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Facultad de Ciencias APLICACIÓN DE LA CARDIOTROFINA EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETES MELLITUS María Jiménez González
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Facu l tad de C ienc ias
APLICACIÓN DE LA CARDIOTROFINA EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETES MELLITUS
María Jiménez González
Servicio de Publicaciones de la Universidad de Navarra
ISBN 978-84-8081-281-8
F a c u l t a d d e C i e n c i a s
APLICACIÓN DE LA CARDIOTROFINA EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETES MELLITUS Memoria presentada por Dª .María Jiménez González para aspirar al grado de Doctor por la Universidad de Navarra
El presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de Terapia Celular y autorizamos su presentación ante el Tribunal que lo ha de juzgar.
Pamplona, 2 de Marzo de 2011
Dr. Felipe Prósper Cardoso Dr. Miguel A. Barajas Vélez (Director de la Tesis Doctoral) (Co-director de la Tesis Doctoral)
Este trabajo ha sido apoyado por las ayudas predoctorales concedidas por el
Programa nacional de becas y ayudas a la formación de profesorado universitario (FPU,
Ministerio de Educación) y por la Fundación para la Investigación Médica Aplicada
(FIMA).
A MIS PADRES
AGRADECIMIENTOS
Me permito confesar que la escritura de la tesis ha sido una de las tareas más arduas de
los últimos años. Sin embargo, llegado el momento de redactar este apartado, la tarea se
‘endulza’ de forma considerable.
En primer lugar deseo agradecer a mis directores de Tesis. A Felipe Prósper, por la
confianza que ha depositado en mi trabajo todos estos años. Gracias a su ayuda he
podido aprender y desarrollarme como futura investigadora en un gran laboratorio, tanto
a nivel profesional como humano. Y por supuesto a mi codirector Miguel Barajas, quien
ha seguido mi aprendizaje desde los primeros días, enseñándome las técnicas más
importantes con infinita paciencia y dirigiendo el rumbo de la intrincada investigación,
pero siempre confiando en mi capacidad e independencia para desenvolverme en el
laboratorio.
Todos estos años en el laboratorio me han permitido conocer muchas personas sin las
cuales, este trabajo no habría podido realizarse. En primer lugar deseo agradecer al
‘Grupo diabetes’especialmente a Saray Rodríguez, una técnico polifacética donde las
haya, gran trabajadora y sobre todo gran persona. A Angelo Porciuncula, ya que su
ejemplo de trabajo y superación (sobretodo de dificultades lingüísticas!) es inspirador.
A Natalia Zapata, una investigadora tenaz a la vez que una bellísima persona con la que
se puede contar para todo. Y por supuesto agradecer la presencia de nuestra nueva
incorporación, Juanro! me pareces un profesional con gran corazón!
Por supuesto hay muchas palabras para el resto de componentes que moran en el
laboratorio de Terapia Celular de la CUN. Gracias Gloria, por tu disposición y paciencia
con el aprendizaje en el manejo de animales, y la gran ayuda que aportas en el
laboratorio. Gracias a Manu, por ser un gran investigador y haberme enseñado sobre el
‘oscuro’ mundo de las inmunos. Agradezco a Quique su presencia en el laboratorio, que
siempre es alegre y sus conocimientos sobre…prácticamente todo! Pero especialmente
sus enseñanzas sobre Western B. Agradezco la frescura, simpatía y ejemplo de trabajo
bien hecho de nuestra benjamina Tania. Al grupo de enfermeras: Goretti, MariFe, María
Guzmán, Idoia, Pili, que siempre están ahí, haciendo su trabajo con dedicación y
siempre dedicando una sonrisa, aunque el día fuera estresante. Adriana, gracias por tus
charlas a la hora de comer!
Muchas gracias a Anama y a Sheila, lleváis poco tiempo en el labo, pero se ve que sois
las mejores compañeras y unas profesionales!
AGRADECIMIENTOS
A la hora de pisar el laboratorio 1.01 del CIMA, siempre agradecía ver a mi compi de
cursos de doctorado preferida y mi correctora de ‘laismos madrileños’ Miriam Araña,
gracias guapísima! Y como no a mi amiga Natalia A, con la que comparto muy buenos
momentos y es un solete de persona. También agradezco la agradable compañía de
nuestra italiana Laurita, también de Olalla, Miriam B, Cris, Virginia, Estíbaliz, Neira,
Edurne A, María Jiménez (y también de Madrid!), Edurne San José, Amaya, Xabi,
Leire, Montse. No me olvido de los nuevos chicos del barrio: Nico (el 84 es el mejor
año!) y Andoni.
La última persona del laboratorio a la que quiero dar mi más profundo agradecimiento
(last but not least) es Bea. Agradezco que como investigadora sea una gran profesional,
con experiencia, sensibilidad y espíritu inconformista. Pero sobretodo agradezco que sea
mi mejor amiga dentro y fuera de las campanas de cultivo.
En el laboratorio echo de menos a gente que ya no está: Maialen, Fede Franchi , Inés,
Sandra, Silvia M, Juana Mari (la mejor compañera de pintxos!) y mi querida Mariajo en
especial. Todos ellos compañeros de ‘despacho’ y mucho más! Son personas
valiosísimas y dejaron una gran huella en el laboratorio.
También quiero agradecer la ayuda que me han aportado personas de otros laboratorios
y departamentos. Agradezco al departamento de Morfología, que siempre aceptaban mis
muestras con una sonrisa, especialmente a Gloria R, Elena A y Elena R.
Por supuesto, al departamento de Imagen, en el que pasé muy buenos ratos. Agradezco
la paciencia de Ainhoa, que me enseño a manejar el microscopio. A David Garcia, mi
maestro de taekwondo, quien me enseñó a manejar el programa Analisys®, y a Jauqui
por enseñarme lo utilísimo que es utilizar Image J para mis múltiples cuentas de
celulillas. Y por supuesto, a los italianos ingenieros: Mario y Thomas, gracias por estar
siempre dispuestos a echar una mano.
Fuera de este paradójico mundo, maravilloso y hostil, de la ciencia; quiero agradecer el
apoyo de mis compis de piso: Bea G, Cris E, Sonia, Ele, Rossella y Alexia. Los buenos
momentos con los chicos de Taekwondo, especialmente el maestro David y la Doctora
Esther. Tampoco olvido a la gente de mi parroquia Santa Mª de Ermitagaña,
especialmente a Don Juan Carlos, y a mis chicos de catequesis (que me enseñaron más
ellos a mí!) Y por supuesto agradezco a mi irreemplazable grupo de amigos (nunca
AGRADECIMIENTOS
olvidaré la SOPABOBA): Mariajo, Dani, Bea, Pablo, Mikel, Thomas, Inés, Juana,
Nelson, Fede I, Jauqui, Maria N, Eloy, Mario, Pedro... y quién sabe si habrá más
incorporaciones!
Sin mi familia, nada de esto podría haberse hecho realidad, porque son los primeros que
ofrecieron su apoyo incondicional, a pesar de lo incomprensible que es a veces esta
profesión. Muchas gracias a mis padres, los mayores ‘sufridores’, a mi tía, a mis
abuelos, a mi hermano y amigo ‘Pete’ y a Vanessa (te trato casi como a mi hermana).
Y puesto que lo mejor se reserva para el final, quisiera dar las gracias a la persona más
importante de mi vida. Gracias Jauqui, por haber sido mi baluarte y alentarme con tanta
confianza en esta etapa tan intensa para mí, pero sobre todo infinitas gracias por ser tú.
ABREVIATURAS
1
ADA: American Diabetes Association
ADN: Ácido Desoxirribonucléico
AG: Aparato de Golgi
AMPc: Adenosín Monofosfato Cíclico
ARNm: Ácido ribonucléico mensajero
ATP: Adenosil Trifosfato
ATPasa: Proteasa de la Adenosil Trifosfato
BCL-xL: B-cell lymphoma-extra large
CEL: Éster carboxyl lipasa
CNTF: Factor Neurotrófico Ciliar
CT-1: Cardiotrofina-1
CT-1-/-: Ratón deficiente para el gen de la CT-1
DAB: Diaminobencidina
DAPI: 4, 6-diamino-2-fenilindol
DEM: Desviación Estándar de la Media
DM1: Diabetes tipo 1
DM2: Diabetes tipo 2
DMEM: Medio de Eagle modificado por Dulbecco
DPP-4: Dipeptidyl-Peptidase 4
ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima
ERK: Extracellular signal Regulated Kinase
FBS: Suero Bovino Fetal
FITC: Fluoresceína Isotiocianato
GAD: Ácido Glutámico
GAPDH: Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa
GIP: Péptido Inhibidor Gástrico
Glc: Glucosa
GLP-1: Péptido similar a glucagon tipo 1
GLUT: Transportador de glucosa
GP130: Glicoproteína 130
HBSS: Hanks Balanced Salt Solution
HGF: Factor de crecimiento de hepatocitos
HLA: Human Leukocyte Antigen
ABREVIATURAS
2
IDDM: Diabetes Mellitus dependiente de Insulina
IFN-γ: Interferón gamma
IL-1β: Interleuquina 1 beta
IL-6: Interleuquina 6
IMC: Índice de Masa Corporal
IR: Receptor de Insulina
JAK: Janus Kinase
LIFR: Receptor del Factor inhibidor de la Leucemia
MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinases
MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad
MLDS: Multiple Low Doses of Streptozotocin
NOD: Ratón Diabético no Obeso
NSY: Naguya-Shibata-Yasuda
OLETF: Otsuka Long-Evans Tokushima fatty
OMS: Organización Mundial de la Salud
OSM: Oncostatina M
PAK: Pancreas After Kidney transplant
PB: Pares de bases de nucleótidos
PDX1: Pancreatic Duodenal Homeobox-1 protein
PFA: Paraformaldehido
PI3K/Akt: Fosfatidil inositol-3 Kinasa
PIP2: Fosfatidil inositol 4,5 bifosfatasa
PLC: Fosfolipasa C
PPAγ: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor
PTA: Pancreas Transplant Alone
RER: Retículo Endoplasmático Rugoso
RT-qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
SNAP: Synaptosomal-associated protein
SNARE: Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor Atachment protein Receptor
SPK: Simultaneous Kidney-Pancreas transplant
STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription
STZ: Estreptozotocina
TMB: 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina
ABREVIATURAS
3
TNF-α: Factor de necrosis tumoral
TTG: Test de Tolerancia a Glucosa
TUNEL: Tdt-mediated dUTP nick end labelling
U: Unidades
VAMP: Vesicle-associated membrane protein
ÍNDICE
5
ÍNDICE
ÍNDICE
7
INTRODUCCIÓN........................................................................................................... 11
1. EL PÁNCREAS ................................................................................................. 13 1.1 Estructura y funciones del páncreas ........................................................... 13 1.2 Célula beta .................................................................................................. 15 1.3 Secreción de insulina .................................................................................. 16 1.4 Mecanismos de apoptosis en célula beta y diabetes ................................... 21
2. LA ENFERMEDAD DE LA DIABETES ......................................................... 22 2.1 DM1............................................................................................................ 24 2.2 DM2............................................................................................................ 26 2.3 MODY y otros tipos ................................................................................... 27
3. TRATAMIENTOS EN DIABETES .................................................................. 28 3.1 Tratamiento con insulina (insulinoterapia)................................................. 28 3.2 Trasplante de páncreas................................................................................ 29 3.3 Trasplante de islotes ................................................................................... 29 3.4 Terapia celular ............................................................................................ 31 3.5 Terapia farmacológica ................................................................................ 34
4. MODELOS ANIMALES EN DIABETES ........................................................ 37 4.1 Modelos animales en DM1......................................................................... 37 4.2 Modelos animales en DM2......................................................................... 39 4.3 Estudio de la regeneración pancreática en modelos animales.................... 41
5. CITOQUINAS DE LA FAMILIA DE GP130 ................................................... 43 5.1 Familia GP130 e IL-6................................................................................. 43 5.2 IL-6 ............................................................................................................. 44 5.3 Cardiotrofina (CT-1): estructura y función ................................................ 45
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................................................ 49
MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................. 53
1. Cultivo de líneas celulares.................................................................................. 55 2. Extracción y cultivo de islotes de Langerhans murinos ..................................... 55
2.1 Obtención de islotes de Langerhans ........................................................... 55 2.2 Cultivo de islotes de Langerhans murinos.................................................. 56
3. Protocolos de inducción de apoptosis................................................................. 58 3.1 Deprivación de suero .................................................................................. 58 3.2 Tratamiento con citoquinas proinflamatorias ............................................. 58
4. Determinación de niveles de apoptosis .............................................................. 59 4.1 Actividad Caspasa 3 ................................................................................... 59 4.2 TUNEL (Tdt-mediated dTUP nick end labelling)...................................... 59
5. Medidas de viabilidad celular: actividad ATPasa .............................................. 61 6. Análisis de la secreción de insulina.................................................................... 61 7. Análisis de la expresión génica .......................................................................... 63
