países têm criado

bancos populacionais de freqüências alélicas, utilizando sistemas multiplex de

genotipagem (Shin et al., 2004; Bini et al., 2005; Pepinski et al., 2005; Poetsch et al.,

2005; Gu e Li, 2006; Gomes et al., 2007). Os marcadores STR utilizados por

laboratórios no mundo têm sido limitados a apenas 39. Esses marcadores se

localizam em íntrons e seqüências intergênicas; apenas o marcador HumARA está

localizado no éxon 1 do gene receptor de andrógenos e cujo número de repetições

está relacionado a aumento de risco a diversas patologias humanas. Portanto, é

recomendada a substituição deste marcador para que se mantenha a privacidade

individual (Szibor et al., 2005a).

Uma das características importantes da informatividade de cada marcador é o

seu poder de discriminação (PD), que no caso dos marcadores localizados no

cromossomo X pode ser definido matematicamente pelas fórmulas [1-∑ fi2], para

homens, e [1-2 (∑ fi2)2 + ∑ fi4] para mulheres, onde f é a freqüência de cada alelo (i)

em um determinado loco (Szibor et al., 2003a). Quanto maior o PD mais informativo

é o marcador. Outra característica importante na eficiência dos marcadores é o

poder de exclusão (PE); porém, mais de uma fórmula tem sido utilizada pela

comunidade científica.

Um novo sistema Mini X-STR foi implementado útil para genotipar DNA

degradado com produtos de amplificação variando entre 76 e 169 pares de

nucleotídeos para 8 marcadores (Asamura et al., 2006a). Neste sistema os sítios de

anelamento dos iniciadores ficam bem próximos dos microsatélites.

15

A taxa de mutação obtida para 16 marcadores do cromossomo X é 2,09 x 10-3

por meiose, similar àquelas descritas para marcadores STR autossômicos (Szibor et

al., 2003a). É de grande importância possuir DNA referência (K562 ou 9947) para

nomear os alelos, pois a designação alélica pode variar entre as publicações

impossibilitando a comparação entre os dados (Szibor et al., 2003b). Sabe-se que a

análise dos produtos da PCR por eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração

com prata não é segura na discriminação de alelos que diferem de apenas 1

nucleotídeo. Deve-se então ser criterioso na nomeação de alelos para evitar

designações erradas que poderiam significar mutações, e portanto, alelos de

exclusão. Nesse sentido, os dados de algumas publicações devem ser

reconsiderados (Szibor et al., 2003c). Maiores informações sobre pesquisa forense

do cromossomo X estão disponíveis online no endereço www.chrx-str.org (Szibor et

al., 2006).

2.4.1 Desequilíbrio de ligação e haplótipos

O desequilíbrio de ligação (LD) é a associação não aleatória entre diferentes

locos, ou seja, há uma freqüência de uma determinada combinação entre alelos,

diferente da esperada pelo produto de suas freqüências individuais. Portanto,

marcadores em LD segregam em bloco formando haplótipos. Em um estudo

realizado por Szibor e colaboradores (2005b) com um grupo de 3 marcadores

ligados eram esperados teoricamente 1144 diferentes haplótipos baseados no

número de alelos observados para cada marcador; porém, de 806 homens

genotipados, foram encontrados 207 diferentes haplótipos. Logo, se os marcadores

se mostrarem estar em forte desequilíbrio de ligação a freqüência haplotípica não

pode ser calculada com base na freqüência alélica de cada loco individual, mas deve

ser estimada diretamente (Hering et al., 2006).

A análise simultânea de marcadores STR localizados no mesmo cromossomo

requer conhecimento sobre a distância dos pares e desequilíbrio de ligação entre

eles. A validação de novos marcadores deve inevitavelmente incluir um preciso

mapa de ligação. Como convenção a distância física de 1 megabase (Mb)

corresponde a distância genética de 1 centiMorgan (cM) isto é, uma recombinação

16

esperada em 100 meioses. Porém, a distância física e genética não são estritamente

correlacionadas (Szibor et al., 2003a).

Junto com mutação, o principal mecanismo de variabilidade genética em

eucariotes é a recombinação meiótica entre pares de cromossomos homólogos. A

abordagem básica para estudar taxas de recombinação no genoma é construir um

mapa genético por genotipagem, com uma alta densidade de marcadores, um

grande número de indivíduos em famílias e então agrupar os dados no mapa físico

correspondente (Kong et al., 2002). A taxa de recombinação varia enormemente

pelo genoma humano, com a maioria dos eventos ocorrendo em estreitas “zonas

quentes”. Setenta e dois por cento dos eventos de recombinação ocorrem em “zonas

quentes” inferidas por estudos de desequilíbrio de ligação (Coop et al., 2008).

17

CAPÍTULO I

Mineração de microsatélites no cromossomo X

18

3. OBJETIVOS

• Realizar uma análise in silico (computacional) compreensiva para

microsatélites no cromossomo X humano.

• Validar in silico marcadores pentanucleotídeos para diagnóstico genético

e investigação de parentesco.

• Validar in silico marcadores no gene do fator VIII de coagulação

sanguínea e adjacências para o diagnóstico indireto da hemofilia A.

19

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Mineração de microsatélites nas regiões Xp e Xq

Os cromossomos X referência disponíveis no NCBI (National Center for

Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) com os números de acesso

NC_000023, AC_000066, AC_000155 tiveram suas seqüências de nucleotídeos

varridas em busca de marcadores do tipo STR. Para tal, foi utilizado o programa

Tandem Repeat Finder TRF (Benson, 1999). Este software utiliza um algoritmo

capaz de encontrar os elementos repetitivos pelo percentual de identidade e pela

freqüência de indels (inserções e/ou deleções) comparado a uma seqüência

referência com repetições perfeitas em série.

Quanto maior for o número de repetições e o tipo de repetição, maior será a

pontuação final. Por exemplo: 10 repetições perfeitas de tetranucleotídeos

apresentam pontuação igual a 80, enquanto 10 de dinucleotídeos apresentam

pontuação 40. Vinte repetições dinucleotídicas fazem 80 pontos. As seqüências

imperfeitas possuem pontuação menor do que as perfeitas com o mesmo número de

repetições, exemplo: a seqüência [AC AC AC AT AC AC AC AC] possui pontuação

menor do que a seqüência [AC AC AC AC AC AC AC AC]. Os descontos na

pontuação final dependem da proporção dos erros de pareamento com uma

seqüência perfeita. Os parâmetros de busca das repetições ({2,3,5}, {2,5,5}, {2,5,7},

{2,7,7}) também influenciam na pontuação final. O primeiro valor fixo {2} corresponde

à identidade e o segundo e terceiro valores {3 ou 5 ou 7} às imperfeições. O

parâmetro que desconta o menor valor da pontuação final devido às imperfeições é

o {2,3,5}; portanto, o mais permissivo. Por outro lado o {2,7,7} é o mais estringente.

No presente trabalho foi utilizado o parâmetro mais estringente.

Este programa foi utilizado pelo consórcio internacional de seqüenciamento

do genoma humano, que concluiu que repetições de 1-6 nucleotídeos constituem

1,5% do genoma humano e este valor pode aumentar para 3,9% utilizando outros

parâmetros (Leclercq et al., 2007).

4.2. Critérios de seleção para locos potencialmente polimórficos

Para selecionar novos marcadores potencialmente polimórficos foram

avaliados aqueles elementos STR com pontuação mínima de 80 e identidade de

20

90%; estes critérios correspondem aos valores mínimos apresentados por 97% e

79% dos tetranucleotídeos validados na Genética Forense, respectivamente. Outros

critérios foram utilizados para incluir os dinucleotídeos no mapa de alta resolução de

marcadores intragênicos e adjacentes ao Fator VIII (F8) de coagulação sanguínea

(Machado e Medina-Acosta, 2008b). As regiões pseudo-autossômicas não foram

avaliadas.

4.3. Validação in silico do polimorfismo

A natureza polimórfica dos locos STR foi validada utilizando banco de dados

dos 3 cromossomos X referência, NC_000023, AC_000066, AC_000155. As

seqüências dos 3 genomas foram alinhadas para cada loco microsatélite usando o

programa online Multiple Sequence Alignment CLUSTALW (http://align.genome.jp/)

para identificar variantes alélicas. Todos os locos foram qualificados utilizando uma

escala de polimorfismo in silico variando de 1 (um alelo) a 3 (três alelos).

4.4. Desenho de Iniciadores

Iniciadores foram desenhados apenas para novos marcadores na região

Xq28. Para as demais regiões, os valores correspondem à posição física em pares

de nucleotídeos do início e fim dos microsatélites.

Para o desenho de iniciadores ao redor das seqüências repetidas foram

utilizados os programas livres e online: OligoPerfect™ Designer da Invitrogen™

(http://www.invitrogen.com/) e o OligoCalc - Oligonucleotide Properties Calculator

(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html). Os iniciadores

desenhados possuem de 18-22 nucleotídeos e amplificam produtos in silico de 100

a 450pb (Machado e Medina-Acosta, 2008b).

4.5. Construção de um mapa genético para STR no cromossomo X.

Para construção do mapa genético foram utilizadas as informações do mapa

combinado de ligação e mapa físico para o genoma humano (Rutgers Map)

elaborados por pesquisadores da Universidade Rutgers (Matise et al., 2007),

também disponível online (http://compgen.rutgers.edu/maps/). Neste mapa estão

presentes 779 marcadores no cromossomo X entre eles, SNPs, STRs, e RFLPs

(Random Fragment Length Polymorphism). O Rutgers é o mapa de ligação mais

informativo até o presente. Essas informações são utilizadas para, por meio de

21

interpolação, estimar a distância genética, conhecida a posição física do marcador a

partir da região telomérica do braço curto cromossômico. A posição genética pode

ser estabelecida para múltiplos marcadores que não estão presentes no mapa por

interpolação das distâncias genéticas conecidas.

22

5. RESULTADOS

5.1. Abundância de microsatélites no cromossomo X Humano

A quantidade de microsatélites variou de acordo com os parâmetros de

estringência da mineração utilizados. O número de elementos STR di- à

pentanucleotídeos variou de 34369 a 743 do critério menos estringente ({2,3,5} com

pontuação mínima igual a 20) para o mais estringente ({2,7,7} com pontuação

mínima igual a 150), respectivamente. A distribuição dos elementos identificados em

cada análise está representada na figura 3.

Figura 3. Distribuição de elementos STR encontrados no cromossomo X

humano segundo estringência da mineração. O quadro inferior relaciona, na

horizontal, a pontuação mínima de 20 a 150 e, na vertical, os critérios de

estringência {2,3,5} a {2,7,7}.

5.2. Informatividade dos marcadores utilizados em Genética Forense.

Após uma revisão sistemática da literatura foram encontrados apenas 39

locos validados para uso em Genética Forense. A distribuição segundo o tamanho

da repetição pela análise com o TRF foi: um STR dinucleotídeo, 4 STR

trinucleotídeo, 1 STR hexanucleotídeo e 33 STR tetranucleotídeo.

O marcador DXS8377 reconhecido como um hexanucleotídeo pelo TRF é na

verdade um trinucleotídeo previamente confirmado por seqüenciamento. Análise

deste loco com o programa IMEX (Imperfect Microsatelte Extractor) (Mudunuri e

23

Nagarajaram, 2007) também reconhece este padrão. O resultado da caracterização

dos 39 marcadores, atualmente utilizados em genética forense, localizados no

cromossomo X referência NC00023 quanto à localização, número de cópias,

identidade, pontuação e validação in silico, estão resumidos na Tabela 1. Os valores

mínimos de número de cópias, identidade e pontuação para tetranucleotídeos foram

de 10, 74 e 77, respectivamente. O sucesso de validação in silico do polimorfismo

para esse conjunto de marcadores foi de 79,5% (31/39). A Figura 4 ilustra a

validação in silico do loco DXS6807.

