ゲノム編集 2018 - Microsoft...3. Yoshimi K. et al., Nature Communications, 7: 10431, 2016 4....

フナコシニュースNews 6/12018

No.658

Cas9をタンパク質で導入guideRNACas9をmRNAで導入Cas9をプラスミドで導入Cas9をウイルスで導入Cas9安定発現細胞株ドナーベクターゲノム編集の確認受託サービスその他の遺伝子改変

p.4p.6p.8p.11p.15p.18p.19p.24p.26p.30

「ゲノム編集の最新技術概要」大阪大学真下先生

p.2

ゲノム編集2018Genome Editing

ゲノム編集の最新技術概要

真下知士准教授Tomoji Mashimo

大阪大学大学院医学系研究科附属共同研ゲノム編集センター／附属動物実験施設Genome Editing Research & Development Center/ Institute of Experimental Animal Sciences, Graduate School of Medicine, Osaka University

大阪大学　ゲノム編集センター（真下研）の皆様前列　中央が真下先生

ゲノム編集とは

新しいゲノム編集ツールが次々と登場！

2012 年，CRISPR-Cas9 が登場して以来，ゲノム編集の利用が広がっている。ガイド RNA（gRNA）を作成して Cas9タンパク質と一緒に細胞や受精卵に導入することで，簡単に遺伝子を改変できる。基礎研究だけでなく，農作物や畜産動物の品種改良にも利用されており，再生医療やゲノム編集治療などへの利用が広がっている。

近年，CRISPR-Cas9 に代わる新しいゲノム編集ツールが開発されている（図 1）。

● レンサ球菌由来 CRISPR-Cas9 は PAM と呼ばれる GG 配列を認識するが，新しいツール Cas12a（Cpf1）は AA 配列を認識してゲノム編集を行うことができる。

● ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）の特許権が来年 2019 年に切れることから，再び注目を集めている。● Cas9 の DNA 切断を不活化した dead Cas9（dCas9）は，DNA 配列に結合するが，切断しない。この dCas9 に転写

活性化因子を結合した CRISPRa（activation），抑制因子を結合した CRISPRi（interference）により，遺伝子の発現を調節できる。また，DNA（脱）メチル化酵素を結合した‘エピゲノム編集’も行われている。

● ‘Base Editor’は dCas9 に塩基置換酵素を結合して，DNA を切断せずに一塩基変異（SNP）の編集ができる。DNAを切らないためオフターゲット効果も削減でき，ゲノム編集治療への応用が期待されている。

DNA ではなく RNA を認識して，RNA を切断する CRISPR も登場している。CRISPR-Cas13a（C2c2）は，遺伝子のメッセンジャー RNA を分解することで，ゲノム編集治療に利用できる。また，微量なウイルスの検出や分解にも利用できる。さらに，dCas13 に RNA 置換酵素を結合させた RNA編集も可能になっている（文献 1）。

図1　さまざまなゲノム編集ツールとその利用目的

フナコシニュース2018年 6月 1日号（No.658）funakoshi news

コラム「ゲノム編集の最新技術概要」

本誌に掲載されている製品はすべて研究用です

2

コンディショナルノックアウトも可能！

ゲノム編集治療に向けて

CRISPR-Cas9 の登場により，ES 細胞を使わなくても遺伝子改変マウスが簡単に作れるようになった。我々は，マイクロインジェクション法の代わりにエレクトロポレーション法を利用することにより，一度にたくさんの受精卵に CRISPR を導入する‘超簡単ゲノム編集’を開発した（文献 2）。また，株式会社バイオダイナミクス研究所と共同して，ニッキング酵素を利用した‘長鎖一本鎖 DNA（lssDNA）’作製法を開発した（文献 3，p.22～23）。さらに，CRISPR-Cas9，lssDNA，エレクトロポレーション法を同時に利用することで，効率的にコンディショナルマウスを作出できる CLICK 法を開発した（文献 4）。CRISPR-Cas9 を使うことで，コンディショナルマウスやラットが簡単に作製できるようになった（図 2）。

ゲノム編集を使ったヒト遺伝子治療の開発競争が繰り広げられている。初めてのゲノム編集治療は，ZFN を用いた米国エイズ患者の T 細胞における HIV レセプターのノックアウトである。イギリスでは，急性リンパ性白血病の小児に TALEN により CAR-T 療法が実施された。これらは，免疫細胞を体外に取り出す ex vivo 治療にあたる。米国では，ムコ多糖症患者の体内に直接 ZFN を投与する in vivo ゲノム編集も実施されている。日本でもモデル動物を使った治療法開発が進められているが，基本特許が欧米に抑えられているため，多くの企業は開発競争に後れを取っている。日本初の新しいゲノム編集技術の開発が，待たれている。

CLICK：CRISPR with lssDNA inducing conditional knockout alleles

図2エレクトロポレーション法により，マウス受精卵に CRISPR-Cas9， guideRNA，長鎖一本鎖 DNA（lssDNA）を導入することで， loxP 配列を 2 箇所同時にノックインできる。コンディショナルマウスを F0 世代で作製することも可能である。

特許申請ゲノム編集方法出願人：大阪大学（真下知士，宮坂佳樹）出願日：平成 28 年 11 月 28 日出願番号：2016-229976

文献1. �Cox D. et al., Science, 358 （6366）: 1019～27, 20172. �Kaneko T. et al., Scientific Reports, 4: 6382, 20143. �Yoshimi K. et al., Nature Communications, 7: 10431, 20164. �Miyasaka Y. et al., BMC Genomics, 19 （1）: 318, 2018

日本ゲノム編集学会第3回大会会場にお越しの際は

フナコシ展示ブースに是非お立ち寄り下さい！会期：2018 年 6 月 18 日（月）～6 月 20 日（水）

会場：広島国際会議場・出展期間：2018 年 6 月 19 日（火）～20 日（水）・ブース番号：21


コラム「ゲノム編集の最新技術概要」


3

CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集には，Cas9 タンパク質と guideRNA の細胞への導入が必要です。ゲノム編集を成功させるためにはこれらを細胞内のターゲットへ確実に届けることが重要です。つまり，トランスフェクションは鍵となるステップといえます。ゲノム編集に適した試薬を選ぶことが重要です。

連載企画

FRONTIERS Vol.31The Delivery Experts

フロンティアーズ

www.polyplus-transfection.com

Polyplus-Transfection 社はフランスに本拠を置く，トランスフェクション試薬のメーカーです。核酸導入分野で 20 年以上にわたり培ってきたノウハウに基づき，様々な導入物質／導入対象に対応する製品ラインナップを揃えています。2002 年には ISO 9001 を取得しており，一部の製品は世界中で臨床試験にも使用されています。今回は同社の Genome Editing Project Leader である Valérie Toussaint 氏に，同社の新製品 jetCRISPR についてお話を伺いました。

トランスフェクションはゲノム編集成功の鍵

哺乳動物細胞の場合，Cas9 タンパク質と guideRNA の導入には 3 種類のアプローチがあり，私たちは各手法に適した製品を取りそろえています。（右図）

①DNA：Cas9 タンパク質，guideRNAをコードしたプラスミドの導入 jetPRIME（p.11）

②RNA：Cas9 をコードしたmRNAと guideRNAの導入 jetMESSENGER（p.10）

③RNP（リボ核タンパク質）：精製 Cas9 タンパク質とguideRNAの複合体の導入 jetCRISPR（p.5）

研究室で広く用いられているのは Cas9 と guideRNA をプラスミド DNA で導入する手法①ですが，トランスフェクションが困難な初代細胞やがん細胞には不向きです。

私たちが新たに開発したトランスフェクション試薬 jetCRISPR は，RNP トランスフェクション（Cas9 タンパク質とguideRNA の同時導入）のための製品です。より高いゲノム編集効率を実現するため，私たちはguideRNA と Cas9 タンパク質の濃度や存在比率，Cas9 タンパク質配列についても検証・最適化を行いました（例：右図）。jetCRISPR との併用によりベストなゲノム編集効率が得られる SpCas9 Nuclease も開発，販売しています。これら 2 製品を組み合わせて使用することで，他社製品よりも高いゲノム編集効率を実現できます。

近年，ゲノム編集研究のトレンドは，Cas9 タンパク質を guideRNA と同時に導入する手法③にシフトしてきました。タンパク質での導入は，オフターゲットの低減など多くのメリットがあるアプローチです。

メリットが多い，RNPを直接導入するゲノム編集

ゲノム編集に最適化されたトランスフェクション試薬 jetCRISPR

短時間で効率よく編集できる転写・翻訳が不要，活性Cas9-guideRNA複合体が細胞に直接送達される

オフターゲットが最小限に抑えられるトランスフェクション後，迅速に分解される（Cas9 クリアランスが速い）

困難な細胞にも簡単に導入可能guideRNAスクリーニングが簡単細胞生存率が高い

Cas9/guideRNA複合体の導入guideRNA：Cas9＝1:1 の条件で，トランスフェクションが成功しゲノム編集による変異導入が生じた細胞の割合（ゲノム編集効率，INDEL％）を数値化した。

INDEL ％

706050403020100

jetCRISPR 0.3μl/well（96ウェルプレート）

RNP 10 nM RNP 30 nMRNP 5 nM

HeLa 細胞

jetCRISPR の詳細は p.5 をご覧下さい！



4

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他

お問い合わせ先：〈試薬〉TEL：03-5684-1620 　 FAX：03-5684-1775 　：[email protected]

65129

Web ページ番号検索

Cas9 導入

Cas9タンパク質とguideRNAの導入専用トランスフェクション試薬jetCRISPR

jetCRISPR と PolyPlus 社で最適化された SpCas9 を併用することで，ゲノム編集効率が上昇します。

■他社トランスフェクション試薬との比較 ■他社 Cas9 タンパク質との比較

※縦軸（INDEL％）：ゲノム編集を行った細胞由来のゲノム DNA から編集部位について PCR を行い，T7 endonuclease 処理後のバンドパターンから，ゲノム編集に成功した細胞の割合（ゲノム編集効率）を算出した。

INDEL ％

60

50

40

30

20

10

0PolyPlus 社 SpCas9 他社製品A 他社製品B 他社製品C

HEK─293 細胞

■高い細胞生存率 ■迅速で確実なゲノム編集

jetCRISPR を用いたトランスフェクション 48 時間後の細胞形態観察 jetCRISPR を用いたゲノム編集効率

導入後も細胞の生存率と形状を維持します。

特　長

HEK-293 細胞

A549細胞

未処理細胞 RNP30 nM

● 接着細胞，浮遊細胞問わず，様々な細胞で使用できます。● 血清や抗生物質の存在下でも使用できます。● 通常のトランスフェクション法に加え，Reverse Transfection 法で迅速な導入を行うことも可能です。● 使用回数：1.5 ml 当たり最大 1,250 回分（24 ウェルプレートの場合）／300 回分（6 ウェルプレートの場合）品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）jetCRISPR, RNP Transfection Reagent

PPU502010 PPU 502-01 0.1 ml / 11,000PPU502070 PPU 502-07 0.75 ml / 65,000PPU502150 PPU 502-15 1.5 ml / 105,000

SpCas9 NucleasePPU722100 PPU 722-100 100 μg / 39,000

配列：NLS-SpCas9-NLS，濃度：Solution at 10 µg/µl，分子量：162 kDa

マークの製品は，無償サンプルのご用意があります。ご希望の方は当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。

無償サンプル品あります！

INDEL ％

70

60

50

40

30

20

10

024h 48h 72h

HEK─293 細胞

期間：～2018 年 7 月 31 日キャンペーン期間限定で，

トランスフェクション試薬 jetCRISPR（0.75 ml）と SpCas9 Nuclease（100 μg）のお得なセットを

販売いたします。

［メーカー：PPU］

セット品商品コード（キャンペーン期間限定）包　装キャンペーン価格

502-07+722-100 1 set ￥65,000 PPU502722

バンドルキャンペーン！

INDEL ％

70

60

50

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30

20

10

0

jetCRISPR（0.3μl）同量の他社トランスフェクション試薬

A549細胞 HEK293 細胞

フナコシニュース 2018 年 6 月 1 日号（No.658）funakoshi news

タンパク質で導入


5

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


65681


guideRNA 受　託

ゲノム編集効率に優れた sgRNA を簡単に作製CRISPRevolution sgRNA 合成受託サービス

SpCas9 用に最適化された guideRNA 合成受託サービスです。標的配列（17～23 塩基）をご指定いただくだけで，最大 90％の高いゲノム編集効率を持つ一本鎖 guideRNA（sgRNA）を合成しお届けします。

ココがすごい！CRISPR/Cas9 を用いてゲノム編集を行う際に，guideRNA を直接トランスフェクション／インジェクションする方法があります。guideRNA はin vitro transcription（IVT）でプラスミドから調製できますが，キットが高価な上に作業の手間がかかります。Synthego 社の CRISPRevolution sgRNA は，手間がかからず安定した高い編集効率を持つ完全合成の guideRNA です。プラスミド配列のデザイン・コンストラクト作製・シークエンス・プラスミド精製の操作／試薬は不要です。

CRISPRevolution sgRNA プラスミド in vitro Transcription（IVT）

guideRNA の作製方法

標的配列を選択し，sgRNA を注文する。納品後すぐに使用可能！

guideRNA 発現プラスミドを設計する。プラスミドのスクリーニング・シークエンス・精製など導入用プラスミドの作製に1～2 週間必要。

プライマーを設計して guideRNA 配列をPCR で増幅する。guideRNA の IVT を行い，精製するなど導入用 guideRNA の作製に 1～3 日必要。

編集効率最大 90％中～高様々

品　質非常に高い様々低い（不純物があり，不一致もみられる）

初代細胞および幹細胞への効率非常に良い悪い悪い

オフターゲット効果非常に低い様々（ゲノム内へ DNA 混入の可能性あり）様々（IVT 用酵素のエラーの可能性あり）

crRNA, tracrRNA のアニーリングが不要で高効率かつ短時間での操作が可能

RNP 複合体を作ることで in vivo でも安定

guideRNA 配列中の 80 mer の Synthego scaffoldは SpCas9 用に最適化済み

100％ DNA フリーのため外来 DNA の挿入を防止

製品到着後すぐにトランスフェクション可能

Web 上でオフターゲットが最小限の guideRNA を簡単にデザイン可能（p.7 参照）

使用例

sgRNA-3IVT-3

sgRNA-2IVT-2

sgRNA-1IVT-1

1009080706050403020100

HEK293T 細胞における sgRNA の編集効率と一貫性の比較3 種類の異なるターゲット遺伝子に対して，本製品と IVT でゲノム編集を行った。どの遺伝子においても IVT で作製した guideRNA に比べ，本製品は高効率かつ安定した挿入または欠失（Indel）を確認できた。

