Farmasötik Gelistirme GC HPLC
-
Upload
dvrm-mslm-gzr -
Category
Documents
-
view
114 -
download
1
description
Transcript of Farmasötik Gelistirme GC HPLC
-
T.C.
HACETTEPE NVERSTES
SALIK BLMLER ENSTTS
RALOKSFENN BYOLOJK MATERYALDEN VE
FARMASTK PREPARATTAN ANALZ N GAZ
KROMATOGRAFS-KTLE SPEKTROMETRS
YNTEMNN GELTRLMES VE VALDE
EDLMES
Kim. Mnevver TANDOAN
Analitik Kimya Program
YKSEK LSANS TEZ
Ankara
2012
-
T.C.
HACETTEPE NVERSTES
SALIK BLMLER ENSTTS
RALOKSFENN BYOLOJK MATERYALDEN VE
FARMASTK PREPARATTAN ANALZ N GAZ
KROMATOGRAFS-KTLE SPEKTROMETRS
YNTEMNN GELTRLMES VE VALDE
EDLMES
Kim. Mnevver TANDOAN
Analitik Kimya Program
YKSEK LSANS TEZ
TEZ DANIMANI
Prof. Dr. Nuran zaltn
Ankara
2012
-
iv
iv
TEEKKR
Tez danmanm olarak bilgi ve deneyimleriyle bana yol gsteren, desteini
esirgemeyen Sayn Prof. Dr. Nuran zaltna,
Beni yksek lisans yapmam iin yreklendiren ve bu sre ierisinde her trl
yardm esirgemeyen sevgili hocam Prof. Dr. Nursabah E. Baya,
Teorik ve pratik derslerde verdikleri deerli bilgiler iin Analitik Kimya
Anabilim Dalnn saygdeer hocalarna,
almalarm srasnda verdii destek ve yardmlar iin Dr. Ebru Uaktrke
almalarm iin etken madde salayan Eli Lilly Companye,
Bu sre ierisinde beni her trl eken, destek ve yardmlarn esirgemeyen
Dr. Cafer akala,
Birlikte almaktan ok keyif aldm takm arkadalarm Sinan nol ve
Tuba Kaara,
Her trl destek ve yardmlar iin Doping Kontrol Merkezi alanlarna,
Hayatmda iyi ki var dediim dostlarma,
Bu gnlere gelmemi saladklar iin ALEME;
Sonsuz Teekkr
-
v
v
ZET
Tandoan, M., Raloksifenin Biyolojik Materyalden ve Farmastik Preparattan
Analizi iin Gaz Kromatografisi-Ktle Spektrometrisi Ynteminin
Gelitirilmesi ve Valide Edilmesi. Hacettepe niversitesi Salk Bilimleri
Enstits Analitik Kimya Program Yksek Lisans Tezi, Ankara, 2012.
Raloksifen, kadnlarda postmenopozal osteoporozun tedavisinde, erkeklerde doping
amacyla kullanlan selektif strojen reseptr modlatrleri (SERM) grubundan bir
ilatr. Raloksifenin insan idrarndan ve farmastik preparattan analizi iin yeni bir
gaz kromatografisi-ktle spektrometrisi (GC-MS) yntemi gelitirilmitir. Raloksifen
GC-MS analizinden nce silillenmitir. Tepkime koullar farkl trev reaktifleri,
tepkime scaklklar ve sresi gibi parametreler incelenerek optimize edilmitir.
Raloksifen, MSTFA/-merkaptoetanol/NH4I trevlendirme reaktifi kullanlarak 80
Cde 30 dkda etkin bir ekilde trevlendirilmitir. Metiltestosteron i standart (IS)
olarak seilmitir. Analiz seilmi iyon modunda (SIM) yaplmtr. Raloksifen iin
m/z 578, IS iin m/z 446 iyonlar nicel analiz amacyla seilmitir. Kromatografik
yntemi optimize etmek iin kromatografik parametreler (balang ve son frn
scaklklar, gaz ak hz) incelenmitir. Raloksifen idrardan karbonat tamponu (pH
9.0) ve metil tersiyer-butil eter kullanlarak ekstre edilmitir. Gelitirilen yntemin,
sistem uygunluk testleri, zgnlk, duyarllk, dorusallk, doruluk, kesinlik, geri
kazanm, kararllk, salamlk ve tutarllk parametreleri insan idrarndan ve
farmastik preparattan raloksifen analizi iin ayr ayr valide edilmitir. drardan
raloksifen tayini iin dorusallk aral 10-200 ng mL-1, alt tayin snr (LOQ) 10.0
ng mL-1
, gzlenebilme snr (LOD) 8.0 ng mL-1 olarak bulunmutur. Raloksifenin
farmastik preparattan analizi iin dorusallk aral 10-400 ng, LOQ 10.0 ng ve
LOD 5.0 ng bulunmutur. Validasyon sonular, yntemin duyarl, kesin, doru,
zgn, salam ve tutarl olduunu gstermitir. Gelitirilen ve valide edilen yntem
Raloksifen HCl ieren farmastik preparatn analizine baarl bir ekilde
uygulanmtr. Sonular kaynaklardaki bir yntemle karlatrlarak aralarnda
istatistiksel olarak anlaml bir fark bulunmamtr.
Anahtar Kelimeler: Raloksifen, Biyolojik Materyal, Farmastik preparat,
Validasyon, GC-MS
-
vi
vi
ABSTRACT
Tandoan, M., Development and Validation of Gas Chromatography-Mass
Spectrometry method for the Analysis of Raloxifene in Biological Material and
pharmaceutical preparation. Hacettepe University Institue of Health Sciences,
Master Thesis in Analytical Chemistry, Ankara, 2012. Raloxifene is selective
estrogen modulator (SERM) drug which is used in the treatment of postmenopausal
osteoporosis in women and used for doping in men. A new gas chromatography-
mass spectrometry (GC-MS) method was developed for the determination of
Raloxifene in human urine and pharmaceutical preparation. Raloxifene was silylated
prior to GC-MS analysis. Derivatization reaction was optimized to investigate
parameters such as different derivatization reagents, reaction temperatures and times.
It was efficiently derivatized using MSTFA/-mercaptoethanol/NH4I at 80 C for 30
min. Methyltestosterone was selected as internal Standard (IS). Analysis was
performed in selected ion monitoring (SIM) mode. The ions m/z 578 for raloxifene
and m/z 446 for IS were selected for quantitation. Chromatographic variables (initial
and final oven temperature, flow rate of gas) were investigated to optimize the
chromatographic method. Raloxifene was extracted from urine with carbonate buffer
(pH 9.0) and methyl ter-butyl ether. The developed method was validated in terms
of system suitability tests, specificity, sensitivity, linearity, accuracy, precision,
recovery, stability, robustness and ruggedness for analysis of Raloxifene in each
urine and pharmaceutical formulation. Linearity was established in the range of 10-
200 ng mL-1
, limit of quantification (LOQ) was 10.0 ng mL-1
and limit of detection
(LOD) was 8.0 ng mL-1
for urine. Linearity was found 10-400 ng, LOQ was 10.0 ng
and LOD was 5.0 ng for pharmaceutical analysis. Developed method was sensitive,
precise, accurate, specific, sensitive, rugged and robust due to the validation study
results. The developed and validated method was successfully applied to analysis of
the pharmaceutical preparation containing raloxifene HCl. The results were
compared to the method in literature and no significant difference was found
between them.
Keywords: Raloxifene, Biological Material, Pharmaceutical Preparation, Validation,
GC-MS
-
vii
vii
NDEKLER DZN
ONAY SAYFASI ......................................................................................................
TEEKKR ............................................................................................................... V
ZET .......................................................................................................................... V
ABSTRACT ............................................................................................................... V
NDEKLER DZN ............................................................................................ V
SMGELER VE KISALTMALAR ............................................................................ X
EKLLER DZN ................................................................................................. X
TABLOLAR DZN ................................................................................................ XV
1. GR VE AMA ................................................................................................... 1
2. GENEL BLGLER ................................................................................................. 3
2.1. Selektif strojen Reseptr Modlatrleri (SERM) ............................................ 3
2.2. Raloksifen HCl ................................................................................................... 4
2.3. Raloksifenin Analiz Yntemleri ......................................................................... 6
2.4. Spektroskopik Yntemler ................................................................................... 9
2.5. Kromatografik Yntemler ................................................................................ 10
2.5.1. Kromatografinin Dayand Temel Parametreler ........................................... 12
2.5.2. Kromatografinin Snflandrlmas ................................................................. 18
2.5.2.1. Ayrlma Mekanizmalarna Gre Snflandrma ......................................... 19
2.5.2.2. Uygulama Biimine Gre Snflandrma ................................................... 21
2.5.3. Gaz Kromatografisi (GC) ............................................................................... 22
2.5.3.1. Gaz-Kat Kromatografisi (GSC) ................................................................ 23
2.5.3.2. Gaz-Sv Kromatografisi (GLC) ................................................................ 23
2.6. Gaz Kromatografisi-Ktle Spektrometrisi (GC-MS) ....................................... 29
2.6.1. GC-MS Ara Balantlar ................................................................................ 31
-
viii
viii
2.6.2. yon Kayna .................................................................................................. 32
2.6.3. Ktle Analizr .............................................................................................. 33
2.6.4. Dedektr ......................................................................................................... 35
2.6.5. Vakum Sistemleri ........................................................................................... 36
2.6.6. GC- MS Sisteminin Ayarlanmas (Autotune) ................................................ 37
2.7. Trevlendirme Teknikleri ................................................................................. 40
2.8. rnek Hazrlama ............................................................................................... 42
2.8.1. Sv-Sv ekstraksiyonu .................................................................................. 42
2.8.2. Kat-Faz Ekstraksiyonu (SPE) ....................................................................... 43
2.9. Analitik Yntem Validasyonu .......................................................................... 43
2.9.1. Yntem Validasyonunun Deerlendirilmesinde Kullanlan Parametreler ..... 44
2.10. Kemometri ........................................................................................................ 49
2.10.1. Plackett-Burman Tasarm .............................................................................. 50
3. GERE VE YNTEMLER .................................................................................. 51
3.1. Kimyasal Maddeler ........................................................................................... 51
3.2. Cihazlar ............................................................................................................. 52
3.3. Cam ve Sarf Malzemeleri ................................................................................. 53
3.4. zeltiler .......................................................................................................... 53
3.4.1. Sentetik Preparatlarn Hazrlanmas ............................................................... 54
3.4.2. Farmastik Preparat zeltisinin Hazrlanmas ............................................. 54
3.4.3. UV-Spektrofotometrik Yntem in zeltiler .............................................. 55
3.5. Analiz Ynteminin Gelitirilmesi ..................................................................... 55
3.5.1. Trevlendirme Basamann Optimizasyonu ................................................. 55
3.5.2. Kromatografik Koullarn Optimizasyonu ..................................................... 56
3.5.3. Ekstraksiyon Basamann Optimizasyonu .................................................... 56
-
ix
ix
3.5.4. standart Seimi ........................................................................................... 56
3.5.5. Validasyon almalar iin rneklerin Hazrlanmas ................................... 56
3.5.6. Kalibrasyon Erilerinin Hazrlanmas ............................................................ 57
3.6. Analitik Yntem Validasyonu .......................................................................... 57
3.6.1. Sistem Uygunluk Testleri ............................................................................... 57
3.6.2. zgnlk ........................................................................................................ 58
3.6.3. Dorusallk ..................................................................................................... 59
3.6.4. Gzlenebilme ve Alt Tayin Snr .................................................................. 59
3.6.5. Doruluk ve Kesinlik ..................................................................................... 59
3.6.6. Geri Kazanm ................................................................................................. 60
3.6.7. Kararllk ........................................................................................................ 60
3.6.8. Salamlk ve Tutarllk ................................................................................... 61
3.7. UV/GB Spektrofotometrik Yntemle (Karlatrma Yntemi) Yaplan
almalar ......................................................................................................... 62
3.8. statistiksel Hesaplamalar ................................................................................. 62
