Ferran Navarro Lucrecia Carrara Navarro Lucrecia Carrara Servei de Microbiologia 19 d’Abril de...
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Diagnòstic molecular de la sèpsia
Ferran NavarroLucrecia Carrara
Servei de Microbiologia
19 d’Abril de 2012
Índice
1. Concepto de Theranostic
2. Diagnóstico de sepsis / bacteriemia
3. Puntos clave de la biología molecular
4. Evaluación Magicplex sepsis
a) Objetivosb) Metodologíac) Resultadosd) Conclusión
5. Reflexión de futuro
Concepto de Theranostics
2 ó más de los siguientes criterios:
- Temperatura: > 38°C ó
< 36°C
- Frecuencia cardiaca: > 90 lat/min
- Frecuencia respiratoria: > 20 resp/min ó
PaCO2: < 32 mmHg
- Recuento de glóbulos blancos: > 12.000 cel/mm3 ó
< 4000 cel/mm3 ó
> 10 % de formes inmaduras
(en banda)
Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)
Dia
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Causas de SRISD
iagn
ostic
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terie
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Causas de SRIS
Traumatismos
Dia
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Causas de SRIS
Traumatismos
Pancreatitis
Dia
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Causas de SRIS
Traumatismos
Pancreatitis
Quemaduras
Dia
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Causas de SRIS
Isquemia
Hemorragias
Cirugías complicadas
Embolismo pulmonar
Traumatismos
Pancreatitis
Quemaduras
Dia
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de s
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s / b
acte
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Causas de SRIS
Traumatismos
Quemaduras
Pancreatitis
Isquemia
Hemorragias
Cirugías complicadas
Embolismo pulmonar
INFECCIÓN
Dia
gnos
tico
de s
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s / b
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ia
Causas de SRIS
Traumatismos
Quemaduras
Pancreatitis
Isquemia
Hemorragias
Cirugías complicadas
Embolismo pulmonar
INFECCIÓN
Cuando el SIRS es producido por una infección: SEPSIS
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ia
Dia
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iaSepsis
Una de las 10 causas principales de mortalidad
600 muertes diarias en EEUU
Tratamiento inadecuado- Duplica la mortalidad.
- Incrementa 7% la mortalidad cada hora de retraso.
Disminución de la mortalidad- Baja un 17% si se informa el Gram en < 1h de positividad por el sistema
- La detección rápida de MRSA en UCI reduce la mortalidad de 48 a 9%.
Técnica de referencia. HemocultivoD
iagn
ostic
o de
sep
sis
/ bac
terie
mia
Ventajas- Necesidad de aislar el microorganismo para:
a. Identificación definitiva e identificación infraespecie (serotipo, patogrupo, serogrupo…)
b. Estudios de sensibilidad
c. Estudios de epidemiología molecular
Desventajas- Falsos negativos en enfermos tratados con ATB
- Lento o nulo crecimiento de microorganismos exigentes
- Resultados a las 24-48 horas
Dia
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iaTécnicas alternativasA partir de hemocultivo positivo:- Detección de antígeno
- Detección de ácidos nucleicosa. PNA-FISH (Hibridació in situ con sondas fluorescentes dirigidas al rRNA)b. RT-PCR (GeneXpert)c. Arrays con nanopartículas (Verigene, Nanosphere)
- Espectrometría de masas. a. PCR/ESI-MS: Espectrometría de masas de ionización por electrospray. Calcula el ratio masa/carga de un producto de amplificación. (Abbott PLEX-ID)b. MALDI-TOF. (Sepsityper system; Bruker Daltonics)
- Pirosecuenciación: Secuenciación de DNA basado en la monitorización a tiempo real de la síntesis de DNA
A partir de la muestra (directo de sangre)Detección de ácidos nucleicos
- PCR/ESI-MS Espectrometría de masas de ionización por electrospray Calcula el ratio masa/carga de un producto de amplificación. (Abbott PLEX-ID)
- RT-PCR (SeptiFast, Magicplex)
- PCR-secuencición
Dia
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iaTécnicas alternativas
1. Conocimiento de la genómica (dianas a detectar):- Conocimiento del genoma completo de muchos microorganismos
- Variaciones genómicas infraespecíficas. Secuenciación del genoma completo de varias cepas
- Desarrollo de la bioinformática: Genómica comparativa, genómica funcional
- Detección de dianas para la identificación pero también de mecanismos moleculares de resistencia
Puntos clave de la Biología MolecularPu
ntos
cla
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Bio
logí
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olec
ular
2. Sistemas de extracción de ácidos nucleicos rápidos, sencillos y eficientes:- Lisis de la pared microbiana:
Extracción de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de una gran variedad de microorganismos y por tanto capacidad de lisis de una gran variedad de paredes (Ej: micobacterias)
- Nucleasas:
Protección de los ácidos nucleicos extraídos y eliminación de los inhibidores de la muestra
- Automatización:
Los extractores automatizados aseguran una mayor reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Puntos clave de la Biología MolecularPu
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Bio
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La extracción de los ácidos nucleicos es probablemente el paso más crítico de cualquier
reacción de amplificación.