1 kb ladderDNA＋C

as9 （control）

DNA＋Cas9＋gu

ideRNA

(2686 bp) linearized pUC19

(1636 bp)linearized pUC19 cut with Cas9(1050 bp)

sgRNA を用いたプラスミド切断実験直線状プラスミドを CRISPRevolution sgRNA で切断した。標的 DNA は 95.8％の効率で切断された。

CRISPRevolution sgRNA in vitro Transcription （IVT）

RNA 純度の比較合成 AAVS1 遺伝子 100 nt に対する guideRNA について，質量分析（MS）を行った。

（左）：CRISPRevolution sgRNA全長配列による単一のピークが見られる。

（右）：IVT-derived guide RNA複数のピークが見られる。不純物はオフターゲットの原因となる。

安定かつ高い編集効率を持つ


ガイドＲＮＡ合成


6

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他

お問い合わせ先：〈受託〉TEL：03-5684-1645　：[email protected]お問い合わせ先：〈試薬〉TEL：03-5684-1620　：[email protected]

●ChemicallyModified sgRNA は，初代細胞や幹細胞，K562 細胞やがん細胞株，造血幹細胞由来細胞といったゲノム編集が難しい細胞にも高効率に安定した塩基の挿入／欠損（Indelformation）を起こすことができます。●guideRNA の 5’ と 3’ 末端 RNA 残基に 2’-O-methylana-logs と 3’phospho-rothioateinter-nucleotide を結合しており，細胞内での RNA 分解を抑制しています。

●Synthego 社の sgRNA は完全合成されているため，IVT で作製した sgRNAとは違い 100％ DNA-free です。これにより，高い効率でノックアウト／ノックイン動物モデルの作製が可能となりました。

●同一の guideRNA 配列であっても，Synthego 社 sgRNAではエクソン切断効率が 2 倍異なることが報告されています。また，ノックイン効率もIVTに比べ3倍も上昇しました。

■Chemically Modified sgRNA の使用例

関連製品：Chemically Modified sgRNA

Un-edited （Unstained）

Un-edited （Stained）

他社2-piece modified crRNA: tracrRNA

Synthego 社 chemically modified sgRNA

91.0％

CD3（TCR）のノックアウトCD3 タンパク質の発現抑制を目的として，TCRα 遺伝子をターゲットとした guideRNA とCas9 タンパク質を CD34＋ヒト造血幹細胞にエレクトロポレーションで導入した。トランスフェクションを行ってから 7 日後にノックアウト効率をフローサイトメトリーで測定した。

ご注文方法／価格

sgRNAの標的配列（17～23mer）をご指定下さい。Synthego社のサイト「KnockoutGuideDesigner」（右記参照）より，簡単にデザインできます。例．5’-AAUUUCACAGCUGCACAUA＋SynthegoScaffold-3’※フナコシWeb にある専用注文書に必要事項をご記入の上，電子メールに添付して当社受託・特注品担当までお送り下さい。

品　　名メーカー商品コード包装 / 価格（￥）

sgRNA KitSGO000101 SGO SGO-0001 1kit/ 59,000SGO000111 SGO SGO-0001-CM Chemically Modified＊ 1kit/ 89,000

＊初代培養細胞や iPS/ES 細胞などの幹細胞において高い編集効率が得られる。

キット内容●CRISPRevolutionsgRNA（3nmol）●TEbuffer●Nuclease-freewater※オプション品（単品購入不可，詳細はお問い合わせ下さい）Cas9Protein，Annealingbuffer，Tris-EDTAbuffer

ゲノム編集が困難な初代細胞や幹細胞などにはChemically Modified sgRNA がおすすめ

高効率にトランスジェニックマウスの作製が可能

KnockoutGuideDesignerSynthego 社ウェブサイト上で遺伝子ノックアウト用配列を簡単にデザインできます。design.synthego.com

Exon Deletion Rate

CommercialIVT sgRNA

IVT sgRNASynthegoModified sgRNA

Synthego sgRNA

Average Success Knock─in

45％

85％

11％

33％


ガイドＲＮＡ合成


7

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


65671


64376


guideRNA

sgRNA 特異性・切断活性評価キットGenCrispr sgRNA Screening Kit

Cas9 導入

Cas9 または Cre リコンビナーゼの高発現用 mRNA

Genome Editing mRNAゲノム上の標的配列に Cas9 ヌクレアーゼを効率良くリクルートでき，かつ切断効率の高い sgRNA を，簡単迅速にスクリーニングできるキットです。

Memosingle guideRNA（sgRNA）スクリーニングCRISPR/Cas9 システムでゲノム編集を行うとき，Cas9 ヌクレアーゼを標的に正しく導く sgRNA の設計が重要です。しかし，標的に関する全ての情報から sgRNA を設計したとしても，そこからベストな特異性と切断効率が得られるとは限りません。このため，あらかじめ配列の異なる複数の sgRNAを設計し，特異性・切断活性がベストとなる sgRNAを選択することが重要です。

●細胞での実験を行う前に，invitro で sgRNA 機能の有効性を確認することができます。

●キット中にはポジティブコントロールの sgRNAと基質DNAが含まれています。

※本キットで得られたinvitro での切断効率が，invivo での活性と一致しないことがあります。

●GenCrisprCas9nuclease●バッファー●ポジティブコントロール sgRNA●ポジティブコントロール基質●RNase-freeWater

1.DNA基質の調製CRISPR/Cas9 の標的となる配列領域を増幅する。

2.Cas9 による切断反応

3.反応物の分析1％アガロースゲル電気泳動で分析する。

特　長

キット内容

操作方法概略


GenCrispr sgRNA Screening KitGSC689030 GSC L00689-30 1kit/ 36,000GSC689100 GSC L00689-100 1kit/ 86,000

Cas9 または Cre リコンビナーゼの mRNA の 3’ 末端にpoly（A）tail を有する，安定性の高い非免疫原性の修飾 mRNA です。それぞれ野生型 Cas9 または核局在化配列融合 Cre リコンビナーゼを高発現します。

特　長●Cas9 発現用mRNAは guideRNA と混合し，トランスフェクション試薬とインキュベートした後，細胞へ添加して導入します。

●細胞質内で直接タンパク質を発現するため，核への取り込みは不要です。

●非分裂細胞に用いることができます。●プロモーター非依存的にタンパク質を発現します。


CRISPR-Cas9 Encoding mRNAOZB MRNA31-20 20μg/ 42,000 OZB273100OZB MRNA31-100 100μg/ 105,000 OZB273110

Cre Recombinase Encoding mRNAOZB MRNA32-20 20μg/ 42,000 OZB273200OZB MRNA32-100 100μg/ 105,000 OZB273210


RmesFect CRISPROZB RMC70500 500μl/ 45,000 OZB170500

From mRNA to Protein

核への取り込みなし

ゲノムへの組み込みなし

トランスフェクションしにくい細胞に最適

タンパク質

核

エンドサイトーシス

エンドソーム

複合体形成翻訳

mRNA

mRNAのリリース

MemoCre リコンビナーゼとはバクテリオファージ P1由来の TypeⅠトポイソメラーゼで，loxP 部位間の DNA の組換えを触媒します。組換え産物は loxP 部位の場所と相対配向に依存します。●2 つの loxP 部位間のDNAの切除●loxP 部位を含むDNA分子の融合●loxP 部位間のDNAの反転

各製品の詳細は，フナコシWebのタブからかんたんに検索できます！

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関連製品

Cas9 発現mRNAや guideRNA 用のトランスフェクション試薬です。RmesFectCRISPR と混合した RNA は分解から保護され，効率良く細胞に導入されます。


ＲＮＡで導入


8

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


8121


Cas9 導入 guideRNA

野生型／変異型 Cas9 発現 mRNA と guideRNA 作製キットTransfection-ready Cas9 SmartNuclease mRNA & gRNA Vector Kit野生型 Cas9 またはニッカーゼ型 Cas9（D10A）と guideRNA を，RNA の状態で細胞などのホストに導入するシステムです。挿入・欠失により遺伝子をノックアウトしたい場合に有用です。

特　長�

［メーカー：SBI］

用　途 Cas9 タ　グ商品コード包　装価格（￥）

SBI998540

真核生物用

野生型（hspCas9�wt）

なし CAS500A-1 20�μg 67,000

SBI135301 GFP CAS530G-1 10�μg 59,000

SBI135311 RFP CAS531R-1 10�μg 59,000

SBI998536変異型

（hspCas9，D10A，Nickase）

なし CAS504A-1 20�μg 67,000

SBI135341 GFP CAS534G-1 10�μg 59,000

SBI135351 RFP CAS535R-1 10�μg 59,000

SBI998539 原核生物用 hspCas9 なし CAS502A-1 20�μg 67,000

■ポジティブコントロール用 mRNA

■コントロール用 gRNA


mRNAExpress Positive Control mRNA, Transfection-readySBI999162 SBI MR700A-2 GFP 2×10�μg�/ 55,000SBI998769 SBI MR800A-2 RFP 2×10�μg�/ 55,000

■gRNA 作製キット●�任意の guideRNA（crRNA-tracrRNA キメラ転写産物）を組み込んだ T7�gRNA�Cloning�Vector により，PCR用またはin�vitro 転写用のテンプレートとして，高効率にguideRNAを作製できます。


Cas9 SmartNuclease AAVS1 gRNA, Transfection-readySBI998534 SBI CAS520A-1 10�μg�/ 49,000

AAVS1 に対する gRNA。


Linearized T7 gRNA SmartNuclease Vector KitSBI998542 SBI CAS510A-1 1�kit�/ 112,000

gRNAクローニングベクター作製キット。

T7 gRNA SmartNuclease Synthesis KitSBI998541 SBI CAS510A-KIT 1�kit�/ 131,000

gRNAクローニングベクター作製キット（#CAS510A-1）に in�vitro 転写を行うための試薬が付属したキット。

Cas9 Protein and T7 gRNA SmartNuclease Synthesis KitSBI998300 SBI CAS400A-KIT 1�kit�/ 183,000

gRNA クローニングベクター作製キット（#CAS510A-1）に組換え Cas9 タンパク質（#CAS400A-1）が付属したキット。

製品ラインナップ�

●�gRNA 作製キットで作製した guideRNA と Cas9�SmartNuclease�mRNA を細胞へ同時にトランスフェクションして，ゲノム編集を行います。

●�RNA の状態で細胞にトランスフェクションするため，免疫原性が低く，タンパク質発現までの時間が短く，速やかにゲノム編集が行われます。ES細胞にも適しています。

●�トランスフェクション効率のチェックに有用なGFP�/�RFP タグ付きCas9�mRNAもあります。

※受注発注品

使用例�

■Transfection-ready Cas9 SmartNuclease mRNA

hspCas9 mRNA+AAVS gRNA (T7)+ Donor

EF1-hCas9-H1-AAVS gRNA vector+ Donor

GFP Fluorescence Bright Field Phase

上図：�Cas9�mRNA と AAVS1 に対する guide�RNA と GFP を組み込むためのドナーベクターを細胞に導入した。

下図：�Cas9 および AAVS1 に対する guide�RNA を発現する All-in-one ベクターと，GFPを組み込むためのドナーベクターを，細胞に導入した。mRNAの直接導入によりAll-in-one ベクター使用時と同等の組換えが生じた。

相同組換えによるノックアウト／ノックインには，別途HRドナーベクターが必要です。詳細はp.20～21をご覧下さい。

※野生型／変異型Cas9 については，p.13 をご覧下さい。

T7 Promoter

AAVS1 gRNA

gRNA ScaffoldKanR Cas9 SmartNucleaseAAVS1 gRNA#CAS520A-1

pUC Ori

T7 Promoter

gRNA Cloning site

gRNA Scaffold

pUC Ori

KanR T7 gRNA Cloningand Production Vector

#CAS510A-1


ＲＮＡで導入


9

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


65373


神経細胞，幹細胞，免疫細胞，線維芽細胞など，特にトランスフェクションが困難な細胞にも高い効率でmRNAを導入可能です。CRISPR/Cas9 によるゲノム編集，iPS 細胞の作製，幹細胞分化および免疫療法研究に最適です。

Cas9 導入

mRNA専用のトランスフェクション試薬jetMESSENGER

mRNA を用いることで，DNA に比べてトランスフェクション効率が向上します。ゲノムに組み込まれるリスクはありません。

使用例�

本製品または他社製品を用いて，各細胞に eGFP�mRNAをトランスフェクションし，48時間後に明視野および蛍光顕微鏡により解析した。

eGFP�mRNA または eGFP 発現プラスミドをトランスフェクションし，24 時間後にフローサイトメトリーにより導入効率を評価した。

本製品（eGFP mRNA）

初代ラット皮質ニューロン

ヒトHepG2細胞

マウス幹細胞

他社製品（L2K/eGFP プラスミドDNA）

■ jetMESSENGER / mRNA■他社製品／プラスミドDNA

各種細胞へのトランスフェクション効率�

分類細胞名トランスフェクション効率

脳細胞U-87MG ＞90％

Cortex�neurons 40～60％

上皮細胞Caco-2 ＞90％

MCF-7 ＞90％

線維芽細胞

MDCK 40～60％

BJ ＞90％

Primary�fibroblasts 70～90％

IMR-90 ＞90％

CPRE2 ＞90％

MEF 60～80％

肝細胞 Hep�G2 ＞90％

リンパ球Jurkat 40～60％

K562 40～60％

マクロファージ Macrophages 50～70％

単球Primary�monocytes 10～30％

THP-1 80～90％

幹細胞hMSC ＞90％

mES 50～70％

eGFP�mRNAをさまざまな細胞にトランスフェクションし，24時間後にフローサイトメトリーにより導入効率を評価した。

■ jetMESSENGER／mRNA　　■他社製品／mRNA

操作方法概略�

品名メーカー商品コード包装 / 価格（￥）

jetMESSENGERPPU 150-01 0.1 ml 1�kit�/ 16,000 PPU150010PPU 150-07 0.75 ml 1�kit�/ 88,000 PPU150070PPU 150-15 1.5 ml 1�kit�/ 148,000 PPU150150

�マークの製品は，小容量の無償サンプルをご用意しています。

ご希望の方は当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。



ＲＮＡで導入


10

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他

お問い合わせ先：〈試薬〉TEL：03-5684-1620 FAX：03-5684-1775 ：[email protected]

4799


ポリマーを用いた，非リポソーム型の DNA / siRNA 用トランスフェクション試薬です。幹細胞をはじめ，HeLa，HEK293，CHO 細胞などの接着細胞に，高い効率で導入できます。