4. BULGULAR ......................................................................................................... 63
4.1. Analiz Ynteminin Gelitirilmesi ..................................................................... 63
4.1.1. Trevlendirme Basamann Optimizasyonu ................................................. 63
4.1.2. Kromatografik Yntem Koullarnn Optimizasyonu .................................... 70
4.1.3. Ekstraksiyon Basamann Optimizasyonu .................................................... 72
4.1.4. Standart Seimi .......................................................................................... 73
4.2. Raloksifenin drardan Analizi in Yntem Validasyonu ................................ 75
4.2.1. Sistem Uygunluk Testleri ............................................................................... 75
4.2.2. zgnlk ........................................................................................................ 76
4.2.3. Kalibrasyon Erileri ve Dorusallk Aralklar ............................................. 79
-
x
x
4.2.4. Gzlenebilme ve Alt Tayin Snr .................................................................. 81
4.2.5. Doruluk ......................................................................................................... 81
4.2.6. Kesinlik .......................................................................................................... 81
4.2.7. Geri Kazanm ................................................................................................. 82
4.2.8. Kararllk ........................................................................................................ 83
4.2.9. Salamlk ve Tutarllk ................................................................................... 84
4.3. Raloksifenin Farmastik Preparattan Analizi in Yntem Validasyonu ........ 86
4.3.1. zgnlk ........................................................................................................ 86
4.3.2. Kalibrasyon Erileri ve Dorusallk Aralklar ............................................. 88
4.3.3. Gzlenebilme ve Alt Tayin Snr .................................................................. 90
4.3.4. Doruluk ......................................................................................................... 91
4.3.5. Kesinlik .......................................................................................................... 91
4.3.6. Geri kazanm .................................................................................................. 92
4.4. UV Spektrofotometrik (Karlatrma) Yntem Bulgular ............................... 92
4.5. Yntemin Farmastik Preparatlara Uygulanmas ............................................. 93
5. TARTIMA ........................................................................................................... 95
6. SONU VE NERLER .................................................................................... 102
KAYNAKLAR ........................................................................................................ 104
EKLER ..................................................................................................................... 111
ZGEM ............................................................................................................. 116
-
xi
xi
SMGELER ve KISALTMALAR
BH Bal hata
BMD Kemik mineral dansitometresi
BSS Bal standart sapma
BSTFA N,O bis(trimetilsilil) trifluoroasetamid
CEE Konjuge strojen
CI Kimyasal iyonlatrma
EI Elektron bombardman ile iyonizasyon
FDA Amerikan Gda ve la Dairesi
GC Gaz kromatografisi
H Kolon tabaka ykseklii
HMDS Hekzametildisilan
HPLC Yksek performansl sv kromatografisi
ICH Uluslararas Harmonizasyon Konferans
IS standart
K Dalm katsays
k Kapasite faktr
L Kolon dolgusunun uzunluu
LOD Gzlenebilme snr
LOQ Alt tayin snr
MS Ktle spektrometrisi
MSTFA N-metil-N-trimetilsilil trifloroasetamid
N Teorik tabaka says
PLOT Porz yzeyli ak borusal kolonlar
PSO Pik simetri oran
Rs Ayrclk
SCOT Destek kapl ak borusal kolonlar
SERM Selektif strojen reseptr modlatrleri
SFC Sperkritik akkan kromatografisi
SIM Seilmi iyon taramas
SPE Kat-faz Ekstraksiyonu
TIC Toplam iyon taramas
-
xii
xii
tm l hacim zaman
TMCS Trimetilklorosilan
TMS Trimetilsilil
TMSDEA Trimetilsilildietilamin
tR Alkonma zaman
U Ortalama dorusal hz
USP Amerikan Farmakopesi
V Ortalama g hz
UV/GB Ultraviyole/Grnr Blge
W Pik taban genilii
WADA Dnya Anti-Doping Ajans
WCOT Duvar kapl ak borusal kolonlar
Seicilik faktr
-
xiii
xiii
EKLLER DZN
ekil 2.1. Raloksifen HCln kimyasal yaps ............................................................. 4
ekil 2.2. Tek bileenli bir numune iin tipik bir kromatogram ................................ 13
ekil 2.3. Van Deemter erisi .................................................................................... 16
ekil 2.4. Gaz kromatografi sistemi ........................................................................... 23
ekil 2.5. GCde kullanlan tayc gazlara ait Van Deemter grafikleri ................... 24
ekil 2.6. WCOT, SCOT, PLOT, Dolgulu kolonlar .................................................. 27
ekil 2.7. Kuadropol GC-MS sisteminin ematik gsterilii ..................................... 30
ekil 2.8. Elektron bombardman ile iyonizasyon (EI) ............................................. 32
ekil 2.9. Kuadropol ktle analizr.......................................................................... 34
ekil 2.10. (a) Dizi dinot, (b) Devaml dinot elektron oaltc dedektrlerin ematik
gsterilii .......................................................................................................... 36
ekil 2.11. Analizde kullanlan GC-MS cihaznn autotune kts ........................... 39
ekil 4.1. Raloksifenin MTBSTFA ile silillenmesi sonucu elde edilen raloksifen-bis-
O-terbutildimetilsilile ait ktle spektrumu ...................................................... 65
ekil 4.2. Raloksifenin MSTFA ile silillenmesi sonucu elde edilen Raloksifen tris-O-
TMSye ait ktle spektrumu ............................................................................. 67
ekil 4.3. Sililleme reaktifleri ile farkl scaklk ve sreler uygulanarak elde edilen
Raloksifen-tris OTMS trevine ait alan ortalama-standart sapma grafikleri ... 69
ekil 4.4. GC-MS kromatografik koullarn karlatrma grafii ............................. 72
ekil 4.5. Raloksifenin farkl pHlarda metil tersiyer-butil eter ile ekstraksiyonunda
mutlak geri kazanm deerleri .......................................................................... 73
ekil 4.6. Metiltestosteronun (IS) silillenmesi sonucu elde edilen metiltestosteron
bis-OTMS ait ktle spektrumu ......................................................................... 74
ekil 4.7. Bo idrar (n=8) ve Raloksifen (10 ng mL-1) ile IS (10 ng mL-1) eklenmi
idrara ait kromatogramlar ve Farkl deriimlere ait (10, 80, 160 ng mL-1 )
raloksifen pikleri ............................................................................................... 77
-
xiv
xiv
ekil 4.8. Bo idrara ait Raloksifen iin (a,b,c) ve IS iin (d) iin seilmi iyon (SIM)
kromatogramlar ............................................................................................... 78
ekil 4.9. drardan Raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile elde edilen a)
Kalibrasyon erisi b) Dorusallk kontrol grafii ............................................ 79
ekil 4.10. Raloksifenin idrardan ekstraksiyonu sonucu a) mutlak ve b) bal geri
kazanm deerlerine ait grafikler ...................................................................... 83
ekil 4.11. (Raloksifen alan/IS alan) deeri iin standartlatrlm etkilerin normal
grafii ................................................................................................................ 86
ekil 4.12. Plasebo zeltisi (raloksifen = 10 ng) ve IS (50 ng) eklenmi sentetik
preparata ait kromatogramlar ............................................................................ 87
ekil 4.13. Raloksifenin GC-MS yntemiyle tayini iin kalibrasyon ve standart
ekleme erileri .................................................................................................. 88
ekil 4.14. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile elde
edilen a) Kalibrasyon erisi b) Dorusallk kontrol grafii.............................. 89
ekil 4.15. Raloksifenin 0.1 M NaOH zeltisi iindeki spektrumu ......................... 92
ekil 4.16. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin UV-GB spektrofotometrik
yntem ile elde edilen kalibrasyon erisi ......................................................... 93
-
xv
xv
TABLOLAR DZN
Tablo 2.1. Ktle spektrometresinin ayarlanmasnda kullanlan ktlelerin bal
okluklar ve izotop ktle oranlar .................................................................... 38
Tablo 2.2. Trevlendirme reaktifleri .......................................................................... 41
Tablo 2.3. Sv-sv ekstraksiyonu iin yaygn olarak kullanlan zcler .............. 43
Tablo 2.4. Validasyon iin incelenen parametreler .................................................... 44
Tablo 2.5. 11 faktre ait Plackett-Burman tasarm matriksi ...................................... 50
Tablo 3.1. Sistem uygunluk test kriterleri .................................................................. 58
Tablo 3.2. Salamlk ve tutarllk iin seilen parametreler ve parametrelere ait
seviyeler. ........................................................................................................... 62
Tablo 4.1. Raloksifen-bis-O-terbutildimetilsilile ait paralanma rnleri ............... 66
Tablo 4.2. Raloksifen tris-O-TMSye ait paralanma rnleri .................................. 68
Tablo 4.3. Gaz kromatografisi iin uygulanan scaklk programlar ......................... 70
Tablo 4.4. Denenen koullarda sistem uygunluk parametreleri ................................. 71
Tablo 4.5. eitli organik zclerin kullanlmasyla elde edilen % geri kazanm
deerleri (20 ng mL-1 Raloksifen HCl iin) ...................................................... 72
Tablo 4.6. Metiltestosteron bis-OTMSye ait paralanma rnleri ........................... 75
Tablo 4.7.Gelitirilen GC-MS yntemi iin sistem uygunluk parametreleri ............ 76
Tablo 4.8. drardan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile izilen kalibrasyon
erisinin zellikleri ........................................................................................... 80
Tablo 4.9. drardan raloksifenin tayini iin GC-MS yntemi ile izilen kalibrasyon
erisinin dorusallktan ayrl ve korelasyon katsaysnn nem kontrol ..... 80
Tablo 4.10. Raloksifenin GC-MS yntemi ile idrardan analizinden elde edilen gn ii
ve gnler aras doruluk ve kesinlik bulgular ................................................. 82
Tablo 4.11. Raloksifenin idrardan ekstraksiyonu sonucu hesaplanan mutlak ve bal
geri kazanm deerleri ...................................................................................... 83
-
xvi
xvi
Tablo 4.12. drarda raloksifenin kararllk sonular ................................................. 84
Tablo 4.13. drarda raloksifenin donma-erime dngs kararll ........................... 84
Tablo 4.14. Salamlk ve tutarllk deneyleri iin tasarm matriksi ve Raloksifen ile
IS iin elde edilen alan deerleri ...................................................................... 85
Tablo 4.15. Salamlk ve tutarllk iin elde edilen (Raloksifen alan/ IS alan)
deerlerine ait ANOVA test sonular .............................................................. 85
Tablo 4.16. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile izilen
kalibrasyon erisinin zellikleri ....................................................................... 90
Tablo 4.17. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile elde
edilen kalibrasyon erisinin dorusallktan ayrl ve korelasyon katsaysnn
nem kontrol ................................................................................................... 90
Tablo 4.18. Raloksifenin GC-MS yntemi ile farmastik preparat analizinde elde
edilen gn ii ve gnler aras doruluk ve kesinlik bulgular ........................... 91
Tablo 4.19. Raloksifenin farmastik preparatlardan GC-MS ve UV/GB
spektrofotometrik yntem ile analiz bulgular .................................................. 94
-
1
1
1. GR VE AMA
Selektif strojen reseptr modlatrleri (SERM) vcutta bulunan hedefleri
uyaran veya tepkisiz hale getiren sentetik non-steroid bir grup bileikten
olumaktadr (1). SERM strojen replasman tedavisinin istenmeyen etkilerini ortadan
kaldrmak ya da azaltmak amac ile kullanma sunulmutur. Meme ve
endometriumda negatif, kemik, kardiyovaskler sistem ve vajende pozitif etki
gsteren ideal hormon replasman tedavisi ilac olarak SERM kullanlabilir (2).
Raloksifen 1997 ylnda ABDde postmenopozal osteoporozun engellenmesi
ve tedavisi iin onaylanm bir ilatr (2). Bu ilacn alld dier alanlar ise
postmenopozal kadnda meme kanseri ve kardiyovaskler hastalk riskinin
azaltlmasdr. Raloksifen iskelet sistemi, lipid metabolizmas ve baz phtlama
faktrleri zerinde agonistik etki gsterirken, meme ve uterusta antagonistik etki
gstermektedir (3).