Considerando um bom marcador aquele que possui um alto poder de

discriminação e uma alta taxa de heterozigosidade, foram feitos levantamentos

sobre esses dados em publicações de revistas especializadas em biologia forense,

Tabelas 2,3,4 e 5. Estas tabelas relacionam o número observado de alelos (Tabela

2), a heterozigosidade observada (Tabela 3) e poder de discriminação em mulheres

(Tabela 4) e homens (Tabela 5) conforme dados da literatura (eixo horizontal) para

cada marcador (eixo vertical).

24

Tabela 1. Caracterização dos 39 marcadores, atualmente utilizados em genética

forense, localizados no cromossomo X referência NC00023.

Loco

S

eqü

ênci

a co

nse

nso

Localização a

Nú

mer

o d

e có

pia

s

Iden

tid

ade

(%)

Po

ntu

ação

Val

idaç

ão

in silico

1 DXS6807 TATC 4753382-4753648 15,3 92 104 3 2 DXS9895 TCTA 7387107-7387253 14,8 96 111 2 3 DXS10135 AAGA 9266321-9266515 36,5 83 180 2 4 DXS8378 ATAG 9330226-9330429 10,0 100 80 2 5 DXS9902 TAGA 15233537-15233708 11,0 100 88 2 6 DXS1214 TG 31170715-31170926 17,5 100 70 1 7 DXS6810 TAGA 42803634-42803854 22,0 90 131 2 8 DXS10076 GAAG 48194253-48194448 30,5 94 208 3 9 DXS10077 CCT 48201954-48202094 20,7 96 106 1* 10 DXS10078 AAAG 48207132-48207275 26,3 86 151 2 11 DXS7132 GATA 64572061-64572348 17,8 91 117 1 12 DXS10079 GAAA 66632579-66632883 23,0 95 166 2 13 AR GGC 66683000-66683210 17,3 100 104 1 14 DXS10074 AAAG 66893842-66894040 17,8 94 124 2 15 DXS10075 TAGA 66914898-66915133 18,3 97 137 2 16 DXS981 AGAT 68114084-68114270 14,3 96 105 3 17 DXS6800 TATC 78567066-78567259 18,5 88 112 3 18 DXS6803 GATA 86317826-86317938 11,5 100 92 2 19 DXS9898 TATC 87683075-87683268 25,3 78 107 2 20 DXS6801 TAGA 92397828-92397957 13,3 91 88 1 21 DXS6809 GATA 94824809-94825067 40,3 91 259 2

22 DXS6789 AGAT

95336070-95336210 14,3 92 96

2 ATAC 9,8 100 78

23 DXS6799 TATC 97265570-97265829 16,0 93 110 1 24 DXS7424 ATT 100505472-100505639 17,0 100 102 1

25 DXS101 TTC

101299672-101299898 17,7 100 106

2 TTA 14,3 100 86

26 DXS6797 TCTA 107367721-107367989 60,8 74 186 3 27 DXS7133 ATAG 108928199-108928320 11,8 100 94 2 28 DXS6804 TATC 111999363-111999547 13,0 100 104 2 29 GATA172D05 AGAT 113061249-113061368 10,8 94 77 2 30 DXS7130 TATC 118084196-118084371 12,3 100 98 1 31 GATA165B12 AGAT 120705649-120705777 11,3 95 81 2 32 HPRTB TCTA 133443071-133443357 18,0 91 117 3 33 DXS10101 AGAA 133482143-133482342 35,3 86 200 2 34 GATA31E08 AGAT 140061921-140062168 12,5 100 100 2 35 DXS9908 TATC 142768992-142769215 16,8 93 116 2 36 DXS8377 AGAAGA 149317129-149317374 29,5 95 255 3 37 DXS10134 AAAG 149400732-149400979 46,5 86 250 3 38 DXS7423 TGGA 149461561-149461747 17,8 92 115 2 39 DXS10011 TCTT 150938682-150939074 41,3 95 278 2

a Distância (em pares de bases) de Xp-tel ;*Disponível em 2 Cromossomos referência

25

Sequence 1: ref|NC_000023.9| 267 bp Sequence 2: ref|AC_000066.1| 263 bp Sequence 3: ref|AC_000155.1| 251 bp ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCTACATATCTATCTATCTATCTATCTA ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCTACATATCTATCTATCTATCTATCTA ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCTACATATCTATCTATCTATCTATCTA ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 TCTATCTATCTATCTATCTATCTATCGTCTATCTATCTCATTACTATCTG ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 ----------------TCTATCTATCGTCTATCTATCTCATTACTATCTG ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 TCTATCTATCTA----TCTATCTATCGTCTATCTATCTCATTACTATCTG ********************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AGGTTTCAGGCATCCACTGGGGGTGGGAGTATTTTTACTATATATCTCCT ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AGGTTTCAGGCATCCACTGGGGGTGGGAGTATTTTTACTATATATCTCCT ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AGGTTTCAGGCATCCACTGGGGGTGGGAGTATTTTTACTATATATCTCCT ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 GTGGATAAGGGAGAACTGCTGTATTAGTATAACAAACACTACTAAACTCA ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 GTGGATAAGGGAGAACTGCTGTATTAGTATAACAAACACTACTAAACTCA ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 GTGGATAAGGGAGAACTGCTGTATTAGTATAACAAACACTACTAAACTCA ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AGTGAAAAATAAATATTCCCTCTAAAATTCTCATGAGGTGGTAAAAATGC ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AGTGAAAAATAAATATTCCCTCTAAAATTCTCATGAGGTGGTAAAAATGC ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AGTGAAAAATAAATATTCCCTCTAAAATTCTCATGAGGTGGTAAAAATGC ************************************************** ref|NC_000023.9|NC_000023_4753 AAATGAGATCATTGCTC ref|AC_000155.1|AC_000155_2615 AAATGAGATCATTGCTC ref|AC_000066.1|AC_000066_8960 AAATGAGATCATTGCTC *****************

Figura 4. Validação in silico do loco DX6807. Em vermelho e em rosa são

realçados os sítios de anelamento dos iniciadores sentido e anti-sentido

respectivamente. Os produtos da amplificação variam de 251 a 267 pares de

nucleotídeos para os três genomas referência.

26

Tab

ela

2. M

édia

do

núm

ero

de a

lelo

s em

dife

rent

es p

opul

açõe

s pa

ra m

arca

dore

s S

TR

X-e

spec

ífico

s.

Watanabe et al.,2000

Koyama et al., 2002

Zarrabeitia et al., 2002

Edelmann et al., 2002

Edelmann e Szibor, 2003

Edelmann et al., 2003

Huang et al., 2003

Hering et al., 2004

Shin et al., 2004

Chen e Pu, 2004

Lee et al., 2004

Zarrabeitia et al., 2004

Edelmann e Szibor, 2005

Shin et al., 2005

Bini et al., 2005

Pepinski et al., 2005

Poetsch et al., 2005

Tabbada et al., 2005

Yu et al., 2005

Asamura et al., 2006 a

Edelmann et al., 2006

Augustin et al., 2006

Hering et al., 2006

Zarrabeitia et al., 2006

Poetsch et al., 2006

Robino et al., 2006

Asamura et al., 2006 b

Turrina et al., 2007 a

Zalán et al.,2007

Rodrigues et al., 2007

Turrina et al., 2007 b

Aler et al., 2007

Pereira et al., 2007

Pico et al., 2008

Gomes et al., 2007

Zalán et al., 2008

Número médio de alelos

DX

S68

07

8

8

8

6

6

7

7

DX

S98

95

7

7

7

7

8

7

DX

S10

135

29

29

DX

S83

78

5

7

7

6

7

5 6

7

6 7

6 5

5

6

DX

S99

02

7

7

DX

S12

14

8

8

DX

S68

10

7

7

DX

S10

076

10

10

DX

S10

077

5

5

DX

S10

078

13

13

DX

S71

32

10

7

6

8

12

9 8

8 8

7 9

8

8

DX

S10

079

13

13

DX

S10

074

14

13

14

DX

S10

075

14

14

DX

S98

1

12

14

13

DX

S68

00

7

8

8

DX

S68

03

9

7

8

DX

S98

98

8

7

8

8

7

6

11

7 7

8 9

8

DX

S68

01

8

8

DX

S68

09

12

11

11

11

10

11

10

16

12

DX

S67

89

9

12

11

10

13

13

10

13

10

10

10

11

11

11

27

DX

S67

99

6

6

DX

S74

24

12

7

11

8

11

9

10

10

DX

S10

1

15

10

14

16

12

17

16

15

10

16

10

17

15

17

15

15

14

DX

S67

97

8

11

10

DX

S71

33

7

7

5

6

7

5

6

DX

S68

04

6

6

GA

TA

172D

05

7

7

6

8

7 7

9 6

7

DX

S71

30

10

12

12

11

AR

17

18

19

22

17

15

18

GA

TA

165B

12

6

6

6

HP

RT

B

8

6

10

7 10

8

8 8

8 6

9

10

9 9

7 9

8 9

8

GA

TA

31E

08

9

9

10

9

DX

S10

101

20

20

DX

S99

08

10

10

DX

S83

77

19

18

19

17

20

17

17

19

20

19

20

19

DX

S10

134

23

23

DX

S74

23

5

5

6 5

4

4 7

7 6

7 7

6 5

7

6

DX

S10

011

36

29

34

32

37

30

28

37

25

37

33

28

Tab

ela

3. H

eter

ozig

osid

ade

méd

ia p

ara

mar

cado

res

ST

R X

-esp

ecífi

cos

em d

ifere

ntes

pop

ulaç

ões.

Hering et al., 2001

Edelmann et al., 2002

Edelmann e Szibor, 2003

Edelmann et al., 2003

Huang et al., 2003

Hering et al., 2004

Chen e Pu, 2004

Edelmann e Szibor, 2005

Shin et al., 2005

Pepinski et al., 2005

Poetsch et al., 2005

Yu et al., 2005

Asamura et al., 2006 a

Edelmann et al., 2006

Augustin et al., 2006

Hering et al., 2006

Poetsch et al., 2006

Asamura et al., 2006 b

Turrina et al., 2007 a

Zalán et al.,2007

Rodrigues et al., 2007

Turrina et al., 2007 b

Aler et al., 2007

Pico et al., 2007

Zalán et al., 2008

Heterozigosidade média

DX

S68

07

,67

,6

9

,66

,7

2

,6

7

,68

DX

S98

95

,74

,7

0

,72

,7

4

,7

2

DX

S10

135

,93

,93

DX

S83

78

,55

,64

,70

,62

,75

,67

,59

,75

,6

3 ,7

0 ,6

1

,65

DX

S99

02

,65

,65

DX

S12

14

,8

0

,80

DX

S68

10

,62

,62

DX

S10

076

,75

,75

DX

S10

077

,51

,51

DX

S10

078

,86

,86

DX

S71

32

,79

,7

3 ,7

2

,75

,59

,79

,76

,65

,79

,73

,7

3

DX

S10

079

,7

7

,77

DX

S10

074

,8

5

,8

5 ,8

5

DX

S10

075

,6

7

,67

29

DX

S98

1

,8

5

,8

5

DX

S68

00

,22

,6

7

,4

5

DX

S68

03

,81

,6

9

,7

5

DX

S98

98

,62

,7

6

,64

,7

6

,75

,7

7 ,6

9

,71

DX

S68

01

,6

3

,63

DX

S68

09

,8

1

,8

0

,8

6 ,8

1 ,7

4

,80

DX

S67

89

,78

,7

8

,82

,85

,6

9

,7

0 ,7

5 ,7

4 ,6

6

,75

DX

S67

99

,7

0

,70

DX

S74

24

,8

4

,7

8 ,7

1

,8

1 ,5

8 ,7

1

,6

3

,72

DX

S10

1

,8

3

,83

,8

8 ,8

3

,8

6 ,8

1

,90

,77

,76

,8

3

DX

S67

97

,75

,6

7

,7

1

DX

S71

33

,68

,59

,69

,49

,66

,53

,6

1

DX

S68

04

,7

4

,74

GA

TA

172D

05

,7

1

,67

,8

2 ,8

2

,7

5

DX

S71

30

,79

,7

5

,7

7

AR

,8

9

,91

,90

GA

TA

165B

12

,6

1

,6

3

,6

2

HP

RT

B

,70

,78

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4

,7

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5

,73

GA

TA

31E

08

,8

1

,8

0

,7

4

,79

DX

S10

101

,86

,86

DX

S99

08

,8

3

,83

DX

S83

77

,89

,9

0

,92

,9

0

,91

,9

4 ,9

6

,92

DX

S10

134

,85

,85

DX

S74

23

,59

,76

,5

2

,54

,60

,78

,66

,69

,68

,61

,6

4

DX

S10

011

,9

6 ,9

5

,95

,9

4

,95

,9

4

,9

5

30

Tab

ela

4. P

oder

de

disc

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méd

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ara

mar

cado

res

ST

R X

-esp

ecífi

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ulhe

res

de d

ifere

ntes

pop

ulaç

ões.