Cas9 導入

Cas9 プラスミド導入に使用実績がありますjetPRIME Kit

●導入操作が非常に簡便です。また，導入後の培地交換は不要です。

●本試薬 1.5ml で DNAを導入する場合，24ウェルプレートの細胞では 1,500 回，6 ウェルプレートの細胞では 375 回導入できます。

●DNAと siRNAの co-transfection にも使用できます。●抗生物質や血清存在下でも使用できます。●ウイルスの作製にも使用できます。

導入実績のある細胞

使用例

jetPRIME を用いてHeLa 細胞に guideRNAと Cas9 を共発現するプラスミドを導入し，DNA複製に関わる遺伝子（PCNAまたは CDC45）をノックアウトした。マーカー選択後，培養 7日目の細胞形態を観察したところ，細胞が平たくなり，核のサイズが大きくなっていた。遺伝子ノックアウトが生じたためと考えられる。

操作方法概略

特　長

細胞の種類細胞株細胞の種類細胞株

上皮細胞

B16-F10

線維芽細胞

COS-7

BNLCl2 HEK293＊

CaCO2 MRC-5

CHO-K1＊ NIH-3T3

HCT-116 骨髄細胞 Raw264.7

HeLa＊筋芽細胞 C2C12

HepG2 神経細胞 SH-SY5Y

Huh-7初代細胞

肝細胞

MCF-7 メラノサイト

MCF-10A

MDCK

PC-3

Vero

＊HeLa，HEK293，CHO 細胞に使用した場合，70～90％の効率で導入できます。

1.DNA/siRNAを jetPRIMEbuffer で希釈する

2.jetPRIMEreagent を加える

3.10 秒間ボルテックスした後，室温で 10 分間インキュベートする

4.3.の混合液をプレートに加える

5.24～72時間インキュベートする

ゲノム編集での使用実績

Empty Vector

細胞毒性が低い

jetPRIME または他社製品を用いてHeLa 細胞にトランスフェクションを行い，24 時間後に位相差顕微鏡で細胞を観察した。

jetPRIME 他社製品他社製品


jetPRIME Kit PPU 114-01 0.1 ml 1kit/ 13,000 PPU114010PPU 114-07 0.75 ml 1kit/ 60,000 PPU114070PPU 114-15 1.5 ml 1kit/ 95,000 PPU114150

マークの製品は，小容量の無償サンプルをご用意しています。

ご希望の方は当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。


導入効率が高い

本製品または他社製品を用いて，24ウェルプレートで培養した各種細胞株に 1ウェル当たり 0.5μg のプラスミドベクターを導入し，フローサイトメーターにより導入効率を測定した。

■ jetPRIME　　■他社製品

1.2.

3.

4.

5.


プラスミドで導入


11

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


26712



目的遺伝子に対する guideRNA が組み込み済み！Gene Knockout Kit via CRISPR / Cas9

構築済みの Cas9 / guideRNA 発現ベクターと相同組換え用のドナーベクターのセットです。19,000 種類以上の標的遺伝子に対するキットを取りそろえています。マーカー遺伝子によるノックアウト細胞のスクリーニングに有用です。

特　長�

包装／価格�

キット内容�●�CRISPR によりORFの 5’ 末端周辺を切断します。●�異なる配列の guideRNA がクローニングされたベクターが2種類含まれ，確実に目的遺伝子をノックアウトできます。

●�GFP と Puro によってセレクションできます。

1�kit／￥364,000※受注発注品

［メーカー：ORI］

●�目的遺伝子に対する guideRNA と Cas9 を 1 つのベクターで発現するpCas-Guide ベクター 2種類（#KN2xxxxxG1，#KN2xxxxxG2）●�ホモロジーアームが組み込まれたGFP-puro ドナーベクター（#KN2xxxxxD）●�ネガティブスクランブルコントロールベクター（#GE100003）


Target seq cloned in pCas-Guide Predesigned donor template DNA

or one of your own

ChromosomeHomologous Repair

Edited Chromosome

LHAGFP Puro

GFP Puro

PGK

RHALoxp Loxp

PGK

Loxp Loxp

ターゲット配列がクローニング済みの pCas-Guide ベクターとHomologous�Arms と Functional�Cassette を含むドナーテンプレートDNAをコトランスフェクション

CRISPR/Cas9 によりターゲット遺伝子がノックアウトされ，GFP（外来プロモーター連結）とピューロマイシン（PGK プロモーター連結）がノックインされる。細胞を～20日間継代・希釈培養し，選択を行う。

使用例�

ATG5–human�gene�knockout�kit�via�CRISPR（#KN210563）を用いてバリデーションを行った。

製品の検索方法／ご注文方法�

選抜前の細胞からゲノム DNA を抽出し，ATG5配列からGFP配列を増幅するプライマーを用いて PCRを行った。 GFP-puro�Cassette の導入により，ATG5がノックアウトされGFPがノックインしたこ

とが分かる。

②�ご注文の際には，上記ラインナップ検索で表示される品名，メーカー（ORI），商品コード，包装（1�kit），数量をお知らせ下さい。

①フナコシWebのWebページ番号検索に【26712】を入力

26712




12

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


46070


線状化されているため，ライゲーションが容易なAll-in-one ベクターです。

Cas9 導入

guideRNA と Cas9 を 1 つのベクターで発現できますPrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectors

特　長�●�guideRNA および Cas9 タンパク質は 1 つの CRISPR ベクターから発現できるため，細胞への導入が必要となるCRISPRベクターは 1種類のみです。

●�変異型 Cas9（D10A）はニッカーゼとして機能し，オフターゲット効果を低減した相同組換えによるゲノム編集が行えます。

●�トランスフェクション効率のチェック用に GFP/RFP 配列が挿入されているベクター（Tagged�Vector）もあります。



Cas9 プロモータータ　グ商品コード包　装価格（￥）

EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA

野生型（hspCas9�wt）

EF1

なし CAS700A-1

1�kit

131,000 SBI137001

EF1-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS700G-1 136,000 SBI137000

EF1-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS701R-1 136,000 SBI137010

CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA

CAG

なし CAS720A-1 131,000 SBI137201

CAG-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS720G-1 136,000 SBI137200

CAG-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS721R-1 136,000 SBI137210

CMV-T7-hspCas9-H1-gRNA

CMV

なし CAS740A-1 131,000 SBI137401

CMV-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS740G-1 136,000 SBI137400

CMV-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS741R-1 136,000 SBI137410

■Cas9 Double Mutant: gRNA Linearized SmartNuclease Vector Kit（10 reactions）

Null�Nuclease（D10A/H840A の 2重変異体）を発現するベクターです。ヌクレアーゼ活性および�ニッカーゼ活性が完全に失われていますが，標的配列への結合能を有し，オフターゲット効果の少ない転写リプレッサーとして機能すると考えられています。



EF1-hspCas9-DM-H1-gRNA 変異型（Null�Nuclease） EF1 なし CAS805A-1 1�kit 131,000 SBI998537



EF1-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA

変異型（hspCas9，D10A，

Nickase）

EF1

なし CAS750A-1

1�kit

131,000 SBI137501

EF1-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS750G-1 136,000 SBI137500

EF1-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS751R-1 136,000 SBI137510

CAG-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA

CAG

なし CAS770A-1 131,000 SBI137701

CAG-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS770G-1 136,000 SBI137700

CAG-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS771R-1 136,000 SBI137710

CMV-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA

CMV

なし CAS790A-1 131,000 SBI137901

CMV-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA GFP CAS790G-1 136,000 SBI137900

CMV-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS791R-1 136,000 SBI137910

Memo変異型Cas9（D10A）とはCas9 タンパク質のD10A アミノ酸変異により，ヌクレアーゼ活性が不活性化し，ニッカーゼ活性を持つようになります。Cas9（D10A）は，野生型Cas9のようにDNA二本鎖を切断せず，一本鎖のみを切断しニックを入れます。そのため，二本鎖切断による DNA 修復機構 NHEJ（非相同末端結合）が起こらず，標的領域以外での遺伝子欠失・挿入やオフターゲット効果を抑制できます。また，ペアのニックにより，細胞株におけるオフターゲット効果を 50～1,500 倍まで減少した例もあります。

5’ CCN

GGN3’ 5’3’

3’

3’

gRNA 1

gRNA 2

Cas9(D10A)NickaseCas9(D10A)Nickase

TAGCCGTAACGAATGGCAAT -5’

TAGCCGTAACGAATGGCAAT

ATCGGCATTGCTTACCGTTA CGTAAGCTTACGCGATGCAC

Targeting site

NGG

NCCGCATTCGAATGCGCTACGTG

5’-CGTAAGCTTACGCGATGCAC

標的部位のアンチセンス鎖に対する gRNA�1 とセンス鎖に対する gRNA�2 を作製し，Cas9（D10A）を用いてペアでニックを入れ，ゲノム編集の効率を向上させる。

■PrecisionX T7 Cas9 gRNA Linearized SmartNuclease Vector（10 reactions）

■Cas9 Nickase: gRNA Linearized SmartNickase Vector（10 reactions）

相同組換えによるノックアウト／ノックインには，別途HRドナーベクターが必要です。詳細はp.20～21をご覧下さい。




13

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


63394



複数の guideRNA を同時発現させるベクターの構築キットPrecisionX Multiplex gRNA Cloning Kit

●1 回のトランスフェクションで複数遺伝子をノックアウトするコンストラクトを作製できる，ユニークなキットです。●必要な guideRNA量は最小限で済みます。●ほとんどの guideRNAベクターに対応します。

直線化した guideRNA（gRNA）ベクターまたは Cas9 All-in-one ベクターに，一度に複数の guideRNA をクローニングできるキットです。最大 8 つの guideRNA をクローニングできます。

特　長

参考文献

Tsui-TingHo,etal.,NucleicAcidsResearch，（2014）.


PrecisionX Multiplex gRNA Cloning KitSBI906170 SBI CAS9-GRNA-KIT 10 tests 1kit/ 67,000

■Multiplex gRNA Cloning Kit と Cas9 発現 All-in-one ベクターとのセット（10 reactions）［メーカー：SBI］


SBI137002 EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA野生型

（hspCas9wt）

EF1 なし CAS700A-KIT

1kit

187,000

SBI137202 CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA CAG なし CAS720A-KIT 187,000

SBI137402 CMV-T7-hspCas9-H1-gRNA CMV なし CAS740A-KIT 187,000

SBI137502 EF1-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA 変異型（hspCas9，D10A，

Nickase）

EF1 なし CAS750A-KIT

1kit

187,000

SBI137702 CAG-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA CAG なし CAS770A-KIT 187,000

SBI137902 CMV-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA CMV なし CAS790A-KIT 187,000

※Cas9All-in-one ベクターについては，p.13 をご覧下さい。

関連製品

使用例B.

C.

A.

D.

■複数のゲノム領域における同時編集

MultiplexgRNACloningKitには，H1andU6プロモーターのブロックが含まれ，簡単にマルチgRNAカセットを作製できます。

Step1作製しようとするgRNAを含む領域を増幅できるプライマーと，キット由来の scaffold-promoterblock を PCR で結合し，両方の gRNA を含む PCR産物を作製する。Step2PCR 産物を fusionreactionmix，線状発現ベクターと結合させる。

（A）MultiplexgRNACloningKit（本製品）とAll-in-oneCas9SmartNickaseVector（p.13）を用いて quad-plexgRNA を作製し，CMV-GFP-T2A-RFP カセットを安定発現する細胞からGFP-T2A-RFP 領域（1,260bp）を除去した。

（B）GFP 配列の 5’ 末端と RFP配列の 3’ 末端で切断が生じるよう，4種類の guideRNAを Cas9 ベクターにクローニングした。

（C）PCR で GFP と RFP 遺伝子領域を増幅し，電気泳動でバンドを確認した。（lane1）ベクター導入なし，1,600bp（lane2）ベクター導入あり，340bp

（D）GFP と RFP 蛍光の検出ベクターを導入した細胞で蛍光が減少した。




14

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


63308


Cas9 導入受　託

最適デザインの guideRNA と Cas9 を組み込んだレンチウイルス発現ベクターtransEDIT CRISPR-Cas9 Lentiviral Reagents

最適なデザインの guideRNA と Cas9 nuclease を，レンチウイルス発現ベクターの中に組み込み，バクテリアのグリセロールストック，またはウイルス粒子の形でお手元にお届けします。

特　長�●�レンチウイルスベクターに，ヒト／マウス／ラットのいずれかの遺伝子をターゲットにしたguideRNAをクローニングします。

●�transOMIC 独自のアルゴリズムにより最適な guideRNA配列をデザインし，上位 3種類の guideRNA をクローニングしたレンチベクターを納品します。

●�オフターゲットを最低限に抑えます。

お問い合わせはこちらまで！

Tel. 03-5684-1645　　Fax 03-5684-6539 : [email protected]

受託・特注品担当

ご注文方法／価格�

詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。※transOMIC 社 Web にアクセスし，目的遺伝子・プロモーター・レポーター・希望納品形態などを確認の上，専用の注文書に必要事項をご記入下さい。詳細はフナコシWeb（Webページ番号：63308）をご覧頂くか，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

［メーカー：TOT］

製品構成�●�guideRNA（上位 3種）●�ネガティブコントロール（non-targeting�control�gRNA）●�OMNIfect�Transfection�Reagent（バクテリア・グリセロール・ストック製品のみ）


transEDIT Mouse CRISPR Cas9 Nuclease plus gRNA All-In-One Target Gene Set （pCLIP-All-EFS-Blast）-Bacterial Glycerol Stock

TOT436100 TOT CAMS1001-EFS-Blast � 1�set�/ 160,000


transEDIT Mouse CRISPR gRNA Target Gene Set （pCLIP-gRNA-EFS-Blast）-Bacterial Glycerol Stock

TOT437300 TOT CCMS1001-EFS-Blast � 1�set�/ 137,000transEDIT CRISPR Cas9 Nuclease Expression Vector

（pCLIP-Cas9-Nuclease-EFS-Puro）TOT408100 TOT TECC1001 1�vial�/ 115,000

ベクターの種類�

BlastR

ZsGhCMV

PuroRgRNA EFS

tRFP

3’LTRCas9P2A

CMV─LTR U6

■All-in-one ベクター

・guideRNAと Cas9 が 1つのベクターから発現します。・単一マーカーで選択可能です。

RNA�plus�Cas9�expression�vectors（pCLIP-All）

■2 ベクターシステム

・�Cas9 と guideRNAの発現を，それぞれ別のベクターで行います。・�系に合わせた最適化やCas9 の選択も可能です。

gRNA�expression�vectors（pCLIP-gRNA）

BlastR

ZsG

PuroRgRNA EFS

tRFP

3’LTRCMV─LTR U6

2 種類の guideRNA が組み込まれたベクター（Dual�gRNA�vector）もあります。

Cas9�expression�vectors�（pCLIP-Cas9�Nuclease,�pCLIP-Cas9�Nickase）

・製品例

・製品例


ウイルスベクターで導入


15

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他

お問い合わせ先：〈受託〉TEL：03-5684-1645 　 FAX：03-5684-6539 　：[email protected]