Raloksifen postmenopozal kadnlarda kemik kaybn engellemekte ve
vertebral krk oluumunu da azaltmaktadr (3, 4). Ancak konjuge strojenlerle
(CEE) karlatrldklarnda bu etki daha az belirgindir (5). Raloksifen gnlk
(60mg) kullanmnn kemik mineral younluu (BMD) zerine olan etkileri CEE nin
% 50-60 ' kadardr.
Randomize almalarda, kardiyovaskler riskin biyokimyasal iaretleyicileri
zerinde olumlu etkisi olduu gsterilmitir (serum total kolesterol ve LDL
seviyeleri azalmaktadr). Ancak HDL kolestrolde deiiklik olmamakla birlikte
trigliserid seviyeleri de artmamaktadr (6,7).
Raloksifen kullanm erkeklerde plazmadaki testosteron seviyesini anlaml bir
ekilde arttrr (8). Bu yzden Dnya Anti-Doping Ajansnn (WADA) belirledii
yasakl maddeler listesinde yer almaktadr (9).
Kaynaklarda raloksifen analizi ile ilgili olarak genellikle yksek performansl
sv kromatografisi (HPLC) (10-20), kapiler elektroforez (CE) (21) ve
spektrofotometri (22-25) yntemlerine rastlanmaktadr. Raloksifenin gaz
kromatografisi-ktle spektrometrisi yntemiyle analizine ait kaynak
bulunmamaktadr. Bu almada kaynaklardaki boluu doldurmak amacyla
raloksifenin insan biyolojik materyalinden (idrar) ve farmastik preparattan (tablet)
-
2
2
analizi iin gaz kromatografisi-ktle spektrometrisi (GC-MS) ynteminin
gelitirilmesi amalanmtr. Raloksifenin GC-MSde analizi iin trevlenmesi
gerektiine karar verilmi ve trevlendirmek amacyla eitli trev reaktifleri,
tepkime scakl ve sresi gibi parametrelerin incelenmesi uygun grlmtr.
Raloksifenin idrardan yksek oranda geri kazanlmas iin ekstraksiyon koullarnn
optimizasyonu planlanmtr. Gelitirilen yntemin validasyon parametreleri
(zgnlk, doruluk, kesinlik, geri kazanm, duyarllk, kararllk, salamlk,
tutarllk) idrardan ve farmastik preparattan raloksifen analizi iin ayr ayr
deerlendirilerek geerliliklerinin kantlanmas planlanmtr. Valide edilen yntemin
raloksifen HCl ieren farmastik preparatlarn analizine uygulanmas ve sonularn
kaynaklarda bulunan bir yntemle istatistiksel olarak karlatrlmas amalanmtr.
-
3
3
2. GENEL BLGLER
2.1. Selektif strojen Reseptr Modlatrleri (SERM)
strojen reseptr, hedef dokularnda (rn., uterus, vajina ve hipofiz bezi)
strojen etkisini balatan tetikleyicidir (26 ).
strojen eksiklii ateroskleroz, osteoporoz ve santral sinir sistemi
dejenerasyonu gibi birok patolojik olaya nclk etmektedir. strojen Replasman
Tedavisi kadnlarda menapoz sonrasnda kognitif fonksiyonlar srdrmek,
aterosklerozun oluumunu engellemek, vertebral krklar nlemek amacyla
kullanlmaya balanmtr (27). te yandan strojenin zellikle meme bezleri ve
uterusta tmr oluumunu ve geliimini arttrd bilinmektedir (27, 28). strojenin
bu istenmeyen etkilerini nlemek amacyla eitli teraptik alternatifler aranmaya
balanm ve 1960l yllarda strojenin yararl etkilerini beyin, kemik ve arterlerde
gsteren ve ayn zamanda strojen gibi meme ve endometriumda tmr oluumuna
neden olmayan yeni bir ila grubu retilmitir. Bu bileiklere dokuya zg
etkilerinden dolay selektif strojen reseptr modlatrleri (SERMs) ad verilmitir
(27). 1970li yllarda birinci nesil SERMlerden biri olan tamoksifen metastatik
meme kanserinin tedavisinde strojen antagonisti olarak kullanlmaya balanmtr.
Tamoksifenin antagonist olarak kullanmnn, strojenin kemiklerdeki mineral
younluunu arttrc etkisini de inhibe edecei dnlmtr. Yaplan almalar
sonucunda tamoksifenin, strojenin etkisini taklit ederek omurilikte kemik mineral
younluunu arttrd, fakat bunun yannda strojen gibi endometrium kanserine
neden olduu gzlenmitir. Buna bal olarak tamoksifenin dokuya zg strojen
agonisti / antagonisti olarak grev yapt saptanmtr (28). Tamoksifenden sonra
yine SERM snfna dahil olan, yapsnda benzotiyofen halkas bulunan kimyasal ad
[6-hidroksi-2-(4-hidroksifenil) benzotiyofen-3-il] [4-[2-(1-piperidinil) etoksi] fenil]
metanon olan yeni bir ila, raloksifen, kemik zerindeki strojen agonisti etkisinden
dolay 1997 ylnda Amerikan Gda ve la Dairesi (FDA) onayyla osteoporoz
tedavisinde kullanlmaya balanmtr (29-31). Raloksifen endometriumda kanser
oluumunu tetiklemeyen bir bileik olarak meme kanserinin nlenmesi amacyla
gvenle kullanlan bir ilatr. Raloksifenin ayrca sanlarda serum total kolesterol
dzeyini, postmenapozal kadnlarda da serum LDL dzeyini drd gsterilmi,
-
4
4
plazma homosistein deriimini azaltt ancak HDL zerinde herhangi bir etkisi
olmad saptanmtr (27).
Erkeklerde raloksifen kullanm ile ilgili yaplan aratrmalar sonucunda
kemik ykm belirtelerinde azalma, kandaki testosteron ve 17-estradiol
miktarlarnda bal olarak yksek art grlmtr (32).
2.2. Raloksifen HCl
Kimyasal ve Fiziksel zellikleri
Raloksifen HCl benzotiyofen snfndan 2. kuak bir SERMdir. Raloksifen [6-
hidroksi-2-(4-hidroksifenil) benzo[b]tien-3-il] [4-[2-(1-piperidinil) etoksi] fenil]
hidroklorr kimyasal yapsna ve C28H27NO4S HCl molekl formlne sahiptir (ekil
2.1). Kimyasal ad metanon-hidrokloriddir. Raloksifen (CAS numaras: 84449-90-1)
erime derecesi 143-147 oC olan ak sar renkli, kat bir maddedir. Suda ok az
znr.
ekil 2.1. Raloksifen HCln kimyasal yaps
Farmakodinamik zellikleri
Hcre ekirdeinde yerleik olan strojen reseptrlerine balanarak baz
dokularda strojen agonistik etki gsterirken, dierlerinde strojen aktivitesini inhibe
eder (antagonistik etki). Raloksifen lipid metabolizmas ve iskelet sistemi zerine
-
5
5
strojen benzeri, meme ve endometrium zerine ise antistrojenik etki
gstermektedir (33).
Gnmzde ve olarak adlandrlan iki ayr strojen reseptr olduu
bilinmektedir. strojenin ve SERMlerin farkl dokularda farkl reseptrleri uyararak
etki gsterdikleri dnlmektedir. Raloksifen bileiindeki antistrojenik etkiden
sorumlu esas blge alkilamino-etoksik yan zinciridir. Bu zincirde yer alan nitrojen,
spesifik olarak strojen reseptrndeki aspartat ile etkileime girmekte ve
antistrojenik etkinin sergilenmesini balatmaktadr (34, 35).
Tamoksifenin endometrial neoplazi riskinde yapm olduu art ile
raloksifen gndeme gelmitir. 1994de raloksifenin yumurtalklar alnm dii
sanlarda tamoksifenin sebep olduu endometrial proliferasyonu engelledii
gsterilmitir (36). 1994 ile 1997 yllar arasnda raloksifenin kemik kaybn
engelledii, serum kolesterol dzeylerini drd ve meme dokusunda gl bir
anti-proliferatif zellii olduu ve endometrial proliferasyonu engellediini tespit
eden birok alma yaplmtr (37, 38)
Farmakinetik zellikleri
Raloksifen lkemizde 60 mg tablet halinde piyasadadr, gda almndan
bamsz olarak gnn herhangi bir saatinde alnabilir. Raloksifen oral uygulamadan
sonra hzla emilir. Oral dozun yaklak % 60 emilmektedir. Yaygn presistemik
glukuronid konjugasyon sz konusudur. Raloksifenin mutlak biyoyararlanm %
2.0dir. Ortalama maksimum plazma deriimine ve biyoyararlanma ulama sresi
raloksifenin ve glukuronid metabolitlerinin sistemik ara dnmne ve kendisi ile
birlikte glukuronid metabolitlerinin enterohepatik sikluslarna baldr (20, 39).
Raloksifen vcutta geni dalm hacmine sahiptir ve dalm hacmi doza
baml deildir. Raloksifen (% 98-99 orannda) plazma proteinlerine gl bir
ekilde balanr (5).
Raloksifen, glukoronid konjugatlarna yaygn ilk gei metabolizmasna
urar: raloksifen-4glukoronid, raloksifen-6-glukoronid ve raloksifen-
6,4diglukoronid. Baka bir metabolit tespit edilmemitir. Raloksifen, raloksifen ve
glukoronid metabolitlerinin kombine deriimlerinin %1inden azn kapsamaktadr.
-
6
6
Raloksifen seviyeleri, enterohepatik geri dnm ile 27.7 saatlik plazma yarlanma
mr vererek salanmaktadr (5, 40).
Raloksifen dozunun ve glukoronid metabolitlerinin byk blm 5 gn
ierisinde esas olarak fees ile atlr. drarla atlan ksm %6s kadardr. % 0.2 kadar
ksm idrardan deimeden atlr (5).
Yan Etkileri
Klinik deneyimlerde dikkati eken iki nemli yan etki ate basmas ve bacak
adalelerinde kramplardr. Ate basmas sklkla tedavinin ilk 6 aynda
gzlenmektedir. FDA onay 60 mg/gn dozu iin geerlidir. 60 mg/gn dozda
raloksifen kullananlar ve plasebo alanlar arasnda, ate basmas nedeni ile tedaviye
son verilme oranlar asndan fark bulunmamtr (41). Delmas ve arkadalarnn
calmasnda da; raloksifen grubunda ate basmas, memelerde hassasiyet ve vajinal
kanama ikayetlerinde plasebo grubuna gore anlaml farkllk bildirilmemektedir
(42). Raloksifenin nemli yan etkisi venoz tromboemboli (Derin Ven Tronbozu,
Pulmoner Emboli veya Renal Ven Trombozu) riskinin artdr. Vaskler
tromboemboli insidans raloksifen grubunda 3.7/1000, plasebo grubunda ise 1,4/1000
olarak saptanmtr (43). Tromboemboli riskinin tedavi balangcndaki ilk 4 aylk
sure icerisinde daha yuksek olduu dikkati cekmitir.
2.3. Raloksifenin Analiz Yntemleri
Reddy ve di., (10) Raloksifenin farmastik dozaj formundan ters faz yksek
performansl sv kromatografisi ile tayini iin yntem gelitirmilerdir. Bu
almada UV dedektr kullanlmtr. Bu yntemde C18 kolon kullanlp, hareketli
faz olarak 1 mL dk-1
ak hznda asetonitril ve fosfat tampon karm (30:70) tercih
edilmitir. la iin alkonma zaman 10.609 dk bulunmutur. Raloksifen iin 0.5-200
g mL-1 deriim aralnda lineer cevap elde edilmitir.