Hering et al., 2001

Zarrabeitia et al., 2002

Edelmann et al., 2002

Edelmann e Szibor, 2003

Edelmann et al., 2003

Huang et al., 2003

Shin et al., 2004

Chen e Pu, 2004

Lee et al., 2004

Zarrabeitia et al., 2004

Edelmann e Szibor, 2005

Shin et al., 2005

Pepinski et al., 2005

Poetsch et al., 2005

Yu et al., 2005

Asamura et al., 2006 a

Edelmann et al., 2006

Augustin et al., 2006

Hering et al., 2006

Zarrabeitia et al., 2006

Poetsch et al., 2006

Robino et al., 2006

Asamura et al., 2006 b

Turrina et al., 2007 a

Zalán et al.,2007

Rodrigues et al., 2007

Turrina et al., 2007 b

Aler et al., 2007

Pereira et al., 2007

Pico et al., 2007

Zalán et al., 2008

Becker et al.,2008

Poder de discriminação médio

DX

S68

07

,8

3

,85

,8

2

,8

8

,81

,8

4

DX

S98

95

,9

8

,87

,8

9

,89

,9

1

,9

1

DX

S10

135

,99

,99

,99

DX

S83

78

,7

3 ,8

4 ,8

5 ,7

8

,89

,83

,78

,74

,85

,8

7 ,8

7 ,8

4 ,8

0

,86

,82

DX

S99

02

,7

9

,7

9

DX

S12

14

,79

,7

9

DX

S68

10

,7

6

,7

6

DX

S10

076

,9

2

,9

2

DX

S10

077

,7

2

,7

2

DX

S10

078

,9

5

,9

5

DX

S71

32

,8

8

,91

,87

,9

1 ,8

9

,90

,8

9

,9

0 ,9

1 ,8

9 ,9

0 ,8

9 ,9

2

,89

,90

DX

S10

079

,94

,9

4

DX

S10

074

,95

,9

6 ,9

5 ,9

5

DX

S10

075

,86

,8

6

DX

S98

1

,94

,94

DX

S68

00

,3

9

,90

,8

6

,7

2

DX

S68

03

,9

4

,98

,96

DX

S98

98

,86

,80

,9

0

,85

,9

1 ,9

0

,9

2

1,0

,91

,87

,89

DX

S68

01

,82

,79

,80

31

DX

S68

09

,95

,9

4

,9

4

,93

,94

,93

,94

,92

,94

DX

S67

89

,89

,92

,9

3

,9

5

,9

0

,87

,93

,91

,91

,90

,89

,88

,91

DX

S67

99

,85

,8

5

DX

S74

24

,93

,8

7

,9

2 ,8

7

,94

,90

,85

,85

,90

,8

9

DX

S10

1

,97

,94

,93

,9

7

,94

,9

7 ,9

6

,97

,98

,94

,9

7 ,9

7 ,9

8 ,9

5

,9

6

DX

S67

97

,8

7

,88

,88

DX

S71

33

,8

4 ,7

8

,84

,6

7

,8

4 ,7

8

,79

DX

S68

04

,89

,8

9

GA

TA

172D

05

,9

0

,9

1

,88

,9

3

,93

,91

,94

,92

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2

DX

S71

30

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1

,89

,9

6

,9

2

AR

,97

,98

,98

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8

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8

,98

GA

TA

165B

12

,84

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,83

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B

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0

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4

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0

,83

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,89

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,88

,88

,90

,90

,8

9 ,8

8

GA

TA

31E

08

,91

,92

,94

,93

,92

DX

S10

101

,92

,98

,95

DX

S99

08

,91

,9

1

DX

S83

77

,98

,98

,9

8

,99

,9

8

,9

8 ,9

9

,99

,99

,99

,98

DX

S10

134

,97

,96

,97

DX

S74

23

,8

6

,67

,87

,7

4

,71

,73

,87

,82

,81

,85

,84

,85

,8

8 ,8

1

DX

S10

011

1,

0 1,

0

1,

0

1,0

,99

,99

1,

0

1,

0

32

Tab

ela

5. P

oder

de

disc

rimin

ação

méd

io p

ara

mar

cado

res

ST

R X

-esp

ecífi

cos

em h

omen

s de

dife

rent

es p

opul

açõe

s.

Hering et al., 2001

Zarrabeitia et al., 2002

Edelmann et al., 2002

Edelmann e Szibor, 2003

Edelmann et al., 2003

Huang et al., 2003

Hering et al., 2004

Shin et al., 2004

Lee et al., 2004

Zarrabeitia et al., 2004

Edelmann e Szibor, 2005

Shin et al., 2005

Pepinski et al., 2005

Poetsch et al., 2005

Yu et al., 2005

Asamura et al., 2006 a

Edelmann et al., 2006

Augustin et al., 2006

Hering et al., 2006

Zarrabeitia et al., 2006

Poetsch et al., 2006

Robino et al., 2006

Asamura et al., 2006 b

Turrina et al., 2007 a

Zalán et al.,2007

Rodrigues et al., 2007

Turrina et al., 2007 b

Aler et al., 2007

Pereira et al., 2007

Pico et al., 2007

Zalán et al., 2008

Poder de discriminação médio

DX

S68

07

,7

0

,69

,6

6

,7

2

,63

,68

DX

S98

95

,7

4

,75

,7

5

,76

,7

5

DX

S10

135

,94

,94

DX

S83

78

,6

0 ,7

0 ,7

0 ,5

5

,74

,67

,57

,68

,70

,6

9 ,7

2 ,6

9 ,6

4

,67

DX

S99

02

,6

6

,66

DX

S12

14

,73

,73

DX

S68

10

,5

7

,57

DX

S10

076

,7

8

,78

DX

S10

077

,5

2

,52

DX

S10

078

,8

2

,82

DX

S71

32

,7

8 ,7

2

,75

,76

,7

6

,74

,73

,78

,76

,75

,74

,79

,7

5

DX

S10

079

,81

,81

DX

S10

074

,83

,8

4 ,8

4

DX

S10

075

,69

,69

DX

S98

1

,83

,8

3

DX

S68

00

,2

9

,75

,6

9

,58

DX

S68

03

,8

1

,71

,7

6

DX

S98

98

,69

,64

,7

6

,64

,7

7 ,7

6

,7

7

,78

,77

,71

,7

3

DX

S68

01

,63

,61

,6

2

DX

S68

09

,84

,8

0

,8

0

,81

,80

,79

,82

,78

,8

1

DX

S67

89

,74

,81

,87

,75

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1 ,8

1

,7

5 ,7

6 ,7

4 ,7

3 ,7

1

,76

33

DX

S67

99

,62

,62

DX

S74

24

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2

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8 ,7

4

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,80

,77

DX

S10

1

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1

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,8

2

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0

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5

DX

S67

97

,7

0

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,7

2

DX

S71

33

,6

8 ,4

3

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,4

7

,6

8 ,5

9

,5

9

DX

S68

04

,73

,73

GA

TA

172D

05

,7

6

,72

,7

4

,81

,7

9

,7

8 ,8

1 ,7

9 ,8

0

,78

DX

S71

30

,7

5

,73

,8

3

,77

AR

,88

,9

0

,88

,8

9

,9

1

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9

GA

TA

165B

12

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4

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2

HP

RT

B

,7

6

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,7

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,70

,69

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,78

,72

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,76

,73

,75

,76

,7

4

GA

TA

31E

08

,7

6

,7

8

,8

0 ,8

1

,7

9

DX

S10

101

,90

,90

DX

S99

08

,76

,76

DX

S83

77

,9

0

,91

,9

2

,89

,91

,91

,9

3 ,9

2 ,9

1

,91

DX

S10

134

,87

,87

DX

S74

23

,7

0

,54

,69

,7

1

,51

,66

,69

,65

,67

,68

,68

,68

,6

6

DX

S10

011

,95

,9

5

,9

5

,95

,94

,94

,9

6

,95

34

Visando responder a pergunta inicial se um bom marcador poderia ser predito

por uma análise in silico, comparamos a pontuação média in silico dos

tetranucleotídeos validados com dados forenses relevantes obtidos de diferentes

populações.

Para tal análise, os tetranucleotídeos complexos (mais de um tipo de

repetição no mesmo loco) DXS6789 e DXS6797 não foram analisados. Os STR

dinucleotídeos e trinucleotídeos que apresentam uma alta taxa de stutters e

pontuações que não podem ser comparadas aos tetranucleotídeos também foram

desconsiderados.

As Figuras 4,5 e 6 mostram a pontuação média in silico versus

heterozigosidade observada, poder de discriminação em mulheres e poder de

discriminação em homens, respectivamente. As maiores pontuações rendem

maiores taxas de heterozigosidade e poder de discriminação em homens e

mulheres. Para demonstrar a importância da distribuição alélica na informatividade

de um marcador, 5 locos com o mesmo número médio de alelos (7) são comparados

(Figura 7).

Um bom marcador na genética forense também deve possuir baixa taxa de

mutação. Assumindo que as taxas de mutação para os marcadores X-STR

comumente utilizados não diferem das encontradas em marcadores autossômicos,

comparamos pontuações médias de marcadores autossômicos utilizados em kits

comerciais de identificação de indivíduos. Essa abordagem foi realizada devido à

escassez de estudos sobre taxas de mutação para marcadores X-específicos e o

número de meioses limitado (Fracasso et al., 2008). A análise demonstrou que locos

com as menores pontuações possuem as menores taxas de mutação (Figura 8).

35

Fig

ura

4. R

elaç

ão e

ntr

e a

po

ntu

ação

méd

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ozi

go

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Loc

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de 0

,79.

Loc

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om p

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ação

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bem

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igos

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e m

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0,7

5.

36

Fig

ura

5. R

elaç

ão e

ntr

e a

po

ntu

ação

méd

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de 0

,92.

Loc

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om p

ontu

ação

méd

ia ≥

159

exib

em p

oder

de

disc

rimin

ação

mín

imo

de

0,92

.

37

Fig

ura

6.

Rel

ação

en

tre

a p

on

tuaç

ão m

édia

e o

Po

der

de

Dis

crim

inaç

ão e

m h

om

ens.

Loc

os c

om p

ontu

ação

méd

ia ≤

91

exib

em p

oder

de

disc

rimin

ação

máx

imo

de 0

,79.