53108


Cas9 導入

guideRNA と野生型／変異型 Cas9 をレンチウイルスベクターで導入しますLentiviral CRISPR / Cas9 System

トランスフェクションの難しい細胞でノックアウトしたい場合や，Cas9 安定発現細胞株を樹立し，複数のノックアウト細胞を効率良く作製したい場合に有用です。


①Cas9 と guideRNA を同時に発現させる All-in-one レンチウイルスベクター［メーカー：SBI］

Cas9 プロモーターマーカー商品コード包　装価格（￥）

野生型�（hspCas9�wt）発現用

CMV Puro CASLV300PA-1

1�kit

131,000 SBI998421

MSCV Puro CASLV320PA-1 131,000 SBI998420

変異型（hspCas9（D10A）mut，Nickase）発現用

CMV Puro CASLV400PA-1 131,000 SBI998419

MSCV Puro CASLV420PA-1 131,000 SBI998418

②Cas9 と guideRNA をそれぞれ発現させるレンチウイルスベクター［メーカー：SBI］



CMV Puro CASLV100PA-1 10�μg 112,000 SBI998445

MSCV Puro CASLV120PA-1 10�μg 112,000 SBI998441

CMV EF1a copGFP CASLV105PA-1 10�μg 112,000 SBI998443

MSCV EF1a copGFP CASLV125PA-1 10�μg 112,000 SBI998439


CMV Puro CASLV200PA-1 10�μg 112,000 SBI998437

MSCV Puro CASLV220PA-1 10�μg 112,000 SBI998433

CMV EF1a copGFP CASLV205PA-1 10�μg 112,000 SBI998435

MSCV EF1a copGFP CASLV225PA-1 10�μg 112,000 SBI998431

guideRNA発現用

EF1a H1 Blasticidin�R CASLV500PA-B 1�kit 112,000 SBI998417

EF1a H1 copGFP CASLV501PA-G 1�kit 112,000 SBI998416

EF1a H1 RFP CASLV502PA-R 1�kit 112,000 SBI998415

EF1a U6 Blasticidin�R CASLV510PA-B 1�kit 112,000 SBI998414

EF1a U6 copGFP CASLV511PA-G 1�kit 112,000 SBI998413

EF1a U6 RFP CASLV512PA-R 1�kit 112,000 SBI998412

Cas9発現用レンチウイルス（#CASLV＊＊＊VA）はウイルスベクター関連製品のため，購入時にご使用者確認書が必要です。ご注文の際は，フナコシWeb（http://www.funakoshi.co.jp/download/pdf/Viral.pdf）にある「ウイルスベクター関連製品ご使用者確認書」に必要事項をご記入の上，販売店担当者にお渡し下さい。なお，製品をご使用の際には「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘナ法）」および所属組織における安全管理規定に従い，しかるべき施設で実験を行って下さい。詳細は文部科学省ライフサイエンス課のWebをご覧下さい。

●！ウイルスベクター関連製品ご購入時のご注意




CMV Puro CASLV100VA-1

2×25�μl

112,000 SBI998429

MSCV Puro CASLV120VA-1 112,000 SBI998427

CMV EF1a copGFP CASLV105VA-1 112,000 SBI998428

MSCV EF1a copGFP CASLV125VA-1 112,000 SBI998426


CMV Puro CASLV200VA-1 112,000 SBI998425

MSCV Puro CASLV220VA-1 112,000 SBI998423

CMV EF1a copGFP CASLV205VA-1 112,000 SBI998424

MSCV EF1a copGFP CASLV225VA-1 112,000 SBI998422

③パッケージング済みの Cas9 発現用レンチウイルス

関連製品�

■レンチウイルスやレトロウイルスのポリエチレングリコール（PEG）沈殿による濃縮を簡便に行える試薬●�本製品 100�ml で，400�ml のウイルス産生細胞の培養上清からレンチウイルスを濃縮できます。


Virus Precipitation Solution, PEG-itSBI LV810A-1 100�ml�/ 56,000 SBI681010SBI LV825A-1 250�ml�/ 121,000 SBI682510




16

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


65082


強力な組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）技術によって，in vivo で Cas9 を導入するためのベクターです。SaCas9は，広く使用されているSpCas9よりもサイズが小さいながらSpCas9と同様の効率を持ち，rAAVベクターへの挿入が可能です。 ※本製品に，ウイルス粒子を産生するためのパッケージングベクターは含まれていません。

Cas9 導入

SaCas9 を発現するアデノ随伴ウイルスベクターAAV Cas9 SmartNuclease Plasmid

MemoAAV による Cas9 導入における問題点と SaCas9 の発見AAV は分裂・非分裂細胞の両方に遺伝子を導入し，長期間発現させる能力があるため，組換え体 AAV（rAAV）は遺伝子治療やゲノム工学研究におけるベクターとして頻繁に使用されます。しかし，rAAV による in vivo における遺伝子導入を行う際には，最も広く使用される Cas9 である Strepto-coccus pyogenes Cas9 gene（SpCas9）のサイズが問題となっていました。この問題を克服するために，Ran らは，よりサイズの小さい Cas9 遺伝子オーソログの特性を解析し，Staphylococcus aureus 由来の Cas9

（SaCas9）を発見しました。SaCas9 はサイズが SpCas9 より 1 kb 程度短いにも関わらず，SpCas9 と同様の効率を持ち，rAAV ベクターへの挿入が可能です。※SaCas9 は guideRNA デザインが異なります。

■参考文献Ran F. A., et al., Nature, 520: 186～191 （2015）.

■All-in-one ベクター● SaCas9 と guideRNA を一つのベクターで発現できます。● 10 reactions品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）Linearized All-in-one SmartNuclease AAV Plasmid

（EF1α-hsaCas9-U6-gRNA （SA））SBI CASAAV100PA-1 1 kit / 131,000 SBI998305

■SaCas9 と guideRNA を別々に導入品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）Cas9 Expression Vector for the Two Vector AAV SmartNuclease System （EF1α-hsaCas9 AAV Plasmid）

SBI CASAAV200PA-1 10 μg / 112,000 SBI998304gRNA Expression Vector for the Two Vector AAV SmartNuclease System, Linearized AAV Plasmid （EF1α-RFP-U6-gRNA（SA））

SBI CASAAV300PA-1 1 kit / 112,000 SBI998303

ワンステップで rAAV 粒子を濃縮する試薬AAVanced Concentration Reagent・ウイルス産生細胞の培養上清を回収し，遠心（1,500×g）するだ

けで rAAV を濃縮できます。・従来の rAAV 粒子の濃縮方法とは異なり，細胞の溶解および CsCl

密度勾配超遠心，クロマトグラフィー，またはアフィニティーマトリックスカラムへの結合などは不要です。

・形質導入する細胞への毒性はありません。


AAVanced Concentration ReagentSBI011000 SBI AAV100A-1 100 ml / 78,000SBI011100 SBI AAV110A-1 250 ml / 157,000

AAVanced rAAV-2 Injected into Mouse Brain

本製品を用いて濃縮した AAV-2（ITR-PGK-GFP-ITR）1.5 μl を 6 週齢 C57 マウスの海馬および中脳に定位注射した。3 週間後マウスを PFA で灌流固定し，40 μm の脳切片を作成して GFP の蛍光を観察した。

Check it out! ［メーカー：SBI］

63833


HR Targeting Vector については，p.20～21 をご覧下さい。

製品ラインナップ




17

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

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受託

その他


63737


64640


ヒトゲノムにおける Safe Harbor である AAVS1 遺伝子座に hspCas9 を組み込んだ，Cas9 の安定発現 HEK293細胞株です。

Cas9 安定発現細胞株 Cas9 安定発現HEK293細胞株Cas9 タンパク質を長期間安定に発現するヒトおよびマウスの細胞株です。

特　長�●�Tet-on システムにより Cas9 タンパク質の発現量を制御できる細胞と，定常発現する細胞があります。

使用例�

Tet-on システムによる Cas9 タンパク質の誘導（#CLHKCAS902）Doxycyclin の培地添加によって，任意のタイミングでCas9 タンパク質を発現誘導できる。


■Tet-on 発現誘導型細胞

■定常発現細胞


Cas9 Stable Cell Line for CRISPR, InduciblePRC210260 PRC CLHKCAS902 293T 1�vial�/ 300,000PRC210250 PRC CLHKCAS901 C2C12 1�vial�/ 300,000PRC210480 PRC CLHKCAS906 HeLa 1�vial�/ 300,000PRC210510 PRC CLHKCAS910 MCF-7 1�vial�/ 300,000PRC210550 PRC CLHKCAS913 MIA PaCa-2 1�vial�/ 300,000PRC210540 PRC CLHKCAS905 U2OS 1�vial�/ 300,000

GFP-Foxp3 and Cas9 Combo Cell LinePRC210360 PRC CLHKCOMBO1 293T 1�vial�/ 300,000


Cas9 Stable Cell Line for CRISPR, Non-InduciblePRC210490 PRC CLHKCAS907 293T 1�vial�/ 300,000PRC210390 PRC CLHKCAS904 3T3-L1 1�vial�/ 300,000PRC210380 PRC CLHKCAS903 NIH 3T3 1�vial�/ 300,000

Tet-On システムを利用した安定発現株のご購入には，事前に Tetシステムライセンス確認・同意書へのご記入，ご提出が必要です。フナコシWeb（Web ページ番号：63737）の価格表に掲載のライセンス同意書に必要事項をご記入の上，販売店担当者にお渡し下さい。詳細は，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

●！ご購入時のご注意

特　長�●�下記ドナーベクター（#CAS620A-1）を用いて，HEK293細胞株に Cas9 遺伝子をノックインして作製した安定発現細胞株です。

●�2×106�Cells/vial品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）Stable Cas9 HEK293 Cell Line with Cas9 Stably Integrated at AAVS1 Safe Harbor LocusSBI CAS630A-1 1�vial�/ 187,000 SBI136300


hspCas9 AAVS1 Safe Harbor Knock-in Donor （AAVS1-SA-puro-EF1-hspCas9）SBI CAS620A-1 10�μg�/ 191,000 SBI136200

L-755,507ヒト iPS 細胞で，CRISPR/Cas9 による�相同組換え修復の効率を促進します。

OH

OHO

HN

NH

NH

NHS

O

O

O

参考文献�Pinder�J.,�et.�al.,“Nuclear�domain�‘knock-in’�screen�for�the�evaluation�and�identification�of�small�molecule�enhancers�of�CRISPR-based�genome�editing.”Nucleic�Acids�Res.,�43:�9379～9392�（2015）.�［PMID：26429972］


L-755,507RSD 2197/10 10�mg�/ 46,000 RSD021970RSD 2197/50 50�mg�/ 191,000 RSD121970β3-アドレナリンレセプターのパーシャルアゴニスト。iPS 細胞において，CRISPR/Cas9 による相同組換え修復（HDR）効率を 2～3 倍（large�fragment）または最大 9倍（点変異の場合）に向上させる。化学式：C30H40N4O6S，M.W.：584.73，純度：＞98％，CAS�No.：159182-43-1

Check�it�out! ［メーカー：RSD］

293T

Dox:

f-Cas9 ── 175 kDa

Tubulin ─

－＋

関連製品�

#GE620A-KIT（p.30）に含まれるドナーベクターです。



18

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


7922


CRISPR/Cas9 を併用し，ゲノムの特定箇所の修正や，変異の導入を行うための相同組換え用ドナーベクターです。導入したセレクションマーカーカセットは，PiggyBac Transposase により痕跡を残さずに除去できます。

ドナーベクター

組み込んだ配列を痕跡を残さず除去できますPiggyBac Gene Editing HR Targeting Vector

特　長�●�任意の変異を導入した相同領域をMCS1／MCS2 にクローニングし相同組換えを起こすことで，特定の箇所への点変異の導入や修正などが可能となります。

●�選択マーカー（Puro 耐性およびGFP蛍光）により，相同組換えを起こした細胞株を選択できます。●�ホストゲノムに導入した選択マーカーは，Transposase 発現ベクターを発現させることにより，ほとんど痕跡を残さずに除去できます。

●�マーカーの除去の際にはチミジンキナーゼ（TK）を利用したセレクションが可能です。

■PiggyBac HR Vector品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）piggyBac HR Vector（5'MCS-EF1-GFP-Puro-TK-3'MCS）SBI PBHR100A-1 10�μg�/ 212,000 SBI998637

営利団体・企業（Commercial�Entity）にご所属のお客様が 9ヶ月を越えて本製品を使用される場合，ライセンス契約が必要です。


原　理�

■Excision-only PiggyBac Transposase （#PB220PA-1，p.32）を用いたシームレスな遺伝子編集例

Step�1：Cas9 は guideRNA に相補的な部分で DSB（二本鎖切断）を起こす。※DSBはイントロン内で生じるようにする。

Step�2：DNA修復機構がDSBにリクルートされる。この時，DSBの付近と相同な配列を持つHRドナーベクターが存在すると，NHEJ（非相同末端結合）ではなくHR（相同組換え）が生じやすい。HR ドナーベクターのホモロジーアームが相同組換えによりゲノムに組み込まれる。

Step�3：マーカーカセットの除去Excision-only�PiggyBac�Transposase が 5’／3’PiggyBac�TR�（Terminal�Repeat）の間にある配列を完全に除去する。

エキソンイントロン

マーカーカセットの除去

ゲノムに導入した目的遺伝子の除去には，別途 Excision-only�Pig-gyBac�Transposase�Expression�Vector�（#PB220PA-1）が必要です。p.32 をご覧下さい。



19

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


7942


タンパク質コード領域およびタンパク質非コード領域を標的とした，ノックアウト／ノックイン用ベクターです。CRISPR/Cas9 と組み合わせて使用します。


ノックイン／ノックアウト／編集用ドナーベクターPrecisionX HR Targeting Vectors

Basic HR Targeting Vector� ノックアウトノックイン編集タグ付け

Gene Tagging HR Targeting Vector� ノックアウトノックイン編集タグ付け

MemoCas9 のみの導入による二本鎖切断の結果，遺伝子ノックアウトを生じさせることは可能ですが，より効果的かつ正確なゲノム編集を行うため，SBI 社ではHR�targeting�vectors（HRドナーベクター）の併用をオススメしています。●�HR ドナーベクターはポジティブまたはネガティブ選択に必要なマーカーを含むため，変異導入に成功した細胞の選択が可能です。