Trontelj ve di.nin, (11) yapt almada ise, farmastik preparattan
raloksifen hidroklorrn, UV ve kulometrik detektrler kullanarak HPLC
yntemiyle tayini iin yntem gelitirilip valide edilmi, ilacn kalite kontrol
-
7
7
almalar yaplmtr. LOQ, kulometrik ve UV dedektrler iin srasyla 0.336 ve
0.610 mg L-1
olarak saptanmtr.
Wang ve di., (12) HPLC-UV ile raloksifen hidroklorr bileiminin tayini
iin yntem gelitirmilerdir. Bu yntemle raloksifen hidroklorrn nitel olarak
analizi yaplmtr. Hareketli faz olarak asetonitril: 0.01M sodyumdodeksilslfat
(55:45, pH:4.0) bileimi kullanlmtr.
Nandini ve di., (13) raloksifen hidroklorr iin HPLC-UV ile tayin ve
validasyon almalarnda hareketli faz olarak 1 mL dk-1 ak hznda asetonitril:su
(40:60) bileimi kullanmlardr. Raloksifen hidroklorr iin 250-750 g ml-1
deriim aralnda dorusal bir cevap elde edilmitir.
Pavithra ve di., (14) tabletten raloksifen hidroklorr analizi iin ters faz
HPLC metodu gelitirmilerdir. Bu yntemde hareketli faz olarak su:metanol
(50:50), ak hz 1 mL dk-1 olarak belirlemilerdir. Raloksifen HCl iin dorusal
cevap aral ise 10-60 mg mL-1dir.
Basavaiah ve di., (15) farmastik preparattan raloksifen HCl analizi iin
gradiyent HPLC-UV ile analizi iin yntem gelitirmilerdir. Dorusallk aral 50
600 g mL1 olarak saptanmtr. LOD deeri 0.04 g mL1 olarak verilmitir.
Yang ve di., (16) fare plazmasnda raloksifen tayini iin gelitirdikleri
HPLC-UV ynteminde rnekleri basit protein ktrmesiyle hazrlamlardr. Bu
ayrma iin C18 kolonu ve hareketli faz olarak asetonitril:amonyum asetat karm
kullanlmtr. Dorusallk aral 0.2-75.0 g mL-1 olarak verilmitir.
Trontelj ve di., (17) insan plazmasndan raloksifen ve metabolitleri iin sv
kromatografisi-tandem ktle spektrometrisinde (LC-MS-MS) yntem gelitirme ve
validasyonu almasnda, insan plazmasndan raloksifenin tayini ve validasyonu ile
beraber iki metabolitinin raloksifen-6-glukoronid (M1) ve raloksifen -4'-glukoronid
(M2) tayini de yaplmtr. Bu almada 0.5 mL plazmadan kat faz ekstraksiyonu
ile ayrma salanmtr. Dorusallk aral M1 iin 0.2-340 g L-1, M2 iin 1.60-
2.72 g L-1 ve raloksifen iin 0.088-60.00 g L-1 bulunmutur. LOD ise M1, M2 ve
raloksifen iin srasyla 8.0, 11.0 ve 6.0 ng L-1 verilmitir.
Zweigenbaum ve di., (18) insan plazmasndan selektif strojen
modlatrleri analizi iin LC-MS yntemi gelitirmilerdir. Gelitirilen metodla ayn
anda tamoxifen, raloxifene, 4-hydroxytamoxifen, nafoxidine, and idoxifene analizi
-
8
8
gerekletirilmitir. Raloksifen iin kalibrasyon araln 7-5100 ng/mL olarak ve
LOQ deerini 6ng/mL olarak saptamlardr.
Kumar ve di., (19) ise insan idrarndan raloksifen hidroklorrn LC-MS-
MS ile tayinini yapmlardr. Salkl insan idrarna raloksifen hidroklorr eklenip
kat faz ekstraksiyonu sonrasnda C18 kolon kullanlarak triple kuadrapol tandem
ktle spektrometresi ile tayini yaplmtr. Hareketli faz olarak amonyum asetat (pH
4.0)-asetonitril (60:40, h/h) karm kullanlmtr. Dorusallk aral 20-1000 ng
mL-1
olarak saptanmtr. LOQ deeri 20 ng mL-1 olarak verilmitir. Doruluk
deriim (50, 500 ve 850 ng mL-1) iin hesaplanm ve yzde bal hata % 0.84
bulunmutur.
Tina Trdan ve di., (20) gerek insan idrarndan raloksifen ve raloksifen-6-
-glukoronid (M1), raloksifen-4--glukoronid (M2), raloksifen-6,4-diglukoronid
(M3) tayinini LC-MS/MS yntemiyle yapmlardr. Raloksifenden, raloksifen
glokoronidi elde etmek amacyla Streptomyces mikroorganizmalarla biyolojik
dnmlerden faydalanmlardr. LC-MS/MS n ilemleri iin kat faz
ekstraksiyonu yapmlardr. Raloksifen iin LOQ deeri 1.01, M1 iin 1.95, M2 iin
2.83 ve M3 iin 4.69 nM olarak belirlenmitir. Yntemin doruluu bal hata %
8.8 bulurlarken, kesinlii tm maddeler iin bal standart sapma % 12 olarak
saptamlardr.
Perez-Ruiz ve di., (21) raloksifenin kapiler elektroforez kullanlarak miktar
tayini ve validasyonu almasnda farkl parametrelerin (tampon deriimi, pH ve
uygulanan voltaj) g zaman, pik simetrisi ve etkinlik zerindeki etkilerini
aratrmlardr. Bu almada, raloksifen iin dorusallk aral 0.12 - 36 g mL-1
olarak bulunmutur.
Annapurna ve di., (22) farmastik formulasyondan raloksifen HCl' n
spektrofotometrik tayini almasnda, raloksifen HCl bulk ve tablet formundan
yeni spektoskopik yntem gelitirilmilerdir. A yntemi bo zeltiye kar cevab
llen maksimum absorbansta 0.1 N NaOHde sar renkli kromojen oluumuna
dayanr. B yntemi, raloksifen ile demir klorr ve 1,10-fenotrolin ile krmz renkli
kromojen oluumuna dayanr. C yntemi ise demir klorr ve 2,2-bipiridil ile kmz
renkli kromojen oluumuna dayanr. Kromojenlerin maksimum absorbans verdii
-
9
9
dalga boyundaki cevaplar llmtr. LOQ deerleri A, B, C yntemleri iin
srasyla 5 g mL-1, 1 g mL-1, 2 g mL-1 olarak verilmitir.
Basavaiah ve di., (23) spektrofotometrik yntemle farmastik preparattan
raloksifen hidroklorr saptanmas ve validasyonu almasnda iki yntem
gelitirmilerdir. Bu yntemde raloksifen dolayl analizi, oksidimetrik reaktif olan
bromat-bromit karmnn kullanlmas ile gerekletirilmitir. Fazla bromr metilen
mavisi [Yntem A] ve rodamin B [Yntem B] boyalar kullanlarak analiz edilmitir.
Optimum koullarda yntem A'nn 0.5-5.0 g mL-1 ve yntem B nin 0.1-2.0 g mL-1
aralnda dorusal olduu bulunmutur. LOQ srayla 0.18 ve 0.13 g mL-1 olarak
bulunmutur.
Basavaiah ve di., (24) farmastik preperattan raloksifen analizi iin iki yeni
spektrofotometrik yntem gelitirip validasyonunu yapmlardr. lk metot asidik
ortamda raloksifenin permanganat ile reaksiyonu sonucunda kahverengi kromojen
gruplarnn 430 nm dalga boyunda verdii absorbans lmne dayanr. kincisi ise
raloksifenin H2SO4 ortamnda permanganatla 550 nm dalga boyunda verdii
absorbans lmne dayanr. Dorusallk aral ilk yntem iin 0.6-6.0 mg mL1,
ikinci yntem iin 1.5-15 mg mL1dir. LOQ ise ilk yntem iin 0.25 mg mL1, ikinci
yntem iin 1.67 mg mL1 olarak bulunmutur.
Dharuman ve di., (25) Raloksifen HCln farmastik preparattan ve bulk
rneklerden spektrofotometrik yntemle analizi iin iki yntem gelitirmilerdir.
Metod A ilacn FeCl3-demirsiyanad ile oksidasyonuna dayanr. Metod B ise fehling
zeltisi ile indirgenmesine dayanr. Gelitirilen yntem hem metot A hem de B iin
tablete uygulanmtr.
2.4. Spektroskopik Yntemler
Spektroskopi, eitli tipte nlarn madde ile etkileimini inceleyen bilim
daldr. Spektrokimyasal yntemler, organik ve inorganik bileiklerin nicel ve nitel
analizlerinde yaygn kullanmlarnn yan sra, molekl yaplarnn aydnlatlmasnda
da en sk bavurulan aralardr.
Spektroskopi, bir rnekteki atom, molekl veya iyonlarn, bir enerji
dzeyinden dierine geileri srasnda absorplanan ya da yaylan nn llmesi ve
-
10
10
yorumlanmasdr. Her atom, molekl veya iyonun n ile kendine zg ilikisi vardr
ve bunlarn dnme, titreim ve elektronik enerjilerindeki deiiklikler
spektroskopinin temelini oluturur.
Ik; atom ve molekller tarafndan absorbe edilebilir. Absorbe edilen enerji
kuantldr ve elektronlarn dk enerjili orbitallerden (temel hal) daha yksek
enerjili orbitallere (uyarlm hal) gemesine neden olur. Ama her enerji absorbe
edilemez; ancak iki enerji seviyesi arasndaki farka eit bir enerji absorbe edilebilir.
Molekler absorpsiyon spektroskopi b cm n yoluna sahip geirgen bir
kapta bulunan bir zeltinin geirgenliinin (T) veya absorbansnn (A) lmne
dayanr. Absorbans, absorpsiyon yapan analitin deriimi ile eitlikte belirtildii gibi
dorusal olarak deiir.
2.1
Verilen eitlik Beer yasasnn matematiksel gsterimidir. Eitlikte, n gc
(P, P0), molar absorptive (), absorpsiyon yapan numunenin deriimi (C, mol L-1
) ile
gsterilmitir.
Bu bantya gre A deeri Cye kar grafie geirilirse, eimi .b olan bir
doru elde edilir. Bylece n absorbe edilen ksm okunur ve 2.1 eitlii
kullanlarak analitin bilinmeyen deriimi bulunur (44).
2.5. Kromatografik Yntemler
Kromatografi, karmlarn ayrlmasnda kullanlan en nemli tekniklerden
biri olup, nitel ve nicel analize olanak salamaktadr. ok geni ve verimli bir alan
olan kromatografinin temeli, Rus bilim adam botaniki Michael Tswett tarafndan
atlmtr. Tswett yeil yapraklardan elde ettii zeltiyi toz haldeki kalsiyum
karbonat doldurulmu cam bir kolondan geirerek, zeltide bulunan klorofil,
ksantofil gibi renkli maddeleri kolonda ayrmay baarmtr. Sonuta elde ettii
renkli tabakalardan esinlenerek yapt ayrmaya kromatografi adn vermitir (44).
Genel olarak, ayrma ilemiyle bir madde, bulunduu ortamdan nicel olarak
baka bir ortama alnr. Maddenin nicel olarak alnmasnn yan sra maddenin saf
-
11
11
olarak da alnmas nemlidir. Bu koullar salayan ayrmalara seici ve spesifik
ayrma denir. Kromatografik yntemler seici ve spesifik ayrmay salar (45).
Kromatografi ilemi, bir karmdaki maddelerin biri sabit dieri hareketli faz
arasnda dalmas esasna dayanr. Devaml olarak temasta olan bu iki faz birbirleri
ile karmaz. Sabit faz, ya porz bir kat madde ya da kat bir destek maddesine
emdirilmi bir sv, hareketli faz ise sv, gaz veya sperkritik bir akkan olabilir.