4. Control de calidad del procesoContaminación por amplicones
Antiguamente zonas separadas (Pre y Post PCR)
PCR a tiempo real: amplificación y revelado en sistema cerrado
Actualmente se incluye así mismo la extracción
Control de amplificación
Antiguamente: controles positivos y negativos
Actualmente:
control interno (amplificación simultánea de otra diana)
control automatizado de reactivos
Puntos clave de la Biología MolecularPu
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Bio
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Objetivos del estudioEv
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obje
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Determinar el rol clínico-microbiológico del sistemaSeegene Magicplex™ Sepsis Real-time Test
en el diagnóstico molecular de sepsis.
Criterios de inclusión
Paciente mayor de 18 años.
Con indicación clínica de recogida de hemocultivo.
Proveniente de los siguientes servicios:
Unidad de Cuidados Intensivos (UCI)Semicríticos (SC)Hematología (hospitalizados)Urgencias.
Eval
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Plex
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etod
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ía
Casos / Muestras
Recolección de muestras:Abril del 2011 a Septiembre 2011. De domingos a viernes
10-20ml para Hemocultivos
1 ml para PCR (EDTA) guardada a 2-8ºC (< 24 h.)
Recolección de información clínica:Prospectiva
Parámetros clínicos de infección:
Constantes vitales, marcadores de inflamación y de disfunción de órganos, maniobras invasivas y origen de la infección
Antibióticos administrados
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Extracción de ácidos nucleicosEv
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Met
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olog
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La tecnología de Magicplex sepsis se basa en:- DPO
- READ
- Software CFX96™ Real-time PCR (Seegene)
Base molecular de Magicplex Sepsis Test
La tecnología de Magicplex sepsis se basa en:- DPO
- READ
- Software CFX96™ Real-time PCR (Seegene)
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olog
íaBASE MOLECULAR DE MAGICPLEX SEPSIS
105
104103
102101
100101/2
5 10 15 20
5
10
15
Cycles
RFU
(103
)
NTC
• Amplificación, detección e identificación.
> Primera amplificación: PCR convencional (System 9700; Applied Biosystems).
- Gram-positivos, mecA, vanA y vanB
- Gram-negativos y hongos
> Screening: se realizan tres amplificaciones por RT-PCR (SmartCycle; Cepheid):
• Gram-positivos
• mecA, vanA y vanB
• Gram-negativos y hongos.
> Identificación: las especies identificables cubren a más del 90% de los principales patógenos responsables de Sepsis.
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íaAmplificación
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olog
ía Amplificación / detección
Amplificación 2.5 h.Amplicon Bank 1. Gram (+) bacteria / DR
73 Gram (+) bacteria3 Drug resistance markers
Amplicon Bank 2. Gram (-) bacteria / Fungi
12 Gram (-) bacteria6 Fungi
Screening 30 min.Gram (+) bacteria Screening
Streptococcus spp.Enterococcus spp.
Staphylococcus spp.
Drug Resistance (DR) Screening
vanA vanB mecA
Gram (-) bacteria / Fungi Screening
Gram (-) bacteria-AGram (-) bacteria-B
Fungi
Identificación 30 min.ID 1 . Streptococcus spp.
ID 2 . Enterococcus spp.
S. agalactiaeS. pyogenes
S. pneumoniae
E. faecalisE. gallinarumE. faecium
ID 3 . Staphylococcus spp.S. epidermidis
S. haemolyticusS. aureus
ID 4 . Gram (-) bacteria-A
ID 5 . Gram (-) bacteria-A
P. aeruginosa A. baumanniiS. maltophilia
S. marcescensB. fragilisS. typhi
ID 6 . Gram (-) bacteria- B
ID 7 . Gram (-) bacteria- B
K. pneumoniaeK. oxytocaP. mirabilis
E. coliE. cloacaeE. aerogenes
ID 8 . Fungi ID 9 . Fungi
C. albicansC. tropicalisC. parapsilosis
C. glabrataC. krusei
A. fumigatus
Características clínicas de los pacientes.Ev
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Met
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267muestras213 pacientes
179 SRIS 88 No SRIS
52 Positivos(Probable Sepsis) 127 Negativos 11 Positivos
(Bacteriemia) 77 Negativos
63 EPISODIOS POSITIVOS DE
INFECCIÓN
Correlación entre ambas técnicas Hemocultivo / PCR
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Plex
/ re
sulta
dos
Hemocultivos positivos
Hemocultivos negativos
Hemocultivoscontaminados Total
PCR positivas 23 15 3 41PCR
negativas 22 169 18 209
PCR contaminadas 0 14 3 17
Total 45 198 24 267
Concordancia73% (con Contaminaciones)
83% (sin Contaminaciones)