7.1 Extracción ARN ......................................................................................... 63 7.2 Retrotranscripción ...................................................................................... 63 7.3 PCR en tiempo real..................................................................................... 64
8. Análisis de expresión de proteínas por Western Blot ......................................... 65 9. Modelos animales de diabetes ............................................................................ 68
9.1 Modelos de inducción de diabetes mediante tratamiento con STZ en ratones C57 WT y C57 CT-1-/- ............................................................................. 68
9.2 Efecto de la dieta hipercolesterolémica en ratones C57 WT y CT-1-/-...... 69
ÍNDICE
8
9.3 Tratamiento sistémico con CT-1 en ratones C57 WT y CT-1-/-................ 70 9.4 Análisis histológico: Inmunohistoquímica ................................................. 71 9.5 Cuantificación histológica .......................................................................... 72
10. Estadística........................................................................................................... 74 RESULTADOS BLOQUE I............................................................................................. 75
1. Caracterización de la línea celular MIN6B1 e islotes de Langerhans................ 77 1.1 Niveles de expresión génica de la vía de señalización de CT-1................. 77 1.2 Presencia y actividad del receptor de CT-1 ................................................ 78
2. Estudio de la activación de rutas de señalización a través de la CT-1 y su receptor ............................................................................................................... 79
3. Medida del efecto antiapoptótico de la CT-1 en islotes de Langerhans y células MIN6B1.............................................................................................................. 81
3.1 Tratamiento con CT-1 en deprivación de suero ................................................. 81 3.2 Tratamiento con CT-1 en presencia de citoquinas proinflamatorias.......... 84 3.3 Incremento de los niveles de proteína BCL-xL tras el tratamiento con CT-1
bajo deprivación de suero .......................................................................... 85 4. Estudio del efecto de la CT-1 en la secreción de insulina en la línea celular
MIN6B1.............................................................................................................. 87 4.1 Efecto de la CT-1 en la secreción de insulina ............................................ 88 4.2 Estudio del mecanismo de acción de la CT-1 en la secreción de insulina en
la línea celular MIN6B1 ............................................................................ 90 RESULTADOS BLOQUE II ........................................................................................... 93
5. Estudio morfológico de los islotes pancreáticos de ratones WT y ..................... 95 CT-1-/- en condiciones normales ....................................................................... 95 6. Modelo agudo de inducción de diabetes en ratones WT y CT-1-/-.................... 96
6.1 Monitorización de la glicemia y el peso..................................................... 97 6.2 Análisis inmunohistoquímico ..................................................................... 99
7. Modelo crónico de diabetes en ratones WT y CT-1-/- ..................................... 100 7.1 Monitorización de la glicemia y el peso................................................... 101 7.2 Análisis inmunohistoquímico ................................................................... 103
8. Análisis de la glicemia en ratones WT y CT-1-/- sometidos a dieta hipercolesterolémica......................................................................................... 104
8.1 Monitorización de la glicemia y el peso................................................... 105 8.2 Test de tolerancia a la glucosa.................................................................. 106
9. Tratamiento sistémico con CT-1 en ratones diabéticos WT y CT-1-/- por inducción con STZ ........................................................................................... 109
9.1 Monitorización de la glicemia y estado de los islotes .............................. 111 9.2 Monitorización del peso de los ratones .................................................... 113
10. Análisis de los mecanismos de regeneración in vivo tras inducción de diabetes.......................................................................................................................... 114
10.1 Monitorización de la glicemia y del peso................................................. 114 10.2 Análisis inmunohistoquímico: Cuantificación de células que expresan
insulina, PDX1 y Ki67 ............................................................................ 116 DISCUSIÓN ................................................................................................................. 119
1. Efecto de las citoquinas en el metabolismo y función de la célula beta........... 121 2. Modelos experimentales de diabetes utilizando ratones C57 CT-1-/-.............. 128
ÍNDICE
9
3. Aplicación de la CT-1 en diabetes.................................................................... 135 CONCLUSIONES......................................................................................................... 139
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 143
INTRODUCCIÓN
11
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
13
La diabetes (DM) es un grupo de enfermedades metabólicas cuyo nexo en
común es la hiperglicemia secundaria a un déficit de la secreción de insulina, a un
defecto en su actividad metabólica, o a ambos [1]. Esta situación de hiperglicemia
ocasiona complicaciones crónicas de tipo microvascular, macrovascular y/o
neuropático, que son comunes a todos los tipos de DM.
Por ello, para diagnosticar la DM se usan criterios basados en la concentración
plasmática de glucosa o en los resultados de la realización de pruebas de sobrecarga oral
de glucosa.
Existen dos tipos principales de Diabetes: tipo I (DM1), debida a una producción
deficiente de insulina; y tipo II (DM2), caracterizada por una utilización ineficaz de esta
hormona. Además, existen otros tipos de alteraciones que llevan a esta enfermedad,
como son la diabetes gestacional y la diabetes tipo MODY, a las cuales también
haremos referencia.
1. EL PÁNCREAS
1.1 Estructura y funciones del páncreas
El páncreas es un órgano glandular de secreción tanto exocrina como endocrina,
que presenta una morfología lobulada y racemosa. En el ser humano se localiza en la
parte dorsal del abdomen, tiene una forma alargada y cónica (con dos partes claramente
distinguibles: cabeza y cola) (Figura 1). En el caso del ratón es un órgano difuso que
ocupa el mesenterio dorsal.
El páncreas está constituido por dos tejidos diferentes en estructura y función:
◊ Tejido Exocrino: Constituye la mayor parte de la masa
pancreática, un 95%. Presenta un aspecto ramificado, organizado en lóbulos, que
a su vez se subdividen en acinos secretores más pequeños. Cada acino está
constituido por una fila de células acinares secretoras del jugo pancreático. Éste
contiene enzimas digestivas como tripsina o amilasa y es secretado hacia
pequeños ductos que van formando estructuras mayores, que finalmente
conectan con el conducto biliar y desembocan en el intestino (Figura 1).
INTRODUCCIÓN
14
◊ Tejido Endocrino: Comprende el 1% del peso total del páncreas.
Su unidad anatómica y funcional son los islotes de Langerhans, agregados de
células dispersos entre el tejido exocrino. Estas estructuras están formadas por
células que sintetizan hormonas de función endocrina, principalmente la insulina
(células beta), el glucagón (células alfa) y la somatostatina (células delta). Cada
islote es una estructura de forma elipsoide con un diámetro comprendido entre
50-250 µm [2]. En el ser humano la mayoría de los islotes presentan un tamaño
de aproximadamente 150 µm. En situaciones de hiperglicemia, algunos islotes
pueden alcanzar los 350 µm de diámetro, debido al edema y la deposición de
placas de amiloide [3]. El número de islotes puede ser muy variable
dependiendo de la edad, Índice de Masa Corporal (IMC), tamaño del páncreas y
condiciones fisiológicas especiales tales como el embarazo; pero se estima que
un páncreas adulto puede contener unos 2 millones de islotes [4].
El número de células por islote puede ser muy variable, desde pocas
células hasta varios miles. Cada islote está constituido por hasta cinco tipos
celulares que producen distintas hormonas:
◊ Célula beta: conforma la mayor parte de la masa del islote, entre
60-80% y es el único tipo celular responsable de la secreción de
insulina. La célula beta también secreta el polipéptido amiloide
(IAAP), aunque sólo un 54% de las mismas [5].
◊ Célula alfa: constituye el 26% y secreta la hormona glucagón,
cuya función es antagonista a la acción de la insulina [6].
◊ Célula delta: constituye un 8% y secreta somatostatina [7],
controla la liberación de hormonas hipofisarias. A nivel pancreático
inhibe la liberación de insulina y de glucagón (regulación paracrina).
◊ Célula gamma y célula epsilon: son una minoría dentro del islote,
la primera es la responsable de la secreción de polipéptido
pancreático [7], cuya función afecta a diversos procesos
gastrointestinales, mientras que la última que ha sido descrita
recientemente, produce grelina, hormona también presente en el
estómago cuya función está relacionada con la regulación del balance
energético y la ingesta; sin embargo, su papel en islotes no está claro,
INTRODUCCIÓN
15
aunque parece estar implicada en la regulación de la secreción de
insulina [8].
Vesícula biliar
Conducto biliar
PíloroPÁNCREAS
Ducto pancreático
Duodeno
Ducto
Acino
Célula del ducto
Célula acinar
Célula alfa
Célula beta
Célula delta
Islote de Langerhans
Célula PP
Ácinopancreático
Hematocitos
Vesícula biliar
Conducto biliar
PíloroPÁNCREAS
Ducto pancreático
Duodeno
Ducto
Acino
Célula del ducto
Célula acinar
Célula alfa
Célula beta
Célula delta
Islote de Langerhans
Célula PP
Ácinopancreático
Hematocitos
Figura 1. Representación esquemática del páncreas. A. Localización del páncreas e imagen de un corte longitudinal que muestra el ducto que se dirige hacia el duodeno. B. Imagen del ducto y los acinos. C. Acino pancreático. D. Representación de un islote localizado entre tejido acinar. (Adaptado de Bardesy et al., 2002 [9]).
1.2 Célula beta
La célula beta es el tipo celular más abundante dentro de la compleja agrupación
de células del islote. Está altamente especializada en su actividad secretora, siendo su
principal función la síntesis y secreción de la hormona insulina, principalmente en
respuesta a glucosa, pero también frente a otros estímulos, tales como nutrientes y
hormonas.
En cuanto a sus características morfológicas, las diversas técnicas
inmunocitoquímicas han permitido determinar la presencia de un citoplasma muy
extenso y granulado, con presencia de gránulos de secreción de 300 nm de diámetro.
INTRODUCCIÓN
16
Cada célula contiene de media unos 13.000 gránulos, responsables de la secreción
inmediata de la insulina tras el estímulo de la glucosa.
Una característica propia de la célula beta es la presencia de proteínas de
membrana, principalmente GLUT2, que permiten la detección de la glucosa en sangre
para posteriormente poner en marcha de un fino mecanismo de regulación de sus
niveles en sangre, mediante la secreción de insulina, cuya función será la de permitir la
recaptación de glucosa por parte de tejidos periféricos (principalmente células hepáticas,
musculares y tejido adiposo).
Hasta la fecha se desconoce la tasa de proliferación de la célula beta madura en
el ser humano [4, 10]. En roedores, se ha descrito que estas células poseen una tasa de
renovación muy baja a través de células beta pre-existentes o a través de precursores del
ducto. Además, en el caso de una mayor demanda de la función de la célula beta se ha
descrito la activación de una serie de procesos compensatorios que pueden alterar la
masa de célula beta tales como: regulación en la replicación, neogenesis, apoptosis,
tamaño celular (hipertrofia y atrofia) [10].
1.3 Secreción de insulina
El proceso de secreción de insulina está altamente regulado por nutrientes,
neurotransmisores y hormonas circulantes.
Cuando, tras la ingesta, los niveles de glucosa en sangre se incrementan, ésta
llega hasta las células beta del páncreas internalizámdose en ellas a través del
transportador de glucosa GLUT-2, de baja afinidad pero alta capacidad (alta Km), lo
que permite un rápido equilibrio entre los niveles de glucosa extra e intracelulares. Una
vez en el interior de la célula beta, la glucosa es catabolizada por la enzima hexoquinasa
de baja Km (glucoquinasa). Este paso es crucial para el inicio de la glucólisis [11]. El
piruvato es el producto final esencial de este proceso, siendo éste metabolizado en la
mitocondria, transformándose en Acetil coenzima A (Acetil-CoA) mediante el ciclo de
Krebs, lo que genera equivalentes reducidos, que finalmente a través de la cadena
respiratoria, producen un aumento en la producción de ATP. Éste pasa al citoplasma y
en su mayor parte sirve para mantener la homeostasis iónica en la célula.
