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インドキシル硫酸産生阻害薬 ～腎保護作用を有する尿毒症治療薬の開発

熊本大学大学院生命科学研究部 臨床薬物動態学分野

教授 齋藤秀之

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研究背景 日本人の主な死因(平成20年、厚生労働省)

順位 死因 死亡率(人口10万人対) 1位 悪性新生物 272.2 2位 心疾患 144.4 3位 脳血管疾患 100.8 4位 肺炎 91.5 5位 不慮の事故 30.2 6位 老衰 28.5 7位 自殺 24.0 8位 腎不全 17.9 9位 肝疾患 12.9 10位 閉塞性肺疾患 12.3

合計 263.1

腎不全は心血管・脳血管疾患と密接な関わりがあり、その死亡率を合わせると、悪性新生物（がん）と同程度の死因となっている。

慢性腎臓病（CKD） ハイリスク群 糖尿病 高血圧 メタボリック症候群 家族歴

健常者

総人口1億人 (20歳以上)

CKD1,2 腎障害（+） 腎機能 軽度低下

CKD3 腎機能 中程度低下

CKD4 腎機能 高度低下

CKD5 末期腎不全

腎障害の原因検索 腎障害を緩解させる治療

合併症検査／治療 腎不全教育 腎機能改善／進行遅延のための治療

合併症治療 腎代替療法の教育 透析導入準備

透 析 移 植

合併症治療 腎移植の推進

19万人

26万人

5万人

腎疾患対策検討会資料より一部抜粋

CVDのリスク増大

1074万人

心血管疾患（CVD）死亡

腎障害進行の危険因子軽減

3

水溶性、低分子型物質 （≦500 Da） タンパク結合型物質 中分子型物質

（>500 Da） 1-メチルアデノシン 1-メチルグアノシン 1-メチルイノシン 非対称ジメチルアルギニン α-ケト－σ-グアニジノ吉草酸 α-N-アセチルアルギニン アラビトール アルギン酸 ベンジルアルコール β-グアニジノプロピオン酸 β-リポトロピン クレアチン クレアチニン シチジン ジメチルグリシン エリスリトール γ-グアニジノ酪酸 グアニジノ酢酸 グアニジノコハク酸 ヒポキサンチン マロンジアルデヒド マンニトール メチルグアニジン ミオイノシトール N2,N2-ジメチルグアノシン N4-アセチルシチジン N6-メチルアデノシン オロト酸 オロチジン シュウ酸 フェニルアセチルグルタミン シュードウリジン 対称ジメチルアルギニン ソルビトール タウロシアミン スレイトール チミン ウラシル 尿素 尿酸 ウリジン キサンチン キサントシン

2-メトキシレゾルシノール 3-デオキシグルコソン CMPF フルクトースリジン グリオキサール 馬尿酸 ホモシステイン ヒドロキノン インドール-3-酢酸 インドキシル硫酸 キヌレニン キヌレン酸 レプチン メラトニン メチルグリオキサール N-カルボキシメチルリジン p-クレジル硫酸 ペントシジン フェノール p-OH-馬尿酸 プトレシン キノリン酸

アドレノメジュリン 心房性利尿ペプチド β2-マイクログロブリン β-エンドルフィン コレシストキニン クララ細胞分泌タンパク 補体D因子 システチンC 脱果粒阻害タンパクⅠ デルタ睡眠誘発ペプチド エンドセリン ヒアルロン酸 インターロイキン-1β インターロイキン6 κ-Ig短鎖 λ-Ig短鎖 メチオニン-エンケファリン ニューロペプチドY 副甲状腺ホルモン レチノール結合タンパク 腫瘍壊死因子（TNF）-α