Kromatografi sisteminde maddelerin hareketini salayan, bunlar srkleyen
hareketli fazdr. Hareketli faz bir kolon iinde, ya normal yerekimi kuvvetiyle veya
basnla kolondaki sabit faz iinden geirilir. Bu esnada hareketli fazda znm
halde bulunan maddelerle, sabit faz arasnda fiziksel ve kimyasal ekim kuvvetleri
devreye girer. Bu ekim kuvvetleri her madde iin ayrdr. Sabit faz tarafndan daha
fazla adsorbe edilen veya daha fazla zlen maddeler sistem ierisinde daha yava
ilerlerken, sabit fazda daha az znen maddeler daha hzl hareket ederler.
Kromatografi ilemi srasnda, madde molekllerinin, fazlardan biri ile
kovalent balanma durumu sz konusu deildir. Karmdaki bileenler, fazlardan
birinde daha uzun sre kalacak ekilde iki faz arasnda birok kez gei yaparlar (44,
45).
Kromatografide hareketli sv faz olarak, su dahil btn organik zcler ve
bu zclerin eitli oranlardaki karmlar kullanlabilir. Ayn zamanda gaz ve
sperkritik zcler de hareketli faz olarak kullanlabilir.
eitli kromatografik tekniklerde en ok kullanlan sabit fazlar; silika,
almina, kmr, florisil (magnezyum-silika karm), kalsiyum karbonat ve
kalsiyum oksit, magnezyum karbonat ve magnezyum oksit, kizelgurlar, diatome
topraklar, poliamitler, niasta, toz eker ve talkdr (44).
Kromatografi ileminden eitli amalar iin yararlanlmaktadr. Kimya,
biyokimya ve biyoloji alanndaki almalarda, organik ve anorganik karmlarn
ayrlmas, maddelerin nitel analizi ile saf olup olmadnn kontrol veya
saflatrlmas, ila endstrisinde hammadde ve imalat safhalar rnleri ile ilalarn
stabilite kontrol ilemlerinde kromatografi yaygn bir ekilde kullanlmaktadr (44,
45).
-
12
12
2.5.1. Kromatografinin Dayand Temel Parametreler
Alkonma (Retensiyon) Zaman
ekil 2.2de tek bir analit ieren numune iin tipik bir kromatogram
verilmitir. Numune enjeksiyonundan sonra gelen ilk pik iin, pik sresi l zaman
olarak adlandrlr ve tm ile gsterilir. l zaman, hareketli fazn ortalama g hzn
verir ve analit piklerinin tannmasnda nemli rol oynar. Numune iinde veya
hareketli fazda ou zaman kolonda tutulmayan bir tr olabilir. Yoksa bile dier
piklerin tannmasna yardmc olmak iin byle bir tr ortama katlabilir. ekilde sa
taraftaki pik bir analit trne aittir. Numunenin enjeksiyonu ile bu pikin dedektre
ulamas iin geen sreye alkonma (tutulma) zaman denir ve tR simgesiyle
gsterilir. Analitin kolon ierisinde hareketi esnasnda ortalama g hz V;
V= L / tR (2.2)
olarak verilir; L kolon dolgusunun uzunluudur. Benzer ekilde hareketli faz
molekllerinin ortalama dorusal hz , yle verilir;
= L / tm (2.3)
-
13
13
ekil 2.2. Tek bileenli bir numune iin tipik bir kromatogram
Analitin G Hz, Kapasite Faktr
Kapasite faktr, k, znen maddelerin kolonda g hzlarn tanmlamakta
yaygn olarak kullanlan nemli bir parametredir.
k = (tR tm) tm (2.4)
tR ve tm deerleri kromatogramlardan kolayca bulunur. Bir znen madde iin
kapasite faktr birden ok kk ise, ayrlma hzl gerekleir ve alkonma
zamannn doru olarak belirlenmesi zor olur. te yandan kapasite faktr 20-30 gibi
bir saydan daha byk olursa ayrlma zaman fazla uzun olur. deal bir ayrma da
kapasite faktr deerinin 1 ile 5 arasnda olmas gerekmektedir. Kapasite faktr
hareketli faz ve sabit faz bileimlerinin deitirilmesiyle ayarlanabilir. Her maddenin
kendine zg bir kapasite faktr deeri vardr.
Seicilik Faktr
Bir karmdaki analitlerin kapasite faktrlerinin oran seicilik veya ayrm
faktr olarak adlandrlr. Bir kolondaki analitlerin seicilik katsays; bir kolonun
-
14
14
sz konusu maddeleri ne kadar iyi ayracann bir lsdr. Bir karmda bulunan
A ve B maddeleri bir kolonda ayrlmaya allsn. Bu sistem iin seicilik faktr ,
u ekilde tanmlanr;
= KB / KA (2.5)
KA = Daha az kuvvetle tutunan veya daha hzl olarak kolondan elue edilen A
maddesi iin dalma katsays, KB = Daha kuvvetli tutunan B maddesi iin dalma
katsaysdr. Bu eitlik ile daima 1den byktr. Deneysel olarak bir
kromatogramdan y belirlemek iin aadaki eitlik kullanlmaktadr.
= [(tR)B - tm ] / [(tR)A- tm ] (2.6)
(tR)B = Kolonda daha kuvvetli tutunan bileiin alkonma zaman
(tR)A= Kolonda daha az kuvvetli tutunan bileiin alkonma zaman
Kolon Etkinlii (Verimlilii)
Baarl bir kromatografinin amac verimli bir ayrma ve dar bir
kromatografik bant elde etmektir. Kromatografik kolon etkinliinin nicel lmnde
birbiriyle bantl iki terim ska kullanlr:
1. Edeer teorik tabaka ykseklii, H, (Plate Height)
2. Teorik tabaka says, N, (Number of Theoretical Plate)
Bu iki terim arasndaki bant aadaki eitlikle verilir;
N= L / H (2.7)
Bir kolonda tabaka yksekliinin azalmas ve teorik tabaka saysnn
artmasyla kolon etkinlii artar. Hareketli ve sabit fazlarn bileimi, kolon dolgu
maddesinin tanecik bykl ve kolon apna bal olarak kolonun tipi kolon
verimliliini etkilemektedir. Kolon dolgu maddesinin tanecik ap kldke kolon
-
15
15
tabaka says artmakta bu da kolon verimliliini artrmaktadr. Martin ve Synge
kromatografik bir kolonun birok ayr fakat bitiik dar tabakalardan meydana
geldiini dnerek teorik bir almayla tabaka ykseklii ve teorik tabaka says
terimlerinin ortaya kna nclk etmilerdir. Her tabakada maddenin hareketli ve
sabit faz arasnda kurduu dengenin, yeniden meydana geldii kabul edilmitir.
Analitin kolon ierisinde hareketi, dengedeki hareketli fazn bir tabakadan dierine
geii olarak kabul edilmitir. Teorik tabaka says u ekilde hesaplanr;
veya
(2.8)
W : Pik taban genilii
W1/2 : Pik taban geniliinin yars
Teorik tabaka says N ve tabaka ykseklii H, kaynaklarda ve kromatografik
cihaz reticileri tarafndan, kolon performansnn bir lm olarak kullanlr.
Kromatografik kolon davranlarna matematiksel yaklam 1956 ylnda
Hollandal aratrmac Van Deemter tarafndan gelitirilmitir. Bu eitlik etkinlii
ortalama hareketli faz dorusal hznn () bir fonksiyonu olarak aklar (ekil 2.3).
Klasik Van Deemter eitlii Eitlik 2.9da tanmland gibidir.
H= A + B / + C (2.9)
H: Edeer teorik tabaka ykseklii
A: Eddy difzyon katsays
B: Boyuna difzyon katsays
C: Ktle transfer katsays
: Tayc gazn dorusal ak hz
-
16
16
ekil 2.3. Van Deemter erisi
A (Eddy difzyon katsays); molekl veya iyonlar dolgulu kolonda ilerlerken
farkl uzunluktaki yollar izlerler. Bu nedenle, ayn molekln farkl kolonda kal
sresi farkl olur. Kolon dolgusunun homojen olmas, bu etkiyi azaltr. Dolgu
kolonlarda bu terim geerlidir, klcal kolonlarda etkin deildir.
B (Boyuna difzyon katsays); molekller deriik blgelerden, seyreltik
blgelere g etme eilimindedirler. Bu g; hem ak ynnde, hem de zt ynde
olabilir. Pik geniliine etki eden, hareketli fazdaki difzyondur. Hareketli faz gaz
ise bu etki daha fazladr. Tayc gaz ak hz arttrlarak, bu etki en aza indirilebilir.
C (Ktle transfer katsays); maddenin sabit ve hareketli faza transfer hz,
kromatografi kolonunun etkinlii zerinde rol oynar. Ktle transferi terimi, sabit
fazda hareketli faz ak hznn artmas ile artar (44-46).
Ayrclk
Kromatografide asl ama, karm iindeki maddelerin birbirinden
ayrlmasdr. Ayrclk (Rs), bu hedefe ne derece yaklaldnn bir lsdr.
Temel olarak, kolonun iki analiti birbirinden ayrabilme yeteneinin nicel lsdr
ve eitlik 2.10 ile ifade edilir.
-
17
17
(2.10)
(tR)B, (tR)A : B ve A nn alkonma zamanlar
WA, WB : A ve B iin zemin pik genilikleri
Rs = 1.5 olmas halinde iki pik birbirinden tamamen ayrlm saylr. Nicel
analizler iin pikler arasndaki ayrcln 1.5den byk (Rs 1.5) olmas
nerilmektedir. Eitlik 2.11a gre ayrcl etkileyen faktr; seicilik (), tabaka
says (N) ve kapasite faktr (k)dr.
(2.11)
Eitlik 2.11e gre, seicilik arttka ayrcln da artmas beklenmektedir.
Seiciliin 1 olduu durumda iki madde arasnda ayrm gereklemez. Bu nedenle
kromatografik bir ayrmn olabilmesi iin seiciliin 1den byk olmas
gerekmektedir.
Kapasite faktrnn (k) = 0 olduu durumda ayrm yoktur, ayrca k deeri
arttka k/(k+1) 1e yaklar ve kapasite faktrndeki artn ayrcla etkisi
kalmaz. k deerini daha fazla arttrmak yalnzca alkonma zamann arttrr.
Optimum k deerleri 1-10 arasnda olmaldr.
Kolon Etkinliinin Optimizasyonu
Kromatografik almalarda deney koullar, bir karmn bileenlerini en
ksa srede net bir ekilde ayracak biimde optimize edilerek belirlenir.
Optimizasyon deneyleri: 1. Bant genilemesini azaltmak, 2. Bileiin bal g hzn
deitirmek amacyla yaplr.
Bant genilemesi ve dolaysyla kolon verimliliinin kayb, znen
bileenlerin kolon ierisinde gleri srasnda yer alan ok sayda ktle-aktarm
ilemlerinin belli hzlara sahip oluunun bir sonucudur. Bu hzlar etkileyen baz
deikenler denetlenebilir ve ayrmalar iyiletirmek iin kullanlabilir.
-
18
18
stenilen ayrmay salamak iin optimum koullar aratrlrken , k ve N
(veya H) gibi temel parametrelerin az ya da ok birbirinden bamsz olarak
ayarlanabilecei unutulmamaldr. Bylece ve k, en kolay scaklk ve hareketli
fazn ak hzndaki oynamalar ya da deiik bir kolon dolgusu kullanlarak
deitirilebilir. Herhangi bir almada, teorik tabaka says, kolon boyu, tabaka
ykseklii, hareketli fazn ak hz, dolgu maddesi tane bykl, hareketli fazn
viskozitesi ve sabit faz oluturan absorbe edilmi sv filmin kalnl gibi
parametreler deitirilerek iyi bir ayrm gerekletirilebilir.