INTRODUCCIÓN
17
En este proceso es esencial el papel que juega el canal de K+ sensible a ATP, ya
que acopla los cambios metabólicos con la actividad eléctrica de la célula beta y la
secreción de insulina estimulada por glucosa [12]. Cuando las concentraciones de
glucosa son inferiores a 5 mM, la membrana plasmática se encuentra polarizada (-70
mV en la parte interna) debido a la salida de K+ al exterior, a través del canal. El
incremento del ratio ATP/ADP, al ser metabolizada la glucosa, provoca el cierre del
canal de K+, lo que inicia la depolarización de la membrana y entrada de Ca2+ al
citoplasma, esencial para la secreción de insulina. El canal de K+ está conformado por
cuatro unidades Kir6.2 que forman el poro y cuatro receptores de sulfonilureas SUR1.
La entrada de Ca+2 al citoplasma se debe a la apertura de los canales de Ca+2 de
tipo L activada por la depolarización de la membrana [13, 14] (Figura 2). La secreción
de insulina estimulada por glucosa presenta una respuesta bifásica, con una primera fase
rápida que dura pocos minutos, seguida de una segunda fase sostenida. Sólo la glucosa y
otros metabolitos catabolizables inducen esta segunda fase; sin embargo, cuando la
secreción está provocada por un estímulo no metabolizable, sólo se produce la primera
fase, lo que sugiere que la segunda fase es un proceso dependiente de energía (Figura 3)
[15].
Ca2+
K+
Kir6.2SUR1
Mitocondria
Bomba de potasio sensible a ATP
Canal de calcio dependiente de voltaje
Núcleo
Kir6.2SUR1 Glucosa
Glucoquinasa
GlucosaGlucosaP
Piruvato
↑ATP/ADP
Vesículas de secreción de Insulina
Des
pola
riza
ción
mem
bran
a
↑Ca2++
+
GLUT2
Ca2+
K+
Kir6.2SUR1
Mitocondria
Bomba de potasio sensible a ATP
Canal de calcio dependiente de voltaje
Núcleo
Kir6.2SUR1 Glucosa
Glucoquinasa
GlucosaGlucosaP
Piruvato
↑ATP/ADP
Vesículas de secreción de Insulina
Des
pola
riza
ción
mem
bran
a
↑Ca2++
+
GLUT2
Figura 2. Esquema del proceso de secreción de insulina tras la entrada de glucosa al interior de la célula beta.
INTRODUCCIÓN
18
Secreción de Insulina in vivo. Curva bifásicatras toma de glucosa 98 mg/dL
050
100150200250300350400
0 20 40 60 80 100 120Tiempo (min)
Insu
lina
plas
mát
ica
(pM
)
1º Fase 2º Fase
Secreción de insulina in vivo. Curva bifásica tras toma de glucosa (98 mg/dl)
Secreción de Insulina in vivo. Curva bifásicatras toma de glucosa 98 mg/dL
050
100150200250300350400
0 20 40 60 80 100 120Tiempo (min)
Insu
lina
plas
mát
ica
(pM
)
1º Fase 2º Fase1º Fase 2º Fase
Secreción de insulina in vivo. Curva bifásica tras toma de glucosa (98 mg/dl)
Figura 3. Ejemplo de perfil de secreción de insulina plasmática tras la estimulación con glucosa en animales de experimentación. (Adaptado de Pratley R.E., et al., 2001 [15]).
Una vez estimulada la secreción de insulina, ésta es secretada mediante
exocitosis regulada. Actualmente la hipótesis más aceptada para explicar este proceso es
la que implica la presencia de proteinas SNARE (Soluble N-ethylmaleimide sensitive
factor Attachment protein REceptor). El acoplamiento entre el gránulo de secreción y la
membrana plasmática sucede mediante la interacción entre las proteínas de las vesículas
secretoras v-SNARE, en el caso de los gránulos de insulina se conocen VAMP-2 y
VAMP-3 y las proteínas de la membrana plasmática tipo t-SNARE, conocidas como
sintaxis-1α y SNAP-25. El complejo formado por la unión de las proteínas SNARE
actúa como receptor de la proteína soluble α-SNAP que permite finalmente la fusión del
gránulo a la membrana. Sin embargo, son las sinaptotagminas, unas proteínas
localizadas en el gránulo secretor, las que actúan impidiendo o favoreciendo la unión de
α-SNAP al complejo SNARE, en función de los niveles de Ca+2 citosólico. Un aumento
de Ca+2 provoca la disociación de la sinaptotagmina y permite la unión de α-SNAP, lo
que inicia la unión del complejo SNARE y posterior fusión del gránulo a la membrana
[16].
INTRODUCCIÓN
19
Procesamiento de insulina
El proceso de maduración de la proteína de insulina conlleva una serie de
procesamientos proteolíticos desde el precursor polipeptídico sintetizado a partir del
ARNm hasta su forma funcional, que se citan a continuación.
Inicialmente, la insulina se sintetiza como un polipéptido precursor de 86
aminoácidos, denominado preproinsulina. El procesamiento proteolítico posterior
elimina el péptido señal amino-terminal, de 24 aminoácidos, generando la proinsulina.
La proinsulina presenta una estructura similar a otros factores de crecimiento afines a la
insulina, que son capaces de unirse, aunque de forma débil, al receptor de insulina. La
proinsulina entra en el retículo endoplasmático rugoso (RER), donde sufre un
plegamiento para que sus dos cadenas A y B queden correctamente alineadas (Figura 4).
A continuación, ésta pasa al Aparato de Golgi (AG), mediante vesículas de transporte y
se acumula en la red trans del AG en vesículas rodeadas de clatrina, donde ocurre el
segundo procesamiento. Durante este paso se produce la escisión de un fragmento
interno de la proinsulina de 31 residuos, gracias a la acción de las endopeptidasas PC1 y
PC2, generando el péptido C y las cadenas A (de 21 aminoácidos) y B (30 aminoácidos)
de la insulina, unidas entre sí por puentes disulfuro (Figura 4). La molécula de insulina
madura dimeriza en presencia de Zn2+, estos dímeros forman a su vez hexámeros. La
insulina, el péptido C y otros compuestos presentes en el gránulo, tales como el IAPP se
almacenan conjuntamente y se segregan simultáneamente desde los gránulos maduros
presentes en las células beta. Como el péptido C es menos sensible a la degradación
hepática que la insulina, constituye un marcador útil de la secreción de insulina y
permite diferenciar la insulina de origen endógeno y exógeno en estudios
experimentales [17].
Cadena A
Cadena B
-COOH
H2N-
Cadena A
Cadena B
-COOH
H2N-
Cadena A
Cadena B
-COOH
H2N-
Péptido C Péptido C
ss
ss
ssss ss
ss
ss
Preproinsulina Proinsulina Insulina
Cadena A
Cadena B
-COOH
H2N-
Cadena A
Cadena B
-COOH
H2N-
Cadena A
Cadena B
-COOH
H2N-
Péptido C Péptido C
ss
ss
ssss ss
ss
ss
Preproinsulina Proinsulina Insulina Figura 4. Procesamiento de la insulina a partir de su precursor, la preproinsulina, dando lugar a la molécula de insulina madura y el péptido C.
INTRODUCCIÓN
20
En cuanto a su expresión génica, la insulina consta de una sola copia en
humanos y se encuentra altamente conservada entre especies. La glucosa es el regulador
fisiológico de la célula beta más importante y, por lo tanto, presenta el principal papel
regulador de los factores de transcripción que activarán la expresión del gen de la
insulina, tales como PDX-1, MAFA y BETA2 [18].
En concreto, la entrada de la glucosa en la célula beta estimula la fosforilación
de los factores PDX-1 y MAFA y su unión al ADN. Por otro lado, también regula la
expresión de insulina a nivel transcripcional, splicing, estabilización y traducción del
ARNm [18].
Acción biológica
La insulina es la principal hormona anabólica y anticatabólica en mamíferos.
Una vez liberada en sangre actúa sobre sus receptores específicos en los tejidos
periféricos, hígado, músculo y tejido adiposo. Su acción implica el incremento en la
captación de glucosa y su conversión a glucógeno hepático y muscular, así como su
conversión en lípidos en el tejido adiposo; y una reducción en la producción de glucosa
por parte del hígado.
El receptor de insulina tiene dominio transmembrana con actividad tirosin-
quinasa y está constituido por dos subunidades alfa extracelulares y dos subunidades
beta transmembrana unidas por puentes disulfuro en las cuales se encuentra el dominio
quinasa. Tras la unión de la insulina a su receptor, se inicia la cascada de fosforilaciones
que permite la translocación del transportador de glucosa GLUT-4 del citoplasma a la
membrana. Este transportador es específico de los tejidos periféricos, cuyo metabolismo
de la glucosa está regulado por insulina. De este modo, se inicia la respuesta de
captación de glucosa y siguientes procesos anabólicos (Figura 5) [19].
INTRODUCCIÓN
21
Receptor Insulina
Glucosa
Compartimentoreserva GLUT-4
Insulina
GLUT-4IRS IRS
P
↑ Glucógeno
↑ Síntesis de proteínas y grasas
Receptor Insulina
Glucosa
Compartimentoreserva GLUT-4
Insulina
GLUT-4IRS IRS
P
↑ Glucógeno
↑ Síntesis de proteínas y grasas
Figura 5. Acción de la insulina sobre los tejidos periféricos. Translocación del transportador GLUT-4 a la membrana plasmática tras la unión de la insulina a su receptor.
1.4 Mecanismos de apoptosis en célula beta y diabetes
El proceso de apoptosis celular es un mecanismo de renovación tisular presente
en condiciones normales en múltiples tejidos. Debido a que la célula beta tiene una tasa
de renovación muy baja, la elevada apoptosis constituye la principal causa de muerte
celular, en situaciones patológicas tales como DM1 y DM2 [20]. En ambos casos
parecen existir mecanismos comunes, pero el origen de la muerte celular es distinto.
En el caso de la DM1, la destrucción de las células beta es debida principalmente
al ataque autoinmune contra las propias células beta pancreáticas. La presencia de
infiltrados de células mononucleares autoreactivas que liberan citoquinas
proinflamatorias, principalmente IFNγ, TNFα e IL-1β, provocan la muerte celular. Por
otra parte, también se ha descrito un mecanismo directo de destrucción de célula beta
través de la interacción Fas-Fas ligando con las propias células T autoreactivas [21].
La causa principal de la DM2 es una resistencia a la acción de la insulina y/o una
desregulación de la secreción de la misma. En estadíos avanzados de la enfermedad se
ha descrito que la masa de célula beta se encuentra reducida [22], lo que también
sugiere la existencia de mecanismos de apoptosis. La hiperglicemia presente en el
desarrollo de la enfermedad induce apoptosis a través de la vía de NF-κB y activación
de Caspasa 3, además de la formación de especies reactivas de Oxígeno (ROS).
Además, es común la presencia de elevados niveles de ácidos grasos que inducen
lipotoxicidad celular, proceso que a su vez induce apoptosis [23].
INTRODUCCIÓN
22
Eliminación de células β
Macrófagos activados
Células T
Quimioquinas
Células β
APOPTOSIS
Citoquinas proinflamatoriasNO
Fas-L
↑ iNOS↑ Caspasa 3
↑ Glucosa↑ Ácidos grasos
Otros factores (genéticos,
ambientales..)
Atracción de macrófagos ‘scavenger’
GL
UT
2
Glucosa
PLC
LIFR
GP1
30
CT-1
Canal de calcio
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
↑Ca2++
+
Des
pola
riza
ción
m
embr
ana
Bomba de K+
↑ATP/ADP
GL
UT
2
Glucosa
PLC
LIFR
GP1
30
CT-1
Canal de calcio
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
↑Ca2++
+
Des
pola
riza
ción
m
embr
ana
Bomba de K+
↑ATP/ADP
Eliminación de células β
Macrófagos activados
Células T
Quimioquinas
Células β
APOPTOSIS
Citoquinas proinflamatoriasNO
Fas-L
↑ iNOS↑ Caspasa 3
↑ Glucosa↑ Ácidos grasos
Otros factores (genéticos,
ambientales..)