●�HR ドナーベクターは最大 6～8�kb の ORF（open�reading�frame）を含み，遺伝子ノックインやタグ付けに利用できます。

■ベーシックドナーベクター

目的遺伝子をホストゲノムに組み込むためのターゲッティングベクターです。発現カセットを任意にカスタマイズできます。

細胞内での目的遺伝子産物の局在や動態の解析に最適です。選択マーカーにより，相同組換えを起こした細胞株を選択できます。

■GFP タグベクター


Basic HR Targeting Vector for Gene Knock-In/Out ［MCS1-LoxP-MCS2-MCS3-pA-LoxP-MCS4］SBI HR100PA-1 10�μg�/ 147,000 SBI998584

EcoRI,Sacl,Kpnl,Nrul,Nsil,Bglll

BstBI,Sacll

BamHI,Sall,Sphl,Hindlll

XbaI,Notl

Replication3856 bp

MCS MCSPolyA

AmpR

GFP-Fusion HR Targeting Vector ［GFP-pA-LoxP-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS］SBI HR120PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998582

GFP-Fusion HR Targeting Vector ［GFP-pA-LoxP-EF1a-RFP-T2A-Hygro-pA-LoxP-MCS］SBI HR220PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998494

T2A-GFP Co-Expression HR Targeting Vector ［T2A-GFP-pA-LoxP-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS］SBI HR130PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998581

GFP-T2A-Luciferase Co-Expression HR Targeting Vector ［GFP-T2A-Luc-pA-LoxP-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS］SBI HR150PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998580

IRES-GFP Co-Expression HR Targeting Vector ［IRES-GFP-pA-LoxP-MCS1-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS2］SBI HR180PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998579

■GFP＋ルシフェラーゼタグベクター

■IRES-GFP 共発現ベクターEcoRI,Sacl,Nrul,Nsil

EF1

Xbal

IRES-GFP-PolyA

7565 bp

BamHI,Sphl

MCSRFP-T2A-Puro-PolyA

AmpR Replication

EcoRI

EF1

BamHI,Sall

7672 bp

MCSRFP-T2A-Puro-PolyAGFP-PolyA

Xbal,Notl

ReplicationAmpR

EcoRI

EF1

BamHI,Sphl

MCSRFP-T2A-Puro-PolyAT2A-GFP-PolyA

7735 bpReplicationAmpR

BamHI,SphlXbal,Notl

Clal,Nhel,Xhol,BstBI

GFP-PolyA EF1 MCSRFP-T2A-Hygro-PolyA


GFP-T2A-Luci-PolyA

EcoRI

EF1

BamHI,Sall

MCSRFP-T2A-Puro-PolyA




20

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


Gene Knock-out HR Targeting Vector� ノックアウトノックイン編集タグ付け

OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector� ノックアウトノックイン編集タグ付け


Gene Knock-Out HR Targeting Vector ［MCS1-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-MCS2］SBI HR110PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998583

Gene Knock-Out HR Targeting Vector with TK selection ［MCS1-LoxP-EF1α-GFP-T2A-Puro-P2A-hsvTK-pA-LoxP-MCS2］SBI HR210PA-1 10�μg�/ 181,000 SBI998570

Gene Knock-Out HR Targeting Vector ［MCS1-EF1a-GFP-T2A-Puro-pA-MCS2］SBI HR410PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998493

Gene Knock-Out HR Targeting Vector ［MCS1-EF1a-RFP-T2A-Hygro-pA-MCS2］SBI HR510PA-1 10�μg�/ 161,000 SBI998492

PrecisionX OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector ［MCS1-EF1α-GFP-T2A-Puro-pA-MCS2-PGK-hsvTK］SBI HR700PA-1 10�μg�/ 181,000 SBI998322

PrecisionX OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector ［MCS1-EF1α-RFP-T2A-Hygro-pA-MCS2-PGK-hsvTK］SBI HR710PA-1 10�μg�/ 181,000 SBI998321

PrecisionX OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector ［MCS1-EF1α-Blasticidin-pA-MCS2-PGK-hsvTK］SBI HR720PA-1 10�μg�/ 181,000 SBI998320

■ネガティブセレクション HR ベクター

3’MCS の外に PGK-hsvTK カセットが挿入されたベクターです。ネガティブセレクションにより，目的の相同組換え以外でドナープラスミドがゲノムに導入された細胞を排除できます。

■デュアルマーカー HR ベクター

EcoRI,SacI,KpnI,NruI,NsiI,BglII

XbaI,NotI

BamHI,SphI

EF1 MCS2MCS1 RFP-T2A-Puro-PolyA

5767 bp

AmpR Replication

GFP-T2A-Puro-PolyA

EcoRI,SacI,KpnI,NruI,NsiI,BglII

XbaI,NotI

BamHI,SaI,SphI

EF1 MCS2MCS1

5840 bp

AmpR Replication

SacI,KpnI,NruI,NsiI,BglII

XbaI,NotIBamHI,SalI,SphI

EF1 MCS2MCS1

6193 bp

AmpR Replication

RFP-T2A-Hygro-PolyA

BsrGI,Bsal Bbsl,Mlul,Notl,Sall

EF1 PGKMCS1 Blasticidin-PolyA

6385 bp

KanR Replication

hsvTKMCS2

SpeI,BsrGI,BsaI BbsI,MluI,NotI,SalI,AgeI

EF1 MCS2MCS1 GFP-T2A-Puro-P2A-TK-PolyA

6903 bp

KanR Replication

BsrGI,Bsal Bbsl,Mlul,Notl,Sall

EF1 PGKMCS2 hsvTKMCS1 GFP-T2A-Puro-PolyA

7402 bp

KanR Replication

BsrGI,Bsal Mlul,Notl,Sall

EF1 PGKMCS2MCS1 RFP-T2A-Hygro-PolyA

7744 bp

KanR Replication

hsvTK



21

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


64803


高い純度で正確な配列を有する長鎖の一本鎖オリゴ（ssDNA）を，半日間で簡単に調製できるキットです。1,500 base または 3,000 base 用のキットがあります。


サイズの大きな遺伝子を効率よくノックインできますLong ssDNA Preparation Kit

本キットで調製した long ssDNA をドナー DNA とし，CRISPR/Cas9 と一緒に導入することで，GFP 配列を正確かつ効率よくノックインすることに成功した報告があります。※参考文献：“ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.” Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: 10431 （2016）.［PMID: 26786405］

ココがすごい！簡単に高純度の目的配列を有する長鎖 ssDNA の取得が可能本製品は，BioDynamics Laboratory 社が大阪大学大学院真下知士准教授と共同で開発したものです。ssDNA の調製には PCR や合成 DNA オリゴマーの使用，エキソヌクレアーゼ反応，逆転写酵素反応などの工程があることから，内部の変異や末端の欠失を生じることは避けられませんでした。また，精製には変性アクリルアミドゲル電気泳動やストレプトアビジン被覆常磁性ビーズなどが用いられてきましたが，大量の dsDNA の混入が指摘される場合もありました。Long ssDNA Preparation Kit（本製品）は，簡単な操作によって，高い純度で目的の配列を有する長鎖の ssDNA を取得することができます。

操作方法概略

1．目的の DNA 断片をキット付属のプラスミドの MCS の 2 つの Nicking 酵素サイトの間，あるいは Nicking 酵素サイトと制限酵素サイトの間にクローニングする。

2． Nicking 酵素や制限酵素を用いて切断する。

3．消化したプラスミドを，添付の Denaturing Gel-loading Buffer で変性させた後，通常の電気泳動を行う。

4．先頭のバンドを切り出し抽出，精製するだけで目的の ssDNA が得られる。

1 2

or

or

3 4

特　長キット内容

● 特許申請中の新技術である Nicking 酵素法によって，変異や末端の欠失を含まない，1,500 base または 3,000 base までの長鎖 ssDNA が調製できます。

● 全操作は，一般的な dsDNA 断片の調製法とほぼ同じで，特別な機器や試薬は必要ありません。

● PCR で増幅しないため，エラーは生じません。● ベクター製品のため，安価です。

● Plasmid＊

● Denaturing Gel-loading Buffer：目的の長鎖 ssDNA を通常のアガロースゲル電気泳動で分離精製することができます。

● 着色済 RNA 分子量マーカー（Prestain Marker for RNA High, DynaMarker®）：ゲル電気泳動をモニターするために有用なインディケーターとして使用できます。

※本製品にはゲルからの DNA 抽出キットは含まれません。＊～1.5 kb 用と 3.0 kb 用の製品とで，キットに含まれるプラスミドの

種類が異なります。

ご注文の際に使用目的確約書が必要です。Web に掲載の使用目的確約書に必要事項をご記入の上，販売店担当者にお渡し下さい。本製品または技術を商用目的で使用される場合は，予め当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。


※調製したい long ssDNA の長さに応じた製品をお選び下さい。※着色済み RNA 分子量マーカーが付属しています。


Long ssDNA Preparation KitBDL006100 BDL DS610 for 1.5kb 1 kit / 40,000BDL006200 BDL DS620 for 3.0kb 1 kit / 40,000

新製品：

長鎖 ssDNA の精製に最適化したゲル抽出キットBioDynamics Laboratory 社では，現在新製品を開発中です。上記キットで作製した長鎖 ssDNA を高収率・高純度で抽出・精製できます。発売情報をお見逃しなく！

Coming

Soon！回収率UP！



22

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

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その他


長鎖の一本鎖DNA（LssDNA）で広がるゲノム編集の可能性大阪大学大学院医学系研究科附属動物実験施設

真下知士准教授

CRISPR-Cas9 システムを利用することで，遺伝子改変マウスを非常に簡単に，短期間で，低コストで作製することが可能になりました。マウス受精卵に guide RNA と Cas9 メッセンジャー RNA（あるいは Cas9 タンパク質）をインジェクションすることで，ノックアウトマウスを作製することができます。技術の難しいインジェクションの代わりに，エレクトロポレーションで簡単に受精卵に導入することも可能になっています（文献 1）。CRISPR-Cas9 のメリットは，複数の guideRNA を同時に使うことで，ダブルノックアウトやトリプルノックアウトしたり，大規模なゲノム領域を欠失させることが可能です。CRISPR-Cas9 と一緒に，短い一本鎖 DNA（ssODN：single-stranded oligonucleotide）を導入することで，ES 細胞ではこれまで煩雑であった一塩基変異（SNP）を簡単に置換することができます（文献 2）。しかしながら，受精卵の中では，相同組換え（HR：Homologous Recombination）効率があまり高くないことから，GFP やヒト遺伝子などの大きなサイズのゲノム DNA をノックインすることが困難でありました。

今回，（株）バイオダイナミクス研究所（メーカー略称：BDL）が開発した長い一本鎖の DNA（LssDNA：long ssDNA）を作成する方法により，CRISPR-Cas9 と一緒に LssDNA を導入するだけで，GFP や大きな遺伝子を効率的にノックインすることができるようになりました。実際，我々の研究室では，神経に発現する Thy1 遺伝子の下流に緑色蛍光タンパク質 GFP がつながるようにデザインしたLssDNA を作成し，受精卵にインジェクションすることで，神経細胞が特異的に緑色の蛍光を発するノックインラットを作製することに成功しました（文献 3）。LssDNA とゲノム編集を組合わせれば，これまでは難しかった蛍光タンパク質や組織特異的 Cre，ヒト遺伝子などのノックインが可能です。（株）バイオダイナミクス研究所（販売：フナコシ（株））の LssDNA 精製キットを利用すると，半日間で簡単に LssDNA を作成することができます。

※本コラムは，2016 年にご執筆いただいたものです。

目的の dsDNA 断片を pLSODN-1 または pLSODN-3 の MCS にクローニングした。これを Nicking 酵素で処理することで目的断片の両端にニックを導入した。Denaturing Gel-loading Buffer で変性後，試料を電気泳動で分離し，目的のバンドから DNA を抽出，精製した。

Lane 1：1,500 bp DNA 断片を導入した pLSODN-1 を，Nicking 酵素で処理した試料Lane 2：精製した長鎖 ssDNA（1,500 base）Lane 3：3,000 bp DNA 断片を導入した pLSODN-3 を，Nicking 酵素で処理した試料Lane 4：精製した長鎖 ssDNA（3,000 base）

使用例

3.0 kb

1 2 3 4

1.5 kb

● Nicking 酵素法（本製品）にて調製した長鎖 ssDNA（2A peptide 配列と GFP 全域の配列，5’ 側 300 base homology arm，3’ 側 60 base homology arm を含む全長1,194 base の相補鎖側 ssDNA）

● poly（A）を付与した Cas9-poly（A）RNA● guideRNA：Thy1-TGA

をラット受精卵へマイクロインジェクションすることによって，ラット rThy1 遺伝子 C 末端に，高い効率（11.1％）でGFP 遺伝子全域をノックインすることに成功した。この論文は，長鎖 ssDNA を用いた LssDNA 法（ssODN に対して LssDNA）によって，外来遺伝子全長のノックイン効率を高めることができることを示した初めての報文である。

参考文献Citation

“ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.”Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: 10431 （2016）. ［PMID: 26786405］

引用文献

1）Kaneko T., et. al., Sci. Rep., 4: 6382 （2014）.2）Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 5: 4240 （2014）.3）Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: 10431 （2016）.



