FACULTAD DE QUÍMICA EDUCACIÓN CONTINUA...
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FACULTAD DE QUÍMICAEDUCACIÓN CONTINUA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
DIPLOMADO DEL ÁREA DE FARMACIA
“Bioquímica y Biología Molecular para la Industria Farmacéutica y Biotecnológica” Farmacéutica y Biotecnológica”
Laura Carmona Salazar
Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro
MÓDULO II. Métodos de Purificación y Análisis de Proteínas
Objetivos.�Revisar los fundamentos en los que se basan los
distintos métodos de purificación de proteínas y
cómo la combinación de éstos permite el
enriquecimiento sustancial de una proteína a partir
de una fuente natural o un organismo que la sobre
expresa.
�Revisar los fundamentos de los distintos métodos �Revisar los fundamentos de los distintos métodos
de análisis de proteínas que permiten la
caracterización fisicoquímica y biológica de
proteínas que son empleadas como fármacos.
�Revisar la fisiología y aplicaciones de algunos
productos biotecnológicos en la terapia.
TEMATICA PONENTES
PURIFICACIÓN LAURA CARMONA SALAZARNATLLELY GARCÍA CARREÑOLUIS T. SÁNCHEZ LINARES
ANÁLISIS NATLLELY GARCÍA CARREÑOSOBEIDA SÁNCHEZ NIETO
ORGANIZACIÓN DEL MÓDULO
SOBEIDA SÁNCHEZ NIETOLEÓN P. MARTINEZ CASTILLAROGELIO RODRIGUEZ SOTRESANGEL G. DÍAZ SÁNCHEZVICTOR ZALDIVAR MACHORRO
EJEMPLOS LAURA CARMONA SALAZARNATLLELY GARCÍA CARREÑO
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
�Lisis celular y extracción de proteínas
�Precipitación diferencial de proteínas por salado, pH y temperaturasalado, pH y temperatura
PARA LA DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN,ESTRUCTURA Y FUNCIÓN YA SEA DE UN TIPO CELULAR, ORGANELO, BIOMOLÉCULA
SE REQUIERE PURIFICARSE PARA SU ESTUDIO
REQUERIMIENTO BÁSICO PARA EL ESTUDIO ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE UNA PROTEÍNA
PURIFICACIÓN
CONSIDERACIONES BÁSICAS PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
1. Conocer las características propias de la proteína:carga, tamaño, solubilidad, localización celular, función
2. La cantidad, es decir la abundancia celular3. Costos 3. Costos
CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES COMUNES DE LOS AMINOÁCIDOS
Grupoamino
Grupo carboxilo
Carbono αααα
Aspartato CH2 COOH
Forma que predominaabajo del pKR
pKR Forma que predominapor arriba del pKR 3.9CH2 COO- + H+
Glutamato CH2 CH2 COOH4.1
CH2 CH2 COO- + H+
Histidina6.0
+ H+CH2
NH
N
H+
CH2
NH
N
EL VALOR DE pK NOS AYUDA A SABER EL ESTADO DE PROTONACIÓN Y LA CARGA DE UN GRUPO QUÍMICO A CIERTO pH. Disociación del grupo R de
un aminoácido
Cisteína CH2 SH CH2S-8.4
+ H+
Tirosina OH10.5
O- + H+
Lisina CH2 CH2 CH2 CH2 NH3
+CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 + H+10.5
Arginina
+
CH2 CH2 CH2 NH C
NH2
NH2
12.5CH2 CH2 CH2 NH C
NH
NH2
+ H+
EL AMINO, CARBOXILO Y LOS RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS CON CADENAS LATERALES CON CARGA CONTRIBUYEN EN LA DETERMINACIÓN DE LA CARGA TOTAL DE LA PROTEÍNA
RESIDUO
CONSIDERACIONES GENERALES PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
1. Definir los objetivos de la purificación: grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos
2. Seleccionar el material biológico de inicio: Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos subcelulares
3. Desarrollar una técnica de análisis: Para la determinación de la pureza, actividad o contenido total de proteína.
4. Minimizar la manipulación de la muestra4. Minimizar la manipulación de la muestra5. Remover desde el inicio posibles contaminantes: por ejemplo proteasas6. Reducir el uso de aditivos7. Apoyarse en el uso de técnicas diferentes en cada paso: Para ello se debe
considerar las propiedades fisicoquímicas de la proteína.8. Minimizar el número de pasos.
PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por
adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño
y afinidad
CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LA FUENTE PROTEICA
� Varias pueden ser las fuentes biológicas
� Facilidad para la obtención de la biomasa
� La cantidad de la proteína en el tejido o célula
� Estabilidad
MATERIAL BIOLÓGICO
Animal
MATERIAL SISTEMA
Vegetal
¿QUÉ ES EL MATERIAL BIOLÓGICO?
¿QUÉ ES EL SISTEMA BIOLÓGICO?
LOS SERES VIVOS SE CLASIFICAN EN TRES DOMINIOS
Envoltura celular
CARACTERÍSTICAS COMUNES DE LAS CÉLULAS BACTERIANAS
LAS CÉLULAS EUCARIONTES POSEEN DIVERSOS ORGANELOS MEMBRANOSOS
PROCARIONTES EUCARIONTES
Aproximadamente 1 µm 5-100 µm
El material genético no se localiza en el núcleo
Material genético en el núcleo
Carece de organelos Organelos determinados
LAS CÉLULAS PROCARIÓTICAS Y EUCARIÓTICAS EXHIBEN DIFERENCIAS EN SU MORFOLOGÍA Y FUNCIÓN
Carece de organelos Organelos determinados por membranas y tienen funciones específicas:MitocondriasRetículo endoplasmáticoComplejo de GolgiLisosomasVacuolas
MATERIALBIOLÓGICO
AISLAMIENTO CELULAR
AISLAMIENTO SUBCELULAR
I. RUPTURA O LISIS CELULAR
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
I. RUPTURA O LISIS CELULAR
1) LISADO 2) SEPARACIÓN
HomogenizaciónMecánicaNo Mecánica
ASPECTOS BÁSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O RUPTURA CELULAR
ASPECTOS BÁSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O RUPTURA CELULAR
Medio homogenización
H+
H+ H+
H+ H+
H+Na+Na+
Na+Na+
Cl-
Cl-Cl-
Cl-
HClCl-
TRIZMAFosfatos
EDTA
Mg2+
Inhibidoresde
proteasasDTT,
ββββ-mercaptoetanol
Medio homogenizaciónRuptura celular
Medio de resuspensiónMantenimiento de integridad
ASPECTOS BÁSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O RUPTURA CELULAR
Mantenimiento de integridadde organelos
PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por
adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño
y afinidad
FRACCIONAMIENTOSUBCELULAR
1.Homogenización(medio isotónico)
2. La separación 2. La separación por tamaño
Fundamento de la centrifugacióndiferencial:Se basa en las propiedades de tamaño, forma y densidad de las partículas parala separación, donde el efecto de la gravedad es diferente para cada molécula.
SEPARA
Centrifugación Diferencial Velocidad de sedimentación (s)Peso
TamañoFormaP
ROPIED
FÍSIR
ACIÓN
DADES
ICAS
Fracciones parcialmente enriquecidas
SEPARACIÓN POR GRADIENTES DE DENSIDAD
1) Centrifugación isopícnicaRequiere de un gradiente desacarosa y en la parte superiorse adiciona una mezcla de organelos,los cuales se van a ir separando acorde a su densidad
MEDIOS DE DENSIDAD DISPONIBLES PARA LASEPARACIÓN DE LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS
ALCOHOLES POLIHIDRATADOS: Son gradientes no iónicos, inertes, estables y de bajo costoSacarosa, Sorbitol, Glicerol, Polietilenglicol PEG
POLISACÁRIDOS: Tienen una fuerza osmótica elevadaFicoll (Sacarosa polimerizada con epiclorohidrina), Dextrán
MEDIOS DE SILICA COLOIDAL: No son soluciones, son suspensiones de partículas de silicacubierta de polivinilpirrolidona PVP (15 a 30 nm de diámetro). Presentan unacubierta de polivinilpirrolidona PVP (15 a 30 nm de diámetro). Presentan unafuerza osmótica baja y cambia poco con cambios en la densidad.Percoll
GRADIENTES DE DENSIDAD MEDIA QUE CONTIENEN YODO Y SON NO-IÓNICOSBasados en el ácido triyodobenzoico, tiene un grupo hidrofílico que favorecela solubilización.Nycodenz, Optiprep
SALES INORGÁNICAS: Son gradientes iónicos de sales de metales pesados usados para separaciones de ácidos nucleicos en gradientes isopícnicos
Centrifugación en gradiente de densidad
De: Organelles and membranes of animal cells, Biological membranes,W. H. Evans
PUREZA
Marcadores: Actividades, características morfológicas o reactividad específica
a un tipo membranal
¿Para qué?