2.5.2. Kromatografinin Snflandrlmas
1-Ayrlma mekanizmalarna gre
Adsorpsiyon kromatografisi
Dalma (partisyon) kromatografisi
yon deitirme kromatografisi
Jel Filtrasyon (molekler eleme) kromatografisi
yon ifti kromatografisi
Afinite kromatografisi
2- Uygulama biimine gre
Dzlemsel kromatografi
o Kat kromatografisi
o nce tabaka kromatografisi (TLC)
Kolon kromatografisi
o Yksek basnl sv kromatografisi
o Sper kritik akkan kromatografisi
o Gaz kromatografisi
3-Faz tiplerine gre
Sv kromatografisi
o Sv - kat kromatografisi
o Sv - sv kromatografisi
Gaz kromatografisi
o Gaz - kat kromatografisi
-
19
19
o Gaz - sv kromatografisi
2.5.2.1. Ayrlma Mekanizmalarna Gre Snflandrma
Adsorpsiyon Kromatografisi:
Hareketli faz, porz bir kat veya ok ince bir toz olan sabit fazn zerinden
geer. Ayrlacak maddelerin yrme hz, sabit faza kar ilgilerine yani adsorbe
edilme derecelerine baldr. Madde sabit faz tarafndan ne kadar kuvvetli adsorbe
ediliyorsa o kadar yava ilerler. Adsorpsiyon kromatografisi, kolay olmas yannda
etkili bir ayrma yntemidir. Bu yntemle izomerler, hidrokarbonlar, rasemler,
hormonlar ve antibiyotikler kolaylkla ayrlabilir.
Adsorpsiyon kromatografisi ynteminin dezavantajlar da vardr. Bunlar,
sabit fazn ayrlmas beklenen maddeleri paralamas ve aranan maddeler yerine
baka maddelerin bulunmas, sabit fazn ayrlan maddelerle kimyasal reaksiyon
vermesi ve uygun sabit faz ve zc bulunabilmesi iin bazen ok zaman
harcanmasdr (44,45).
Dalma Kromatografisi:
Sabit faz inert ve kat bir destek maddesi zerine kaplanm bir svdr. Sv
veya gaz olabilen hareketli faz, sabit faz ile kapl destek maddesinin zerinden geer.
Maddelerin, bu sistemdeki yrme hzlar, iki sv faz arasndaki bal
znrlklerine yani dalma katsaylarna baldr. Sabit fazda daha ok
znenler daha yava ilerlerken, hareketli fazda daha ok znenler daha hzl
ilerler.
yon Deitirme Kromatografisi:
Bu yntem, kat bir maddenin, yapsnda bulunan iyonlar, temasta bulunduu
zelti iindeki baka iyonlarla bir dengeye gre deitirmesi zelliine dayanr. Bu
amala kullanlan kat maddeler, zelti ortamnda hi znmeyen byk molekll
doal ve yapma maddelerdir. Bunlar inorganik ve organik diye ikiye ayrlr.
norganik olanlar yaklak bir asrdr kullanlan killer ve zeolitlerdir. Organik olanlar
1937den beri kullanlmaktadr. Hem inorganik hem de organik iyon deitiricilerde
-
20
20
temasta bulunduklar zeltideki iyonlarla deitirilebilecek pek ok sayda iyon
bulunur.
Sulu zeltide, ykl iyonlar ile iyon deitirici reine temas ettiklerinde,
iyon deitiricinin fonksiyonel gruplarnn ykleri ile iyonlarn ykleri arasnda bir
etkileme oluur. Sulu zeltideki iyonlar, sabit fazdaki ayn ykl iyonlarla yer
deitirerek, kolona balanrlar. Balanmayan iyonlar ise kolondan en nce karlar.
Bu yntemde reine tanecikleri sabit faz, geirilen zc ise hareketli faz
oluturmaktadr (44,45).
Jel Filtrasyon (Molekler Eleme) Kromatografisi:
Bu yntemde, maddeler molekl byklklerindeki farklla gre ayrlrlar.
As yapl polimer materyalde, maddeler molekl byklklerine bal olarak, as
yapya girme derecelerine gre birbirinden ayrlrlar. Kk molekller tanecikler
arasndaki boluklara girebildiklerinden ilerlemeleri gecikirken, byk molekller bu
boluklara giremez ve kolayca ilerlerler.
yon ifti Kromatografisi
Bu yntem, zellikle iyonlaabilen asidik veya bazik maddelerin
ayrlmasnda kullanlr. Hareketli faza ilave edilen iyon ifti reaktifi sabit faz
tarafndan adsorplanr ve iyonize olmu maddeler bu iyon iftleri ile iyonik
etkileime girerek birbirinden ayrlr (44, 45).
Afinite Kromatografisi:
Enzim, hormon vb. spesifik proteinlerin saflatrlmasnda kullanlr.
Kolonunun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selloz vb) spesifik protein
ile kompleks yapabilen bir ligand balanr. Ligand ile kompleks yapan spesifik
protein, kat destee balanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terk
ederler. Daha sonra, bal protein pH deiiklii veya ligand ilavesiyle kolondan ele
edilir.
-
21
21
2.5.2.2. Uygulama Biimine Gre Snflandrma
Dzlemsel Kromatografi
Kat Kromatografisi:
Bu yntemde zel retilmi kat (selloz) destek ve gzeneklerine yerleen
su ise sabit sv faz oluturur. Hareketli faz, bir yrtme tank ierisine
yerletirilmi uygun zcdr. Kat zerine uygulanan karm, bir yrtme tank
ierisinde, su ieren hareketli faz, kadn rnek uygulanan kenarndan kar kenarna
ulaana kadar beklenerek ayrlr. zc, kat zerinde kapiler etki ile ilerlerken
karmdaki maddeler zelliklerine gre ayrlma gsterir (44).
nce Tabaka Kromatografisi:
Bu yntemde, kromatografi ilemi cam, alminyum veya plastik bir yzey
zerine kaplanm bir adsorban tabakasnda gerekleir. Yrtme tankndaki
hareketli faz, adsorban tabakas zerinde aadan yukarya doru ilerler (45).
Adsorblayc tabaka seiminde ayrlmas beklenen maddelerin asidik veya bazik
karakterli olmas dikkate alnr. Genellikle asidik karakterli maddeler iin asidik
adsorblayclar (silikajel), bazik karakterli maddeler iin de, bazik adsorblayclar
(aluminyum oksit, talk gibi) tercih edilir (44).
yi bir adsorblaycda aranan balca zellikler yle sralanabilir;
Olduka ok miktarda madde adsorplayabilmeli,
zerinde adsorbe olmu madde baka zcler kullanlarak kolaylkla
geriye alnabilmeli,
Ayrlacak maddelerle ve zclerle kimyasal reaksiyona girmemeli,
Renklendirme ayralaryla reaksiyona girmemeli,
Yaps zcnn rahatlkla gemesine elverili olmal.
-
22
22
Kolon Kromatografisi
Yksek Performansl Sv Kromatografisi:
Yksek performansl sv kromatografisi, scakla hassas olan maddelere de
uygulanabilmesi nedeniyle yaygn olarak kullanlan yntemlerdendir. Ayrlacak
karm, sisteme bir enjektr yardmyla verilir ve sv hareketli faz ile kolondan
basn altnda geirilir. Numune bileenleri sabit veya hareketli faza olan ilgilerine
gre ayr ayr bandlara ayrlr. Bu bandlar kolon boyunca ilerler ve dedektrden
geer. Dedektr bir kaydediciye baldr ve kolondan kan her bileen, pikler
halinde kaydedilir. Piklerin k zaman alkonma zaman olarak tanmlanr.
Yntemin uygulanabildii balca bileikler ise nkleik asitler, terpenoitler,
pestisitler, antibiyotikler, steroitler, proteinler, aminoasitler, ilalar, hidrokarbonlar,
karbonhidratlar, metal organik bileikleri vb. dir.
Sperkritik Akkan Kromatografisi:
Sperkritik akkan kromatografi (SFC), gaz ve sv kromatografilerinin bir
hibridi saylr ve her iki yntemin stnlklerini birletirmektedir. SFC, geleneksel
sv ve gaz kromatografi yntemleri ile tayini mmkn olmayan bir grup bileiin
tayinini mmkn kld iin nemlidir. Bu bileikler arasnda uucu olmayan veya
gaz kromatografisi artlarnda termal bozunmaya urayan bileikler ve sv
kromatografide kullanlan spektroskopik veya elektrokimyasal dedektrlerle
belirlenmelerini mmkn klacak fonksiyonel gruplara sahip olmayan bileikler
saylabilir.
2.5.3. Gaz Kromatografisi (GC)
Gaz kromatografisinde, numune buharlatrlarak kolonun giriine enjekte
edilir. nert bir hareketli gaz faz ile elsyon yaplr. Dier kromatografik yntemlerin
aksine gaz faz analitin moleklleri ile etkilemez; gazn tek ilevi, analiti kolon
boyunca tamaktr (44-46) (ekil 2.4).
Gaz kromatografisi iki ekilde uygulanmaktadr;
Gaz-kat kromatografisi (GSC)
Gaz-sv kromatografisi (GLC)
-
23
23
ekil 2.4. Gaz kromatografi sistemi
2.5.3.1. Gaz-Kat Kromatografisi (GSC)
Kat sabit faz zerinde fiziksel adsorpsiyon sonucu analitlerin alkonmasn
temel alr. Gaz-kat kromatografisi iki nedenle snrl uygulama alan bulur bunlar;
polar molekllerin kalc denebilecek lde alkonma problemi ve adsorpsiyon
olaynn dorusal olmay nedeniyle kuyruklanmann ar oranda meydana
gelmesidir. Bu nedenlerle yntem kk mol ktleli molekllerin ayrlmasnn
dnda fazla bir uygulama alan bulamamtr.
2.5.3.2. Gaz-Sv Kromatografisi (GLC)
Analitin gaz halindeki hareketli faz ile bir katnn yzeyine tutturulmu sabit
sv faz arasnda dalm zerine kurulmutur (44).
-
24
24
Gaz Kromatografisi Sisteminin Ksmlar:
Tayc Gaz:
nert olmas gereken tayc gaz; genelde helyum, hidrojen ya da azottur.
ekil 2.5 incelendiinde, minimum teorik tabaka yksekliinde, en yksek
verimlilii N2 gaznn verdii; fakat N2 gaznn dorusal hznn artmasyla verimin
dt grlmektedir (46). H2 gaz geni dorusal hz aralna sahip olmakla
birlikte patlayc zellie sahip olmas nedeniyle pek kullanlmaz. N2ye gre daha
iyi hz aralna sahip olan He gaznn kullanm daha fazladr.
ekil 2.5. GCde kullanlan tayc gazlara ait Van Deemter grafikleri
Gaz seimi genelde kullanlan dedektr tipine baldr. Tayc tpne bal
elektronik basn kontrol (EPC) sistemleri, gstergeler ve ak sayalar bulunur.
Bunlara ek olarak, su ya da dier safszlklar gidermek iin gaz sisteminde ou
zaman molekler elek bulunur.
Ak hz kontrol, normal olarak gaz silindirine bal iki basamakl basn
reglatrleri ve kromatografiye bal ak reglatrleri ile yaplr. Genel olarak giri
basncnn sabit kalmas halinde ak hznn deimeyecei varsaylr. Modern ticari
kromatografiler ak hzn istenilen deerlere ayarlayabilen ve kontrol eden
elektronik cihazlarla donatlmtr.
-
25
25
Numune Enjeksiyon Sistemi:
Kolon verimi, numunenin uygun miktarda ve buhar halinde bir defada
verilmesini gerektirir. Yava enjeksiyon veya daha fazla miktarda numune verilmesi,
pik genilemesine ve dk ayrma gcne neden olur. Sv veya gaz numune
enjeksiyonunda, yaygn olarak kullanlan yntemlerden biri szdrmaz enjektrle
manuel enjeksiyondur. Enjeksiyon bir silikon lastik diyaframdan ya da bir septumdan
yaplr. Septumun hemen arkasnda kolon giri ucunda hzl buharlatrc bir blme
bulunur. Normal analitik amalar iin enjeksiyon hacmi 0,1-20 L arasnda olabilir.