23

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


63186


編集確認

Cas9発現をmRNAレベルで確認Cas9 遺伝子用プライマーのセット

細胞内における Cas9 mRNA の発現を確認するための RT-PCR 用プライマーのセットです。

●増幅サイズの異なる2種類のプライマーセットが付属します。●野生型 Cas9，NickaseCas9，doublemutantCas9 のいずれも検出可能です。

219bp122bp

Cas9 発現細胞とコントロール細胞由来の cDNAを用いて PCR を行い，増幅産物を電気泳動した。Cas9 発現細胞由来試料の Ct 値はおよそ 17 であり，ネガティブコントロールではバンドが検出されなかった。

使用例特　長


Cas9 RT-PCR Primer SetSBI998324 SBI CAS9-PR-1 1kit/ 18,000

各プライマー 50µl（5µM），50回分

WEB 会員にご登録下さい！ログインにより，各種お問い合わせフォーム，カタログ請求，受託オンラインオーダーが便利になります。

編集確認

抗 Cas9 抗体

※略号：Mono:Monoclonal,Poly:Polyclonal,AAPu:AntigenAffinityPurified,PAPu:ProteinA/GAffinityPurified,APu:AffinityPurified,Pu:Purified,Dot:DotBlotting,EMSA:Electro-phoreticMobilityShiftAssay,FCM:FlowCytometry,IC:Immunocytochemistry,IF:Immunofluorescence,IHC:Immunohistochemistry,IP:Immunoprecipitation,Neut:Neutral-ization,West:WesternBlotting

品　名免疫動物（クローン）標識適用メーカー商品コード包　装価格（￥）

NOV236441 Anti-Cas9, N-terminalクラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria

Mouse-Mono （7A9-3A3）

－ IC, IF, IHC, IP, West

NOV NBP2-36440SS 0.025 ml 29,000NOV736440 NOV NBP2-36440 0.1 ml 68,000NOV721047 Anti-Cas9, C-terminal

クラス：IgG，性状：PAPu，交差性：BacteriaMouse-Mono

（6G12）－ ChIP, IC, IF,

IP, WestNOV NBP2-52398SS 0.025 ml 29,000

NOV721060 NOV NBP2-52398 0.1 ml 66,000

NOV668108

Anti-Cas9, Antibody Packクラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria※#NBP2-36440SS（0.025ml，1.0mg/ml）と#NBP2-52398SS（0.025ml，1.0mg/ml）が1vial ずつ含まれるセットです。

Mouse-Mono －－ NOV NBP2-52986 1 set 49,000

GNT940415 Anti-Cas9クラス：IgG，性状：PAPu，交差性：Bacteria

Mouse-Mono （7A9）

－ IC, IF, IP, West

GNT GTX53807 25 μg 32,000

EPG090000 Anti-Cas9クラス：IgG，性状：PAPu

Mouse-Mono （7A9）

－ ELISA, IF, IP, West

EPG A-9000-010 10 μg 13,000EPG090001 EPG A-9000-050 50 μg 34,000EPG090002 EPG A-9000-100 100 μg 60,000

■関連製品：抗 Cpf1 抗体

品　名免疫動物（クローン）標識適用メーカー商品コード包　装価格（￥）

GNT935571 Anti-CPF1クラス：IgG，性状：AAPu

Rabbit-Poly － IC, IF, West GNT GTX133296 25 μl 23,000

アンティ先生

検索絞込み機能が強化されたフナコシWebで抗体検索もらくらく！

MemoAcidaminococcus およびLachnospiraceae 由来の Cpf1 タンパク質は，ヒト細胞においてゲノム編集を効率的に行うことが分かっています。Cpf1 は Cas9 といくつか共通の特性を持ちますが，特に下記のような利点があります。●単一の crRNA 誘導エンドヌクレアーゼであり，干渉を調節するtracrRNAを必要としない。

●Cas9 によって産生される平滑末端の代わりに，付着末端を産生する。●T（チミン）リッチな PAM配列を利用。●pre-crRNAプロセッシングのためのRNaseⅢ機能を有する。■参考文献：ZetscheB.,etal.,Cell.,163（3）:759～71（2015）.



24

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


65625


65672


編集確認

Cas9/SaCas9 定量用 ELISA キットEpiQuik CRISPR/Cas9/SaCas9

Assay ELISA Kit

編集確認

標的配列が切断されたかを検出するキット

GenCrispr Mutation Detection Kit

Cas9 を導入した発現クローンのスクリーニングに有用です。

特　長�●�Cas9（SpCas9）または SaCas9 タンパク質を，ダイレクトELISA 法により定量するキットです。

●�電気泳動を用いずに，Cas9 タンパク質の定量を行えます。●�キットには Cas9 または SaCas9 のコントロールが含まれています。

●�迅速（3時間），高感度かつ特異的に定量できます。●�測定試料：全細胞抽出物，精製Cas9●�測定範囲：0.5～20�ng/well●�測定波長：450�nm

使用例�

左：�HeLa 細胞抽出物に異なる濃度で Cas9 タンパク質を添加し，EpiQuik�CRISPR/Cas9�Assay�ELISA�Kit�（#P-4060）で Cas9 タンパク質量を測定した。

右：�K562 細胞抽出物に異なる濃度で SaCas9 タンパク質を添加し，EpiQuik�CRISPR/SaCas9（S.�aureus）Assay�ELISA�Kit（#P-4062）で SaCas9 タンパク質量を測定した。

検量線左図：EpiQuik�CRISPR/Cas9�Assay�ELISA�Kit�（#P-4060）右図：EpiQuik�CRISPR/SaCas9�Assay�ELISA�Kit�（#P-4062）


EpiQuik CRISPR/Cas9 Assay ELISA Kit （Colorimetric）EPG540600 EPG P-4060-48 48 Assays 1�kit�/ 71,000EPG540601 EPG P-4060-96 96 Assays 1�kit�/ 121,000

EpiQuik CRISPR/SaCas9 （S.aureus） Assay ELISA Kit （Colorimetric）EPG540620 EPG P-4062-48 48 Assays 1�kit�/ 60,000EPG540621 EPG P-4062-96 96 Assays 1�kit�/ 103,000

CRISPR/Cas9 などのゲノム編集ツールで切断されたゲノムDNAを，PCRにより検出するキットです。切断効率を確認することができます。

特　長�●�目視で簡単に確認できます。●�標的配列を含む領域の PCR でミスマッチを含む二本鎖（ヘテロ二重鎖）が形成された場合，PCR 反応液を T7�Endo-nuclease�Ⅰ処理するとミスマッチ部位で切断されます。電気泳動上で切断された断片がバンドとして検出されます。

●�遺伝子突然変異誘発や SNPの検出にも使用できます。

キット内容�

キットにはポジティブコントロールの鋳型DNA とプライマーミックスが含まれています。●�High-Fidelity�DNA�polymerase●�PCR�reaction�buffer●�GenCrispr�T7�endonuclease�Ⅰ●�GenCrispr�T7�endonuclease�Ⅰ�reaction�buffer●�Control�template�DNA●�Control�primer�mix●�Protease�K●�dNTP※本製品にゲノムDNA抽出キットは含まれません。


1.�細胞の回収：CRISPR/Cas9 などで処理された細胞を遠心して回収する。

2.�PCR 用試料の調製：キットなどを用いて，ゲノムDNAを抽出する。

3.�PCR による増幅：キットに付属の DNA�polymerase でPCRを行う。

4� ヘテロ二重鎖 DNA の消化：PCR 後，反応液に T7�endo-nucleaseⅠを処理する。

5.�検出：アガロースゲル電気泳動を行う。品　　名

メーカー商品コード包装 / 価格（￥）GenCrispr Mutation Detection KitGSC L00688-25 25 reactions 1�kit�/ 39,000 GSC688025GSC L00688-100 100 reactions 1�kit�/ 86,000 GSC688100



25

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


64354


受　託

安い・早い・高効率CRISPR/Cas9 による遺伝子改変マウス作製受託サービス

特　長�●�標的遺伝子に対する guideRNA 設計から in�vitro 活性評価を行い，受精卵へのインジェクションを行います。

●�産子の 50％以上に変異導入されることが期待されます。●�ドナーを用いたノックインも承ります。●�guideRNAの設計からマウス作製まで，トータルサービスのご提供が可能です。また，一部工程のみの実施も可能です。

詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：TRG］

オプション工程�

■自然交配による次世代マウスの作製ファウンダーマウスと野生型マウスとの自然交配により，次世代マウスを作製します。産子全頭について，ダイレクトシーケンスによる導入変異の解析をいたします。納期：約 3ヶ月※SPF 施設の飼育ラック 1棚を占有させ，1世代（3か月間）の飼育・繁殖を行います。産子については，8 週齢までの飼育とダイレクトシーケンスによる変異配列の解析を実施します。※1棚は 10 ケージを収納する規模です。交配・繁殖の進行に伴い，適宜，ケージ数を調整します。※妊娠出産に至らず産子が得られないときは，交配費用のみでの精算とさせていただきます。


お客様のご要望に応じた工程での実施例■ES細胞への導入ES 細胞を用いて，相同組換え法との組み合わせにより，2 箇所のloxP 配列を挿入したコンディショナル・ポテンシャルの ES 細胞クローンを取得しております。■受精卵へのインジェクションCas9 ベクターあるいは Cas9 タンパク質と一緒に ssOligo�DNA を受精卵にインジェクションし，ポイントミューテーション（点変異）等をノックインしました。これまでに，数塩基欠失，1塩基欠失，1塩基置換などの変異アレルを持つマウスを得ることに成功しております。■高効率CRISPR/Cas9 ノックイン法Cas9 タンパク質と RNAおよびドナーを一緒に受精卵に導入することで，ゲノム中の特定の場所へノックインすることができます。これまでは難しかった点突然変異の導入や大きなサイズの組換えを，受精卵で効率よく行うことが可能で，CRISPR/Cas9 によるマウス作製受託の適用範囲がさらに拡大するものと考えられます。■その他上記の他，様々な技法（ノックイン，flox マウス作製など）についても，ご相談を承ります。

CRISPR/Cas9 関連のライセンス内容（株）トランスジェニックは，2015年 4月 21日に米国 Broad 研究所からCRISPR/Cas9 に関する特許群（US8697359B1 他）の日本国内における非独占的実施権を取得しております。（株）トランスジェニックで受託作製した遺伝子組換えマウスは，お客様の機関内における研究目的での使用が認められています。また，国立大学法人東京医科歯科大学より高効率CRISPR/Cas9 ノックイン法に関する特許の日本国内での非独占的使用権許諾を受けております。※作製費用にはBroad 研究所および東京医科歯科大学へのライセンス料を含みます。

作業概要（標準工程）�

変異が導入されている産子（ファウンダーマウス）をスクリーニングし，ダイレクトシーケンスによって変異体の検出を実施します。※解析の結果，ファウンダーマウスが得られなかった場合，3．の費用はご請求致しません。

3. ファウンダーマウスの同定（4～5ケ月）

1. guideRNA設計と活性確認（約 2ケ月）

標的遺伝子に対して guideRNA を設計し，その標的配列を認識・切断できるかどうか�in�vitro で切断活性評価を行います。ご要望に応じて，Cas9 発現ベクターの構築も実施いたします。

guideRNA

市販 Cas9 ベクター

Cas9

2. 受精卵へのインジェクション

既存のトランスジェニックマウス作製と同様の方法を用いて，Cas9 タンパク質とRNAの複合体を受精卵にインジェクションします。同時にドナーをインジェクションすることで，相同組換えによるノックインを期待します。※実施内容については，ご要望を踏まえてご提案させていただきます。

4. F1 ヘテロマウスの取得（7～8ケ月）

ファウンダーマウスのうち，目的通りの変異が導入されている個体を選択し，次世代（F1）マウスを作製します。ファウンダーマウスはモザイク（変異が導入された細胞とされていない細胞が混在している）なので，次世代マウスに生殖系列伝播した個体を作出し，かつ変異を特定する必要があります。この工程で作出される次世代マウスは，ヘテロ（＋／－）マウスです。※価格にはライセンス料を含みます。マウスの輸送費・微生物検査費は，別途申し受けます。



26

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


63392


受　託

ゲノム編集のエキスパートがあなたの研究をサポートCRISPR/Cas9 関連受託サービス

ご指定頂いたゲノム領域を標的とする CRISPR/Cas9・guideRNA 発現プラスミドや HR ドナーベクターのデザインおよび作製を行う受託サービスです。目的遺伝子（accession number）や DNA シーケンス情報をお送りいただきます。


詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：SBI］

まずはお気軽にご相談下さい！

Tel. 03-5684-1645　　Fax 03-5684-6539 : [email protected]

受託・特注品担当

10

Relative miR-21（fold） 1

0.1

0.01

0.001

0.0001

Vector

KO1

KO2

KO3

KO4

KO5

AGFP

+Cre

-Cre

Bright FieldB

カスタム gRNA およびカスタム HR ドナーベクターを用いた HEK293細胞における miR-21 遺伝子のノックアウト（A）�miR-21遺伝子の発現量をqPCRで測定したところ，gRNAを導入した細胞（KO1～

KO5）では遺伝子のノックアウトが確認された。（B）�GFP マーカーを除去するため，HR ドナーベクターの LoxP 領域で組換えを起こす

Cre リコンビナーゼで処理したところ，効率的に GFP マーカーが除去されていることが分かる。

カスタム CRISPR/Cas9・guideRNA 発現プラスミド作製サービス�

カスタム HR ドナーベクター作製サービス�

ゲノム編集済み細胞株作製サービス�

特定の配列を標的とするguideRNAのデザイン，発現プラスミドの作製を行うサービスです。●�SBI 社の SmartNuclease または SmartNickase ベクター（p.13）にクローニングします。野生型／変異型 Cas9 からベクターをお選び下さい。

※変異型Cas9 については，p.13 をご覧下さい。

特定の配列を標的とするホモロジーアームのデザイン，およびHRドナーベクターを作製するサービスです。●�遺伝子のノックアウト，ノックイン，タギング，単一ヌクレオチド修飾に有用です。●�ホモロジーアームは，SBI 社のHRドナーベクター（p.20～21）に導入します。

特定の配列を標的として，カスタム作製したCas9 およびHRドナーベクターを用いて細胞株を作製する受託サービスです。●�遺伝子のノックアウト，ノックイン，タギング，単一ヌクレオチド修飾が可能です。●�改変された安定細胞株をお送りし，クローンの単離，特性評価はお客様に行って頂くDeliver�unscreened�cells サービスと，ご希望通りの修飾がなされた細胞株のスクリーニングを実施してお届けするDesired�modification サービスがあります。

©樹庵じゅあん



27

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


64464


687


受　託

CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集遺伝子改変細胞株の作製受託サービス

受　託

大好評！クローニング不要！人工遺伝子合成受託サービス

フナコシニュースを定期送付いたします

毎月 2回，フナコシニュースは最新の情報をお届けします。

無料です

�カタログ送付のお申し込み・フナコシニュース定期送付の新規お申し込み・送付先の変更・専用バインダーのお申し込みは，下記までご連絡下さい。

：[email protected] FAX：03-5684-1634

フナコシWeb（http://www.funakoshi.co.jp）からオンラインでのお申し込みもできます。�

CRISPR/Cas9 を用いて遺伝子のノックアウト，ノックイン，タグ付け，単一ヌクレオチド修飾を行った細胞株を作製する受託サービスです。

サービスの作業工程（例）�

1.�細胞培養条件の検討

2.�guideRNA設計と Cas9 ベクター構築

3.�細胞株への遺伝子導入

4.�1 次スクリーニング

5.�陽性クローンの解析

6.�リクローニングと解析

7.�遺伝子改変細胞株の樹立※ご依頼内容を伺った上で，作業工程の詳細をご相談させていただきます。


ゲノム編集をご希望の細胞種，ゲノム編集の内容，対象遺伝子などをご準備の上，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

納品�

目的配列が挿入されたベクター（凍結乾燥品，約 4�μg＊2）＊2 �他の容量での納品をご希望の際は，当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。