尿毒症物質の種類 Vanholder R, et al:Kidney Int, 63 (5): 1934–1943, 2003

CH3

OSO3H

4

体内で産生される低分子型の尿毒症物質のひとつ．腎機能が正常な場合は、尿中へ排泄されるため、血液中に蓄積されることはない

NH

OSO 3 H

インドキシル硫酸

血清中インドキシル硫酸濃度が高い腎不全患者ほど生存率が低く（A）、心血管系合併症による死亡率も高い（B） Clin J Am Soc Nephrol. 2009

糸球体濾過機能（GFR）が低下する程、血清中インドキシル硫酸濃度が高くなる

累積

生存

率

心血

管疾

患患

者の

累積

生存

率

血清

中イ

ンド

キシ

ル硫

酸濃

度(μ

M)

GFR (mL/min/1.73m2

日 数 日 数

IS 1st tertile

IS 2nd tertile

IS 3rd tertile

IS 1st tertile IS 2nd tertile

IS 3rd tertile

5

腎不全・腎障害患者では、尿中に排泄される尿毒症物質（インドキシル硫酸等）が血液や各臓器に蓄積することで、慢性腎臓病への進行だけでなく心血管系合併症等のリスク要因となる。

腎不全患者における尿毒症物質の除去を目的として、人工透析や医療用吸着炭（クレメジン）投与による治療が行われているが、尿毒症物質の体内合成と蓄積を根源的に抑える医薬品は開発されていない。

肝臓で産生される強毒性の硫酸抱合型尿毒症物質に着目し、その体内産生を抑制するとともに腎保護作用、高尿毒素血症改善作用、合併症予防効果を有する新規作用機序の薬物探索・開発を企図する。

治療の現状

本技術の着眼点

6

✔ 未だ開発されていない”高尿毒素血症”改善治療薬の創製 ✔ 強毒性尿毒症物質の体内合成を阻止する薬物の探索スク

リーニング ✔ 腎障害・腎不全・高尿毒症血症の治療ターゲットとしての

尿毒症物質産生系の有用性およびコンセプト検証

インドキシル硫酸産生阻害薬の用途・目標とする臨床適用

✔ 高尿毒素血症（尿毒症状）の改善・治療 ✔ 急性腎障害から慢性腎臓病への進展抑制 ✔ 慢性腎臓病に伴う心血管系疾患の予防的治療

7

Cisplatin

保険適用: 精巣腫瘍 膀胱がん 腎・尿管上皮がん 前立腺がん 子宮がん 非小細胞肺がん 胃がん 食道がん 副作用: 急性腎障害 (AKI) 神経毒性 嘔気 / 嘔吐 聴覚障害

シスプラチン投与により血清中及び腎組織中インドキシル硫酸蓄積が上昇するが、AST-120処理により有意に低減する。

(Pharm Res. 2008;25:2526)

Saline Cisplatin Cisplatin + AST-120

10

20

30

40

0

Seru

m I

S co

nc.

(μg/

mL)

**

## 10

5

15

20

0

Rena

l IS

conc

. (μg

/g o

f kid

ney)

Saline Cisplatin Cisplatin + AST-120

**

##

0

150

100

50

200

BUN

(m

g/dL

)

Saline Cisplatin Cisplatin + AST-120

** ##

**

0

0.5

1.0

1.5

2.0

SCr

(mg/

dL)

Saline Cisplatin Cisplatin + AST-120

**

** ##

シスプラチン腎症ラットにおけるAST-120（クレメジン）の腎保護効果

血清中インドキシル硫酸 腎組織中インドキシル硫酸

血清クレアチニン BUN

8

タンパク質

トリプトファン

チロシン

インドール

P-クレゾール

腸内細菌

尿細管上皮細胞

ABCC2

CYP2E1 CYP2A6 SULT1A1

インドール

インドキシル

OAT4 OAT3

OAT1

尿中排泄

肝臓

消化管

腎臓 尿細管

P-クレジル硫酸

インドキシル硫酸

硫酸抱合型尿毒症物質の代謝産生・排泄

NH

N H 2

O H

O

NH N

H

O H

NH

OSO 3 HCYP2A6 CYP2E1 SULT1A1

Tryptophanase

Tryptophan Indole Indoxyl Indoxyl Sulfate (IS)