Atracción de macrófagos ‘scavenger’
GL
UT
2
Glucosa
PLC
LIFR
GP1
30
CT-1
Canal de calcio
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
↑Ca2++
+
Des
pola
riza
ción
m
embr
ana
Bomba de K+
↑ATP/ADP
GL
UT
2
Glucosa
PLC
LIFR
GP1
30
CT-1
Canal de calcio
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
↑Ca2++
+
Des
pola
riza
ción
m
embr
ana
Bomba de K+
↑ATP/ADP
Figura 6. Mecanismos de inducción de apoptosis en diabetes tipo I y II. (Adaptada de Cnop et al., 2005 [23]).
2. LA ENFERMEDAD DE LA DIABETES
La clasificación de la DM se realiza bajo un criterio etiológico. Según la ADA,
existen principalmente dos tipos de DM (Tabla 1):
La DM1 autoinmune se da en un 5-10 % de los casos y deriva de una
progresiva destrucción de las células beta debida a la acción del propio sistema
inmunitario. Se trata de la diabetes ‘insulinodependiente’, pues el déficit de células beta
impide la producción de insulina en el individuo y en consecuencia es necesaria la
administración de la hormona de forma exógena para controlar los niveles de glucosa en
sangre.
La DM2 es la más frecuente, con un 90-95% de los afectados. Su inicio es más
tardío y, en principio, no requiere de la administración exógena de insulina, aunque sí
de un mayor control sobre los hábitos del individuo, ya que la predisposición genética
descrita para la enfermedad se ve favorecida por factores externos como la obesidad,
hipertensión arterial, etc... Actualmente la edad de inicio de este tipo de diabetes está
adelantándose debido al aumento de la obesidad infantil y a los hábitos de sedentarismo
y alimentación occidentales.
INTRODUCCIÓN
23
Además de estas dos formas mayoritarias de DM, existen otras formas que
aparecen con menor frecuencia y que se agrupan bajo el nombre de MODY (Maturity
Onset Diabetes of the Young). Estos tipos de diabetes se deben a alteraciones genéticas
implicadas en la función de la célula beta o en su desarrollo. Por último, la diabetes
mellitus gestacional (DMG) es una forma de diabetes inducida por el embarazo, con
desaparición de la misma en muchos casos, una vez transcurrido éste.
Prevalencia
La prevalencia de la diabetes a nivel mundial ha adquirido proporciones
epidémicas, especialmente en aquellos países donde se han desarrollado hábitos de vida
que promueven la aparición de DM2. Actualmente, hay en el mundo unos 250 millones
de afectados y se estima superar la cifra de 300 millones para el año 2030 [24].
En España se han realizado numerosos estudios sobre la prevalencia de la DM2.
Los primeros estudios que se realizaron fueron los de León y Lejona (Vizcaya) [25, 26]
en los años 80, teniendo como referencia medidas de glicemia basal y sobrecarga oral
de glucosa. Estos y otros estudios revelaron una prevalencia que se situaba en torno al
5%. Actualmente se dispone de datos validados internacionalmente acerca de la
prevalencia de DM2 en varias comunidades autónomas y estas tasas se han visto
incrementadas sitúandose entre el 6 y el 10% de la población general. Esta tendencia se
encuentra confirmada por los últimos datos presentados por el estudio [email protected] donde
se muestra una prevalencia del 12% a nivel nacional.
INTRODUCCIÓN
24
Tabla 1. Clasificación de los distintos tipos de DM según su origen
DM1 (destrucción de la célula beta, generalmente con deficiencia absoluta de insulina)
A. Autoinmune
B. Idiopática
DM2 (el factor predominante puede ser insulinorresistencia, alteraciones en la secreción de
insulina o ambas)
Otros tipos específicos de DM:
A. Defectos genéticos de la función de la célula beta: MODY y mutación del ADN
mitocondrial
B. Defectos genéticos de la acción de la insulina: insulinorresistencia tipo A,
leprechaunismo.
C. Enfermedades del páncreas exocrino: pancreatitis, trauma/pancreatectomía.
D. Endocrinopatías: acromegalia, síndrome de Cushing, glucagonoma.
E. Fármacos u otros sustancias químicas: vacor (raticida), pentamidina.
F. Infecciones víricas: rubéola congénita, citomegalovirus.
G. Formas poco comunes de diabetes de naturaleza inmune
H. Otros síndromes genéticos ocasionalmente asociados a diabetes: síndrome de
Down, síndrome de Klinefelter
Diabetes mellitus gestacional (DMG): DM producida durante el embarazo
2.1 DM1
Se trata de una enfermedad crónica de base autoinmune cuyo origen se encuentra
en la destrucción progresiva de los islotes de Langerhans. En la aparición de la
enfermedad hay tres componentes esenciales implicados: la susceptibilidad genética de
base, los factores ambientales y el desencadenamiento de la autoinmunidad (Figura 7).
La base genética reside principalmente en genes del complejo mayor de
histocompatibilidad, aunque hay otros genes de suceptibilidad que no pertenecen al
complejo HLA. En su conjunto son llamados genes IDDM (insulin-dependent diabetes
mellitus). Los estudios en gemelos y poblacionales han permitido identificar diversos
haplotiplos de susceptibilidad [27, 28].
El complejo mayor de histocompatibilidad se encarga de presentar los antígenos
procesados a las células efectoras del sistema inmune, las células T. En el proceso de
maduración de estas células, las moléculas HLA presentan los péptidos propios a las
INTRODUCCIÓN
25
células T inmaduras para que desarrollen tolerancia frente a éstos. Si existen fallos en el
desarrollo de esta tolerancia, el sistema inmune puede reaccionar, reconociendo como
extrañas moléculas propias de la célula beta.
Por otra parte, se ha descrito que los factores ambientales podrían intervenir
favoreciendo la iniciación del proceso autoinmune o incidiendo en la progresión de la
enfermedad. Entre estos factores se encuentran: virus, cuya infección puede ejercer un
efecto destructor sobre las células beta o bien provocar el desencadenamiento de un
proceso autoinmune [29, 30]; toxinas, tales como nitratos y nitritos [31], y algunas
proteínas de los alimentos, como derivados de la leche, gluten y cereales [32, 33].
La interacción entre los factores ambientales y la susceptibilidad genética
desencadena la respuesta autoinmune. Ésta es mediada por células T cuya activación
lleva a una respuesta inflamatoria en los islotes, con la llegada de células (insulitis) que
liberan factores proinflamatorios [34] y humoral, generando autoanticuerpos contra
estructuras y proteínas de la propia célula beta, como la propia insulina, la decarboxilasa
del ácido glutámico (anti-GAD) o la tirosina fosfatasa 2 (IA-2) [35, 36].
La progresiva eliminación de células beta origina la pérdida de secreción de
insulina, posterior a la ingesta. El diagnóstico de la enfermedad suele suceder tras un
80% de pérdida de masa de células beta (Figura 7).
Figura 7. Evolución temporal de la diabetes autoinmune (Adaptado de Harrison et al., 2008 [37]).
PREDISPOSICIÓN GENÉTICA
PRE-DIABETES
DIABETES
FACTORES AMBIENTALES
Autoanticuerposcontra: Insulina, GAD65, IA-2
Func
ión
célu
la b
eta
100%
DAÑO EN CÉLULA BETA
Pérdida primera fase secreción insulina
Pérdida de tolerancia a glucosa
Años
PREDISPOSICIÓN GENÉTICA
PRE-DIABETES
DIABETES
FACTORES AMBIENTALES
Autoanticuerposcontra: Insulina, GAD65, IA-2
Func
ión
célu
la b
eta
100%
DAÑO EN CÉLULA BETA
Pérdida primera fase secreción insulina
Pérdida de tolerancia a glucosa
Años
INTRODUCCIÓN
26
2.2 DM2
La DM2 es el tipo de diabetes más frecuente, representando el 90-95% de los
casos en edad adulta. La causa principal de la enfermedad se debe a dos fenómenos: una
deficiente captación de la glucosa por parte de los tejidos periféricos (músculo, hígado y
tejido adiposo), fenómeno denominado insulinorresistencia, y por un déficit relativo de
la producción de insulina por parte de las células beta [38].
Hoy en día son bien conocidos ciertos factores claves en el desarrollo de esta
enfermedad: la obesidad, la falta de ejercicio, el sedentarismo y, en general, el modo de
vida de la sociedad occidental que, al establecerse en edades más tempranas, está
influyendo en la incidencia de la enfermedad en poblaciones cada vez más jóvenes.
La insulinorresistencia puede tener múltiples orígenes: modificaciones en la
propia molécula de insulina o en el receptor que hagan su unión menos efectiva,
alteraciones en la vía de señalización de la insulina o en la actividad del transportador
de glucosa GLUT-4, pueden afectar en la efectividad de la respuesta a la insulina.
Por otra parte, los niveles altos de glucosa en sangre derivados de esta resistencia
a la insulina (glucotoxicidad), junto con la presencia de ácidos grasos (lipotoxicidad),
pueden ser tóxicas para la propia célula beta, disminuyendo su capacidad secretora [39]
e incluso produciendo su muerte [40].
La toxicidad lipídica también está relacionada directamente con la menor
captación de glucosa en los tejidos periféricos. Se ha descrito que un exceso de
metabolitos lipídicos, como el diacil-glicerol o acetil-CoA en el interior de células
musculares y hepáticas pueden originar defectos en la vía de señalización de la insulina,
impidiendo la correcta actividad del receptor y, por tanto, reduciendo el transporte de
glucosa a los tejidos a través de GLUT-4 [41].
También existen factores genéticos que predisponen al desarrollo de la
enfermedad, de manera que se conocen polimorfismos y alteraciones en genes
relacionados con la disfunción de la célula beta y la resistencia a la insulina [42, 43],
aunque la principal contribución siguen siendo los factores ambientales.
Para el tratamiento de los pacientes con DM2, en principio no es necesario el
aporte de insulina exógena, pero sí un riguroso control de la dieta y el ejercicio, para
evitar la progresiva destrucción de la masa de células beta y la evolución de las
complicaciones derivadas de la enfermedad, como son enfermedad cardíaca
INTRODUCCIÓN
27
(enfermedad cardiovascular), ceguera (retinopatía), lesiones nerviosas (neuropatía) y
daño renal (nefropatía).
2.3 MODY y otros tipos
La diabetes monogénica es aquella causada por mutaciones producidas en un
solo gen y que presenta un patrón de herencia autosómica dominante. Entre las más
conocidas, se encuentran las MODY [44].
El estudio de las alteraciones que llevan al desarrollo de la enfermedad en estos
casos ha dado como resultado la obtención de amplia información sobre los mecanismos
genéticos y patofisiológicos de los genes involucrados en su desarrollo. También ha
permitido entender mejor la homeostasis de la glucosa y definir nuevas dianas
terapeúticas para el desarrollo de nuevos fármacos.
Hasta el año 2006 fueron descritas 7 variantes MODY, sin embargo, en los
ultimos años han sido reportadas dos nuevas alteraciones responsables de la
enfermedad, mutaciones en los factores de transcripción PAX4 [45] y KLF11 [46]. De
los genes descritos responsables de las variantes MODY, ocho son expresados en la
célula beta y están involucrados directamente en procesos funcionales de la misma [47].
Curiosamente, otro gen cuya alteración está asociada a una variante MODY es el que
codifica para la enzima éster carboxil-lipasa (CEL) cuya acción principal tiene lugar en
el páncreas exocrino, siendo uno de los componentes principales del jugo pancreático
[48].
En estos casos, el papel de los factores ambientales no es clave para el desarrollo
de la enfermedad, pero el embarazo, la pubertad, ciertas infecciones e incluso la
obesidad pueden precipitar su aparición; generalmente diagnosticada antes de los 25
años de edad. Su prevalencia a nivel mundial no es del todo conocida, pero se estima
que la diabetes MODY es responsable de aproximadamente 2-5% de todos los casos de
DM [49].