DistribuciónRecuperación
EnriquecimientoContaminación
¿Para qué?
VISUALIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN A TRAVÉS DE LA TABLA DE RECUPERACIÓN
DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD RECUPERADA. CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas donde cada uno sebasa en alguna propiedad específica de las proteínas, lo cual puede tener ventajas y desventajas.
Cuantificación por medición de absorbencia a 280 nm: depende dela presencia de residuos aromáticos tirosina y triptófano. Tiene la desventaja deque otros componentes no proteicos pueden absorber en el UV.
Ensayo de Biuret: Las proteínas reducen los iones cúprico (Cu3+) en iones cuproso (Cu1+) el cual reacciona con los enlaces peptídicos y da una coloración azul. Ventajas no interfiere el PEG y desventaja a pHalcalinos hay interferencia
Ensayo de Lowry: Es una extensión del ensayo de Biuret, donde los iones cuprosos reaccionan con el reactivo Folin-Ciocalteu formando un complejo defosfato-tungnsteno-molibdato que da un color azul intenso. Ventaja es más sensibley requiere una menor cantidad de proteína, pero es más sensible a la interferencia
DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD RECUPERADA. CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas donde cada uno sebasa en alguna propiedad específica de las proteínas, lo cual puede tener ventajas y desventajas.
Ensayo de Bradford: Es el más ampliamente utilizado, es sensible, sencillo, rápidoy resistente a la interferencia, se basa en el colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida, conforme reacciona con las proteínas se torna café-rojizo.Desventaja es que reacciona con las celdas de lectura para el espectroscopio.Desventaja es que reacciona con las celdas de lectura para el espectroscopio.
CURVA PATRÓN
ENZIMÁTICOS: Actividad específica asociada a un organeloparticular
RE: NADPH-citocromo c reductasa
MIT:,Cit c oxidasa,ATPasa sensible a NaN3
GOLGI: GSI
TONOPLASTO: ATPasa sensiblea NO3-
MEMBRANA PLASMÁTICA: GSII,ATPasa sensible VO4
3-
Endosomas tempranosEndosonas tardíos
INMUNOLÓGICOS:
MORFOLÓGICOS: Grosor de membrana
Reactividad
Endosonas tardíosMP basolateral
REGICRE
C. Pasquali et al., J. Chromatogr B, 722 (1999)
VESÍCULAS DE MICROSOMAS
VESÍCULAS DE MEMBRANAPLASMÁTICA
FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD
Capacidad crear y mantener gradientes pH
Transporte de electronesTransporte de electrones
Transporte de solutos
Permeabilidad al agua (Coef.permeabilidadosmótica)
PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por
adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño
y afinidad
MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN SELECTIVA DE PROTEÍNAS
Fundamento.- Para precipitar una proteína se debe modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una proteína pueden interaccionar con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución.
TODA MOLÉCULA SE ENCUENTRA SOLVATADA
PRINCIPIOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR SALES
SALTING INLas proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de sales.
SALTING OUTDisminuye la solubilidad cuando se aumenta en exceso la concentración de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en laconcentración de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en laexclusión del cosolvente, en este caso la sal.
La precipitación con Sulfato de amonio (NH4)2SO4
es el método más ampliamente utilizado
¿POR QUÉ EL SULFATO DE AMONIO?
Se pueden utilizar aniones y cationes polivalentes y monovalentes, la preferencia esun anión polivalente y un catión monovalente.
Preferencia de la serie Hofmeister de aniones en concentraciones molares equivalentes:
citrato > sulfato> fosfato > cloruro > nitrato > tiocianato
Tendencia de la estabilidad de las proteínasTendencia de la estabilidad de las proteínas
Considerando que es muy utilizado, se han diseñado tablas y fórmulas para determinar las concentraciones de (NH4)2SO4
que se pueden emplear para adicionar a las proteínas y obtener una concentración específica.