Klcal kolonlarda daha kk hacimlerde (10-3 L) enjeksiyon yaplr. Bunun iin
kolon giriine bir blc yerletirilir. Blc, enjekte edilen numunenin bir ksmn
kolona verirken, kalan ksm da dar atar. Nicel analizlerde daha tekrarlanabilir
miktarlarda gaz veya sv numunelerinin cihaza verilebilmesi iin dner numune
vanalar kullanlr. Bu vanalarla, numune enjeksiyonundan kaynaklanan bal hatalar
%0.5-%2 civarna drlebilir. Ancak gnmzde otomatik enjeksiyon sistemleri
kullanlarak, enjeksiyondan kaynaklanan hatalar en aza indirilmitir. Numune
istenilen hacimde ve ok hzl verilir (44).
Kolonlar:
Enjeksiyonla verdiimiz bileenlerin birbirinden ayrld, nicel ve nitel
analizin yapld blmdr. Dolgulu ve klcal kolon olmak zere iki tip gaz
kromatografisi kolonu bulunmaktadr (ekil 2.6). Dolgulu kolonlar cam veya
metalden yaplm, i aplar 2-4 mm, uzunluklar 2-3 m olan kolonlardr. Bu
kolonlar ince bir sabit sv faz ile kaplanm, homojen ve ince taneli bir kat ile iyice
doldurulur. Teorik tabaka says klcal kolonlardan azdr. Klcal kolonlarda ise dolgu
materyali yerine sv fazn kendisi veya destek maddesi ile birlikte kolon i
eperlerine balanmtr. aplar 0.1-0.5 mm, uzunluklar 10-100 mdir. Klcal
kolonlarn kullanlmas ile dolgulu kolonlarn nemi azalmtr.
Eritilmi silika klcal kolonlarn gelitirilmesi ve ok eitli materyallerle i
eperlerinin kaplanabilmesi nedeniyle klcal kolonlarn kullanmlar hzla
artmaktadr. Bu kolonlarda sabit faz kolon duvarna mikrometrenin onda biri kadar
ince kalnlkta kaplanm sv filminden olumaktadr (46, 47).
-
26
26
Klcal kolonlar, trldr (ekil 2.6): Bunlar;
a) Duvar kapl ak borusal kolonlar (Wall-Coated Open Tubuler
Columns, WCOT): Sabit faz kat, viskoz sv veya zamk formunda polimerlerdir.
Klcal kolon eperine kaplanr. ap 0.005-0.53 mm, film kalnl 0.1-3 m'dir .
1979da WCOT kolonlar eritilmi silis ak borusal kolonlar (FSOT) olarak
adlandrlmtr. Bu kolonlar kuvars materyalinden yaplmtr. Daha esnektir ve
istenen ekil daha kolay verilebilir.
b). Porz yzeyli ak borusal kolonlar (Porous Layer Open Tubuler
Columns, PLOT): tabakas adsorban materyalle ile kapldr. Dezavantaj dk
etkinlie sahip olmas, tekrarlanabilir ve kararl olmamasdr.
c) Destek kapl ak borusal kolonlar (Support-Coated Open Tubuler
Columns, SCOT): Destek materyalle sv faz kaplanm ekilde klcal duvarna
yaptrlmtr. En nemli avantaj sabit faz kalnlnn daha geni aralkta
tutulabilmesidir.
-
27
27
ekil 2.6. WCOT, SCOT, PLOT, Dolgulu kolonlar
Gaz kromatografisi kolonlarnda 3 nemli zelliin bulunmas
gerekmektedir:
1. Sabit faz, olabildiince inert bir destek yzeyini tamamen kaplayan
tekdze kalnlktaki film tabakas ile oluturulmaldr.
2. Kolon film tabakasnn, yksek scaklklarda bozunma ve buharlamaya
kar ssal kararll olmaldr. Bu sabit faz molekllerini destek materyaline
kimyasal veya fiziksel olarak balayarak polimere benzeyen bir film tabakas
oluturarak gerekletirilir.
-
28
28
3. Geri dnmsz olarak numune bileenlerinin adsorpsiyonuna neden olan
ve metalik elementleri, zgn bileenlerin bozunmas iin katalitik ksmlar olarak
rol oynayan aktif blgelerin olmamas gerekmektedir.
Eer kolon, scaklk snrlarnn zerinde uzun sre kalrsa ve WCOT
kolonlarda kolon duvarlarnda yumuak, tekdze bir sv kaplamas baarlamazsa
aktif blgeler ortaya kacaktr. Polar ve apolar sabit faza sahip olan WCOT kolonlar
yksek verimlilie sahiptir.
Kolonlar saklanrken sv faza difze olabilecek oksijen veya dier kirlilikleri
engellemek iin ular uygun bir ekilde kapatlmaldr.
Dedektrler :
Gaz kromatografide kullanlan ideal dedektrler aadaki zelliklerde
olmaldr:
- Yeterli duyarllk nicel olarak tanmlanamaz. Genel olarak bugnn
dedektrlerinin duyarlklar 10-8-10-15 g madde s-1 arasnda deimektedir.
- yi bir kararllk ve tekrarlanabilirlik, geni bir dorusal alma aral,
400C ye kadar varan scaklk aral olmas istenir.
- Numuneyi paralamamaldr.
- Her trden analite benzer cevap alnmal veya belirli snf maddelere kar
tahmini kolay ve seici cevap verme zellii olmaldr.
Gaz Kromatografisinde kullanlan balca dedektrler unlardr:
Termal iletkenlik dedektr
Elektron yakalama dedektr
Alev iyonlama dedektr
Alev fotometri dedektr
Azot fosfor dedektr
Fotoiyonizasyon dedektr
Ktle seici detektr
-
29
29
Gelitirilen yntemde gaz kromatografisi sisteminde dedektr olarak ktle
seici dedektr kullanlmtr.
Ktle Seici Dedektr (MSD):
Ktle spektrometrisi gibi zel olarak retilen sistemler, gaz kromatografisiyle
birlikte dedektr olarak kullanlmaktadr. Ktle dedektr, gaz kromatografisinden
gelen rnekleri gaz halinde ykl ve hareketli iyonlarna dntrerek, bunlar
ktle/yk oranlarna gre ayrr ve elde edilen spektrum maddenin tehis ve tayinini
salar. Burada ykl bir paracn ktlesi m, yk de zdir. Bir maddeden m/z
oranlar birbirinden farkl birok parack meydana gelebilir. Cihaz, m/z deerleri
ayn olan tanecik demetleri iin birer pik izer. Oluan iyonlar paralanarak
paralanma rnlerini olutururlar. Paralanma rnleri ktle seici analizrden
geerken m/z oranlarna gre ayrlr, oaltlr, saylrlar ve bylece ilgili maddeye
ait ktle spektrumu oluturulur. Ktle spektrumlar, bal okluk ve m/z deerleri
arasnda izilen grafiklerdir. Ksmen basit bileiklerin spektrumlarnda bile, farkl
ykseklikte ok sayda pik grlr. Piklerin says; bileiin yapsna, iyonlama
potansiyeline ve kullanlan cihazn yapsna baldr (46).
2.6. Gaz Kromatografisi-Ktle Spektrometrisi (GC-MS)
Gaz kromatografisi ou zaman seici spektroskopik ve elektrokimyasal
tekniklerle balantl olarak kullanlr. Bylece kombine yntemler ad verilen bu
sistemler, kompleks karmlarn analizinde gl bir ara olarak tercih edilir (46).
Ktle spektrometresi uzun yllardan beri kullanlmakta olup ktle spektrumu
ilk kez 1898de Wien tarafndan elde edilmitir. 1905de ise Thompson kararl
izotoplarn bulunduunu gstermek iin yapm olduu deneyde farkl pozitif
iyonlarn ktle/yk (m/z) oranna gre farkl parabolik yrnge kat ettiini
gstermitir. Ktle spektrometresi, 1957 ylnda Holmes ve Morrel tarafndan, gaz
kromatografisi ile birletirilmitir. Ktle spektrometresinin gaz kromatografisi
dedektr olarak kullanlmasnn nedeni toplanacak bilgilerin okluudur. Btn
organik bileik snflarna ve tm organik bileiklerde ortak bir fiziksel zellik olan
ktleye cevap verebilmesi en byk zelliidir.
-
30
30
Ktle spektrometrisinde gaz fazndaki numune, yksek enerjili elektronlarla
arptktan sonra elektronlarn kaybederek pozitif veya negatif ykl eitli iyonlar
haline dnmektedir. Hzlandrlan bu iyonlar manyetik ve/veya elektrik alannda
saptrlmaktadr. yonlarn sapmas; ktlelerine, yklerine ve hzlarna baldr. Eer
yk, hz ve saptrc g sabit ise, sapma ar paracklarda az ve hafif paracklarda
ok olacaktr.
Ktle spektrometresi, evrensel, ktle baml ve ykc (paralayan) bir
dedektrdr. Ktle spektrometresi, tek bir cihaz olarak kullanld gibi, gaz ve
yksek basnl sv kromatografisi (HPLC) cihazlarna bal olarak da
kullanlmaktadr. Her numune iin sinyal verir. Numunenin deriiminden
bamszdr (46).
Ktle spektrometresi u ksmlardan oluur (ekil 2.7);
1. Ara balant
2. yon kayna
3. Ktle analizr
4. Dedektr
5. Vakum Sistemleri
ekil 2.7. Kuadropol GC-MS sisteminin ematik gsterilii
-
31
31
2.6.1. GC-MS Ara Balantlar
Gaz kromatografisi ile ktle spektrometresi arasndaki basn farkndan
dolay ara balantya gerek vardr. Gaz kromatografisi atmosfer basncnda, ktle
spektrometresi ise ok dk basnta (10-5-10-9 torr) almaktadr. Ktle
spektrometresindeki vakum koullarnn bozulmasn engellemek iin gaz
kromatografisinden gelen eluattan tayc gazn uzaklatrlmasn ve bileenlerin
ktle spektrometresi iyon kaynana iletilmesini salamak iin ara balant kullanlr.
Kullanlan ara balantlar unlardr;
a) Effusif ara balant: Bu balantnn alma prensibi tayc gaz ile
numunenin ktle farkllndan dolay ayrlmasna dayanr. Gaz kromatografisi
aknts vakum iine yerletirilmi porz cam tpn iine doru olur. Daha ok
dolgulu kolonlarda kullanlr.
b) Jet ayrclkl ara balant: Temeli numune ve tayc gazn gaz
kromatografisinden kp kk jet aklna doru gemesine dayanr. Geite
molekln hz artar ve iki aklktan geerek iyon kaynana gelir. Hafif tayc
gazlar vakum alannda dar pompalanr. Numunelerin inertlii iin jet ara balant
camdan yaplmtr ve geni aralktaki numune tiplerine uygundur. Hem dolgulu hem
de WCOT kolon ile kullanlabilir.
c) Geirgen zarl ara balant: Tayc gaz ve numunenin silikon zar
yzeyinden, zarn dier tarafnda bulunan iyon kayna vakum odasna doru
geiini salar. Organik molekller zar yzeyinde znr ve ktle
spektrometresinin vakum ksmna girer. Organik olmayan tayc gaz molekl
zlemez ve dar atlr. Dolgulu kolon kullanlan gaz kromatografisi cihaz
genelde organik madde analizlerinde tercih edilir.
d) Dorudan blmeli ara balant: Ak, ara balantda blnerek ktle
spektrometresinin pompalama kapasitesine uygun olmas salanr. Kolon sonunda
blnen ksm atmosfere atlr. Nicel analiz iin uygun deildir.
e) Ak blmeli ara balant: Kolon ucu ktle spektrometresine gaz
ayarlaycs ile balanr. Gaz ayarlayc ile istenen ak salanarak gazn fazlas dar
atlr. Klcal kolonlarla kullanlr.
-
32
32
f) Dorudan klcal kolon balantlar: 1-3 mL dak-1 gibi dk tayc gaz
ak hzlar sz konusu olduunda gerekli basn dmesi, ktle spektrometresinin
vakum sistemi ile salanabilir. Bu nedenle de dorudan bir ara balant kullanlabilir.