INTRODUCCIÓN
28
3. TRATAMIENTOS EN DIABETES
El tratamiento de la diabetes con aporte exógeno de insulina ha permitido que la
enfermedad ya no sea aguda y mortal. Sin embargo, las complicaciones de la misma,
aún monitorizando los niveles de glucosa, hacen que la búsqueda de nuevos
tratamientos sea un requisito de primera necesidad.
A lo largo de la historia de esta enfermedad se han estudiado diversas estrategias
para el tratamiento tanto de DM1 como DM2, las cuales se citan a continuación:
3.1 Tratamiento con insulina (insulinoterapia)
El descubrimiento y uso de la insulina en el tratamiento de la diabetes es
considerado uno de los grandes logros de la Medicina del siglo XX. Hoy en día todos
los tipos de insulina presentes en el mercado son insulinas humanas sintetizadas por
ingeniería genética (ADN recombinante). Las insulinas de origen bovino o porcino han
desaparecido prácticamente del mercado. Todas ellas están muy purificadas, siendo el
único factor que las diferencia la duración de su acción en el organismo. La vida media
de la insulina en sangre es muy corta (menos de 15 minutos), de manera que una forma
de prolongar su acción se basa en retardar su liberación y por ello su efecto. Para tal
propósito se han utilizado diferentes estrategias, alguna de las cuales se citan a
continuación:
◊ La unión a otras proteínas, como por ejemplo la protamina.
◊ La cristalización: la adición de zinc hace que las partículas cargadas con
insulina sean más grandes y tarden más tiempo en hacerse solubles consiguiendo
que éstas se liberan lentamente.
Dependiendo de cada sistema de retardo, la acción de las diferentes
formulaciones de insulina puede clasificarse en rápida, intermedia o lenta. Aún así, su
administración debe ser diaria y controlando siempre los niveles de glucemia.
Desafortunadamente, incluso con estas mejoras, existe la posibilidad de la aparición de
episodios de hipoglucemia y complicaciones a largo plazo. Además, no es una terapia
completa que revierta todos los efectos adversos de la enfermedad.
INTRODUCCIÓN
29
3.2 Trasplante de páncreas
El trasplante de páncreas se presenta como el método más efectivo para
establecer un estado de normoglicemia a largo plazo en el paciente diabético [50].
El primer trasplante de páncreas fue realizado con éxito en la Universidad de
Minessota en 1966, y se efectuó simultáneamente junto con trasplante de riñón. Sin
embargo, fue en los años 80, gracias a la introducción de inmunosupresores como la
ciclosporina o el tacrolimus, cuando el trasplante se empezó a considerar una opción
terapeútica en pacientes con DM1 y desde entonces se han efectuado más de 25.000
intervenciones en todo el mundo. De ellas, la mayoría (78%) se realizan en un trasplante
simultáneo de páncreas-riñón (SPK, simultaneous Pancreas-Kidney), un 22% tras un
trasplante de riñón (PAK, Pancreas After Kidney ) y en un 6% de los casos se realiza un
trasplante sólo de páncreas (PTA, Pancreas Transplant Alone). Ésta técnica está siendo
aplicada sólo en una minoría de pacientes con síntomas severos de hipoglucemia, y que
además presentan complicaciones renales graves, razón por la que en la mayoría de los
casos en la misma intervención se realiza el trasplante conjunto de riñón y páncreas,
SPK [51].
En la actualidad, gracias a la mejoría en la terapia inmunosupresora, en el
procedimiento quirúrgico y en el tratamiento antimicrobiano, el éxito en el injerto
supera el 70%. Tras el trasplante, el paciente es prácticamente independiente de la
terapia con insulina exógena. Sin embargo, pese al éxito de la técnica, no todas las
complicaciones derivadas del procedimiento han sido solucionadas, ya que sigue siendo
un procedimiento no estandarizado. Además, los costes derivados del procedimiento son
elevados y la escasez de los páncreas donantes hace que no sea un tratamiento
ampliamente aplicado.
3.3 Trasplante de islotes
Tal y como se ha citado anteriormente, actualmente la única medida terapéutica
capaz de restablecer la normoglucemia en el paciente DM1 es el trasplante de páncreas.
De este modo se restablece la función de producción de insulina por las células
destruidas por el ataque autoinmune. Sin embargo, se trata de un procedimiento muy
complicado, sometido a un régimen inmunosupresor de por vida.
INTRODUCCIÓN
30
La alternativa más prometedora, teniendo en cuenta que no es necesario para el
paciente el uso del páncreas entero (sólo de la porción endocrina) es el trasplante de
islotes. El procedimiento consiste en la obtención de islotes a partir de un páncreas y su
posterior infusión en el hígado del receptor a través de la vena porta hepática. Este
procedimiento conlleva menos complicaciones quirúrgicas y problemas
inmunosupresores permitiendo, en caso de ser necesario, repetir el trasplante.
Los primeros trasplantes de islotes se realizaron a principios de los años 80, sin
embargo éstos no tuvieron mucho éxito, ya que la insulina-independencia al año sólo se
lograba en el 10% de los casos [52]. En el año 2000 se desarrolló con éxito un nuevo
protocolo para el trasplante de islotes de Langerhans, denominado protocolo de
Edmonton [53, 54], en el cual se realizaron diversos cambios para mejorar el proceso,
tales como el aumento del número de islotes en cada trasplante y la eliminación del uso
de glucocorticoides como inmunosupresores, los cuales resultaban tóxicos para los
islotes. De esta manera, se consiguió una independencia de la insulina exógena más
sostenida en el tiempo, con un 100% de los casos tras un año de seguimiento.
Posteriormente se realizó un estudio internacional siguiendo este protocolo [54] y los
resultados se reprodujeron de forma parcial. Teniendo en cuenta la variabilidad y
experiencia de los distintos centros, el 58% de los pacientes consiguieron independencia
de la insulina exógena durante 2 años. Sin embargo, a lo largo de los años se observó un
deterioro del injerto y tan sólo el 10% de los pacientes se mantuvieron insulino-
independientes a los 5 años [55].
A pesar de los resultados obtenidos tras el trasplante de islotes, en la mayoría de
los casos se observa una función beta residual que permite un mejor control glucémico,
aunque todavía sea necesario administrar insulina exógena en estos pacientes. Sin
embargo, para poder estandarizar esta técnica es clave mejorar el método de obtención
de islotes, y sobre todo buscar nuevas estrategias que eviten su rechazo y pérdida tras el
trasplante. Además, el trasplante de islotes presenta una limitación importante: se debe
partir de dos o incluso tres páncreas donantes para conseguir el número de islotes
necesarios para su trasplante. Por ello, el estudio de nuevas fuentes celulares que
permitan la obtención de células productoras de insulina para el trasplante se ha
convertido en uno de los objetivos principales en el campo de la investigación en
INTRODUCCIÓN
31
diabetes. En este sentido, la terapia celular se presenta como una alternativa
esperanzadora para el tratamiento de pacientes diabéticos.
3.4 Terapia celular
La célula beta es un tipo celular muy especializado que presenta una baja tasa de
renovación. Por esta razón, es clave conseguir una metodología que permita la
producción de células en el número necesario y sobre todo su diferenciación a un
estadío realmente maduro. Para tal propósito, se están estudiando estrategias que
permitan la obtención de células productoras de insulina a partir de diversas fuentes
celulares. Algunas de estas estrategias se basan en la inducción de la proliferación a
partir de la propia célula beta, mientras que otras se centran en la diferenciación de
células con distinto grado de plasticidad.
Está demostrado que en situaciones de lesión o insulinorresistencia se activan
mecanismos de proliferación de las células beta preexistentes [56]. Por esta razón, la
activación de la capacidad proliferativa de estas células es una estrategia que está siendo
puesta en práctica por numerosos grupos de investigación. Estos estudios han
determinado que la célula beta necesita volver a un estadío más desdiferenciado para ser
expandidas y posteriormente volver a ser diferenciadas mediante utilización de medios
condicionados y matrices especiales [57, 58]. La ventaja de estos protocolos es que el
estadío desdiferenciado, mostrando una morfología más mesenquimal, resulta muy
proliferativo posibilitando la obtención del número de células necesario para su
posterior trasplante; sin embargo, estos estudios han demostrado que, tras la
rediferenciación, no es posible obtener una célula beta completamente madura, en
comparación con las células de partida [59].
Otra estrategia englobada en la terapia celular, es el uso de células troncales para
ser diferenciadas hacia célula beta. Las posibilidades, en cuanto a su origen y capacidad
de diferenciación, son múltiples y, en este sentido, se han desarrollado numerosos
estudios con diferentes tipos de células troncales (Figura 8).
Se define una célula troncal como aquella que puede dividirse indefinidamente
dando lugar a células hijas sin mostrar signos de senescencia, esto es la capacidad de
autorrenovación. Además, poseen la capacidad de diferenciarse a otros tipos celulares
del organismo, lo que llamamos potencialidad. Estas células se clasifican según su
INTRODUCCIÓN
32
origen: embrionario o adulto; y potencial diferenciador: totipotentes, pluripotentes,
multipotentes y unipotentes.
Las células troncales embrionarias se obtienen de la masa interna de embriones
en estadío de blastocisto. Para su cultivo se han desarrollado medios específicos que
permiten mantener su potencial de diferenciación, pudiendo dar lugar de esta manera a
todos los tipos celulares de un organismo (endodermo, ectodermo y mesodermo). A lo
largo de los últimos años han surgido múltiples trabajos con células troncales
embrionarias, con el objetivo de obtener protocolos de diferenciación hacia tejido
pancreático (Figura 8). Los primeros trabajos fueron capaces de generar células
productoras de insulina mediante su selección tras un proceso de diferenciación
espontánea [60]. Posteriormente se diseñaron protocolos de diferenciación específicos
basados en estudios de las primeras etapas de la formación del endodermo durante el
desarrollo embrionario, para conseguir una diferenciación más robusta [61, 62]. Al
trasplantar estas células en modelos de ratones diabéticos se conseguió normalizar los
niveles de glucosa en sangre [63].
Pese al relativo éxito del uso de las células troncales, el mayor problema de la
utilización de estos tipos celulares es la alta probabilidad de formación de teratomas;
además de la elevada complejidad de los protocolos a utilizar y la baja eficiencia de
formación de verdaderas células beta pancreáticas. Además, el uso de estas células
implicaría someter al paciente a un tratamiento inmunosupresor de por vida, puesto que
no es posible realizar una terapia autóloga. Por otra parte, el estudio y aplicación de
células troncales embrionarias implica la existencia de consideraciones éticas, respecto
al uso de células derivadas de embriones humanos.
Las células troncales adultas se encuentran en estado indiferenciado entre las
células diferenciadas de un órgano y son capaces de autorrenovarse y diferenciarse
hacia los diferentes tipos celulares del tejido u órgano.
La médula ósea es una fuente importante de células troncales con gran capacidad
diferenciadora. Por esta razón, se han realizado diversos estudios en los cuales se han
utilizado células derivadas de la médula para tratar ratones diabéticos (Figura 8).
Diversos autores han demostrado que, una vez trasplantadas en ratones diabéticos,
reducían los niveles de glucosa en sangre, siendo posible que hubiera cierta
diferenciación a tejido pancreático, aunque la hipótesis más plausible es que estas
células ejerzan su efecto promoviendo la regeneración del tejido pancreático [64, 65].
INTRODUCCIÓN
33
Otra alternativa es la generación de células beta pancreáticas a partir de tejidos
emparentados con el páncreas durante el desarrollo embrionario, tales como el tejido
hepático, proceso denominado ‘transdiferenciación’. En diversos estudios se ha
demostrado que, expresando el factor de transcripción PDX-1 en células troncales
adultas hepáticas, es posible activar la expresión de genes propios de célula beta e
incluso inducir la liberación de insulina en presencia de glucosa (Figura 8) [66, 67].
Por otra parte, las células troncales adultas también han sido descritas en el
propio tejido pancreático: islotes de Langerhans, ductos y acinos. Se ha demostrado la
existencia de progenitores pancreáticos próximos a los ductos pancreáticos que expresan
el factor NGN3, de vital importancia en el proceso de desarrollo embrionario del
páncreas [68].