価格�●�最低価格� ……￥19,400／1断片●� ～3�kb……￥45/base＊1

●�3�kb～5�kb……￥55/base＊1

●�5�kb～8�kb……￥65/base＊1

＊1 �価格は鎖長，配列の複雑さ（GC の含有量，リピート配列など）により変動いたします。

フナコシWeb（http://www.funakoshi.co.jp/online_orders/）のオンラインオーダーフォームからご注文下さい。［メーカー：GSJ］

ご注文方法�

任意の配列のDNAを合成し，ベクターに挿入する受託サービスです。cDNA ライブラリーから PCR により目的のDNA断片を増幅することが煩雑な場合などに有用です。

特長�●�配列情報のみから人工遺伝子を合成します。●�シークエンシング解析データ，プラスミドマップもご提供します。

●�独自のOptimumGene テクノロジーにより，発現宿主（E.�coli，酵母，昆虫，哺乳動物，植物など）のコドン最適化による発現タンパク質の最大化を無償で行います。

※繰り返し配列が含まれるDNA断片は，合成できない場合もあります。

オンラインオーダー

MemoOptimumGene テクノロジーとはGenScript 社独自の配列最適化技術 OptimumGene のアルゴリズムは，コドン出現頻度，mRNA の構造や転写・翻訳の際の調節領域などタンパク質発現における様々なステージでのパラメータを加味して最適化を行います。

150

KDM M

75

50

32

発現誘導を行っていない系

他社システムによりコドン最適化した配列

最適化を行っていない元来の配列

OptimumGeneによりコドン最適化した配列

タンパク質α

哺乳動物由来のタンパク質�α�をE.�coli で発現させた。OptimumGeneでコドン最適化させた場合，最適化を行っていない場合の 10倍に，また他社システムの 3倍に発現量が増大した。

まずはお気軽にご相談下さい！

TEL 03-5684-1645　　FAX 03-5684-6539 : [email protected]

受託・特注品担当［メーカー：FUN］

￥45～/bp



28

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


64832


受　託

ノックイン遺伝子の挿入位置を安価に解析します外来DNAの挿入位置解析受託サービス

合同会社PGL（ピージーエル）独自の技術であるPGL法を用いて，生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出／解析するサービスです。

Memo特許申請中の技術「PGL法」とは生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出する方法です。探索したい遺伝子配列がわかっていれば，ゲノム内のどこに入っているかが安価に解析できます。複数箇所にも対応でき，前後のゲノム配列との融合遺伝子として外来遺伝子を検出できます。

応用例：�トランスジーンの導入位置の探索，ウイルスのインテグレーション位置の探索，融合遺伝子の探索など。

外来DNA特異的プライマー（　：ビオチン）

任意プライマー

PCR①

②④

③

ゲノムDNA

PCR

カラム精製

DNAシークエンス

1.�トランスジーンやウイルス DNA などの外来 DNA に特異的なプライマー（5’ 末端ビオチン化）と任意プライマーを用いて，外来DNAの近傍配列を増幅する。

2.�アフィニティー精製により，近傍配列を含む PCR産物を濃縮する。3.�濃縮された PCR 産物を鋳型に再度 PCR を行い，外来DNAの近傍配列を特異的に増幅する。

4.�アガロース電気泳動により DNA フラグメントを分取後，キャピラリーシーケンサーにより近傍配列を解読し，外来DNAの挿入位置を決定する。

解析例�

■形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定

手順

1.�マイクロインジェクションによって作製された形質転換マウスからゲノムDNAを抽出する。

2.�PGL 法を用いてトランスジーン近傍配列の特異的増幅を行う。（下図）

3.�アガロース電気泳動によって分離されたDNAフラグメントを回収する。

4.�キャピラリーシーケンサーを用いてトランスジーン近傍配列を解読する。

5.�マウスゲノムとトランスジーンの融合配列を確認する。

6.�近傍配列の Blast 検索でマウスゲノム上のトランスジーンの挿入位置を決定する。

結果異なるトランスジーンを持つ形質転換マウス 4系統において，それぞれの系統で複数のトランスジーン挿入およびその挿入位置を決定することができた。

［決定されたトランスジーン挿入位置］（系統 1）�a：Chr8:124，…，…．�

b：Chr6:52，…，…．（系統 2）�c：Chr3:10，…，…．�

d：Chr1:154，…，…．�e：Chr8:115，…，…．

（系統 3）�f：Chr16:54，…，…．�g：Chr14:82，…，…．

（系統 4）�h：Chr12:120，…，…．�i：Chr10:79，…，…．�j：Chr1:98，…，…．�k：Chr12:37，…，…．

※未発表データのため，挿入位置の下 6桁は「…，…．」で表示しています。

M：DNA size markerP：parent line1～ 4：形質転換マウス

Mbp

8000

4000

2000

1000

500

P 1 2 3 4

●�トランスジーンの配列情報●�使用したウイルス，ウイルスベクターなどの情報●�トランスジェニック生物のゲノムDNA�（100�ng/μg，A260/A280＞1.6，A260/A230＞1.6）

ご用意いただくもの�

利用例�●�CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子ノックインのオフターゲットによって生じた遺伝子挿入の位置決定

●�HTLV，HBV，HIV などのウイルスによって宿主ゲノムに挿入されたウイルスゲノムの挿入位置の決定

●� iPS 細胞などの再生医療向け細胞株の安全性評価●�形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定


詳細は当社受託・特注品担当までお問い合わせ下さい。［メーカー：PGL］



29

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


64619


遺伝子が挿入されても表現型への影響がなく安全な遺伝子領域として知られる AAVS1 Safe Harbor Site に，任意の目的遺伝子や Cas9 などを簡便にノックインするキットです。

特　長�

キット内容�

MemoSafe Harbor とはSafe�Harbor は様々な細胞で転写活性を有し，かつその領域に遺伝子導入を行ってもフェノタイプに影響を及ぼさない遺伝子領域です。ゲノムに外来遺伝子を導入する際に，遺伝子導入による影響や導入遺伝子の発現に影響が生じないように Safe�Harbor を標的として利用する手法が確立されています。

●�導入遺伝子は恒常的に発現します。●�同質遺伝子細胞株を簡便に構築できます。●�オフターゲット効果を最小化できます。●�hspCAS9�AAVS1�Safe�Harbor�Knock-in�Donor� �（#CAS620A-KIT）は，CRISPR/Cas9 ライブラリーの効率的なスクリーニングに有用です。

●�HR ドナーベクター（#GE62xA-1）●�AAVS1 用 gRNA/Cas9 発現 All-in-one ベクター（#CAS601A-1）●� junction�PCR プライマー（#GE640PR-1，AAVS へのノックイン確認用）

※それぞれ単品でのご購入も可能です。


目的遺伝子をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-EF1-MCS

メーカー商品コード包　装価格（￥）

SBI GE622A-KIT 1�kit 344,000 SBI166221

Cas9 をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-EF1-hspCas9


SBI CAS620A-KIT 1�kit 363,000 SBI136201

任意のプロモーターとレポーター遺伝子（GFP）をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-MCS-GFP



任意のプロモーターと目的遺伝子をノックインするキット

AAVS1-SA-puro-MCS



使用例�

M 11. Cas9 stable cell　 line in AAVS1　 locus #8

2. Cas9 stable cell　 line in AAVS1　 locus #17

3. Non transfected　 293 cells

2 3Cas9 knock in at AAVS1 locus

ノックイン細胞

NC

9000800070006000500040003000200010000

8 11 17 20 28 32

Relative expression

左：本製品を用いて作製した HEK293 細胞株各クローン AAVS1 遺伝子座における Cas9 遺伝子の qPCR による発現量解析

右：Cas9 高発現細胞 8 と 17 の Surveyor Assay の結果矢印（←）のバンドはCas9による切断を示す。コントロール�細胞（NC，lane3）には，このバンドが存在しない。

MemoSurveyor Assay によるゲノム切断効率の測定ターゲティングの目安として，Surveyor�Assay で求められる「挿入欠失（indel）頻度」を使用できます（Guschin�D.�Y.,�et.�al.,�2010）。PCR で標的遺伝子を増幅すると，遺伝子対が増幅されます。CRISPR/Cas9 による変異は，染色体間の塩基配列の相違となって現れるため，遺伝子対それぞれから生じる増幅産物は，配列が異なる場所にバルジを生じます。PCR産物をヌクレアーゼ消化し，バイオアナライザーやアガロースゲル電気泳動で分析すると，挿入欠失の起こった細胞の割合を推定することができます。

ゲノムの安全領域にノックインするキットAAVS1 Safe Harbor Targeting System



30

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


784


BAC，PAC，プラスミドベクター，コスミド，または E. coli 染色体等の DNA 改変を行うシステムです。CRISPR / Cas9 でノックアウトを導入し，Red / ET で変異を導入した BAC コントラストを導入することで，少ない労力と制約の元で遺伝子改変が可能です。

特　長�


使用例�●�ファージタンパク質による相同組換えを利用してE.�coli の遺伝子改変を行う技術です。

●�最大 80�kb の配列をクローニングできます。●�制限酵素部位とは無関係に作用するため，DNA 配列中のどの位置でも改変が可能です。

●�ライゲーション操作は不要です。

■BAC Modification Kit, Quick and Easy（#K001）●�E.�coli 染色体の改変や，BAC，PAC，コスミド，プラスミドベクターから不要な配列を欠失させるキットです。

●�キットに含まれるネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子カセット（Tn5-neo）の両端に，PCRで相同配列を付加します。

※本キットに含まれるネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子カセットには，E.�coli のみで機能するプロモーターが連結しています。

■BAC Modification Kit, Counter-Selection（#K002）●�野生型 rpsL 遺伝子によるストレプトマイシン感受性を利用したカウンターセレクションにより，BACなどに選択マーカーのような余分な配列を残さずに様々な改変を行うキットです。

●�目的の遺伝子が相同組換えを起こした場合，rpsL-neo 遺伝子カセットが切り離されてストレプトマイシン耐性となるため，簡単に選択できます。

※ストレプトマイシン耐性のE.�coli 株をご使用下さい。※本キットに含まれるネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子カセットには，E.�coli のみで機能するプロモーターが連結しています。

■BAC Subcloning Kit（#K003）●�BAC，PAC，P1 オリジンをベースにしたベクター，またはコスミドなどから，制限酵素部位の制約を受けずに長鎖のDNA断片をサブクローニングできるキットです。

●�キットに含まれる Col�E1 オリジンおよびアンピシリン耐性マーカーを含む線状DNAに相同領域を付加することにより，目的遺伝子を含むDNA 断片と相同組換えを起こさせることができます。

■Animal targeting constructs●�条件つきノックアウト・ノックイン●�エクソンスワッピング●�点変異の導入

■大腸菌ゲノムの改変●�遺伝子破壊・欠失・挿入●�レポーター遺伝子やタグ導入●�promoter�fine�tuning●�点変異の導入


BAC Modification Kit, Quick and Easy, Red/ET RecombinationGBR100010 GBR K001 � Quick and Easy 1�kit�/ 179,000GBR100020 GBR K002 � Counter-Selection 1�kit�/ 207,000

BAC Subcloning Kit, Red/ET RecombinationGBR100030 GBR K003 � 1�kit�/ 161,000


1.�Attachment�of�homology�arms相同領域に 50�bp のフランクがあれば，組換え可能です。

2.�RecombineeringRed/ET 発現ベクターをE.�coli に形質転換します。目的遺伝子を含む PCR産物を導入します。

3.�Selection/screening組換えDNAを持った細胞を選択します。

キット内容�●�pRed/ET�expression�plasmid●�Suitable�control�experiments※L-arabinose が別途必要です。

本製品は，大学・官公庁研究所（Academic）にご所属の方のみご購入いただけます。また，ご購入に際して事前にライセンス使用許可が必要です。詳細は，フナコシWeb に掲載のサブライセンス確認書をご覧下さい。営利団体・企業（Commercial�Entity）にご所属の方が Red�/�ET�Recombinationテクノロジーを使用するためには，Gene�Bridges社とのライセンス契約を締結していただくほか，ライセンス料が別途必要となります。詳細は当社受託・特注品業務担当までお問い合わせ下さい。


相同組換えを利用した正確かつスピーディーなクローニングRed / ET Recombination System



31

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


5301


トランスポゾンを用いて，ウイルスを用いずに目的 cDNA・miRNA・shRNA 配列を宿主細胞のゲノムに組み込み，安定発現細胞株を樹立できる発現システムです。※本製品で用いているウイルスベクターには，欠損し機能を有さないものの，構造遺伝子の gag と env の一部が含まれています。

組み込んだ配列を痕跡を残さず除去できますPiggyBac Transposon Vector System

営利団体・企業（Commercial Entity）にご所属のお客様が 9 ヶ月を越えて本製品を使用される場合，ライセンス契約が必要です。


原　理

1. 目的 cDNA 配列などを挿入した PiggyBac Transposon Vector（p.33）と，切り出し用 Super Transposase 発現ベクター（#PB210PA-1，下記）を宿主細胞にコトランスフェクションする。

2. 発現した Super Transposase により，PiggyBac Transpo-son Vector 中の両端に存在するトランスポゾン特異性末端逆位配列（PiggyBac Terminal Repeat）の部分で配列が切り出される。

3. 切り出された配列が，宿主細胞ゲノム中の TTAA 部位に組み込まれ，安定発現細胞株が樹立される。

4. 安定発現細胞株に除去用 Excision Only Transposase 発現ベクター（#PB220PA-1）のみを再度トランスフェクションすると，発現した Transposase により，組み込んだ目的配列が痕跡を残さずに除去される。

特　長

● 一度のトランスフェクションで，安定発現細胞株の樹立が可能です。

● 高効率での遺伝子導入，iPS 細胞の樹立，可逆的な遺伝子改変などに有用です。

● ヒト・マウス・ラット由来細胞で使用できます。

● ゲノムに組み込んだ目的配列は，除去用（Excision only）Transposase により痕跡を残さずに除去できます。

● 10～100 kb の配列も導入可能です。● 複数のベクターを同時に組み込むことも可能です。

（痕跡を残さずに除去）

＋ITR ITR

ITR ITR

＋

ITR ITR

ITR ITR

PiggyBacトランスポゾンベクター（p.33） Super PiggyBac

Transposase

染色体DNAのTTAA配列

Excision only PiggyBac Transposase

“CUT”

“PASTE”

“RE-EXCISE”

Footprint-free Removal

Transposase発現ベクター

■切り出し用 ■除去用品　　名メーカー商品コード包装 / 価格（￥）

Super PiggyBac Transposase Expression VectorSBI PB210PA-1 10 μg / 76,000 SBI998509

Excision only PiggyBac Transposase Expression VectorSBI PB220PA-1 10 μg / 76,000 SBI998508