Bu durumda hem tayc gaz hem de numune, tayc gazn numune
molekllerinden daha byk hzda pompaland ktle spektrometresinin iyon
kaynana girerler. Yksek tayc gaz aklarndan dolay dolgulu kolona
uygulanmaz. almalarmzda bu sistem kullanlmtr.
2.6.2. yon Kayna
Molekllerin iyonlat blmdr. Bir molekl, atom veya iyondan bir
elektron uzaklamas olayna iyonlama denir. yonlatrma teknikleri; gaz, sv ve
kat gibi maddenin farkl fiziksel durumuna ve maddenin ssal kararllna bal
olarak seilir. Gazlar ve svlar iin elektron ve foton bombardmanl iyonlatrma;
katlar iin ise termal, lazer desorpsiyon, atom bombardman, elektrik boalm ve
alan desorpsiyon iyonlama uygundur. Gnmzde en ok kullanlan iyonlatrma
teknikleri elektron bombardman ile iyonizasyon ve kimyasal iyonizasyondur.
a) Elektron bombardman ile iyonizasyon (EI): EI ksaca analit
moleklnn enerjili elektronlarla bombardman edildii iyonlamadr (ekil 2.8).
ekil 2.8. Elektron bombardman ile iyonizasyon (EI)
-
33
33
Scak bir flamandan kan elektronlar blme boyunca odaklanr ve 70 eV'luk
bir potansiyele sahip bir elektrot tarafndan ekilir. Bylece her bir elektron 70
eV'luk bir enerji kazanr ve ortama giren numune ile arparak bir dizi paralanma
tepkimeleri oluur. Molekldeki balarn krlmas pozitif ve negatif iyonlarn
olumasn salar. ou organik molekl iin pozitif iyon oluumu enerji asndan
daha ok tercih edilir. Elektronun sahip olduu enerji balar krmak iin yeterli
enerjidir. 70 eV'luk enerjinin kullanlmas kararl, tekrarlanabilir ve molekle zg
ktle spektrum olumasn salar. Elektron bombardman ile oluan iyonlarn bal
byklkleri, iyonize edici elektronlarn enerjileri ve iyonizasyonun olutuu
scakla baldr. almamzda EI teknii kullanlmtr.
b) Kimyasal iyonlatrma (CI): Genellikle dz zincirli alkan, alken veya
alkoller gibi homolog bileikler EI ile kararl molekler iyonlara sahip pozitif
tanmlama yaplamayacak kadar kk bal bollua sahiptirler. CI'nn esas iyon-
molekl tepkimelerine dayanr. Yksek enerjili iyonlar arptklar molekle ya
proton aktarrlar ya da ondan hidrr ve elektron koparrlar. Kimyasal iyonlamal
ktle spektrometresinde (CI-MS), iyon kaynana reaktif gaz verilerek yksek basn
elde edilmektedir. Reaktif gaz numune moleklleri ile i etkileime girecek reaktif
iyonlarn oluturmak zere elektron demeti tarafndan iyonize edilmektedir.
Ortamdaki yksek basncn etkisiyle reaktif iyon ile numune i etkileime girer. EI'ya
gre enerji daha dktr.
2.6.3. Ktle Analizr
yon kaynandan kan iyonlama rnleri analizre ynlendirilir. Analizr,
m/z oranlarna gre maddelerin ayrmnn saland blmdr.
En ok kullanlan ktle analizrleri unlardr;
a) Manyetik sektrl ktle analizr: Manyetik sektr analizrlerinde
kalc mknatslar veya elektromknatslar kullanlr; bu mknatslar iyon kaynandan
gelen demete iyonlarn m/z oranlarna bal olarak 180, 90 veya 60 derecelik alarla
dairesel hareket yaptrrlar. Bu blgede i basn 10-7 torr civarndadr.
-
34
34
b) Uu zamanl ktle analizr: yonlar uu tp ad verilen tpn
iinden geerler ve bu srada hzlandrcnn etkisiyle eit momentuma sahip olurlar.
Bylece ktleleri birbirinden farkl olan iyonlarn hzlar da farkl olarak belirlenir.
c) Kuadropol ktle analizr: Kuadropol, eksenlere simetrik olarak
yerletirilmi, 4 adet zenginletirilmi altn ubuktan olumaktadr. Kuadropol ktle
analizrnn belirli bir ktle aralnda tarama yapmas ve ayrm iin radyo frekans
(RF) ve doru akm (DC) voltaj uygulanr. X eksenindeki ubuklara pozitif, y
eksenindeki ubuklara negatif gerilim uygulanarak iyonlaan rnek molekllerinin
ubuklar arasnda rezonansa gelmesi salanr. RF voltajnn bykl iyonlarn
ktlesini belirtir. DC voltajnn RF voltajna oran, ayrm belirtir.
Kuadropol ktle analizr, yksek duyarlla ve milisaniye aralklar ile hzl
tarama zelliine sahiptirler. Bu zellikler dar piklere sahip WCOT kolon taklm
gaz kromatografisi cihazlarna balamak iin ok uygundur ve altmz cihazda
kuadropol ktle analizr kullanlmtr. Kuadropol ktle analizr ematik olarak
ekil 2.9da gsterilmitir.
ekil 2.9. Kuadropol ktle analizr
Kuadropol analizrn en nemli zellii, tarama hznn byk olmas ve
taranan ktle aralnn magnetik sektrl ktle spektrometrelerine gre snrl
-
35
35
olmasdr. Kuadropol analizrnde, yksek ktlelerde bal okluk fazla deildir.
Filtre edilen ktlelerin farkl olabilmesi iin RF/DC oran sabit tutularak DC
potansiyeli deitirilir. Ktle taramas ya DC ve RF voltaj deitirilip oranlar sabit
tutularak ya da RF ve DC voltaj sabit tutulup frekans deitirilerek yaplmaktadr.
2.6.4. Dedektr
Ktle analizrlerinden geen iyonlar elektron oaltc dedektre ular.
Elektron oaltcda arpmadan dolay oluan akm, nce analog voltaja, sonra da
dijital sinyale dnr.
En ok kullanlan dedektrler dizi dinot elektron oaltc (ekil 2.10.a) ve
devaml dinot elektron oaltclardr (ekil 2.10.b). Bunlar sinyali 107 dzeyine
kadar artrabilirler. Bu da femtoamper gibi ok dk iyon akmlarnn
kaydedilmesini salar.
Ktle spektrometresinden milisaniye aralklarla gelen verilerin hzla
kaydedilmesi ve depolanmas gereklidir ki, bu bir bilgisayarla kolayca
salanabilmektedir. GC-MS sistemi, ara balant ve veri toplama basamaklarndaki
problemlerin zlmesinden sonra, daha yaygn kullanlmaya balanmtr.
Bunlardan baka aletin kalibrasyonun otomatik yaplp, sonularnn alnabilmesi,
analiz koullarnn kolayca girilmesi, aletin kontrolnn yaplp verilerin
alnabilmesi, analiz sonras veri deerlendirmelerinin yaplabilmesini bilgisayar
salamaktadr.
Ktle spektrometresi ile analizlerde 3 tip iyon tarama ekli vardr;
1. Toplam iyon taramas (TIC): Bir analiz srasnda ayrm yapmadan tm
iyonlarn istenilen atomik ktle birimlik (akb) aralnda taratlmas ile
gerekletirilir.
2. Seilmi iyon taramas (SIM): Aranlan bileik iin en karakteristik olan,
kararl ve bolluu fazla olan m/z deerleri seilip, taratlr. Seici iyon taramasnda
seilen iyonlarn tarama sresi (dwell time) analizci tarafndan seilir.
3. Tek iyon taramas: Tek iyon taratlr. ok hassastr, ancak kesin
tanmlama yaplamaz.
-
36
36
almamzda TIC alma konumunda okluu en fazla olan m/z deerleri
belirlenmi ve bunlardan 3 tane iyon seilerek SIM taramas ile analizler
gerekletirilmitir. En yksek cevab veren iyon zerinden ise nicel tayin
yaplmtr.
ekil 2.10. (a) Dizi dinot, (b) Devaml dinot elektron oaltc dedektrlerin ematik
gsterilii
2.6.5. Vakum Sistemleri
Ktle spektrometresi cihaz 10-5-10-9 torr dk basn altnda almaktadr.
Ktle spektrometresinde vakum sisteminin olmasn gerektiren nedenler yle
sralanabilir;
1. Flaman yksek basntaki oksijen altnda stlrsa ykseltgenip yanabilir.
-
37
37
2. Basn arttka ktledeki oaltc, kaynak ve analizrde yksek voltaj
krlmalar olabilir.
3. Ktle spektrometresinin iyon kaynanda bulunan gaz, spektral geri zemine
katlabilir (rn; su, azot ve oksijenden gelebilecek m/z: 18, 28 ve 32).
4. Ktle spektrometresinde dk basn salamann en nemli nedeni, analiz
edilen iyonlar arasndaki arpmay en aza indirmektir. nk, iyon srekli dier
molekller ve yzeyler ile arpyorsa, iyonlar belli bir yolda ynlendirmek iin
kullanlan gler yararsz olacaktr.
5. Yksek basn ile analizrn, iyon kaynann ve odaklarn kirlenmesi
artmaktadr.
6. Yksek basn ile spektrum almak ve yorumlamak zordur.
7. Basn artarken iyon kaynana doru olan elektron akm dzeltmeleri
zorlar.
8. Vakum sistemi analizrn ilemini gerekletirmesi iin gereken
molekler ortalama yolu salar.
Bu nedenlerden dolay ktle spektrometresi iin vakum sistemleri ok
nemlidir. Ktle spektrometresinde cihaz iindeki basnc 10-5 torr civarnda tutmak
iin deiik pompalar kullanlr. Bunlardan en ok kullanlan kaba, turbo molekler
ve difzyon pompalardr. almamzda difzyon ve kaba pompal MSD
kullanlmtr.
2.6.6. GC- MS Sisteminin Ayarlanmas (Autotune)
Analize balamadan nce ve periyodik aralklarla ktle spektrometresindeki
iyonlatrc, ktle analizr ve dedektr ksmlarnn, uuculuu yksek ve kararl
organik bileikler kullanlarak ayarlanmas gerekmektedir. Sistemde bu ilem
"autotune" denilen donanm kullanlarak yaplr. Ayarlama iin iyon kaynann
basnc 10-5 torr civarnda olmaldr. Standart olarak kullanlan bileik allan ktle
araln kapsamal ve pik iddeti yksek olmaldr. Uuculuu fazla ve kararl
organik maddelerden olmaldr. Kullanlan ayarlama maddesi iyon kaynana
verilerek ktleler ve izotoplar gzlenir.
Ayarlama bileii olarak almamzda kuadropol sistemlerinde standart
olarak en ok tercih edilen perflorotributilamin (PFTBA) kullanlm ve bu maddeye
-
38
38
zg 69, 219, 502 m/z pikleri temel alnmtr. Autotune sonucu Tablo 2.1de
tanmlanan kabul kriterlerine gre deerlendirilmitir. Kabul kriterleri salanmadan
analize balanmamtr. ekil 2.11de cihazn kabul edilebilir bir autotune kts
grlmektedir. (48)
Ayrca m/z=18 (su) ve 28 (hava) pikleri, m/z=69 pikinin %10'undan az
olmaldr. Fazla olduunda sistemde kaak olmas olasl vardr. m/z=502 pikinin
bal okluu azaldnda ise, iyon kaynann kirlendii sylenebilir.
Tablo 2.1. Ktle spektrometresinin ayarlanmasnda kullanlan ktlelerin bal
okluklar ve izotop ktle oranlar
Ktle Bal okluk (%) zotop Ktlesi zotop Oran (%)
69.0 100 70.0 0.5 1.6
219.0 > 35 220.0 3.2 5.4
502.0 > 1 503.0 7.9 12.3
-
39
39
ekil 2.11. Analizde kullanlan GC-MS cihaznn autotune kts
-
40
40
2.7. Trevlendirme Teknikleri
Ayrlacak karmn, sabit fazla etkilemesinden dolay, piklerde
kuyruklanma grlebilecei gibi, alkonma zamanlarnn uzam