FARMACODINAMICA (PD):descrive ciò che il farmaco fa all’organismo (obiettivo terapeutico, rapporto rischio/ beneficio)

FARMACOCINETICA (PK):descrive ciò che l’organismo fa al farmaco (e in quanto tempo)

ADMEAssorbimento

Distribuzione

Metabolismo

Escrezione

ADME : definizioni

ASSORBIMENTO

Velocità: dipende da diversi fattori; per un dato farmaco è proporzionale alla sua concentrazione a livello del sito di assorbimento

Entità: è definita dalla competizione tra velocità di assorbimento e velocità con cui il farmaco viene perso (p.e per degradazione chimico-fisica, metabolizzazione o passaggio attraverso il tratto GI)

VALUTAZIONE DELL’ ASSORBIMENTO INTESTINALE

FATTORI CHE INFLUENZANO L’ ASSORBIMENTO INTESTINALE

ESPRESSIONE DI ENZIMI FARMACO-METABOLIZZANTI NEI DIVERSI SEGMENTI DEL TRATTO INTESTINALE

Modelli in vivoModelli in situModelli in vitro

Modelli organotipiciSacco intestinale rovesciato (everted

drug sac)Segmenti intestinali isolati e perfusiCamere di Ussing

Modelli cellulariParallel artificial membrane permeability assay (PAMPA)Test di permeabilità

MODELLI PER LO STUDIO DELL’ASSORBIMENTO INTESTINALE

Sistemi non intestinali: MDCK (Madin Darby canine kidney cells)Linee cellulari di ratto derivate da intestino tenue fetale o neonataleCaco-2

MODELLI CELLULARI PER LO STUDIO DELL’ASSORBIMENTO INTESTINALE

Area * time

Papp (cm sec−1) =amount transported

initial concentration

1*

OrigineAdenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in monostrato

Crescita cellule epiteliali in monostrato

Differenziamento 14-21 dopo la confluenza

morfologiaCellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola apicale

Parametri elettrici Resistenza elettrica elevata

Enzimi digestivi Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue

Trasporto attivo Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….

Trasporto ionico di membrana

Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+, cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-

Trasportatori non ionici di membrana

P-glicoproteina, MRPs, LRP

RecettoriVitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio (GLUT1,3,5 e SGLT1)

CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2

CONDIZIONI DI COLTURA PER L’USO DELLA LINEA CELLULARE Caco-2

Siero inattivato nel terreno sul versante apicale

20%

Siero inattivato nel terreno sul versante basolaterale

20%

rivestimento Collagene di tipo I (non richiesto con filtri dal 0.4 μm)

Additivi

Aminoacidi non essenziali (1%)

Glucosio (25 mM)

Glutamina (2 mM)

Antibiotici (streptomicina 100 μg/l; penicillina (100mU/ml)

CO2 10 o 5%

pHGeneralmente 7.4 su entrambi i versanti, o 7.4 sul versante basolaterale e 6.4 su quello apicale

Densità cellulare alla semina 2.5 x 103 – 4 x 103

Numero di passaggi 25 – 100

PRINCIPALI CONTROLLI DA EFFETTUARE SU CELLULE IN MONOSTRATO

Resistenza elettrica transepiteliale (TEER) 260 – 420 Ω/cm2

Può indicare tossicità o perdita ddi funzionalità delle tight junctions

Markers di differenziamento Attività enzimatiche: saccarosio isomaltasi, aminopeptidasi, fosfatasi alcalina

Differenziamento morfologico Microscopia elettronica

Espressione della Pgp Immunoistochimica, Western blot o misura dell’attività della Pgp

Assenza di contaminazione da micoplasmi Metodi microbiologici standard

Integrità del monostrato cellulare mediante misura della permeabilità a composti standard

Mannitolo, PEG

Meccanismo Agenti Effetti

Ruolo della P-gpInibitori

Verapamil Chinidina Ciclosporina A

0.5 mM sul versante apicale (A) e basolaterale (B)0.5-1 mM in A e B50 μM in A e B

Aumento del trasposrto dal versante A al B (se il farmaco è posto sul versante A)

Substrati Rodamina 123 1 mM

Ruolo delle MRP

Inibitori Come i substrati

Substrati

Leucotriene C4S-2,4‑dinitrofenilglutationePAHDoxorubicinaEtoposideVinblastinaMetotrexate

Ruolo della LRPInibitori

Substrati Antracicline

Trasporto paracellulare

EGTAcitocalasina

Aumento del trasporto, se è paracellulare

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA

BCEC (brain capillary endothelial cells) immortalizzate condizionali ottenute da animali transgenici

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERASANGUE-CSF

PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERAPLACENTARE

VALUTAZIONE DEL LEGAME ALLE PROTEINE PLASMATICHE

Spiazzamento di farmaci che legano specifici siti

IbuprofeneWarfarin

ALBUMINA >>> altre proteine (p.e. α-glicoproteina acida)

ADME : definizioni

ELIMINAZIONE: perdita irreversibile di farmaco dall’organismo

Velocità: proporzionale alla concentrazione del farmaco

Entità: dipende dalla competizione tra vie di eliminazione diverse

ADME : definizioni

METABOLISMO: Perdita irreversibile di farmaco dovuta alla formazione di nuove specie chimiche

Detossificazione/attivazioneFase I:ossidazione (CYP-dipendente)

riduzione, idrolisiFase II:coniugazione

ADME : definizioni

METABOLISMO (cont.)