※Transposase 発現ベクターは，使い切りの製品となります。

SV40poly-A

SV40 late16s Intron

Sad(2000)Hind Ⅲ

(4347)

Sma Ⅰ(269)

Sma Ⅰ(269)

CMVPromoter

Super PiggyBacTransposase

Super PiggyBacTransposaseExpression Vector

(6964 bp)

Excision onlyPiggyBacTransposase

Excision OnlyPiggyBacTransposaseExpression Vector

(6964 bp)

SV40poly-A

SV40 late16s Intron

Sad(2000)Hind Ⅲ

(4347)

CMVPromoter



32

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


営利団体・企業（Commercial Entity）にご所属のお客様が 9 ヶ月を越えて本製品を使用される場合，ライセンス契約が必要です。



Inducible cDNA Cloning and Expression Vector ［PB-Cuo-MCS-IRES-GFP-EF1-CymR-Puro］

SBI PBQM812A-1 10 μg / 173,000 SBI081200Cumate Solution, 10000×

SBI PBQM100A-1 0.5 ml / 18,000 SBI999379

MCS5’- Xbal Nhel EcoRl BstBl Swal -3’

マーカー

MCS5’- Xbal Nhel EcoRl BstBl Swal BamHl Notl -3’

CMV orMSCV

Dual Promoter

マーカー

siRNA template insert

sense

＋1

sense Dicer

UU UUUU

loop antisense

antisense

sense

antisense

terminatorTranscription

shRNA shRNA siRNA

H1 promoter

puro

SV40poly─A

CoreInsulator

BamHl

EF1α or CMV

CoreInsulator

5’PBTerminalRepeat

3’PBTerminalRepeat T2A

HI

EcoRl

pUCori

PiggyBacshRNA Vectors

AMpR

PiggyBac cDNA Cloning and Expression Vector

Inducible cDNA Cloning and Expression Vector

PiggyBac cDNA Cloning and Expression Vector

■cDNA/miRNA 恒常発現ベクター

■shRNA 発現ベクター

● 包装／価格：10 μg / ￥108,000

● 包装／価格：10 μg / ￥108,000


目的遺伝子の発現マーカーの発現マーカー商品コード

EF1α （IRES）

GFP PB530A-2 SBI053000

RFP PB531A-2 SBI053100

Neo PB533A-2 SBI053300

CMVEF1α

Puro PB510B-1 SBI999387

GFP PB511B-1 SBI999386

RFP PB512B-1 SBI999385

GFP＋Puro PB513B-1 SBI999384

RFP＋Puro PB514B-2 SBI051410

MSCV GFP＋Puro PB713B-1 SBI999183

■cDNA/miRNA 誘導発現ベクター

● Cumate の添加により，cDNA または miRNA を厳密に誘導発現できるベクターです。● 非誘導時のバックグラウンドが抑えられます。● 本製品では 1 つのベクターで，目的誘導遺伝子と CymR リプレッサーを共発現します。

Cumate スイッチ OFF

Cumate スイッチ ON

CymR リプレッサーにより遺伝子の発現が抑制されている状態

Cumate を加えると，Cumate が CymR リプレッサーに結合し CymR リプレッサーがCuO から解離するため，遺伝子発現が起こります。Cumate オペレーター配列（CuO）に強く結合している CymR リプレッサーを介して発現の ON/OFF が行われます。

Inducible cDNA Cloning and Expression Vector （PB-Cuo-MCS-IRES-GFP-EF1-CymR-Puro）


目的遺伝子の発現マーカーの発現マーカー商品コード

H1CMV

GFP＋PuroPBSI505A-1 SBI999377

EF1 PBSI506A-1 SBI999376



33

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


8066


プロモーターと発現遺伝子の組み合わせなどの遺伝的特徴をゲノム部位特異的に導入できます。様々な目的遺伝子をゲノム上の同部位にノックインし，同じ遺伝的背景を持つアイソジェニック細胞株を作製できます。

同じ遺伝的背景を持つノックイン細胞株を作製できますPinPoint Targeted Integration System

phiC31 インテグラーゼ（p.35）またはCas9 を使用します。

原　理� 製品ラインナップ�

1.�ゲノムの標的部位へ PinPoint�Site を導入するPlacement ベクターを用いて，ゲノム上に目的遺伝子の挿入サイト（PinPoint�Site）を指定する。方法1 PinPoint-FC システムphiC31 インテグラーゼ発現プラスミドと PinPoint-FC�Placement�Vector をトランスフェクションし，phiC31インテグラーゼにより，標的部位にPinPoint�Siteを導入する。方法2 PinPoint-HR システムCRISPR/Cas9 と PinPoint-HR�Placement�Vector をトランスフェクションし，相同組み換え修復（HDR）により切断した領域に PinPoint�Site を導入する。

2.�PinPoint�Site に目的遺伝子を導入するPinPoint ドナーベクターと PinPoint インテグラーゼ発現ベクター（右記）を細胞にトランスフェクションし，1.で指定した PinPoint�Site に目的遺伝子カセットを挿入する。

3.�（オプション）Cre�/�LoxP 反応により遺伝子カセットを除去する

Step 1Insert PinPoint Placement site （PinPoint attP） into the target genome using Cas9 or PhiC31

Selection Cassette

Selection Cassette

LoxP

LoxP

Cas9OR

PhiC31 Integrase

PinPoint attP

PinPoint attP

Genomic DNA

PinPoint attPPlacement Vector

Step 2Integrate PinPoint Donor Vector into pre-placed PinPoint attP site

Selection Cassette

PinPoint Integrase

LoxP Expression CassetteLoxP

Genomic DNA

Expression Cassette

LoxP PinPoint attB

PinPoint DonorVector

Step 3 （optional）Remove selection cassette and other vector sequences with Cre/Lox

Cre Recombinase

Expression CassetteLoxP

Genomic DNA


PinPoint-FC System for Platform Cell Line Generation & RetargetingSBI PIN300A-KIT 1�kit�/ 454,000 SBI998558

PinPoint-FC attP Placement VectorSBI PIN300A-1 10�μg�/ 121,000 SBI998559

PinPoint-HR attP Placement VectorSBI PIN400A-1 10�μg�/ 201,000 SBI998565

PinPoint-HR attP AAVS1 Placement VectorSBI PIN410A-1 10�μg�/ 201,000 SBI998563相同組換えによりAAVS1 遺伝子に PinPoint�Site を導入するベクター。

PinPoint-HR System for Platform Cell Line Generation & RetargetingSBI PIN400A-KIT 1�kit�/ 454,000 SBI998564

PinPoint Integrase Expression PlasmidSBI PIN200A-1 10�μg�/ 117,000 SBI998560

alpha PinPoint Donor VectorSBI PIN500A-1 EF1 10�μg�/ 161,000 SBI998561pPP-EF1a-MCS-pA-attB-Puro-pA

PinPoint Donor VectorSBI PIN510A-1 CAG 10�μg�/ 161,000 SBI998554pPP-CAG-MCS-WPRE-pA-attB-Puro-pA

PinPoint Donor VectorSBI PIN520A-1 Empty 10�μg�/ 161,000 SBI998553pPP-MCS-WPRE-pA-attB-Puro-pA

■ 方法1 （PinPoint-FC システム）の All-in-one キット

キット内容：● PinPoint-FC�attP�Placement�Vector（#PIN300A-1）● PhiC31�Integrase�Expression�Plasmid（#FC200PA-1）p.35● PinPoint�Integrase�Expression�Plasmid（#PIN200A-1）● CAG�PinPoint�Donor�Vector（#PIN510A-1）● CAG-GFP-T2A-Luc�PinPoint�Positive�Control�Donor�Vector（#PIN600A-1）

■ 方法2 （PinPoint-HR システム）の All-in-one キット

キット内容：● PinPoint-HR�attP�Placement�Vector（#PIN400A-1）● PinPoint�Integrase�Expression�Plasmid（#PIN200A-1）● CAG�PinPoint�Donor�Vector（#PIN510A-1）● CAG-GFP-T2A-Luc�PinPoint�Positive�Control�Donor�Vector（#PIN600A-1）

※別途，細胞内でCas9 を発現させる必要があります。

キット単品�

■PinPoint Site Placement ベクター

■PinPoint インテグラーゼ発現用ベクター

■PinPoint ドナーベクター



34

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


7553


目的遺伝子組み込み用ドナーベクターと，phiC31 インテグラーゼ発現ベクターを用いて，目的遺伝子をゲノムのphiC31 インテグラーゼ認識配列に組み込むシステムです。ウイルスを用いずに安定発現細胞株を作製できます。

ウイルスを使わず，シングルコピーをワンステップでゲノムに導入phiC31 Integrase Vector System

原　理�

使用例�


1.�目的遺伝子を attB ドナープラスミドにクローニングし，PhiC31�Integrase�Expression�Plasmid（#FC200PA-1，右記）とコトランスフェクションする。

2.�細胞内でPhiC31�Integraseが一過性発現し部位特異的な組換えが生じる。（ドナープラスミドの attB とゲノムのpseudo�attP 間）

3.�pseudo�attP サイトはゲノム中の転写活性部位に存在することが多いため，導入遺伝子は安定的に発現する。

目的遺伝子

＋

目的遺伝子

attB

PhiC31 Integrase

PhiC31 Integrase

Pseudo attP

attL attR

Pseudo attP

attB Donor Plasmid

目的遺伝子

attB

attB Donor Plasmid

MemophiC31 インテグラーゼは，バクテリオファージ由来の配列特異的セリンリコンビナーゼです。ファージゲノム内の attP�site と宿主バクテリアゲノム内の attB�site の 2 つの 34�bp 配列（attachment�site：att）間の組換えを触媒します。哺乳動物細胞を含む多くの細胞で効果的に機能することが知られ，どのようなサイズのドナーベクターにもシングルコピーとして結合することができ，コファクターを必要としません。

HEK293 細胞にドナーベクター（#FC551A-1）と phiC31�Integrase�Expression�Plasmid（#FC200PA-1）をトランスフェクションした。Puromycin を添加後，培養・観察した。大多数の細胞が GFP を発現していることがわかる。

Phase

GFP GFP

Phase

4 Days 11 Days


PhiC31 Integrase Expression PlasmidSBI FC200PA-1 10�μg�/ 84,000 SBI998632

PhiC31 Donor Vector［pFC-EF1α-MCS-pA-PGK-RFP-T2A-Puro］SBI FC550A-1 10�μg�/ 120,000 SBI998615

PhiC31 Donor Vector［pFC-PGK-MCS-pA-EF1α-GFP-T2A-Puro］SBI FC551A-1 10�μg�/ 120,000 SBI998614

PhiC31 Donor Vector［pFC-CMV-MCS-pA-SV40-Neo］SBI FC501A-1 10�μg�/ 120,000 SBI998617

PhiC31 Donor Vector［pFC-MCS-pA-SV40-Neo］SBI FC500A-1 10�μg�/ 120,000 SBI998618

Positive Control Donor Vector［pFC-CMV-GFP-SV40-Neo］SBI FC520A-1 10�μg�/ 120,000 SBI998616

■phiC31 インテグラ－ゼ発現ベクター

■ドナーベクター

phiC31 インテグラーゼ（上記）を用いて，ゲノムに GFP を組み込むポジティブコントロール用のベクターです。



35

Cas9導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

その他


注目記事

目次Cas9 導入-

タンパク質で導入 p.4～5

Cas9 導入-

プラスミドで導入 p.11～14

Cas9 安定発現細胞株 p.18

guideRNA p.6～8

Cas9 導入-

mRNA で導入 p.8～10

Cas9 導入-

ウイルスベクターで導入 p.15～17

ドナーベクターノックイン／ノックアウトドナーベクター p.20～21長鎖 ssDNA 調製キット p.22～23PiggyBac ドナーベクターと Transposase p.19

ゲノム編集の確認Cas9 増幅プライマー／抗 Cas9 抗体 p.24Cas9/SaCas9 定量用 ELISA キット p.25標的配列の切断検出キット p.25

受託サービス遺伝子改変マウス作製受託 p.26ベクターデザイン・作製など受託 p.27遺伝子改変細胞株の作製受託 p.28人工遺伝子合成受託 p.28外来 DNA の挿入位置解析受託 p.29

その他の遺伝子改変Safe Harbor にノックインするキット p.30相同組換えによるクローニングシステム p.31組み込んだ配列を痕跡を残さず除去 p.32～33アイソジェニック細胞株の作製に p.34ウイルスを使わず安定発現細胞株を作製 p.35

Cas9 タンパク質＆ guideRNA 導入専用トランスフェクション試薬

安定かつ高い編集効率完全合成の guideRNA をお届けする受託サービス

長鎖の一本鎖オリゴ（ssDNA）を半日間で簡単に調製できるキット

p.4～5

p.6～7

p.22～23

jetCRISPR & SpCas9

Long ssDNA Preparation Kit

メーカーインタビュー掲載しています！

受託


36

Cas9 導入

guideRNA

ドナー

編集確認

受託

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販売店

※本紙に記載されている価格は，2018年 6月1日現在です。 FUN-6184（ 2018.6, № 658 ）

フナコシ株式会社　〒113-0033　東京都文京区本郷2丁目9番7号http://www.funakoshi.co.jp/　e-mail : info＠funakoshi.co.jp

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機器に関して : Tel.03-5684-1619　　Fax.03-5684-5643

NOTE※本紙に記載されている価格は，2018 年 6 月 1 日現在です。表示価格に，消費税等は含まれていませ

ん。一部価格が予告なく変更される場合がありますので，あらかじめご了承下さい。※本紙に掲載されている製品は，すべて研究目的用にのみ販売しています。医薬品，診断用医薬品，

食品，食品検査等の用途には使用できません。※ 印の製品は，「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律

（通称：カルタヘナ法）」使用規制対象となりますので，ご使用に際しては規制に則し，適切にお取り扱い下さい。

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※ 印の製品は,「毒物及び劇物取締法」に基づく医薬用外毒劇物です。法規制に従って，保管，廃棄等して下さい。

※ 印の製品は，毒性があるため，取り扱いに注意または厳重な注意が必要です。製品は，鍵の掛かる場所に保管して下さい。添付されているデータシートや商品ラベルをよくお読み下さい。

※ 印の製品には安全にご利用いただくための警告ラベルが貼られています。表示に従って安全対策を実施して下さい。

※ 印は，液体窒素中での保存を要する製品です。ドライアイス包装で配送していますが，製品到着後，直ちに液体窒素中で保存して下さい。

※ 印は，－80℃ での保存を要する製品です。ドライアイス包装で配送していますが，製品到着後，直ちに－80℃ のフリーザー等に保存して下さい。

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ゲノム編集 2018 - Microsoft...3. Yoshimi K. et al., Nature Communications, 7: 10431, 2016 4....

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