Loc

os c

om p

ontu

ação

méd

ia ≥

159

exib

em p

oder

de

disc

rimin

ação

mín

imo

de

0,78

.

38

Fig

ura

7.

Info

rmat

ivid

ade

de

mar

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s co

m o

mes

mo

nú

mer

o o

bse

rvad

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elo

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Loco

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O m

arca

dor

GA

TA

172D

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ão,

port

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o lo

co m

ais

info

rmat

ivo.

39

Fig

ura

8.

Rel

ação

en

tre

a p

on

tuaç

ão m

édia

e a

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a o

bse

rvad

a d

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uta

ção

em

mar

cad

ore

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≤ 9

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ação

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de 0

,11%

. Lo

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com

pon

tuaç

ão m

édia

≥12

5 ex

ibem

tax

a de

mut

ação

mín

ima

de 0

,16%

.

40

5.3. Busca de marcadores tetra e pentanucleotídeos

Os critérios de escolha foram: Pontuação mínima de 80 onde se enquadram

97% dos tetranucleotídeos utilizados e identidade de 90%, valor mínimo

apresentado por 79% dos marcadores. Para busca de tetranucleotídeos foi utilizado

o cromossomo referência NC000023 e foram encontradas 889 repetições com este

critério (dados não mostrados). Nesta dissertação foram validados somente os

pentanucleotídeos encontrados nos 3 cromossomos X referência. Assim sendo,

foram encontrados 163 marcadores, dos quais, 57% apresentaram mais de um alelo

in silico estabelecendo a natureza polimórfica desses Locos (Tabela 6).

41

Tabela 6. Validação in silico de marcadores pentanucleotídeos. a

Lo

caliz

ação

b

NC

0000

23

Nú

mer

o d

e có

pia

s

Iden

tid

ade

(%)

Po

ntu

ação

Lo

caliz

ação

b

AC

0000

66

Nú

mer

o d

e có

pia

s

Iden

tid

ade

(%)

Po

ntu

ação

Lo

caliz

ação

b

AC

0001

55

Nú

mer

o d

e có

pia

s

Iden

tid

ade

(%)

Po

ntu

ação

4338640--4338689 10,2 95 84 8546573--8546622 10,2 95 84 2202847--2202896 10,2 95 84

5078938--5079020 17,4 90 138 9293393--9293480 18,4 90 148 2949427--2949514 18,4 90 148

5267696--5267784 17,8 91 144 9482441--9482529 17,8 91 144 3136682--3136770 17,8 91 144

5631230--5631282 10,6 100 106 9846034--9846086 10,6 100 106 3499560--3499607 9,6 100 96

6651714--6651757 8,8 100 88 10866799--10866842 8,8 100 88 4501255--4501298 8,8 100 88

7794401--7794452 10,4 91 88 12009685--12009736 10,4 91 88 5641586--5641637 10,4 91 88

8715315--8715437 25,2 95 225 12932972--12933089 24,2 94 215 6582394--6582511 24,2 94 215

9720010--9720200 38,2 100 382 13931929--13932277 69,8 100 698 7592280--7592828 109,8 100 1098

11124177--11124220 8,8 100 88 15341707--15341750 8,8 100 88 8994100--8994148 9,8 100 98

12061250--12061292 8,6 100 86 16268760--16268797 7,6 100 76 9922021--9922058 7,6 100 76

12648022--12648138 25,4 92 148 16852076--16852183 23,4 91 137 10504625--10504732 23,4 91 137

13134927--13134975 10,0 95 91 17342675--17342723 10,0 95 91 10986337--10986395 12,0 96 111

13799108--13799162 10,8 96 85 18006264--18006323 11,8 96 95 11647062--11647121 11,8 96 95

15088206--15088271 13,2 100 132 19293306--19293366 12,2 100 122 12936924--12936979 11,2 100 112

17030058--17030141 17,0 95 116 21240755--21240837 17,0 93 116 14880277--14880350 15,0 94 105

17149229--17149304 15,0 98 143 21360090--21360155 13,0 98 123 14997985--14998050 13,0 98 123

18370509--18370553 9,0 100 90 22580686--22580730 9,0 100 90 16215931--16215975 9,0 100 90

19754725--19754790 13,2 100 132 23967984--23968049 13,2 100 132 17590960--17591025 13,2 100 132

21380793--21380859 13,4 100 134 25591896--25591962 13,4 100 134 19213356--19213422 13,4 100 134

21412329--21412368 8,0 100 80 25623432--25623471 8,0 100 80 19245125--19245164 8,0 100 80

23500928--23500988 12,2 100 122 27712639--27712694 11,2 100 112 21329428--21329483 11,2 100 112

23795148--23795196 9,8 97 80 28002790--28002833 8,8 97 70 21629617--21629665 9,8 97 80

24681356--24681407 10,4 100 104 28894306--28894357 10,4 100 104 22513925--22513961 7,4 100 74

26034466--26034545 16,0 97 151 30252838--30252897 12,0 96 111 23861873--23861942 14,0 96 131

26886432--26886527 19,4 97 185 31105360--31105455 19,4 97 185 24717645--24717735 18,4 97 175

27047436--27047486 10,2 100 102 31266381--31266431 10,2 100 102 24878375--24878425 10,2 100 102

29009059--29009109 10,6 93 88 33228010--33228060 10,6 93 88 28053480--28053532 10,6 100 106

30852225--30852293 13,6 96 129 35069636--35069704 13,6 96 129 28683206--28683274 13,6 96 129

31402746--31402794 9,8 97 89 35620321--35620369 9,8 97 89 29231455--29231503 9,8 97 89

31841757--31841817 11,8 91 88 36059352--36059412 11,8 91 88 29669458--29669518 11,8 91 88

32064591--32064637 9,4 100 94 36282150--36282191 8,4 100 84 29892724--29892765 8,4 100 84

33927343--33927384 8,4 100 84 38144656--38144700 9,0 100 90 31754482--31754528 9,4 100 94

34123936--34123978 8,6 100 86 38341251--38341293 8,6 100 86 31952978--31953025 9,6 100 96

34532895--34533003 22,2 94 195 38750213--38750321 22,2 94 195 32365732--32365840 22,2 94 195

34701644--34701689 9,0 95 83 38918965--38919008 9,0 95 81 32533395--32533440 9,0 95 83

35410034--35410086 10,6 100 106 39627582--39627634 10,6 100 106 33239587--33239639 10,6 100 106

37195167--37195208 8,4 100 84 41447936--41447977 8,4 100 84 35056704--35056745 8,4 100 84

42

37356079--37356125 9,8 90 80 41608821--41608867 9,8 90 80 35217525--35217571 9,8 90 80

38049944--38049997 10,8 100 108 42302648--42302701 10,8 100 108 35909559--35909607 9,8 100 98

38506957--38507013 11,6 98 107 42759644--42759695 10,6 97 97 36366241--36366292 10,6 97 97

39153009--39153109 20,0 93 175 43405876--43405981 21,0 94 185 37010571--37010681 22,0 94 195

39537164--39537209 9,2 100 92 43790012--43790057 9,2 100 92 37390488--37390533 9,2 100 92

39881746--39881795 9,6 91 82 44135614--44135667 10,8 100 108 37733232--37733301 13,6 94 122

40365022--40365068 9,8 95 80 44620388--44620434 9,8 95 80 38211185--38211241 11,8 96 100

40520637--40520690 10,8 100 108 44775220--44775273 10,8 100 108 38365452--38365515 12,8 100 128

40762705--40762831 25,6 96 238 45018514--45018641 25,6 95 231 38608033--38608109 15,6 94 138

42213465--42213515 10,2 100 102 46471275--46471325 10,2 100 102 40061462--40061512 10,2 100 102

44103964--44104015 10,4 95 95 48358785--48358836 10,4 95 95 41946316--41946367 10,4 95 95

44503396--44503440 9,0 100 90 48755250--48755294 9,0 100 90 42339956--42339995 8,0 100 80

46544222--46544273 10,6 95 97 50851142--50851188 9,6 95 87 44371388--44371434 9,6 95 87

46670401--46670456 11,2 100 112 50977719--50977754 7,2 100 72 44496936--44496971 7,2 100 72

47244530--47244572 8,6 100 86 51554849--51554891 8,6 100 86 45071779--45071816 7,6 100 76

49263271--49263333 12,8 96 119 53445845--53445902 11,8 96 109 46843318--46843375 11,8 96 109

53036673--53036762 17,8 93 155 56854367--56854459 18,8 97 179 50080809--50080901 18,8 97 179

53516091--53516156 13,2 100 132 57330930--57330995 13,2 100 132 50556282--50556342 12,2 100 122

54111928--54112006 15,8 94 140 57926438--57926516 15,8 91 122 51147705--51147783 15,8 91 122

54160513--54160574 12,4 100 124 57975024--57975080 11,4 100 114 51195147--51195203 11,4 100 114

54282267--54282315 9,8 100 98 58096765--58096813 9,8 100 98 51316988--51317036 9,8 100 98

56256423--56256496 15,6 94 95 60078195--60078268 15,6 94 95 53293135--53293203 14,6 93 85

56582516--56582564 9,8 100 98 60398078--60398121 8,8 100 88 53617966--53618009 8,8 100 88

62161394--62161451 11,6 100 116 62572784--62572841 11,6 100 116 56128749--56128806 11,6 100 116

63555304--63555395 18,8 92 145 63985411--63985492 16,8 91 125 57461085--57461166 16,8 91 125

64678213--64678268 11,2 96 103 65108632--65108687 11,2 96 103 58591637--58591692 11,2 96 103

64697870--64697918 9,8 100 98 65128280--65128328 9,8 100 98 58609528--58609576 9,8 100 98

64785458--64785520 13,0 93 112 65215870--65215932 13,0 93 112 58697245--58697307 13,0 93 112

64882243--64882282 8,0 100 80 65312661--65312700 8,0 100 80 58793833--58793872 8,0 100 80

65189581--65189644 12,8 100 128 65620000--65620053 10,8 100 108 59100667--59100720 10,8 100 108

66359776--66359823 9,4 97 87 66792137--66792184 9,4 97 87 60271341--60271388 9,4 97 87

66656216--66656295 16,0 94 142 67088577--67088656 16,0 94 142 60567356--60567440 17,0 95 152

67009341--67009389 10,0 95 91 67444090--67444138 10,0 95 91 60923152--60923200 10,0 95 91

67399362--67399450 17,8 94 133 67834179--67834272 18,8 94 143 61312077--61312170 18,8 94 143

68581611--68581650 8,0 100 80 69017792--69017831 8,0 100 80 62487081--62487130 10,0 100 100

68748831--68748914 16,8 100 168 69185439--69185507 13,8 100 138 62651971--62652034 12,8 100 128

69600766--69600862 18,6 90 149 70037368--70037459 17,6 90 139 63505721--63505812 17,6 90 139

69969845--69969896 11,0 91 83 70406456--70406507 11,0 91 83 63871498--63871549 11,0 91 83

70005607--70005705 19,8 96 180 70442228--70442306 15,8 95 140 63907076--63907154 15,8 95 140

70269328--70269411 17,0 93 143 70706507--70706560 11,0 90 83 64171386--64171439 11,0 90 83

71715055--71715133 15,8 98 140 72141553--72141631 15,8 98 131 65552841--65552914 14,8 98 130

71902961--71903016 11,2 100 112 72329958--72330013 11,2 100 112 65740806--65740861 11,2 100 112

71976720--71976805 17,6 92 142 72403710--72403775 13,6 90 102 65814970--65815035 13,6 90 102

76973124--76973187 12,8 100 128 77327345--77327388 8,8 100 88 70673247--70673290 8,8 100 88

77019966--77020026 12,2 100 122 77374167--77374227 12,2 100 122 70719271--70719321 10,2 100 102