Principalmente a livello epatico (ma anche intestinale, polmonare e cutaneo)

Complessità:InduzioneInibizione

Polimorfismi

INTERAZIONI CON ALTRI FARMACI

VARIABILITÀ

ADME : definizioni

ESCREZIONE: perdita irreversibile del composto originale

Renale: dipende dalla struttura chimica (carattere idrofilo) e dal peso molecolare

Biliare: dipende dalla struttura chimica (è necessaria la presenza di un gruppo non polare) e dal peso molecolare

Altre vie, generalmente meno importanti

CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1

CYP3A4

PRIINCIPALI ENZIMI IMPLICATI NEL METABOLISMO DEI FARMACI NELL’UOMO

Fase I: enzimi citocromo P450-dipendenti (CYP)

Fase II: UDP-dependent glucuronosyl transferase (UGT), phenol sulfotranferase (PST)estrogen sulfotransferase (EST)glutathione-S-transferase (GST).

STUDI METABOLICI IN VITRO

FRAZIONE EPATICA S9

MICROSOMI

EPATOCITI

in sospensione

in coltura

SUPERSOMI

parent compound concentration (before incubation)

% parent compound disappearance

1 −

. 100

parent compound concentration (after incubation)

= X 100

Molecola candidata

per lo sviluppo

Tossicità acuta(somministrazione singola

a dosi elevate)

Tossicità persomministrazioni ripetute

(da 1 a 6 mesi)

Mutagenesi in vitro

Sperimentazione clinica(Fasi I e II)

Tossicità dello sviluppo(fertilità, sviluppo peri- e

post-natale, teratogenicità)

Mutagenesi in vivo

Cancerogenesi(studio per due anni nel topo e nel ratto)

Tossicità speciali

TEST DI TOSSICITÀ ACUTA

valutano effetti avversi che si verificano entro un tempo breve dalla somministrazione di una dose singola della sostanza in esame

devono essere effettuati almeno su due specie animali, di cui una non roditrice;

il farmaco deve essere somministrato secondo almeno due vie di somministrazione

gli animali vengono osservati per 14 gg

DL50

Dose singola, derivata statisticamente, di una sostanza, per la quale ci si attende una mortalità pari al 50% degli animali trattati

TEST DI TOSSICITÀ PER SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE

SCOPI ottenere informazioni sulla tossicità di un prodotto medicinale prevedibilmente destinato ad essere somministrato ripetutamente

valutare i rischi connessi con l’impiego terapeutico del prodotto stesso, tenendo anche conto dei suoi prodotti di biotrasformazione

Durata proposta per il trattamento nell’uomo

Durata suggerita per gli studi di tossicità

Una o più dosi nell’arco di 24h

2 settimane(studi di tossicità acuta)

Fino a 7 gg 4 settimane(studi di tossicità subacuta)

Fino a 30 gg 3 mesi(studi di tossicità subcronica)

Oltre 30 gg 6 mesi(studi di tossicità cronica)

TEST DI TOSSICITÀ PER SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE

Test di tossicità dello sviluppo

i. Modifiche della fertilità o procreazione anormale ii. Interferenza con le fasi del pre-impianto e dell’impianto

dello sviluppo fetaleiii. Effetti tossici sull’embrioneiv. Effetti tossici sul fetov. Modifiche della fisiologia materna con conseguenti

effetti tossici secondari sull’embrione o sul fetovi. Effetti sulla crescita e sullo sviluppo dell’utero o della

placenta vii. Interferenza con il partoviii. Effetti sullo sviluppo post-natale, sull’allattamento e

sulla capacità di prendere il latte da parte dei natiix. Effetti tardivi sulla discendenza

Test di tossicità dello sviluppo

Segmento I - Test di performance riproduttiva e fertilità generaleSegmento II – TeratogenesiSegmento III – Tossicità peri- e post-nataleSegmento IV – Studi multigenerazionali

Test di cancerogenesi

Sono di norma indispensabili

a) Quando appare possibile che un farmaco sia somministrato con regolarità per un periodo di tempo abbastanza lungo

b) Quando la struttura chimica del farmaco fa sospettare un potenziale effetto cancerogeno

c) Quando il farmaco può suscitare dubbi a causa dii. Aspetti specifici della sua azione biologicaii. Quadro di tossicità o ritenzione a lungotermine rilevati

da studi precedentiiii. Positività in prove di mutagenesi e/o di cancerogenesi

a breve termine

1. Quality system concerned with the organisational

process and the conditions under which non-clinical health

and environmental safety studies are planned, performed,

monitored, recorded, archived and reported.

Good Laboratory Practice (GLP)

SVILUPPO CHIMICO

Sintesi chimica: come produrre il farmaco in modo efficiente

“Commercial manufacturing”: come produrre il farmaco in modo economico

Formulazione: come preparare il farmaco in una forma adatta per la somministrazione