Además, se ha descrito el potencial diferenciador del tejido exocrino hacia célula
beta, en concreto el tejido ductal cultivado en ciertas condiciones es capaz de secretar
insulina en respuesta a glucosa e incluso generar islotes funcionales que revierten la
hiperglucemia una vez trasplantados en ratones diabéticos (Figura 8) [69, 70].
Por último, las células acinares también parecen presentar cierta plasticidad que
permite obtener células productoras de insulina sin pasar por un estado pluripotente,
gracias de nuevo al proceso de ‘transdiferenciación’ [71]. Esta plasticidad se ha
demostrado tanto in vitro [72] como in vivo [73].
En resumen, se ha conseguido la obtención de células productoras de insulina a
partir de diversos tipos celulares, tanto progenitores presentes en tejidos adultos, como a
partir de células de origen embrionario. Sin embargo, hasta la fecha ningún protocolo ha
conseguido obtener células beta completamente maduras, cuya regulación de la
secreción de insulina sea totalmente compatible con las necesidades fisiológicas.
Un mayor conocimiento de los factores que participan en la diferenciación
pancreática y la optimización de los protocolos permitirían, en el caso de la utilización
de células progenitoras adultas, obtener una posible fuente de células autólogas capaces
de secretar insulina evitando así el rechazo por parte del paciente. Además, estas células
presentarían un menor riesgo de formación de tumores y sin las implicaciones éticas
derivadas del uso de células de origen embrionario.
INTRODUCCIÓN
34
Célula BetaDesdiferenciación
Proliferacion
Células troncales
Células embrionarias
Células Adultas
Páncreas
Hígado
Ductos Acinos
Zalzman et al., 2003Ferber et al., 2000
C.Gerstengorn et al., 2004R. Gao et al., 2005
B. Soria et al., 2000
D’Amour et al., 2006Lumelsky et al., 2001
Kroon et al., 2008
Ianus et al., 2003D. Hess et al., 2003
Xuabo Xu 2008 et al.,. 2008S.Bonner-Weir et al.,. 2006
Ramiya et al., 2000
M.Okuno et al., 2007Breuck et al., 2005
Finegood et al., 2002
Transdiferenciación
Célula BetaCélula BetaDesdiferenciación
Proliferacion
Células troncales
Células embrionarias
Células Adultas
Páncreas
Hígado
Ductos Acinos
Zalzman et al., 2003Ferber et al., 2000
C.Gerstengorn et al., 2004R. Gao et al., 2005
B. Soria et al., 2000
D’Amour et al., 2006Lumelsky et al., 2001
Kroon et al., 2008
Ianus et al., 2003D. Hess et al., 2003
Xuabo Xu 2008 et al.,. 2008S.Bonner-Weir et al.,. 2006
Ramiya et al., 2000
M.Okuno et al., 2007Breuck et al., 2005
Finegood et al., 2002
Transdiferenciación
Figura 8. Posibles fuentes para la obtención de nuevas células beta para su futura aplicación en el tratamiento de la DM mediante estrategias de terapia celular.
3.5 Terapia farmacológica
La terapia con fármacos está indicada para el tratamiento de síntomas asociados
a la propia enfermedad (poliuria, polifagia, polidipsia y pérdida de peso) y evitar así
complicaciones derivadas, tales como hiperglucemia, hipoglucemia, cetoacidosis y
mejorar el control metabólico. La mayoría de estos fármacos son utilizados sobre todo
para el tratamiento de DM2.
Para evitar la hiperglucemia, se han ensayado fármacos que actúan a diferentes
niveles del metabolismo de la glucosa. Éstos se denominan secretagogos de la insulina y
se trata de fármacos que inician o potencian el mecanismo de secreción de insulina por
parte de los islotes al actuar sobre diferentes vías. Algunos de ellas se citan a
continuación:
Insulinosensibilizadores: se trata de fármacos que potencian el efecto de la
insulina o disminuyen la resistencia a ella, reducen la hiperglicemia y la
hiperinsulinemia, con lo que la célula beta queda en reposo y alivia la fatiga que ocurre
con la disfunción beta.
INTRODUCCIÓN
35
Metformina: Su efecto hipoglucemiante se debe
fundamentalmente a que reduce la producción hepática de glucosa y en
menor medida a una disminución de la resistencia periférica a la insulina.
Estimula la traslocación de los transportadores de glucosa desde el
citoplasma a la membrana plasmática tanto en hepatocitos como en
miocitos. No estimula la producción de insulina y por ello no produce
hipoglucemias en monoterapia [74, 75] Glitazonas: Son un grupo de fármacos con una estructura común,
la tiazolidina 2-4 diona, ligandos de un receptor nuclear conocido como
PPARγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma). Una vez
activado este receptor, se activa la transcripción de multitud de genes
reguladores del metabolismo lipídico con el resultado final de un
aumento de la captación muscular de glucosa y por tanto de una
disminución de la glucemia [76].
El mecanismo de acción aún no es del todo conocido y aunque el
receptor se expresa fundamentalmente en el tejido adiposo, el efecto se
produce a escala muscular mediado por señales aún no bien conocidas.
En la actualidad se encuentran comercializadas rosiglitazona [77] y
pioglitazona [78]. Reducen la hiperglucemia sin estimular la secreción de
insulina y de hecho disminuyen las concentraciones de insulina. No
producen hipoglucemia en monoterapia y precisan de la presencia de
insulina para su acción, por ello son insuficientes para el control de la
glucemia en modelos de diabetes con insulinodeficiencia. Conforme
mejora la insulinorresistencia se exige un menor esfuerzo de las células
beta y mejora la sensibilidad a la insulina del tejido muscular y adiposo.
Secretagogos: Se trata de compuestos que favorecen la secreción aumentada de
insulina por las células beta del páncreas, entre ellos se encuentran los siguientes:
Inhibidores de canales de potasio: Se trata de fármacos, como
las sulfonilureas y meglitinidas, que permiten la depolarización de la
membrana y, por tanto, estimulan la secreción de insulina. Las
INTRODUCCIÓN
36
sulfonilureas actúan principalmente sobre la subunidad SUR1 del canal
de potasio, bloqueando su acción [79].
Incretinas (GLP-1 y GP1): Se trata de péptidos intestinales que
en condiciones normales son liberados tras la ingesta de comida y son
capaces de estimular la producción de insulina a través del aumento de
Adenosín Mono fosfato cíclico (AMPc). El GLP-1 (Glucagon Like
Peptide 1) secretado por las células L intestinales y el GIP (Gastric
Inhibitory Peptide) secretado por las células K, son las principales
incretinas conocidas actualmente. El GLP-1, es un potente estimulador
de la secreción de insulina sin producir hipoglucemia, suprime la
secreción de glucagón, y es una agente inductor de la proliferación de las
células beta [80]; sin embargo, es rápidamente degradado en el
organismo debido a la acción de la dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4). Por
esta razón, se han desarrollado agonistas sintéticos del receptor del GLP-
1 más efectivos, los incretinomiméticos [81].
Inhibidores de la DPP-4: Estos agentes impiden la acción de la
enzima DPP-4 encargada de la degradación de GLP-1, de este modo se
potencia la vía de las incretinas. Los más estudiados en la actualidad son
la sitagliptina (Merck), la vildagliptina (Novartis) [82] y la saxagliptina
(Bristol, Asta-Zéneca).
Incretinomiméticos: son una nueva clase de fármacos con
múltiples acciones antihiperglicemiantes que mimetizan varias de las
acciones de las hormonas incretinas como GLP-1, incluyendo aumento
de la secreción de insulina dependiente de glucosa [83].
Entre los agentes más conocidos actualmente se encuentran la
Liraglutida, un análogo de la GLP-1, que entre otros efectos actúa
disminuyendo la concentración de glucosa plasmática y activando la
primera fase de secreción de insulina [84]. Y el Exenatide [85] cuya
acción es similar y su estructura es resistente a la degradación de GLP-1
mediada por la enzima DPP-4.
Insulinomiméticos: Se trata de fármacos capaces de mimetizar la
acción de la insulina o de potenciar su acción, actuando sobre su receptor
INTRODUCCIÓN
37
en los tejidos diana donde está presente. Algunos ejemplos de
insulinomiméticos que se están estudiando en modelos animales son la
molécula L-783,281 [83, 86].
4. MODELOS ANIMALES EN DIABETES
El empleo de modelos animales de experimentación en el campo de la diabetes
ha sido ampliamente llevado a cabo por diversos grupos de investigación. La mayoría
de los estudios se han realizado en modelos murinos, aunque otros también se han
realizado en animales más grandes. El primer modelo animal de diabetes permitió
descubrir el origen de la enfermedad. Ya en 1880, Minkowski y Von Merin
descubrieron que los perros pancreatectomizados presentaban las características de la
enfermedad [87]. Posteriormente, en 1921, Banting y Best consiguieron prolongar la
vida de perros pancreatectomizados mediante la administración de un extracto
pancreático denominado ‘isletina’. Un año más tarde se purificó la hormona de la
insulina, cuyo descubrimiento supuso el Premio Nobel de fisiología en 1923.
La diabetes es un conjunto de enfermedades de etiología compleja, y los
modelos en animales deben asumir características tanto de DM1 como de DM2. Por lo
tanto, se han desarrollado diversas estrategias que pretenden obtener un fenotipo
diabético que abarque todas sus características. Entre estos mecanismos se encuentra la
reducción de la función del páncreas mediante pancreatectomía o el uso de tóxicos
específicos para célula beta, la utilización de líneas de ratones derivadas de individuos
que desarrollan espontáneamente hiperglucemia y/o resistencia a insulina; y por último,
el uso de técnicas de biología molecular para generar animales con alteraciones en
genes implicados en la función de la célula beta. Además, el desarrollo de estos modelos
no sólo es útil para el tratamiento de la DM, sino que también es de gran utilidad para el
estudio de procesos de regeneración en las células beta.
4.1 Modelos animales en DM1
El estudio de la DM1 necesita de modelos animales donde se genere la
destrucción específica de las células beta pancreáticas, asociada principalmente al daño
mediado por el sistema inmune. Una estrategia muy utilizada es la administración de
INTRODUCCIÓN
38
estreptozotocina (STZ), un derivado nitroso aislado de Streptocotomyces achromogenes,
de capacidad alquilante que interfiere en el transporte de la glucosa [88], la función de
la enzima glucoquinasa [89] e induce daños en el ADN produciendo su rotura que
finalmente lleva a la muerte celular [90]. La administración de una única dosis alta de la
STZ produce hiperglicemia debido a una rápida destrucción de las células beta
pancreáticas. Por otra parte, el modelo de administración de dosis bajas de STZ en días
consecutivos (multiple low-dose streptozotocin, MLDS) permite la adquisición de un
daño más progresivo en el que se ha descrito la presencia de mecanismos de
inflamación propios de la DM1, que se traduce en la observación de insulitis en los
islotes [91]. Sin embargo, este agente mediante el modelo MLDS es capaz de producir
el fenotipo diabético en ausencia de la acción del sistema inmune (células T y B).
A partir de los años ochenta, muchos estudios se llevan a cabo en modelos
animales espontáneos de diabetes mellitus. El ratón diabético no obeso (NOD) y la rata
BB (Bio breeding) son dos modelos comúnmente usados que desarrollan
espontáneamente la enfermedad, y cuyas características resultan similares a la DM1
humana. Se trata de modelos animales derivados de cepas seleccionadas a partir de
individuos que presentaban hiperglicemia. Como resultado del proceso, estos animales
presentan alteraciones fenotípicas y genéticas que permiten la detección de factores
asociados a la aparición de la enfermedad como genes de susceptibilidad y regiones del
MHC [92]. El ratón NOD tiene su origen en una cepa de laboratorio inicialmente
utilizada para el estudio del desarrollo de las cataratas (el ratón JcI-ICR) [93]. La
insulitis se presenta a las 4-5 semanas de edad, seguida de la destrucción progresiva de
las células beta y el descenso de la producción de insulina. Sin embargo, la diabetes no
se manifiesta como tal hasta un periodo de 12-30 semanas de edad; curiosamente hay
una gran diferencia según el género: un 90% de las hembras NOD desarrollan diabetes
frente al 60% de los machos.