TÉCNICAS PARA EL DESALADOUna vez que se ha precipitado la proteína por sales, el siguiente paso consiste enRemover la sal de la muestra:
DIÁLISIS: Celulosa o celofán con un poro determinado
ULTRACENTRIFUGACIÓNULTRACENTRIFUGACIÓN
PRINCIPIOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR SOLVENTES
Las proteínas se mantienen en solución por la interacción de los grupos hidrofílicosde su superficie con el solvente
Si la polaridad del solvente se reduce por la adición de un solvente orgánico menos polar que el agua, la proteína se vuelve menos soluble
MENORESTABILIDAD
LA PRECIPITACIÓN POR SOLVENTES SE REALIZA CON TEMPERATURAS BAJAS
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR SOLVENTES
Los dos solventes ampliamente utilizados son el Etanol y la Acetona
Ambos logran precipitar adecuadamente a la s proteínas, pero la Acetona preserva mejor las propiedades de las proteínas
Los rangos de temperatura usualmente utilizados son:Los rangos de temperatura usualmente utilizados son:Temperaturas cercanas a 0 oC hasta -20 oC
Para la recuperación de la proteína se debe centrifugar y puede resuspenderse en un amortiguador apropiado
Desventaja: Bajos rendimientos y puede haber desnaturalización
PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por
adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño
y afinidad
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS Y CROMATOGRAFÍASobeida y Luis
ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
PORTOCOLO PARA EL ESTUDIO DE LA ATPasa DE H+ DE LAMEMBRANA PLASMÁTICADE CÉLULAS VEGETALESDE CÉLULAS VEGETALES
ApoplastoApoplasto ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ = 120 a 160 = 120 a 160 mVmV
LA ATPasa HLA ATPasa H++ SE ECUENTRA EN LA MEMBRANA SE ECUENTRA EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE CÉLULAS VEGETALESPLASMÁTICA DE CÉLULAS VEGETALES
CitoplasmaCitoplasma ∆∆∆∆∆∆∆∆pH = 1.5 a 2 pH = 1.5 a 2 unidadesunidades
ESTRUCTURA DE LA ATPasa DE HESTRUCTURA DE LA ATPasa DE H++ DE MEMBRANA DE MEMBRANA PLASMÁTICAPLASMÁTICA
CitoplasmaCitoplasma
Exterior celularExterior celular
MPMP
GonzálezGonzález--HalphenHalphen
Polipéptido de 100 kDa
Cantidad de enzima
Tipos de isoformas
a) Expresión génica
b) Regulación traduccional
c) Expresión diferencial
MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ATPasa DE H+
Tipos de isoformas
Modificaciones
en la enzima
c) Expresión diferencial
f) Oligomerización
d) Fosforilación/defosforilación
e) Interacción con la proteína 14-3-3
g) Interacción con lípidos membranales
SELECCIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO PARA OBTENER EL SISTEMA BIOLÓGICO
OBJETIVO: PURIFICAR LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE TEJIDOS VEGETALES
Edidin, 2003
Fase líquidadesordenada (l )
PURIFICACIÓN DE UNA FRACCIÓN SUBMEMBRANAL
desordenada (ld)
FluidezMovilidad lateral
FosfatidilserinaFosfatidilglicerolFosfatidilinositolFosfatidiletanolamina
FluidezMovilidad lateral
Fase líquidaordenada (lo)
EsfingomielinaCerebrósidosGlobósidosGangliósidosEsteroles
TEJIDO VEGETAL CON DISMINUCIÓN ENLOS NIVELES DE ESFINGOLÍPIDOS ENDÓGENOS
Obtención de FM/MP
Obtención de DRMs
Caracterización:
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Caracterización:
1) Ultraestructura por MET
2) Análisis proteómico
3) Cuantificación e identificación
de ceramida y de esfingolípidos
4) Cuantificación de ácidos grasos de cadena larga
5) Cuantificación e identificación de esteroles
ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE VMP
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE DRM
MP
CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LOS AMORTIGUADORES DE HOMOGENIZACIÓN Y SUSPENSIÓN
VISUALIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN A TRAVÉS DE LA TABLA DE RECUPERACIÓN
CARACTERIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN DE LAS VMP
CARACTERIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN DE LAS DRM
TAREA PARA EVALUACIÓN:1. Proteína asignada por la profesora.2. Determinar el material y sistema biológico para el estudio. Criterios3. Elaboración del protocolo de purificación de la proteína de interés:a. Establecer las condiciones de homogenización en específico: soluciones y fundamento.b. Centrifugación diferencial/por densidad: precisar los pasos requeridosc. Determinación de la proteína. Selección del métodod. Aislamiento de la proteína: selección de la precipitacióne. Purificación: Determinación de la electroforesis, cromatografía, etc.f. Pruebas de evaluación de la pureza en específico para el sistema biológicof. Pruebas de evaluación de la pureza en específico para el sistema biológicog. Pruebas de evaluación de la funcionalidad en específico para la proteína de interés.