CYP: cytochrome P450 SULT: sulfotransferase

腸内細菌によるトリプトファンからインドールへの代謝

インドールが腸管吸収された後、肝臓でCYPによる代謝、SULT1A1による硫酸抱合を受けて、インドキシル硫酸ができる

＊硫酸抱合を受けなかったインドキシルは、グルクロン酸抱合を受け尿中へ排泄される。

インドキシルグルクロン酸抱合体は水溶性が高いため組織移行性が低く、タンパク結合性も低い。尿中へ排泄されやすく、透析除去も容易。

9

Tryptophan

Indole

Indoxyl

Indoxyl sulfate

NH

N H 2

O H

O

NH

NH

O H

CYP2A6,CYP2E1

SULT1A1

Tryptophanase

NH

OSO 3 H

Indo

xyl s

ulfa

te p

rodu

ctio

n (p

mol

/min

/mg

prot

ein)

0

5

10

15

20

25

1 Inhibitor concentration (μM)

1000 100 10 0.1

: Tranylcypromine : DDTC

: Quercetin : Curcumin : Resveratrol

: DCNP

ラット肝S9画分インドキシル硫酸産生に及ぼす種々薬物の阻害効果

Indole concentration (μM)

Indo

xyl s

ulfa

te p

rodu

ctio

n (p

mol

/min

/mg

prot

ein)

Km=27.1 μM Vmax=30.5 pmol/min/mg prot.

0 0.6 1.2 0 5

10 15 20 25 30

25

20

15

10

5

0 0 20 40 60 80 100 120

35

0.3 0.9 v/S

v

ラット肝S9画分によるin vitroインドキシル硫酸産生反応系の確立

硫酸基転移酵素SULTの阻害薬物によってインドキシル硫酸の産生阻害効果が認められた。→インドキシル硫酸産生阻害薬物のスクリーニング系として有用【特開2011-107130 】

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実験動物: Sprague-Dawley系雄性ラット (6週齢)

シスプラチン (10 mg/kg, i.p.)

0 72 hr

腎機能検査

-24 hr 24 hr 48 hr -1 hr

Control group： Saline

Cisplatin group： Cisplatin

Cis + Quercetin group： Cisplatin + Quercetin (50 mg/kg p.o.)

Cis + Curcumin group：Cisplatin + Curcumin (60 mg/kg p.o.)

Cis + Resveratrol group： Cisplatin + Resveratrol (5 mg/kg p.o.)

シスプラチン誘発急性腎障害に及ぼすポリフェノールの影響

Quercetin

Curcumin

Resveratrol

DCNP

O H

O

O H

O H

O H

O

OH

O H

O H

OH

N

O

OCl

O H

Cl

OH O H

O HO

H 3 CO OCH 3

ポリフェノール系化合物の経口投与

11

0

0.5

1.0

1.5

2.0

SCr

(mg/

dl)

#

0

50

100

150

BUN

(m

g/dl

)

**

Kim-1

β-actin

コントロール Cisplatin +Quercetin

シスプラチン誘発急性腎障害に対するポリフェノール系化合物の腎保護効果

Control(saline) Cisplatin

Cis + quercetin Cis + curcumin

Cis + resveratrol

血清クレアチニン

BUN

#

*

12

NH

O H

SULT1A1

NH

OSO 3 H

シスプラチン誘発急性腎障害ラットの血清及び組織中インドキシル硫酸蓄積に及ぼすポリフェノール系化合物の影響

0

IS c

onc.

(nm

ol/g

of t

issue

)

20

40

60

80

100 Kidney IS

## #

0

Seru

m IS

con

c. (μ

M)

200

150

50 ## ##

Serum IS

100

0

IS c

onc.

(nm

ol/g

of t

issue

)

10

20

30

40

50 Liver IS

## #

血清中インドキシル硫酸 腎組織中インドキシル硫酸

肝組織中インドキシル硫酸

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-24 hr -1 hr 0 hr 24 hr 48 hr

腎虚血30分後再灌流 サンプリング（血清、臓器）

薬物投与 (p.o.)