43

77208185--77208229 9,2 95 83 77562612--77562656 9,2 95 83 70907521--70907565 9,2 95 83

78285549--78285607 11,8 100 118 78639187--78639245 11,8 100 118 71977167--71977215 9,8 100 98

79125400--79125511 22,4 91 179 79478667--79478788 24,4 92 199 72820684--72820795 22,4 91 179

79743191--79743260 14,0 98 131 80096653--80096722 14,0 98 131 73437256--73437315 12,0 98 111

81596159--81596215 11,4 100 114 81946762--81946818 11,4 100 114 75281532--75281593 12,4 100 124

81811153--81811212 11,6 92 102 82161847--82161906 11,6 92 102 75496698--75496742 8,6 90 72

82230147--82230213 13,8 93 120 82580756--82580827 14,8 94 130 75916334--75916405 14,8 94 130

82243764--82243839 15,6 94 138 82594375--82594455 16,6 94 148 75929493--75929573 16,6 94 148

83161806--83161868 12,8 93 110 83512558--83512620 12,8 93 110 76847785--76847852 13,8 93 120

85410150--85410211 12,4 100 124 85763053--85763109 11,4 100 114 79099417--79099473 11,4 100 114

85571195--85571239 9,2 95 83 85924097--85924141 9,2 95 83 79259061--79259105 9,2 95 83

85735058--85735101 8,8 100 88 86088119--86088162 8,8 100 88 79421800--79421843 8,8 100 88

86698338--86698378 8,2 100 82 87051359--87051399 8,2 100 82 80392305--80392345 8,2 100 82

87376384--87376423 8,0 100 80 87727925--87727959 7,0 100 70 81071717--81071751 7,0 100 70

87534527--87534571 9,0 100 90 87886133--87886172 8,0 100 80 81231592--81231631 8,0 100 80

88261700--88261744 8,8 97 81 88621351--88621395 8,8 97 81 81958843--81958887 8,8 97 81

91342532--91342584 10,4 95 97 91958915--91958967 10,4 95 97 80447773--80447824 10,4 100 104

92224677--92224754 15,6 97 138 92863286--92863363 15,6 97 138 82161507--82161584 15,6 97 138

92811561--92811609 9,8 95 80 93450153--93450201 9,8 95 80 82747154--82747201 9,8 93 80

95782929--95782968 8,0 100 80 96414625--96414664 8,0 100 80 85696978--85697017 8,0 100 80

96270745--96270852 21,8 91 175 96902196--96902303 21,8 91 175 86185661--86185778 23,8 92 195

96467199--96467250 10,4 100 104 97098268--97098319 10,4 100 104 86383082--86383133 10,4 100 104

96754517--96754563 9,4 95 85 97385546--97385592 9,4 95 85 86672209--86672260 10,4 95 95

97091345--97091413 13,8 100 138 97722303--97722366 12,8 100 128 87007180--87007243 12,8 100 128

97606151--97606195 9,0 100 90 98239368--98239407 8,0 100 80 87523278--87523317 8,0 100 80

98353399--98353453 10,8 98 101 98987222--98987276 10,8 98 101 88270822--88270876 10,8 98 101

98852704--98852748 9,0 100 90 99486553--99486597 9,0 100 90 88768556--88768600 9,0 100 90

99130392--99130449 11,6 98 89 99764242--99764299 11,6 98 89 89047170--89047247 15,6 98 111

100464188--100464244 11,8 98 100 101096993--101097049 11,8 98 100 90382527--90382598 14,8 98 130

101805151--101805197 9,4 100 94 102357126--102357172 9,4 100 94 91583677--91583723 9,4 100 94

105187285--105187361 15,4 91 82 105775229--105775305 15,4 91 82 94927569--94927645 15,4 91 82

105730150--105730209 11,8 98 111 106314839--106314898 11,8 98 111 95470509--95470568 11,8 98 111

105783391--105783437 9,4 100 94 106368081--106368127 9,4 100 94 95524808--95524854 9,4 100 94

107632145--107632184 8,0 100 80 108216919--108216958 8,0 100 80 97368429--97368468 8,0 100 80

107828222--107828272 10,8 97 81 108412987--108413037 10,8 97 81 97565449--97565499 10,8 97 81

109638110--109638161 10,8 91 90 110231080--110231128 9,8 91 82 99371437--99371483 9,8 90 80

109897483--109897536 10,8 100 108 110490420--110490468 9,8 100 98 99629539--99629587 9,8 100 98

110502936--110502981 9,2 100 92 111095857--111095902 9,2 100 92 100238435--100238480 9,2 100 92

110533933--110533978 9,2 100 92 111126851--111126906 11,2 100 112 100269895--100269950 11,2 100 112

111011020--111011078 12,0 90 93 111603880--111603938 12,0 90 93 100745393--100745451 12,0 90 93

113336601--113336652 10,4 93 88 113933196--113933247 10,4 93 88 103077591--103077642 10,4 93 88

113546772--113546829 11,6 100 116 114075748--114075800 10,6 100 106 103225055--103225122 13,6 100 136

114400844--114400891 9,6 95 87 114929754--114929796 8,6 94 77 104079725--104079767 8,6 94 77

114672554--114672602 9,8 100 98 115201353--115201411 11,8 100 118 104350177--104350225 9,8 100 98

116310482--116310543 12,4 98 115 116883545--116883601 11,4 98 105 105920969--105921030 12,4 98 115

44

116368393--116368448 11,4 96 105 116941446--116941516 14,4 97 135 105977956--105978026 14,4 97 135

119314264--119314320 11,4 100 114 119895821--119895881 12,2 100 122 108882580--108882661 16,4 100 164

119650004--119650055 10,8 97 90 120230300--120230351 10,8 97 90 109229834--109229885 10,8 97 90

120913705--120913755 10,2 95 84 121467251--121467301 10,2 95 84 110463210--110463260 10,2 95 84

121422118--121422157 8,0 100 80 121975668--121975712 9,0 100 90 110970570--110970614 9,0 100 90

121674034--121674097 13,0 98 121 122227481--122227544 13,0 98 121 111222116--111222154 8,0 97 71

122715923--122715978 11,2 100 112 123274270--123274325 11,2 100 112 112275172--112275222 10,2 100 102

125276629--125276680 10,2 97 95 125834621--125834672 10,2 97 95 114828694--114828745 10,2 97 95

126096800--126096842 8,6 100 86 126651159--126651211 10,6 100 106 115671938--115672000 12,6 100 126

128441312--128441372 12,2 100 122 129002330--129002390 12,2 100 122 118019799--118019839 8,2 100 82

128863499--128863577 15,8 94 95 129422322--129422400 15,8 94 95 118436565--118436643 15,8 94 95

129063458--129063501 8,8 100 88 129622334--129622382 9,8 100 98 118632346--118632394 9,8 100 98

129155573--129155614 8,4 100 84 129714368--129714409 8,4 100 84 118723235--118723276 8,4 100 84

129284456--129284545 17,2 96 135 129843272--129843361 17,2 96 135 118851624--118851713 17,2 96 135

129428002--129428061 12,0 96 111 129986787--129986846 12,0 96 111 118995379--118995438 12,0 96 111

130339326--130339372 9,4 95 85 130898081--130898127 9,4 95 85 119917196--119917242 9,4 95 85

130462225--130462294 14,6 95 110 131020976--131021045 14,6 95 110 120039135--120039204 14,6 95 110

130819485--130819527 8,6 100 86 131378208--131378250 8,6 100 86 120396428--120396470 8,6 100 86

131497687--131497765 15,8 100 158 132056406--132056484 15,8 100 158 121073798--121073876 15,8 100 158

131856178--131856253 15,2 93 127 132414872--132414942 14,2 92 117 121432986--121433056 14,2 92 117

132435888--132435958 15,0 91 114 132994651--132994721 15,0 91 114 122009430--122009500 15,0 91 114

132438350--132438432 16,8 98 159 132997113--132997205 18,8 98 179 122011842--122011959 23,8 99 229

133372318--133372360 8,6 100 86 133931481--133931523 8,6 100 86 122943202--122943239 7,6 100 76

133438712--133438771 12,6 94 99 133997876--133997935 12,6 94 99 123009253--123009312 12,6 94 99

133642214--133642304 18,2 95 164 134201405--134201495 18,2 95 164 123213079--123213169 18,2 95 164

134445849--134445897 9,8 100 98 135002143--135002196 10,8 100 108 123976367--123976420 10,8 100 108

135195344--135195397 10,8 100 108 135730329--135730382 10,8 100 108 124638610--124638653 8,8 100 88

136422769--136422819 10,4 95 95 136961115--136961165 10,4 95 95 125863776--125863826 10,4 95 95

136952415--136952466 10,4 100 104 137490740--137490791 10,4 100 104 126392975--126393051 15,4 100 154

137964690--137964761 14,4 98 90 138503012--138503083 14,4 98 90 127404323--127404399 15,4 98 109

139326336--139326400 12,8 98 121 139870775--139870844 13,8 98 131 128766605--128766664 11,8 98 111

145152732--145152791 12,0 100 120 145657493--145657552 12,0 100 120 134311158--134311197 8,0 100 80

145619648--145619730 16,6 100 166 146124379--146124461 16,6 100 166 134775606--134775713 21,6 100 216

146031211--146031258 9,4 97 87 146578452--146578499 9,4 97 87 135184339--135184386 9,4 97 87

150880936--150880982 9,6 95 87 151375871--151375917 9,6 95 87 139984576--139984622 9,6 95 87

152910286--152910340 11,2 96 103 153490799--153490853 11,2 96 103 141909307--141909361 11,2 96 103 a Os pentanucleotídeos com mais de um alelo estão sombreados. b Distância (em pares de bases) a partir da região telomérica do braço curto do

cromossomo X.

45

5.4. Localização dos marcadores pentanucleotídeos validados in silico no

mapa genético do cromossomo X

Para construção do mapa genético foi utilizado os mapa Rutgers (Matise et

al., 2007). Foram marcados pontos a cada megabase de 1 a 154 no cromossomo X

NC000023 que possui 196 cM. Com os dados da localização física de cada

marcador foi criado um mapa de recombinação em cM/Mb . As regiões em azul e

vermelho representam “zonas frias” e “zonas quentes” de recombinação,

respectivamente. A distribuição de 31 STR tetranucleotídeos utilizados em genética

forense é indicada no mapa de recombinação (Figura 9). A posição no mapa de

recombinação das 94 STRs pentanucleotídeos validados neste trabalho é indicada

na figura 10. Este mapa será de grande importância na montagem de marcadores

em haplótipos para identificação de indivíduos.

46

Fig

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9. M

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47

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10.

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48

6. DISCUSSÃO

O principal critério de escolha de marcadores microsatélites tanto nos campos

da Genética Médica quanto na Forense baseia-se na prioridade histórica. Durante a

última década, a comunidade científica que trabalha em identidade humana

estabeleceu um conjunto de marcadores STR autossômicos que é extensamente

usado para tipagem de DNA. Uma variedade de kits comerciais possibilita a

amplificação robusta destes marcadores. Treze de tais marcadores foram

selecionados em 1997 para montar o Sistema de Índice de DNA combinado (CODIS

Combined DNA Index System) com base em seu uso pelos laboratórios do FBI e na

criação da base nacional de dados dos Estados Unidos (NDNAD) bem como por

outras bases de dados em outros países (Butler, 2006). Os marcadores alossômicos

complementam os resultados obtidos por microssatélites autossômicos.

Diversas ferramentas computacionais têm sido desenvolvidas para mineração

de microsatélites em genomas. Vinte e um programas foram descritos em uma

revisão de Sharma e colaboradores (2007). O programa TRF utilizado neste trabalho

possui como características importantes a gratuidade, disponibilidade de versões

online e doméstica, minera repetições perfeitas e imperfeitas é executável em

diferentes sistemas operacionais.