Por otra parte, el modelo de DM1 de rata BB fue originado en los laboratorios
comerciales Bio Breeding [94]. Tras la aparición de la enfermedad, los animales
presentan pérdida de peso, poliuria, polidipsia, hiperglicemia e insulinopenia a las 12
semanas de edad. Al igual que en el ratón NOD los islotes pancreáticos están sometidos
al ataque autoinmune de las células T y B y los macrófagos son reclutados en el proceso
de insulitis. Estas ratas presentan una severa linfopenia de células T, y diversos estudios
genéticos han identificado genes de susceptibilidad incluyendo regiones del complejo
MHC [95].
INTRODUCCIÓN
39
4.2 Modelos animales en DM2
La DM2 consiste en un síndrome complejo donde participan numerosos factores
tanto ambientales como genéticos, y que está principalmente caracterizado por la
resistencia a la acción de la insulina por los tejidos periféricos y la secreción alterada de
la insulina. Los modelos animales utilizados hasta la fecha para el estudio de la DM2
también reflejan esta naturaleza compleja de la enfermedad diabética, donde ésta forma
parte de un fenotipo aún más complejo que presenta obesidad, dislipidemia e
hipertensión. Del mismo modo que en los modelos animales de DM1, para el estudio de
modelos murinos en DM2 se han seleccionado cepas que desarrollan espontáneamente
la enfermedad en el laboratorio; así como modelos de ratón transgénico donde la
delección de un solo gen es responsable de un fenotipo de obesidad monogénica que
lleva consigo la alteración del metabolismo de la glucosa.
Los ratones KK son un importante modelo para el estudio del desarrollo de la
DM2, éstos adquieren una progresiva obesidad en la edad adulta asociada a resistencia a
insulina e hiperplasia en las células beta [96]. Estudios en esta cepa han determinado
que la reducción de la ingesta revierte la aparición del fenotipo. Otro modelo importante
es el que aporta el ratón NSY (Nagoya-Shibata-Yasuda), derivado de la cepa Jc1:ICR ,
que también es la cepa origen del ratón NOD. Este roedor desarrolla DM2 con la edad,
presentando una alterada secreción de la insulina y una ligera resistencia a la misma.
Además la obesidad no es un factor principal y hay una marcada diferencia en el género,
siendo diabéticos el 100% de los ratones machos frente a un tercio de las hembras [97].
Por último, la rata OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima fatty) presenta una clara
intolerancia a la glucosa, obesidad y, del mismo modo que en el caso de los ratones
NSY, los ejemplares macho son más susceptibles a la aparición de la enfermedad que
las hembras [98]. Estudios genéticos en las ratas OLETF han permitido describir
regiones de susceptibilidad en los cromosomas 1, 7, 14 y X. En conclusión, el uso de
cepas murinas seleccionadas por el desarrollo espontáneo de la DM2 permite el estudio
del fenotipo caracerístico de la enfermedad, así como facilita los análisis genéticos que
contribuyen al descubrimiento de las variables genéticas relacionadas con su desarrollo.
Dentro de los modelos murinos de obesidad monogénica, se han descrito cepas
como los ratones ob/ob [99] o las ratas fa/fa [100], que son capaces de mantener la
glicemia en valores normales gracias al desarrollo de una respuesta compensatoria de
las células beta pancreática como la hiperinsulinemia frente a la resistencia a insulina.
INTRODUCCIÓN
40
Sin embargo, otras cepas, tales como el ratón db/db [101] o Psammomys obesus [102]
desarrollan rápidamente hiperglicemia, ya que sus islotes no son capaces de producir la
suficiente insulina que requiere su organismo para mantener los niveles de glucosa en
sangre. Los estudios en animales con obesidad monogénica podrían dar explicación al
desarrollo de diabetes en ciertos invididuos obesos, mientras que en otros no se llega a
desarrollar la enfermedad [92].
Por otra parte, el uso de técnicas de biología molecular ha permitido el desarrollo
de estrategias que posibilitan la alteración de genes específicos siendo posible analizar
el efecto de la perturbación en modelos animales. Una estrategia muy importante en la
actualidad es la generación de ratones knock-out, los cuales presentan la delección de un
gen. Esto es posible gracias al diseño de construcciones de ADN homólogas al gen
diana que presentan una alteración en su secuencia genética que impide la transcripción
del gen o la viabilidad de la proteína traducida. Estas construcciones son introducidas en
células troncales pluripotentes dentro del blastocisto del ratón, que dará lugar a un
individuo quimera, que posteriormente podría dar lugar a descendencia que porte el
transgen. Se han obtenido numerosos modelos utilizando esta estrategia con el objetivo
de estudiar qué papel juega cada uno de los componentes implicados en la alteración de
la función de insulina, tanto en la deficiencia de su secreción como en la resistencia a su
acción por los tejidos periféricos [103]. El primer modelo animal knock-out de
insulinorresistencia tuvo como objetivo eliminar la función del receptor de insulina (IR).
Los estudios observaron que el animal heterocigoto para la delección del gen no
presenta el fenotipo diabético, por lo que la expresión del 50% de IR era suficiente para
mantener la homeostasis de la glucosa. Sin embargo, el ratón homocigoto para la
delección desarrolla una diabetes con cetoacidosis severa y muere a los 3-7 días tras el
nacimiento [103]. Otros modelos knock-out para el IR solo presentan la delección en
tejidos específicos como es el caso de los ratones MIRKO en los que IR no es expresado
en el tejido muscular [104]. Este modelo presenta un mayor porcentaje de tejido adiposo
y mayores niveles de triglicéridos y ácidos grasos en sangre, lo cual forma parte del
metabolismo alterado asociado a la resistencia a insulina que se presenta en la DM2.
Otros genes han sido alterados en ratones knock-out y se ha demostrado así su papel en
la adquisición de la diabetes, como es el caso del gen que codifica para la glucoquinasa
[105], enzima que cataboliza la glucosa tras su entrada a la célula, y genes implicados
en el metabolismo adiposo, como PPAR y C/EPB [106, 107].
INTRODUCCIÓN
41
4.3 Estudio de la regeneración pancreática en modelos animales
El estudio de la regeneración pancreática permite esclarecer los posibles
mecanismos de compensación de la célula beta ante el daño producido por diversos
estímulos. Diferentes procesos, tales como la proliferación y apoptosis celular, la
hiperplasia, o la diferenciación a partir de células progenitoras, podrían estar implicados
en este fenómeno. Las estrategias empleadas en el análisis de procesos regenerativos
alteran la masa celular beta en los diferentes modelos animales, de modo que es posible
analizar la respuesta al daño en el tejido pancreático remanente. Uno de los métodos
más empleados es la administración de agentes tóxicos específicos para la célula beta
como STZ o alloxan. Estudios en rata han determinado que la administración de una
sola dosis alta de STZ produce una hiperglicemia aguda debido a una masiva
destrucción de células beta por necrosis durante las primeras 48 horas; sin embargo, a
las 2 semanas los niveles de glucosa se estabilizan, observándose a nivel histológico la
presencia de pequeñas agrupaciones de células beta en proliferación cerca de los ductos
[108, 109]. Por otra parte, la pérdida de células beta mediante el empleo de STZ
también afecta a la expresión de otras células, mostrando la presencia de bajos niveles
de PDX1 e insulina en células acinares. El empleo de técnicas quirúrgicas, tales como la
pancreatectomía parcial, también ha resultado de gran utilidad. Una extirpación del 50-
70% del páncreas en modelos murinos no supone la adquisición de diabetes debido a
que los mecanismos de regeneración y compensación son capaces de revertir la
hiperglicemia. En los estudios realizados bajo este modelo se ha observado que la masa
de célula beta aumenta más de un 68%, con la presencia de nuevos pequeños islotes y
un aumento en el tamaño de islotes más grandes [110]. Por otra parte, la
pancreatectomía del 90% sí convierte al animal en diabético, aunque también se
observan mecanismos compensatorios, ya que el contenido total de insulina en el
páncreas remanente es el doble. Además, se ha descrito el incremento de la
proliferación iniciado en los ductos y la expresión temporal del factor PDX1 en las
células ductales [111]. La ligación del ducto pancreático también es otra técnica
quirúrgica que conduce a una pancreatitis aguda y a la expresión de marcadores
progenitores pancreáticos en las zonas cercanas al ducto [112]. Por último la técnica de
‘envoltura con celofán’ (cellophane wrapping) permite una obstrucción parcial del
ducto pancreático mediante la envoltura de la cabeza del páncreas del animal. Según los
estudios publicados, a las dos semanas de la cirugía aparecen pequeños agregados de
INTRODUCCIÓN
42
células endocrinas en proliferación en las zonas cercanas al ducto, lo que proporciona la
duplicación de la masa de células beta tras 6 semanas de la intervención [113]. En
resumen, los estudios de regeneración pancreática en modelos animales han permitido
determinar que, al contrario que otros órganos como hígado, médula ósea o piel, el
páncreas tiene un escaso potencial regenerativo debido a la limitada capacidad
replicativa de las células beta y a la falta de verdaderos progenitores activados [114].
Los actuales estudios en estos modelos están centrados en mejorar la capacidad
intrínseca de las células para restaurar la función pancreática o la búsqueda de nuevos
progenitores.
Tabla 2. Modelos animales en DM DM1
• Administración de STZ/Alloxan: Dosis única Dosis bajas en días consecutivos (Amishahroki K. et al., 2008)
• Cepas seleccionadas Ratones NOD (Makino S. et al., 1980) Ratas BB (Nakhooda et al., 1997)
DM2 • Cepas seleccionadas
Ratones KK (Nakamura et al.,1987) Ratones NSY(Ueda et al ., 1995) Ratas OLETF (Kawano et al., 1992)
• Obesidad monogénica Ratones db/db (Kabayashi et al, 2000) Psammomys obesus (Ziv et al., 1999)
• Ratones knock-out Ratones IR+/- , IR-/- (Plum et al., 2005) Ratones MIRKO (Brunning et al., 1998) Ratones PPAR-γ +/- (Kubota et al ., 1999) Ratones C/EBP-α -/- (Wang et al ., 1995)
REGENERACIÓN PANCREÁTICA • Administración de STZ. (Thyssen. et al., 2006) • Pancreatectomía 50-70 % no diabetogénica (Peshavaria et al., 2006) • Pancreatectomía 90% diabetogénica (Bonner-Weir et al., 1988) • Ligación del ducto (Rosenberg et al., 1998) • Cellophane wrapping (Rosenberg et al ., 1983)
INTRODUCCIÓN
43
5. CITOQUINAS DE LA FAMILIA DE GP130
5.1 Familia GP130 e IL-6
Las citoquinas cumplen papeles esenciales en la comunicación entre células de
los organimos pluricelulares. Se trata de proteínas de muy diversa función y estructura
que actúan como mediadores intercelulares en concentraciones del orden de nanomoles
o incluso picomoles. Regulan procesos relacionados con la supervivencia, crecimiento,
diferenciación, respuesta del sistema inmunitario, etc… Al contrario que las hormonas,
las citoquinas no se encuentran almacenadas en vesículas que son liberadas tras el
estímulo, sino que son rápidamente sintetizadas y liberadas. Una sóla citoquina puede
actuar en múltiples tipos celulares (pleiotropismo) y afectar a la acción de otras
citoquinas potenciando su acción o bloqueándola. Además, la misma respuesta
biológica puede ser obtenida por distintas citoquinas, lo que indica que también existe
cierta redundancia en sus funciones [115].
Debido a su gran variabilidad, las citoquinas se han clasificado de diversas
formas: 1) en base a su respuesta biológica en pro o anti-inflamatorias, 2) de acuerdo a
su receptor, y 3) según su similitud en su estructura tridimensional.
A pesar de la falta de similitud en la secuencia proteica, la familia de citoquinas
de IL-6 fue caracterizada y agrupada atendiendo a su estructura tridimensional,
consistente en la disposición de 4 α-hélices y al uso de la subunidad GP130 en su
receptor de membrana, lo que indica que comparten mecanismos de transducción de
señales y ejercen efectos similares. Concretamente, esta familia de citoquinas la
componen los siguientes miembros: interleuquina (IL)-6, IL-11, LIF, OSM, CNTF y
Cardiotrofina (CT-1) (Figura 9). Todas ellas actúan a través de receptores que son
homodímeros de la subunidad GP130, como el caso de IL-6 e IL-11; o heterodímeros
conformados por GP130 y el receptor para LIF (LIFR), aunque para el caso de OSM
existe un segundo posible heterodímero con un receptor específico denominado OSMR.