▶血清中 IS 濃度 ▶腎機能指標 (SCr、BUN) ▶腎障害バイオマーカー kim-1尿中排泄 ▶核内 Nrf2 のタンパク質発現 ▶rOAT1 / rOAT3 のタンパク質発現

検査項目

③ + AST-120 (2.5 g/kg p.o.) 群 ② 虚血再灌流 (IR) 群 ① 対照 (sham) 群

④ + Resveratrol (5 mg/kg p.o.) 群 ⑤ + Quercetin (50 mg/kg p.o.) 群

使用動物：6 週齢 SD 系雄性ラット

⑥ + Sulforaphane (5 mg/kg p.o.) 群

虚血再灌流急性腎障害に及ぼすポリフェノール系化合物の影響

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虚血性急性腎障害ラットにおける血清中インドール並びに腎機能指標に及ぼすAST-120、ポリフェノール、スルフォラファンの影響

虚血性急性腎障害ラットにおける尿中Kim-1排泄に及ぼす薬物投与の影響

(hr)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Urin

e Ki

m-1

(ng

/mg

UCr)

## ##

#

##

0

50

100

150

200

250

300

350(mg/dl)

** (µM)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

**

##

## #

#

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0(mg/dl)

**

## ##

#

血清クレアチニン BUN 血清中インドキシル硫酸

#

尿中Kim-1排泄量 IR + Quercetin

IR

IR + AST-120 IR + Sulforaphane IR + Resveratrol

Control

15

57 KDa

Nrf2

rOAT1 77 KDa

72 KDa

Keap1

Cal3 Ub

Ub Ub Nrf2分解

ROS

Nrf2

Nrf2

ARE/EpRE

Maf Nrf2 NQO1 HO-1 GST MRPs GLC CYPs etc

核

OATs

抗酸化ストレス因子 & 解毒因子

MG132

UTox OSO3H

UTox OSO3H

腎尿細管細胞

Proteasome +

Sulforaphane

Nrf2

小胞体ストレス 炎症性ストレス

+

BARDO

+

尿細管上皮細胞

ABCC2

OAT4 OAT3

OAT1

尿中排泄

腎臓 尿細管 rOAT3

酸化ストレス

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Apparent IC50 (μM) for hepatic IS production

A 1.34 E 7.01 J 1.54 D 24.5 I 2.72 F 24.8 B 3.91 H 36.8 C 6.86 G 84.5

ラット肝S9画分を用いたインドキシル硫酸産生阻害薬物のスクリーニング Esculetin

Esculetin logIS p

mol/

min

/m

g p

rote

in

-1 0 1 2

-5

0

5

10

15

meclofenamate

meclofenamate

IS p

mol/

min

/m

g p

rote

in

-2 -1 0 1 20

5

10

15

20

MIJ

MIJ

IS p

mol/

min

/m

g p

rote

in

-2 -1 0 1 20

5

10

15

20

myricetin

myricetin log

IS p

mol/

min

/m

g p

rote

in

-2 -1 0 1 20

5

10

15

20

catechin-(+,-)hydrate

catechin-(+,-)hydrate log

IS p

mol/

min

/m

g p

rote

in

0 1 2 30

5

10

15

Acacetin

Acacetin log

IS p

mol/

min

/m

g p

rote

in

0 1 2 30

5

10

15

Comp. A

17

Seru

m in

doxy

l sul

fate

con

c. (

μM)

hrs

(mg/dl)

(mg/dl) 血清クレアチニン

BUN

虚血性急性腎障害ラットの血清中インドキシル硫酸並びに腎機能指標に及ぼすCompound A静注投与の効果

30min

IR

6hr after IR

48hr after IR

10mg/kg Comp.A i.v. inj.