Nenhum marcador STR pentanucleotídeo no cromossomo X havia sido

validado mesmo que in silico para aumentar o painel de marcadores na prática

forense, até a execução do presente trabalho. As propriedades combinadas de alto

poder de discriminação, poucos microvariantes e baixos níveis de produtos stutter

fazem deste tipo de marcador STR ideal para análise forense (Bacher e Schumm,

1998). Na presente dissertação foram identificados e analisados 163 novos

microsatélites pentanucleotídeos bem distribuídos no cromossomo X, sendo que 94

apresentaram mais de um alelo na comparação com 3 genomas referência. Alguns

elementos STR não foram encontrados nos três genomas devido a que as

seqüências disponíveis para o cromossomo X são de projetos com versões de

finalização diferenciada. Essas diferenças são genoma-abrangentes devido à

disparidade observada no tamanho dos três genomas referência.

Quanto à aplicabilidade deste novo repertório de marcadores STR podemos

prever a sua inclusão em novos kits para identificação de indivíduos. Da mesma

49

forma, os STR tetranucleotídeos identificados neste trabalho quando validados

deverão ser utilizados para genotipagem. Também prevemos a crescente

substituição de marcadores STR dinucleotídeo, amplamente utilizados em estudos

de ligação em genética médica, pelos novos STR penta- e tetranucleotídeos, uma

vez que a tipagem destes geralmente não está associada com artefatos do tipo

stutter que dificultam muitas vezes a interpretação dos dados. A tipagem com STR

penta e tetranucleotídeos permitirá a determinação inequívoca, acurada, de

freqüências alélicas em diferentes populações humanas. Neste sentido, atenta-se às

discrepâncias entre as freqüências alélicas e, por conseguinte, das taxas de

heterozigosidade e poder de discriminação comumente encontradas na literatura em

relação aos marcadores STR dinucleotídeos. Assim sendo, recomendamos

fortemente a tipagem de indivíduos utilizando o repertório de STR penta e

tetranucleotídeos descrito nesta dissertação.

Atenta-se também ao fato que várias publicações recentes (Gomes et al.,

2006; Turrina et al., 2007; Rodrigues et al., 2007; Aler et al., 2007; Pico et al., 2008)

têm utilizado erroneamente a regra do produto (multiplicação do poder de

discriminação de cada loco) para calcular o poder de discriminação combinado em

locos que estão distanciados a menos de 50cM, quando na verdade deveriam ser

calculadas freqüências haplotípicas. Lamentavelmente foram também encontrados

trabalhos que utilizam a mesma fórmula para calcular o poder de discriminação em

homens e mulheres (Gu e Li, 2006; Liu e Li, 2006; Cainé et al., 2007) e fórmulas

invertidas para homens e mulheres (Gao et al., 2007), o que indica descuido e

desconhecimento do significado desta variável importante na Genética Forense.

Acreditamos que os mapas genéticos e de recombinação apresentados nesta

dissertação sejam de grande valia para os pesquisadores de ambas as áreas

médica e forense. Os mapas foram elaborados por interpolação dos mapas Rutgers,

cujos dados são mais robustos do que os dados relativos ao mapa genético

Marshfield (www.marshfieldclinic.org), que se baseia em um número muito limitado

de marcadores. Embora muito utilizado e referenciado por pesquisadores, não é

possível uma interpolação acurada com os dados do mapa Marshfield. Nesse caso,

para os marcadores que não estão disponíveis no mapa, a estimativa é feita pela

conversão 1Mb=1cM, o que pode levar a erros em análises de ligação. Prevemos,

50

assim, a necessidade de uma mudança para a utilização de mapas mais densos

como os descritos nesta dissertação

O único kit comercial para análise de microsatélites no cromossomo X,

Mentype Argus®, descreve que os marcadores exibem distâncias genéticas de 50

cM (Becker et al., 2008). Porém, quando interpolados no mapa Rutgers combinado,

isto é, físico e de ligação, mais informativo disponível atualmente (Matise et al.

2007), dois grupos de ligação do kit estão a de 34 cM de distância, portanto, não

pertencendo a grupos de ligação independentes (Machado e Medina-Acosta,

2008c).

Quanto aos novos marcadores STR para o diagnóstico molecular indireto de

portadores de mutações causadoras de hemofilia A, criamos um mapa

compreensivo de alta resolução de 2,4Mb em Xq28. Nesta região estão presentes

74 genes e foram selecionados 95 microsatélites que incluem os 14 locos validados.

Portanto, o repertório de novos marcadores representa um aumento de 5,8 vezes de

locos STR que serão úteis no diagnóstico indireto em famílias de portadores da

hemofilia A. O uso de marcadores intragênicos, inevitavelmente deve ser feito por

genotipagem de dinucleotídeos, uma vez que a seqüência do gene F8 não possui

elementos STR tetra- ou pentanucleotídeos adequados ao diagnóstico. Acreditamos

que a tipagem de marcadores tetra- e pentanucleotídeos F8-extragênicos já

validados in silico deva substituir os marcadores dinucleotídeos extragênicos. Como

mencionado, o principal inconveniente prático da genotipagem de dinucleotídeos

que complica o uso em análise genética, é a ocorrência de produtos stutter, que são

gerados por desacoplamento e acoplamento da polimerase durante a replicação in

vitro. A tipagem acurada com STR tetra e pentanucleotídeos resultará em menor

taxa de falso diagnóstico.

No presente trabalho procuramos responder as seguintes perguntas: O que é

um bom marcador? Um bom marcador poderia ser predito por uma análise in silico?

Se por um lado os marcadores mais informativos, ou seja, aqueles que possuem

maiores taxas de heterozigosidade e poder de discriminação possuem as maiores

pontuações, por outro, os marcadores com as maiores pontuações possuem as

maiores taxas de mutação. Então, que marcador utilizar?

51

As nossas análises permitem concluir que um bom marcador pode ser

definido diferentemente para o uso na genética médica ou na genética forense. A

elevada taxa de mutação de microsatélites não é um ponto crítico no diagnóstico

individual de alterações cromossômicas ou na caracterização dos cromossomos

sexuais em pacientes portadores de genitália ambígua. Entretanto, para estudos de

segregação gênico-cromossômica em famílias e identificação de indivíduos, um

marcador estável, isto é, com baixa taxa de mutação, deve ser preferencialmente

usado.

Na identificação de indivíduos a dosagem alélica não é tão importante quanto

na determinação de aneuploidias. Locos muito polimórficos tendem a apresentar

diferenças significativas entre o menor e maior alelo. Um estudo de Robino e

colaboradores (2006) demonstrou que mulheres heterozigotas para o marcador

altamente polimórfico DXS10011 possuíam em média uma relação de 1:0,63 entre o

produto amplificado do menor e maior alelos. Portanto, locos altamente polimórficos

podem gerar falso-positivos no diagnóstico de aneuploidias. Desta forma, a nossa

recomendação é que a escolha de um bom marcador deve ficar a critério do

propósito a ser utilizado. Claramente, a informatividade in silico, definida no presente

estudo, é um bom guia para definir novos alvos de estudo nas áreas da Genética

Médica ou Forense.

Por último, acreditamos que a estratégia de mineração e validação de

marcadores polimórficos informativos descrita na presente dissertação também será

adequada para validação e definição de critérios de predição de novos marcadores

tanto para autossomos quanto para o cromossomo Y.

52

7. CONCLUSÕES

o A tipagem com os novos STR penta e tetranucleotídeos permitirá a

determinação inequívoca, acurada, de freqüências alélicas em diferentes

populações humanas. Neste sentido, atenta-se às discrepâncias entre as

freqüências alélicas e, por conseguinte, das taxas de heterozigosidade e

poder de discriminação comumente encontradas na literatura em relação aos

marcadores STR dinucleotídeos. Assim sendo, recomendamos fortemente a

tipagem de indivíduos utilizando o repertório de STR penta e

tetranucleotídeos descrito nesta dissertação.

o Os novos marcadores tetra- e pentanucleotídeos F8-extragênicos validados in

silico deverão substituir os dinucleotídeos extragênicos, já que estes geram

resultados de difícil interpretação.

o Os mapas genéticos e de recombinação são de grande valia para os

pesquisadores de ambas as áreas médica e forense, visto que os dados são

mais robustos do que os dados relativos ao mapa genético Marshfield, que se

baseia em um número muito limitado de marcadores.

o A informatividade in silico, definida no presente estudo, é um bom guia para

definir novos alvos de estudo nas áreas da Genética Médica ou Forense. A

escolha do marcador deve ficar a critério do propósito a ser utilizado. Os

marcadores mais informativos possuem maiores taxas de heterozigosidade e

poder de discriminação e, na análise in silico, as maiores pontuações. Atenta-

se ao fato que os marcadores autossômicos que exibem as maiores

pontuações possuem as maiores taxas de mutação.

o A estratégia de mineração e validação de marcadores polimórficos

informativos descrita na presente dissertação também é adequada para

validação e definição de critérios de predição de novos marcadores tanto para

autossomos quanto cromossomo Y.

53

CAPÍTULO II

Genotipagem de indivíduos com constituição alossômica duvidosa

54

3. OBJETIVOS

• Genotipar pacientes com constituição alossômica duvidosa.

• Determinar a origem parental e meiótica da não disjunção cromossômica

em portadores de aneuploidia gonossômica

55

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material biológico

Sangue venoso: amostras de 0,5-2mL de sangue venoso foram coletadas

em tubo contendo anticoagulante EDTA e mantidas sob refrigeração até o

momento da extração de DNA dos leucócitos.

Líquido Amniótico: Amostras de conveniência encaminhadas pelo Dr.

Francisco Coelho do Centro de Infertilidade e Medicina Fetal de Campos, sede

Hospital Escola Álvaro Alvim,

Células do epitélio bucal: Células bucais foram coletadas por esfregaço

bucal utilizando haste flexível, estéril, com ponta de algodão hidrofílico. Este

material foi coletado preferencialmente de crianças menores de cinco anos.

Amostras de DNA referidas: Enviadas por colaboradores do projeto: DNA de

pacientes acometidos pelas síndromes de Turner e Klinefelter, paciente com

suspeita de mosaicismo ou quimerismo autossômico e alossômico foram doadas

pela Profa Dra Mônica Vanucci Lipay (Universidade Federal de São Paulo); DNA de

paciente portador de dupla aneuploidia autossômica e gonossômica e dos

respectivos pais biológicos foram doados pelas Profa Dra Eny Maria Goloni Bertollo

e Profa Dra Érika Cristina P. Bertelli (Faculdade de Medicina de São José do Rio

Preto).

4.2. Aspectos éticos

Todas as coletas de pacientes com suspeita clínica foram feitas perante

assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo). As coletas

foram feitas por profissionais autorizados e/ou remetidas por especialistas que

encaminharam o material ao NUDIM.

56

4.3. Métodos

4.3.1. Extração de DNA

As amostras biológicas foram submetidas ao método de extração do DNA

genômico utilizando o kit de extração e purificação de DNA genômico (Ilustra blood

genomicPrep), GE Heathcare, UK, conforme a especificação do fabricante.