6%
9%
Especies identificadasEv
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s
Especies TotalDetectado
Detectadaspor PCR
Detectadas por HC Coincidencias
Staphylococcus sp.S.C.N. 43 21 30 8MRSA 2 1 2 1MSSA 3 3 3 3
Bacilos Gram-negativosE. coli 20 14 10 4
K. pneumoniae 11 10 5 4K. oxytoca 1 0 1 0P. mirabilis 1 1 1 1E. cloacae 2 2 0 0
P. aeruginosa 5 1 4 0Streptococcus sp.
S. pneumoniae 4 3 2 1Enterococcus sp.
E. faecalis 2 2* 2 1Hongos
Candida sp. 1 0 1 0No incluídos en el panel de identificación
Bacillus sp. 1 0 1 0Lactobacillus sp. 1 0 1
S. viridans 1 0 1 0Corynebacterium sp. 4 0 4 0
Anaerobios 4 0 4 0S. dysgalactiae 3 1* 3 1
Al repetir PCR sobre subcultivo:P. aeruginosa.
(11) ( 5) (10) (4)
1 Atopobium rimae.1 Odoribacter splanchnicus
1 Veillonella sp.
Utilidad de la PCREv
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s
Resultados de la PCR.
Episodios clínicos
Episodios Positivos Episodios Negativos Totales
Positiva 41 17 58
Negativa 22 187 209
Totales 63 204 267
Prevalencia: 24%
VPP: 71%VPN: 89%
Especificidad: 92% Sensibilidad: 65%
Utilidad del HemocultivoEv
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resu
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s
Resultados del HC.
Episodios clínicos.
Episodios positivos: Episodios negativos: Totales:
Positivos: 45 24 69
Negativos: 18 180 198
Totales: 63 204 267
Prevalencia: 24%
VPP: 65%VPN: 91%
Especificidad: 88% Sensibilidad: 71%
Staphylococcus spp.Ev
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s
CtId/mecA Resultado PCR Resultado Hemocultivo
13.09/13.19 Negativa/mecA NEG
14.36/13.84 Negativa/mecA NEG
10.02/Neg Staphylococcus sp. S. aureus OXA R
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Plex
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sulta
dos
267 muestras
134 Sin ATB 101 Con ATB
23 Magicplex + 20 Hemocultivos + 17 Magicplex + 23 Hemocultivo +
14 contaminaciones
13 contaminados
3 contaminaciones
9 contaminados
32 Sin datos disponibles
Efecto de los ATB.
17% 15% 17% 23%
Alternativas MolecularesEv
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s
Test Desarrollado por:
Principio Límite de detección(UFC/ml)
Tiempo de respuesta
Sensibilidad/
Especificidad
SeptiTest
Molzyme, Bremen,Alemania
Broad-range PCRSecuenciación 20-40 para
S. aureus 8-12h >300 especies
87%/
85%
SeptiFast
Roche Molecular Systems,
USA.
Multiplex PCR sondas
de fluorescencia (FRET)
y secuenciación
3-30 6h
>90% de los principales patógenos
causantes de Sepsis.
70%/
99%
VYOO/LOOXSTER
SIRS-lab, Jena,
Alemania.
Multiplex PCR con gel de
electroforesis3-10 8h
>90% de los principales patógenos
causantes de Sepsis.+ 5 ATBR
?
Magicplex Seegene, Seul, Korea
Multiplex PCR sondas
de fluorescencia (FRET)
y secuenciación
30 para S. aureus, S
penumoniaeP aeruginosaCandida sp.
6h
>90% de los principales patógenos
causantes de Sepsis.
65%/
92%
PLEX-ID BAC Abbott/Ibis
Multiples PCRDetermina la
composicion de nucleótidos por MS
? 4-6h >300 especies 61%/
83%
CONCLUSIÓNEv
alua
ción
Mag
icPl
ex /
conc
lusi
ón
Magicplex Sepsis puede ser un complemento al hemocultivo aunque debido a la complejidad de la técnica sólo será útil en situaciones concretas dependiendo de la infraestructura del servicio.
•Sensibilidad (65-71%) especificidad; (92-88%); VPP (71-65%)y VPN (89-91%) muy similar al hemocultivo.•El porcentaje de contaminaciones es similar al hemocultivo(5-8%).•El uso de ATB previos afecta por igual ambas técnicas.•El punto de corte para estafilococos debería revisarse.•La detección de Enterobacterias es mayor para Magicplexque para el Hemocultivo.•La detección de P. aeruginosa es mayor para el Hemocultivoque para Magicplex.
Reflexión de FuturoEv
alua
ción
Mag
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Futu
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Drug dicovery today 2002;7:1092
AgradecimientosPere Coll
Roser PericasMiquel Turbau
Motse SeresIndalecio MoranIsabel Quintana
Rodrigo Martino
IZASA, S.A.Seegene, Inc
http://www.santpau.es/santpau/activitats/inicioMicrobiologia.htm