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インドシアニングリーンに代表される

生体イメージング用近赤外蛍光色素の

蛍光増強および安定化技術

所属 理研（生命システム研究センター）

氏名 神 隆

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1) 背 景 （目的）

• 近赤外蛍光色素の水溶液中での不安定性（色

素の凝集や蛍光消失）の改善 • 近赤外色素の蛍光輝度の改善 • 近赤外生体蛍光イメージングの高感度化 → 血管、リンパ節、癌腫瘍蛍光イメージング

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近赤外蛍光イメージングの例 （乳がん腫瘍）

乳がん 乳がん

明視野 近赤外蛍光(800 nm)

（高輝度発近赤外量子ドットプローブ） 蛍光の量子収率＞20%

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生体蛍光イメージング用の近赤外色素

(780 ex. / 820 em.)

(670 ex. / 685 em.) (680 ex. / 700 em.)

インドシニングリーン (ICG)

ローダミン800 オキサジン750

(960 ex. / 1200 em.)

QY：2.5 % QY：5 %

QY：2 % QY < 1 %

QY(水中での量子収率）

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近赤外蛍光色素の一般的な性質

• 水への溶解性が低い 特に生理的緩衝液には溶けにくい • 水中で凝集する（不安定） 共役系が長く、比較的疎水性であるため • 蛍光の量子収率が小さい 水中では時間とともに蛍光輝度が低下する

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ICG水溶液 の蛍光像

０ 時

間

１週間経過

インドシアニングリーン(ICG)の場合

ICGの蛍

光強

度

水溶液調整後の日数

ICG水溶液の蛍光の消失

リン酸緩衝生理食塩水溶液

0 1 2 3 4 5 6

1

0

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2) 従来技術とその問題点

ICG水溶液の安定性、蛍光輝度を改善するため、ICGをリポソーム、ナノ粒子、高分子ミセルなどに封入する方法があるが、 ・試料の調整に手間と時間がかかる ・粒径サイズが大きくなる ・抗体等の生体分子の修飾が難しい などの問題があり、広く利用されるまでには至っていない。

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ICGを安定化、蛍光輝度を増大させるために報告されている高分子ミセル (例） 1)Poly(styrene-alt-maleic anhydride)- block-poly(stylene) 分子量=21600

2)Pluronic F-127 (poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide), 分子量=12600

3)MPEG-PLA-PA (poly(ethylene glycol)-poly(lactide)-poly(β-amino ester), 分子量=4807-8500

J. Biomed. Opt. 13, 014025 (2008)

Mol. Pharmaceutics. 6, 480 (2009)

Biomaterials. 35, 3467 (2014)

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3) 新技術の特徴、効果

• ミセルのサイズが小さい（5nm以下）。 • 近赤外蛍光色素の安定性、発光輝度の著しい改善（水中で１ヶ月以上安定、200％以上の輝度増大）。

• 添加剤の大量合成が容易で安価で毒性がない。

• リンパ節、乳がん腫瘍の生体蛍光イメージングへの応用が可能。

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本技術でミセル形成に用いる化合物

1, 3, 5

両親媒性カリックスアレーン

分子量 < 3000

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ICGのカリックスアレーンミセルへの取り込み

ミセル

ICG

蛍光輝度増大

疎水的環境で 安定化

水中では不安定

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F. I.

S4-6： R = C6H13

S4-6 無 有 S4-6 無 有

本技術によるICGの蛍光輝度の改善

PBS 溶液

[ICG] = 5 µM [S4-6] = 10 mg/mL

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本技術によるICGの蛍光増強および安定化 ICGの蛍光スペクトル

ICGの吸収スペクトル

ICGの量子収率

ICG蛍光の時間変化

PBS溶液

[ICG] = 1 µM [S4-6] = 10 mg/mL

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マウス肝臓およびリンパ節のイメージング 本技術

本技術

[ICG] = 5 µM [S4-6] = 10 mg/mL

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ICGによるリンパ節の検出感度の比較

[ICG] = 5 µM, [S4-6] = 10 mg/mL

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b)

ICG修飾抗体での蛍光強度の増大効果

ICG-NHS

ICG修飾抗体の蛍光スペクトル

抗体へのICG修飾

Ab: ハーセプチン

[Ab]= 1mg/mL [ICG] = 5 µM [S4-6] = 10 mg/mL

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ヒト乳がん細胞の近赤外蛍光イメージング

Ab: ハーセプチン, [Ab]= 1mg/mL [ICG] = 5 µM, [S4-6] = 10 mg/mL

ICG-Abによる細胞イメージング（830 nm蛍光）

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504

358

212

67

S4-6 (+)

S4-6 (-)

S4-6 (+) S4-6 (+)

S4-6 (-) S4-6 (-)

0 hr 48 hrs 72 hrs

F. I.

ヒト乳がんの近赤外蛍光イメージングの高感度化

[Ab]= 1mg/mL、[ICG] = 5 µM, [S4-6] = 10 mg/mLICG

ICG-Abを100 µL尾静脈から注入

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F. I. ICG-Ab, S4-6 (+) ICG-Ab, S4-6(-)

腎臓 肝臓

心臓 脾臓 腫瘍

腎臓 肝臓

心臓

脾臓

腫瘍

ヒト乳がん腫瘍でのICG-Abの蛍光強度の比較

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4) 想定される用途

• 近赤外蛍光色素（ICG等)水溶液の安定化、長期保存。

• 近赤外蛍光色素（抗体修飾ICG等）を用いた細胞イメージング。

• 近赤外蛍光色素（ICG等)を用いた生体蛍光イメージングの高感度化。

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5) 実用化に向けた課題

• 培養細胞、動物等を対象として本技術を実用化する場合、近赤外蛍光試薬の溶解液としてキット化するなどの工夫が必要。

• ヒトでの応用を目指すには、さらなる体内動態、細胞毒性、免疫毒性など安全性の評価が必要。

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6) 企業への期待

• 蛍光試薬合成、蛍光イメージングの技術を持つ企業との共同研究を希望。

• 当面は、小動物での蛍光イメージング用近赤外プローブの蛍光増強剤として実用化していただける企業を希望。

• 将来的には、ヒトでの生体近赤外蛍光イメージングの実用化を目指す企業との共同研究を希望。

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7) 本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：カリックスアレーン誘導体 • 出願番号 ：特願2015-063326 • 出願人 ：理化学研究所 • 発明者 ：神 隆

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8) 本技術に関する論文発表

• 論文題目： Enhancement of aqueous stability and fluorescence

brightness of indocyanine green using small calix[4]arene micelles for near-infrared fluorescence imaging

• 著 者 名 ： Takashi Jin, Setsuko Tsuboi, Akihito Komatsuzaki, Yukio Imamura, Yoshinori Muranaka, Takao Sakata, and Hidehiro Yasuda

• 雑誌名：Med. Chem. Commun., 2016, DOI: 10.1039/C5MD00580A

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お問い合わせ先

国立研究開発法人理化学研究所

産業連携本部 知財創出・活用課

越前谷 美智子（エチゼンヤ ミチコ）

E-mail:michiko.echizenya@riken.jp TEL:078-306-3436