4.3.2. Amplificação de regiões polimórficas e monomórficas específicas dos

cromossomos sexuais

Uma alíquota de 2 ng de DNA total, após diluição, foi submetida ao processo

de amplificação em sistema multiplex (amplificação de vários marcadores em reação

única), pelo método da PCR Quantitativa Fluorescente (QF-PCR) utilizando os

iniciadores listados na tabela 7 para os marcadores DXS981, DXS1187, XHPRT,

P39, DXS996, DXS1283E, X22, AMEL, SRY, DYS448 (Ogilvie et al., 2005). Este

sistema foi otimizado pelo Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular (Moreira,

2007). Para amplificação das seqüências de DNA foi utilizado o seguinte programa

da PCR: Estágio I, 1 ciclo a 95º por 1 minuto; Estágio II, 28 ciclos a 94ºC por 1

minuto, 57ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto; Estágio III, 1 ciclo a 60ºC por 60

minutos. O tampão de reação é composto por: 0,2 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1,25 U

Taq Polimerase (Alves da Silva, 2007). Os marcadores do cromossomo Y foram

utilizados como controles positivos ou negativos no caso de genotipagem de

homens e mulheres respectivamente. Também foram utilizados para dosagem da

proporção de X para Y nos casos suspeitos de Síndrome de Klinefelter.

4.3.3 Quantificação de DNA genômico

DNA foi quantificado de forma indireta através de diluições de acordo com o

rendimento do kit de extração e purificação de DNA genômico, para cada tipo de

material biológico.

4.3.4. Caracterização dos alelos amplificados

Aos produtos de amplificação foram adicionados formamida (Hi-Di

Formamida, Applied Biosystems) e o padrão de massa molecular GeneScan LIZ

500, marcado com o fluorocromo LIZTM (fluorescência laranja) (Applied

Biosystems). Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese capilar

57

com o polímero POP 4 (Applied Biosystems), utilizando a plataforma ABI PrismTM

310 Genetic Analyzer. Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando os

programas GeneScanTM e GenotyperTM (Applied Biosystems). Os alelos foram

nomeados com o valor em pares de nucleotídeos dos produtos da PCR. A Figura 3

mostra as informações requeridas para interpretar um eletroferograma.

58

Tab

ela

7. In

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59

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A

C

D

B

60

5.RESULTADOS

5.1. Caracterização molecular dos cromossomos sexuais em pacientes com

constituição alossômica duvidosa.

No histórico do atendimento do serviço social do NUDIM constam 17 casos de

investigação da constituição dos cromossomos sexuais em pacientes com suspeita

de síndrome de Turner ou genitália ambígua. Todos os relatos de caso foram feitos

por médicos especialistas e apresentação clínica não está presente nesta

dissertação. Em todos os casos o diagnóstico final foi feito pelos médicos

especialistas remetentes. Alguns exemplos da caracterização molecular dos

cromossomos sexuais em pacientes são apresentados a seguir.

Suspeita de síndrome de Turner

Menor, encaminhada com suspeita clínica de síndrome de Turner. A presença

de perfis dialélicos em marcadores X específicos (Figura 4) afastou a suspeita

clínica. Esta paciente foi diagnosticada posteriormente pela abordagem clínica como

portadora da síndrome de Noonan, que possui como um diagnóstico diferencial da

síndrome de Turner a presença do par de cromossomos X.

Ambigüidade genital

Neste item são apresentados 5 casos de pacientes portadores de genitália

ambígua, sendo 1 no pré-natal, que foram encaminhados por médicos especialistas

para caracterização dos cromossomos sexuais. Os pacientes são indicados como A-

E.

Paciente A. Menor de 8 anos de idade, com sexo de criação feminino e sexo

psicológico masculino. Foi caracterizado o par sexual (XX) ,figura 5, nesta paciente

que foi diagnosticada posteriormente como portadora de hiperplasia congênita da

supra-renal.

Paciente B. Menor de 13 anos de idade, sexo de criação feminino. A

investigação molecular demonstrou a presença de monoalelismo para marcadores

do cromossomo X e amplificação de marcadores específicos do cromossomo Y

(figura 6). A paciente foi diagnosticada como portadora da síndrome de

insensibilidade a andrógenos, tratando-se, portanto de um caso de mulher XY sry+.

61

Paciente C. Foi encaminhada amostra de líquido amniótico da gestante, pois

na ultra-sonografia o feto teve indicação clínica de ambigüidade genital. O feto foi

caracterizado como portador da constituição XY (Figura 7). Após o nascimento, os

pais retornaram ao NUDIM e relataram o nascimento de um menino.

Paciente D. Recém nascida, registrada como menina, pois a ultra-sonografia

de abdômen revelou a presença de genitais internos femininos. Paciente com

histórico familiar de genitália ambígua. A caracterização molecular demonstrou

constituição XX (Figura 8). O diagnóstico clínico foi de pseudo-hermafroditismo

feminino (hiperplasia congênita da supra-renal).

Paciente E. Recém nascido com 15 dias, registrado como menino. A

presença de marcadores específicos para o cromossomo Y indicou constituição

alossômica típica masculina XY, sry+ (Figura 9). O paciente foi diagnosticado como

portador de hipospádia e indicado para correção cirúrgica.

Confirmação molecular das síndromes de Turner e Klinefelter.

Amostras de uma paciente Turner e um Klinefelter foram recebidas em caráter

de colaboração, para demonstrar a eficiência da citogenética molecular nesses

casos clínicos. Os resultados moleculares corroboram com os da citogenética

clássica, utilizada para diagnosticar os dois pacientes referidos (Figuras 10 e 11).

62

Fig

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7.

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AMEL

70

5.2 Determinação da origem parental e meiótica da não disjunção

cromossômica em uma criança com dupla aneuplodia 48,XXY+21

O trio familiar foi genotipado com os marcadores alossômicos para determinar

a origem parental da cópia extra do cromossomo X, e com 5 marcadores localizados

na região 21q (Alves da Silva, 2007) para determinar a origem parental da cópia

extra do cromossomo 21.

A origem de ambos os eventos de não disjunção foi materna, uma vez que o

probando possui duas cópias de alelos maternos exclusivos para ambos os

cromossomos adicionais (Tabelas 8 e 9 e Figuras 12 e 13). Os erros ocorreram

durante a meiose I, devido à manutenção da heterozigosidade materna entre os

alelos dos cromossomos não disjuntos na criança. Não foram observados eventos

de recombinação entre os marcadores genotipados (Manuscrito em preparação).

Tabela 8. Perfil alélico dos marcadores específicos para o cromossomo 21

estabelecido por QF-PCR para o trio familiar.

PERFIL ALÉLICO a Nº DE CÓPIAS b

Marcador Mãe Pai Filho Filho

D21S11 (21q21) 243 257 239 239 239 243 257 1 1 1

D21S226 (21q22.1) 451 459 455 459 451 459 1 2

D21S1270 (21q21-

q22.1)

293 299 299 312 293 299 312 1 1 1

D21S1411 (21q22.3) 284 292 288 292 284 292 1 2

IFNAR (21q22.1) 384 388 388 388 384 388 1 2

a Tamanho do alelo em pares de nucleotídeos. b Marcadores exibindo perfil dialélico com razão entre áreas > 1,8 foram

considerados evidência de trissomia.

71

Tabela 9. Perfil alélico dos marcadores específicos para os cromossomos sexuais

estabelecido por QF-PCR para o trio familiar.

PERFIL ALÉLICO a

Marcador Mãe Pai Filho

P39 (Xq28) 151 159 159 151 159

DXS981 (Xq13.1) 244 244 244 244 244

DYS448 (Yq11.2) Ausente 351 351

DXS1187 (Xq26.2) 143 147 147 143 147

XHPRT (Xq26.1) 276 284 276 276 284

AMEL (Xp22.22/Yp11.2) 104 104 109 104 b 109

DXS996 (Xp22.3) 129 162 152 129 162

SRY (Yp11.2) Ausente 244 244

DXS1283E (Xp22.3) 311 326 320 311 326

X22 (Xq28/Yq12) 204 218 204 243 204 b 218 a Tamanho do alelo em pares de nucleotídeos. b Alelo informativo com razão de área 2:1.

Figura 12. Eletroferograma dos perfis genéticos para os marcadores D21S11e

D21S226 evidenciando a origem materna da trissomia do cromossomo 21. (Detalhes

para interpretação de um eletroferograma na Figura 3).

Mãe

Filho

Pai

72

Figura 13. Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador X22 demonstrando

a origem materna da cópia extra do cromossomo X. (Detalhes para interpretação de

um eletroferograma na Figura 3).

5.3 Investigação molecular em menor hermafrodita verdadeiro

47,XX,+mar/47,XY,+mar/46,XX/46,XY

Para diferenciar entre quimerismo e mosaicismo na origem de formação em

um paciente hermafrodita verdadeiro apresentando 4 linhagens celulares

47,XX,+mar/47,XY,+mar/46,XX/46,XY em proporções [1:1:27:14] foram genotipados

neste trabalho 31 marcadores microssatélites em 13 cromossomos autossômicos e

27 marcadores nos cromossomos sexuais. Ensaios de FISH, executados pela Profa

Dra. Mônica Lipay (Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São

Paulo) tinham demonstrado que os cromossomos marcadores são derivados do

cromossomo Y.

Para todos os marcadores investigados o paciente apresentou dois

componentes paternos e um materno. As Figuras 14 e 15 exemplificam marcadores

informativos no cromossomo 13 e X respectivamente. As dosagens alélicas

corroboram com as proporções encontradas no cariótipo.

Mãe

Filho

Pai

73

Figura 14. Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador D13S305

(cromossomo 13) do núcleo familiar. A) Mãe, B) Criança, C) Pai. A criança possui

duas cópias de alelos paternos exclusivos (440pb e 451pb) e um alelo materno

(447pb). (Detalhes para interpretação de um eletroferograma na Figura 3).

Figura 15. Eletroferograma dos perfis genéticos para o marcador XHPRT

(cromossomo X) do núcleo familiar. A) Mãe, B) Criança, C) Pai. A criança possui

um alelo paterno exclusivo 288pb, demonstrando a origem paterna de um dos

cromossomos X. (Detalhes para interpretação de um eletroferograma na Figura 3).

A

B

C

A

B

C

74

5. DISCUSSÃO

É reconhecido que tempo de espera longo para entrega de resultados

laboratoriais pode causar muito sofrimento psicológico para as famílias, que é uma

das razões principais do uso de métodos moleculares para diagnóstico de

desordens cromossômicas comuns. Este tipo de abordagem não requer cultura de

células e os relatórios podem ser emitidos habitualmente entre 1-2 dias (Hultén et

al., 2003).

Implementamos a metodologia QF-PCR de citogenética molecular no auxílio

ao diagnóstico de diferentes casos clínicos suspeitos de aneuploidias ou constituição

alterada dos cromossomos sexuais. A maioria dos resultados foi entregue em até 48

horas.

A automatização da QF-PCR permite que um único operador manipule 40

amostras por dia. A disponibilidade de seqüenciadores multicapilares permite o

processamento de grande número de amostras a baixo custo (Cirigliano et al.,

2004). No Reino Unido o custo do cariótipo é em média 264 dólares por amostra e

pode chegar a 74 dólares por QF-PCR (Grimshaw et al., 2003).

Contaminação com células maternas é um dos principais problemas na

genotipagem de amostras no pré-natal. Nós realizamos apenas uma genotipagem

no pré-natal com amostra de líquido amniótico de boa qualidade que nos permitiu

com segurança afirmar o sexo cromossômico do concepto. Acreditamos que como

no Brasil a interrupção da gravidez devido a diagnóstico pré-natal de anomalias

cromossômicas é proibida, não há muito interesse na comunidade acadêmica e/ou

na indústria nacional no desenvolvimento de kits de diagnóstico por QF-PCR.

Mesmo nos países onde o aborto é permitido, o diagnóstico molecular durante o pré-

natal é importante não só para o casal, mas no manejo da gestação e para o

cuidado multidisciplinar do neonato acometido com aneuploidias.