血清中インドキシル硫酸

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■インドキシル硫酸及びp-クレシル硫酸等の硫酸抱合型尿毒症物質の体内産生系（SULT）をターゲットとした“高尿毒素血症治療薬”については、これまでに報告・開発されていない。

■腎不全の治療剤としては、腸管内で尿毒症物質の前駆物質を吸着させる

ことで腎臓の負担を軽減し、腎不全の発症又は進行を抑制する経口吸着剤（クレメジン,AST-120）が用いられている。しかし、この治療薬は大量服用する必要があるために服薬コンプライアンスが不良である（とても飲みづらい）他、吸着特異性を有していないため、他の治療剤と併用する場合に相互作用の注意が必要など、臨床上の問題点、課題等がある。

■選択的に腸管内のインドール量を低減させるトリプトファナーゼ阻害作

用を成分とする治療剤（カプセル充填化ビフィズス菌）の有用性が報告されているが、未だ実用化には至っていない。

従来技術とその問題点、課題等

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■本技術により見出された薬物は、慢性腎臓病並びに薬剤性急性腎障害、虚血性腎障害に伴う低分子型尿毒症物質の体内蓄積と腎蓄積を抑える作用を有する。従来、ポリフェノール系薬物の薬理作用として抗酸化効果が着目され研究が進展してきたが、硫酸抱合型尿毒症物質の肝産生を抑える事実は見出されていなかった。 ■肝臓産生型の尿毒症物質は、腎不全患者における予後、心血管系合併症に密接に関連する”内因性有害因子”であることが臨床試験により実証されており、これら尿毒症物質を体内合成の段階で阻止する治療ストラテジーは現在報告がない。 ■本研究により見出された薬物をリード化合物、もしくはシーズとして周辺化合物・類縁薬物等の探索スクリーニングを系統的に展開することによって、より薬理効果の優れた安全性の高い尿毒症治療薬・心血管系合併症防御薬を新たに創製・開発し得る可能性が期待できる。 ■製薬企業との共同研究プロジェクト ・企業保有化合物ライブラリーを活用した尿毒症物質産生阻害作用を有する新規薬物のスクリーニング・探索等 ・本技術により見出された化合物をシーズとする合成研究、尿毒症物質産生阻害効果のスクリーニング（in vitro試験、in vivo動物実験）、モデル動物等による安全性試験等。

【技術概要のまとめと実用化に向けた今後の展開等】

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国内特許コード P120006602 整理番号 09037AB 掲載日 2012年2月6日 出願番号 特願2010-234185 公開番号 特開2011-107130 出願日 平成22年10月19日(2010.10.19) 公開日 平成23年6月2日(2011.6.2) 優先権データ 特願2009-240062 (2009.10.19) JP

発明者 齋藤 秀之、濵田哲暢

出願人 国立大学法人 熊本大学

発明の名称 インドキシル硫酸の産生の阻害剤のスクリーニング方法、インドキシル硫酸代謝産生阻害剤、及び腎障害軽減剤

発明の概要

【課題】代表的な尿毒症物質であるインドキシル硫酸(IS)の肝臓での代謝産生を阻害する物質を迅速に探索できるスクリーニング方法、インドキシル硫酸代謝産生阻害剤及び腎障害軽減剤を提供すること。 【解決手段】インドール及び被験物質を肝臓Ｓ９画分の存在下でインキュベートし、インドキシル硫酸の産生を阻害する被験物質を選択することを含む、インドキシル硫酸の産生の阻害剤のスクリーニング方法。該方法により得られたインドキシル硫酸の産生を阻害する物質を含む、インドキシル硫酸代謝産生阻害剤及び腎障害軽減剤。

本技術に関する知的財産権

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産学連携の経歴 • 2012年-2013年 JST・研究成果最適展開支援プログラムフィージビリティスタディ ステージ【FS】探索タイプ委託研究開発事業に採択 • 2013年-2014年 JST知財活用促進ハイウェイ「大学特許価値向上支援」事業に採択

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お問い合わせ先 熊本大学マーケティング推進部 研究コーディネーター 松本 泰彦 TEL 096 – 342 -3209 FAX 096 – 342 - 3239 E-mail y-matsumoto@jimu.kumamoto-u.ac.jp