O sistema empregado na genotipagem apresentou artefatos inerentes ao tipo

de repetição STR. Três dos seis marcadores polimórficos específicos para o

cromossomo X são STR dinucleotídeos, apresentando alta taxa de stutters. Embora

estes marcadores possuam perfil eletroforético de difícil interpretação, eles são

polimórficos e discriminam indivíduos. Devido a grande quantidade de STR tetra e

75

pentanucleotídeos presentes no cromossomo X (capítulo I), sugerimos que eles

devam substituir os STR dinucleotídeos para fins de diagnóstico envolvendo o

cromossomo X, exceto quando o uso de dinucleotídeos é inevitável, isto é não

existam outros STR tipáveis na região de interesse, como no gene F8 para o

diagnóstico indireto da Hemofilia A

A genotipagem de marcadores STR polimórficos permite determinar a origem

parental e meiótica da não disjunção cromossômica em pacientes aneuplóides.

Essas informações serão úteis para o cálculo do risco de recorrência e atenção

especial aos sintomas clínicos. No presente estudo foram investigados dois casos

raros de aneuplodia.

Relatamos um caso de dupla aneuploidia 48, XXY +21 em criança nascida de

mãe de 13 anos de idade. Poucos estudos moleculares em dupla trissomia estão

disponíveis, e a origem parental da não-disjunção nesses casos é

predominantemente materna (Li et al., 2005). No presente caso, ambos os eventos

de não-disjunção eram maternos e aconteceram durante MI. Glass e colaboradores

(2006) relataram um caso de 48,XXY,+21 no pré-natal no qual os cromossomos X e

21 extras eram provindos da não disjunção na MI materna. Em contraste, Lorda-

Sanchez e colaboradores (1991) relataram um nascido vivo 48,XXY,+21 com o

cromossomo 21 adicional de origem materna e não-disjunção na MII e o

cromossomo X adicional de origem paterna e não-disjunção na MI.

A ocorrência de dupla aneuplodia em uma mulher muito jovem, como no caso

presente (12 anos na concepção), contrasta com relatos publicados que indicam um

risco aumentado de para não-disjunção autossômica e alossômica com o aumento

da idade materna (Jyothy et al., 2001; Morris et al., 2002). De acordo com estudos

de população pelo Registro Citogenético Nacional da Síndrome de Down (NDSCR)

no Reino Unido (Morris et al., 2002), nenhum caso de trissomia 21 simples em mãe

de 13 anos havia sido registrado. A exclusão de idade materna avançada como fator

de risco para a não disjunção cromossômica no presente caso sugere a existência

de outros fatores de risco idade independente.

Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a origem da constituição

46, XX/XY em hermafroditas verdadeiros (Niu et al., 2002), entre esses se

encontram o quimerismo partenogenético e a diploidização de triplóides. A prova

76

molecular para diferenciar indivíduos gerados por quimerismo partenogenético ou

diploidização de zigoto triplóide é difícil de ser obtida. O estudo molecular irá

demonstrar a presença de dois constituintes genéticos paternos e um materno

(Malan et al., 2006).

Central para a compreensão do mecanismo genético na origem da criança

hermafrodita apresentada nesta dissertação é a ocorrência de um pequeno

cromossomo marcador derivado de Y estabelecido por FISH, em duas linhagens

celulares; 46,XX,+mar e 46,XY,+mar. Os cromossomos Y marcadores não estavam

presentes nos pais e esses exibem tamanhos diferentes evidenciando dois tipos de

marcadores derivados de Y. Análise molecular comparativa de microssatélites

autossômicos e alossômicos nos pais e na criança permitiu a conclusão inequívoca

que a criança possui apenas um componente genético materno e dois paternos.

Assim, em nenhum dos locos genotipados em regiões centroméricas e distais a

criança exibiu dois alelos maternos. As dosagens alélicas observadas em DNA de

leucócitos foram coincidentes com os valores esperados das proporções de células

estabelecidas por cariotipagem.

Embora a maioria dos cromossomos marcadores resulte de erros mitóticos

em embriões diplóides, acreditamos que os marcadores Y nesta criança foram

originados de um extensivo e efetivo evento de diploidização de um embrião triplóide

como postulado por Golubovsky (2003), Figura 16. A maioria dos embriões triplóides

é abortada e há um número limitado de casos de nascidos vivos (Iliopoulos et al.,

2005). A prova do evento de diploidização de um embrião triplóide é sem

precedentes e pode ser visto como um mecanismo de proteção que efetivamente

restabelece a ploidia para gerar mosaicos complexos viáveis.

77

Figura 16. Possíveis mecanismos de geração de indivíduos 2n XX/XY com 2

componentes genéticos maternos e 1 paterno. a) Representa o mecanismo de

ativação partenogenética do ovócito seguido pela fertilização de células idênticas por

dois diferentes espermatozóides contendo diferentes cromossomos sexuais. b)

Representa o cenário de fertilização dispérmica de um ovócito seguido de

diploidização pós-zigótica de concepto triplóide como postulado por Golubovsky

(2003). (Figura adaptada de Souter et al., 2007)

78

7. CONCLUSÕES

o A genotipagem de marcadores STR polimórficos permite determinar a origem

parental e meiótica da não disjunção cromossômica em pacientes

aneuplóides de maneira eficiente e rápida. Os testes podem ser aplicados em

amostras diversas durante o pré-natal ou após o nascimento. Essas

informações serão úteis para o cálculo do risco de recorrência e atenção

especial aos sintomas clínicos.

o Análise molecular comparativa de microssatélites autossômicos e

alossômicos nos pais e na criança acometida por dupla aneuploidia confirmou

os dados citogenéticos e permitiu estabelecer a origem materna da não

disjunção para ambos os cromossomos não disjuntos.

o A tipagem molecular permitiu a conclusão inequívoca que a criança

acometida por hermafroditismo verdadeiro possui apenas um componente

genético materno e dois paternos. Quanto ao possível mecanismo genético

na origem da criança hermafrodita atenta-se ao fato que ambos os estudo de

citogenética clássica e molecular são indispensáveis para diferenciar entre

mosaicismo e quimerismo partenogenético.

79

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Andrews, T.D.; Scott, C.E.; Searle, S.; Ramser, J.; Whittaker, A.; Deadman, R.;

Carter, N.P.; Hunt, S.E.; Chen, R.; Cree, A.; Gunaratne, P.; Havlak, P.; Hodgson,

A.; Metzker, M.L.; Richards, S.; Scott, G.; Steffen, D.; Sodergren, E.; Wheeler,

88

D.A.; Worley, K.C.; Ainscough, R.; Ambrose, K.D.; Ansari-Lari, M.A.; Aradhya, S.;

Ashwell, R.I.; Babbage, A.K.; Bagguley, C.L.; Ballabio, A.; Banerjee, R.; Barker,

G.E.; Barlow, K.F.; Barrett, I.P.; Bates, K.N.; Beare, D.M.; Beasley, H.; Beasley,

O.; Beck, A.; Bethel, G.; Blechschmidt, K.; Brady, N.; Bray-Allen, S.; Bridgeman,

A.M.; Brown, A.J.; Brown, M.J.; Bonnin, D.; Bruford, E.A.; Buhay, C.; Burch, P.;

Burford, D.; Burgess, J.; Burrill, W.; Burton, J.; Bye, J.M.; Carder, C.; Carrel, L.;

Chako, J.; Chapman, J.C.; Chavez, D.; Chen, E.; Chen, G.; Chen, Y.; Chen, Z.;

Chinault, C.; Ciccodicola, A.; Clark, S.Y.; Clarke, G.; Clee, C.M.; Clegg, S.; Clerc-

Blankenburg, K.; Clifford, K.; Cobley, V.; Cole, C.G.; Conquer, J.S.; Corby, N.;

Connor, R.E.; David, R.; Davies, J.; Davis, C.; Davis, J.; Delgado, O.; Deshazo,

D.; Dhami, P.; Ding, Y.; Dinh, H.; Dodsworth, S.; Draper, H.; Dugan-Rocha, S.;

Dunham, A.; Dunn, M.; Durbin, K.J.; Dutta, I.; Eades, T.; Ellwood, M.; Emery-

Cohen, A.; Errington, H.; Evans, K.L.; Faulkner, L.; Francis, F.; Frankland, J.;

Fraser, A.E.; Galgoczy, P.; Gilbert, J.; Gill, R.; Glockner, G.; Gregory, S.G.;

Gribble, S.; Griffiths, C.; Grocock, R.; Gu, Y.; Gwilliam, R.; Hamilton, C.; Hart,

E.A.; Hawes, A.; Heath, P.D.; Heitmann, K.; Hennig, S.; Hernandez, J.;

Hinzmann, B.; Ho, S.; Hoffs, M.; Howden, P.J.; Huckle, E.J.; Hume, J.; Hunt, P.J.;

Hunt, A.R.; Isherwood, J.; Jacob, L.; Johnson, D.; Jones, S.; de Jong, P.J.;

Joseph, S.S.; Keenan, S.; Kelly, S.; Kershaw, J.K.; Khan, Z.; Kioschis, P.; Klages,

S.; Knights, A.J.; Kosiura, A.; Kovar-Smith, C.; Laird, G.K.; Langford, C.; Lawlor,

S.; Leversha, M.; Lewis, L.; Liu, W.; Lloyd, C.; Lloyd, D.M.; Loulseged, H.;

Loveland, J.E.; Lovell, J.D.; Lozado, R.; Lu, J.; Lyne, R.; Ma, J.; Maheshwari, M.;

Matthews, L.H.; McDowall, J.; McLaren, S.; McMurray, A.; Meidl, P.; Meitinger, T.;

Milne, S.; Miner, G.; Mistry, S.L.; Morgan, M.; Morris, S.; Muller, I.; Mullikin, J.C.;

Nguyen, N.; Nordsiek, G.; Nyakatura, G.; O'Dell, C.N.; Okwuonu, G.; Palmer, S.;

Pandian, R.; Parker, D.; Parrish, J.; Pasternak, S.; Patel, D.; Pearce, A.V.;

Pearson, D.M.; Pelan, S.E.; Perez, L.; Porter, K.M.; Ramsey, Y.; Reichwald, K.;

Rhodes, S.; Ridler, K.A.; Schlessinger, D.; Schueler, M.G.; Sehra, H.K.; Shaw-

Smith, C.; Shen, H.; Sheridan, E.M.; Shownkeen, R.; Skuce, C.D.; Smith, M.L.;

Sotheran, E.C.; Steingruber, H.E.; Steward, C.A.; Storey, R.; Swann, R.M.;

Swarbreck, D.; Tabor, P.E.; Taudien, S.; Taylor, T.; Teague, B.; Thomas, K.;

Thorpe, A.; Timms, K.; Tracey, A.; Trevanion, S.; Tromans, A.C.; d'Urso, M.;

Verduzco, D.; Villasana, D.; Waldron, L.; Wall, M.; Wang, Q.; Warren, J.; Warry,

G.L.; Wei, X.; West, A.; Whitehead, S.L.; Whiteley, M.N.; Wilkinson, J.E.; Willey,

89

D.L.; Williams, G.; Williams, L.; Williamson, A.; Williamson, H.; Wilming, L.;

Woodmansey, R.L.; Wray, P.W.; Yen, J.; Zhang, J.; Zhou, J.; Zoghbi, H.; Zorilla,

S.; Buck, D.; Reinhardt, R.; Poustka, A.; Rosenthal, A.; Lehrach, H.; Meindl, A.;

Minx, P.J.; Hillier, L.W.; Willard, H.F.; Wilson, R.K.; Waterston, R.H.; Rice, C.M.;

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93

ANEXOS

94

A. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .

B. Artigo publicado na revista Haemophilia.

C. Artigo aceito para publicação na revista Haemophilia.O material suplementar

não está anexado.

D. Artigo aceito para publicação na revista Forensic Science International

Genetics.