Además, IL-6, IL-11 y CNTFR cuentan con un tercer componente específico del
receptor, responsable de la unión inicial de la citoquina y posterior reclutamiento del
resto de componentes del receptor. OSM y LIF se unen directamente al heterodímero
que conforma su receptor. En el caso de la CT-1, se ha propuesto la existencia de un
tercer componente específico de unos 80 KDa, todavía no identificado (Figura 9) [116].
INTRODUCCIÓN
44
Figura 9. Familia de citoquinas GP130 y las subunidades de sus receptores. (Adaptado de Heinrich et al ., 1998 [115]).
Todas las citoquinas de esta familia actúan en diferentes tipos celulares y ejercen
efectos redundantes puesto que los receptores de todas ellas son capaces de actuar
activando la ruta de las JAK kinasas, que finalmente conduce a la fosforilación del
factor de transcripción STAT3, implicado en procesos de diversa naturaleza. Por otro
lado, también se ha descrito que, en diferentes situaciones, son capaces de activar las
rutas de ERK y AKT, de modo que según el tipo celular y las condiciones ejercen
diversos efectos activando diferentes vías metabólicas.
5.2 IL-6
La IL-6, es la citoquina que da nombre a esta familia de proteínas. Se trata de
una proteína multifuncional producida por células linfoides y no linfoides que incluyen
principalmente macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, y está involucrada
principalmente en procesos autoinmunes y reacciones inflamatorias. Se le han atribuido
una gran variedad de efectos en diferentes sistemas celulares, según el microambiente
donde esté presente. Entre las funciones descritas se incluyen la diferenciación de
células mieloides y neurales, promoviendo la proliferación de células de mieloma. En
células cancerosas parece tener un papel tanto proliferativo como inhibidor del
crecimiento dependiendo del tipo celular. Además, juega un papel relevante en la
supervivencia de ciertos tipos celulares como las anteriormente citadas células de
mieloma o neutrófilos. Esta supresión de la apoptosis está asociada al incremento de la
expresión de BCL-xL en las células que expresan el receptor para la IL-6 [117].
INTRODUCCIÓN
45
Por otra parte, la IL-6 se expresa en los adipocitos y parece tener un papel muy
importante en el metabolismo lipídico y carbohidratos. Está descrito que la presencia de
IL-6 en sangre se correlaciona con el IMC de forma similar a la leptina [118], lo que
podría sugerir un papel ‘endocrino’ asociado a la IL-6. Por otra parte, su administración
exógena puede elevar la presencia de triglicéridos y glucosa en sangre [119, 120].
Además, estudios con ratones deficientes para el gen que codifica para la IL-6
mostraron que la ausencia de esta citoquina induce la aparición de obesidad de forma
más temprana que en ratones de la cepa salvaje. Probablemente este fenómeno esté
relacionado con la presencia de elevados niveles de leptina y de una menor respuesta a
ella en los ratones deficientes para IL-6 [121].
El efecto antiapoptótico de la IL-6 también ha sido puesto de manifiesto en el
hígado. Experimentos in vivo han demostrado que la presencia de IL-6, induce un
aumento en la expresión de BCL-xL en ratones que han sufrido un daño hepático [122].
En diversos estudios realizados en islotes de rata, se ha descrito la inducción de
la secreción de IL-6 por parte de los macrófagos activados debido a la presencia de
citoquinas proinflamatorias [123]. Sin embargo, su función en el proceso inflamatorio
no está del todo clara, ya que su papel apoptótico no parece tener un efecto sinérgico
con las citoquinas proinflamatorias, aunque sí afecta de manera significativa a la
secreción de insulina. Sin embargo, estudios realizados en islotes murinos sometidos a
la presencia de citoquinas proinflamatorias o deprivación de suero han determinado un
posible papel protector de la IL-6, demostrando un incremento en la expresión de genes
antiapoptóticos y en la presencia de la proteína BCL-xL [124].
5.3 Cardiotrofina (CT-1): estructura y función
La cardiotrofina es una citoquina que fue aislada en 1995 a partir de cuerpos
embrionarios murinos, observándose que su principal efecto era su capacidad para
inducir hipertrofia en cardiomiocitos [125]. Sin embargo, al igual que el resto de las
miembros de la familia GP130 se trata de una citoquina pleiotrópica que actúa en
diferentes tipos celulares y ejerce diferentes efectos según las condiciones del sistema
(Tabla 3). La mayoría de los estudios hasta ahora realizados se centran en su papel en
procesos cardiovasculares [126], aunque también se ha visto que ejerce funciones
importantes en otros tejidos [127].
INTRODUCCIÓN
46
Se trata de una proteína de 201 aminoácidos que ejerce su efecto tras su unión al
complejo de membrana formado por el heterodímero GP130/LIFR [128]. Al igual que
en el resto de citoquinas de la familia de IL-6, no hay una única ruta de señalización en
la que esté implicada la acción de CT-1. Algunos autores indican que CT-1 puede
activar la vía de ERK promoviendo la supervivencia en diversos tipos celulares [129].
Por otra parte, la activación de la vía JAK/STAT3 está relacionada con la inducción de
la hipertrofia en el miocardio [130], aunque también se ha descrito su papel beneficioso
para la protección de los cardiomiocitos ante el daño isquémico y estrés oxidativo
mediante mecanismos de activación de la angiogénesis, promoviendo una mejor
oxigenación y menor grado de fibrosis [131, 132]. Por último, estudios realizados en
cardiomiocitos han demostrado que la CT-1 también es capaz de activar la vía de AKT
a través de PI3K contribuyendo así al estímulo de mecanismo de protección frente a la
apoptosis [133].
Tabla 3. Efectos de la CT-1 en diferentes tejidos
TEJIDO EFECTO REFERENCIA
Hígado, riñón, bazo Inducción del crecimiento Jin H et al., 1996
Timo Atrofia Jin H et al., 1996
Plaquetas y hematocrito Inducción de la
proliferación
Jin H et al., 1996
Hígado Protección frente estímulos
proapoptóticos
Bustos M et al., 2007
Adipocitos Activación vías de
JAK/STAT y ERK
Resistencia a la acción de la
insulina
Zvonic S et al., 2004
Motoneuronas Protección frente estímulos
proapoptóticos
Oppenheim RW et al., 2001
Otro tejido en el que se ha visto que CT-1 ejerce un papel claramente protector
es el hígado. Se ha descrito que la expresión de CT-1 en hepatocitos aumenta en
procesos de regeneración hepática y que, en modelos de daño hepático, ejerce un
potente efecto antiapoptótico [134]. La sobreexpresión de CT-1 en el hígado mediante
el uso de un adenovirus portador del gen que codifica para CT-1 ejerce un efecto
INTRODUCCIÓN
47
protector en un modelo de hepatectomía en rata [135]. Del mismo modo, el tratamiento
con esta citoquina de forma sistémica mediante su administración intraperitoneal en
ratas, prolongó la supervivencia de las mismas cuando fueron sometidas a fallo hepático
fulminante [136]. Estos autores también han descrito la activación de las rutas de ERK,
JAK/STAT3 y AKT en los hepatocitos tras el estímulo con de CT-1, además de un
aumento en la expresión de proteínas de acción antiapoptótica, tales como BCL-xL, lo
que sugiere que los diversos mecanismos de actuación de la CT-1 dependen de una
posible combinación de estas vías (Figura 10).
LI
FR
GP1
30
Akt
BAD
JAK
STAT3
SHC SOS
GRB-2RAS
RAF
MEK
MAPK
CT-1
+P
STAT3
Factores de transcripción
+P +P
+P
+P
Heterodímero LIFR/GP130
Membrana celular
Citoplasma
Núcleo
LIFR
GP1
30
Akt
BAD
JAK
STAT3
SHC SOS
GRB-2RAS
RAF
MEK
MAPK
CT-1
+P
STAT3
Factores de transcripción
+P +P
+P
+P
Heterodímero LIFR/GP130
Membrana celular
Citoplasma
Núcleo
Figura 10. Estructura del receptor de CT-1, donde se muestra el heterodímero LIFR/GP130 así como las rutas activadas por esta citoquina, que dan lugar a la activación de diversos factores de transcripción en el núcleo. (Adaptado de Calabro et al., 2009 [126]).
Otro sistema donde la CT-1 parece ejercer un efecto esencial como agente
protector es en el sistema neuromuscular. El músculo produce citoquinas importantes
para la supervivencia de las motoneuronas durante el desarrollo. Estudios en ratones
INTRODUCCIÓN
48
deficientes para el gen de la CT-1 demostraron que ésta tiene un papel importante para
la supervivencia de ciertos tipos celulares durante el desarrollo embrionario [137].
También se ha descrito que la CT-1 ejerce un papel protector frente a la
apoptosis en células neurales corticales. Estos estudios se han realizado en modelos
murinos tanto in vitro como in vivo, observándose un descenso en la actividad Caspasa
3 en presencia de CT-1 [138].
Al igual que otras citoquinas de la familia de IL-6, la CT-1 parece tener un papel
importante en la homeostasis del tejido óseo, estando presente en la diferenciación de
osteoblastos, osteoclastos y condrocitos [139, 140].
La CT-1 también parece tener un importante papel en el metabolismo lipídico y
de carbohidratos. Se ha descrito su producción en adipocitos, la cual se ve incrementada
en presencia de glucosa [141]. Por otra parte, los adipocitos parecen responder a su vez
a la presencia de CT-1, ya que expresan las proteínas transmembrana GP130 y LIFR.
Estudios in vitro han demostrado que la administración de CT-1 en cultivos de
adipocitos produce un descenso en la presencia del receptor de insulina (IRS-1) que se
traduce en un fenómeno de resistencia a la insulina [142]. De forma consistente con
estos resultados, estudios realizados en pacientes con síndrome metabólico, donde el
tejido adiposo juega un papel importante en la patogenia de la enfermedad, se ha
descrito un incremento en los niveles de CT-1 en sangre con respecto a individuos sanos
[141].
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
49
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
51
Aunque los tratamientos actuales han permitido mejorar la calidad de vida de los
pacientes diabéticos, todavía es necesario desarrollar nuevas estrategias que permitan un
control más preciso de la glicemia. La aplicación de nuevas moléculas que mejoren el
estado funcional de los islotes, tanto en terapia sustitoria (trasplante de islotes) como en
terapia regenerativa, podrían mejorar los tratamientos actuales.
La IL-6 ha demostrado tener efectos beneficiosos en la viabilidad y
funcionalidad de los islotes, tanto en experimentos in vitro como in vivo. Además, el
modelo de ratón IL-6-/- presenta un metabolismo alterado, desarrollando obesidad,
resistencia a la insulina y un incremento de la masa de células alfa como mecanismo
compensatorio de la pérdida de células beta pancreáticas.
Por otra parte, la CT-1 es una citoquina de la misma familia que la IL-6 que
ejerce efectos protectores en diversos tejidos, como el corazón, tejido neuromuscular e
hígado. Se ha demostrado su efecto protector en hepatocitos in vitro y la mejora de la
supervivencia en modelos animales sometidos a daño hepático.
Hígado y páncreas comparten un mismo origen embrionario y gran parte de sus
vías metabólicas y características funcionales. Del mismo modo que la IL-6 presenta
efectos beneficiosos en la supervivencia de los islotes, nos planteamos estudiar el papel
que juega la CT-1 en el tejido pancreático, tanto in vitro como en modelos in vivo,
mediante el uso del ratón CT-1-/-.
Por tanto, los objetivos específicos propuestos en el presente trabajo de
investigación son:
1. Estudiar el papel que juega la CT-1 como factor de supervivencia in vitro en
células beta pancreáticas.
2. Analizar el mecanismo de acción de la CT-1, así como las principales vías de
señalización implicadas en la acción de esta citoquina, en procesos tales
como la protección frente a la apoptosis de las células beta pancreáticas y la
secreción de insulina.
3. Determinar el papel de la CT-1 en el control metabólico de la glucemia
utilizando un modelo de ratón deficiente en CT-1.
MATERIAL Y MÉTODOS
53
MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL Y MÉTODOS
55
1. Cultivo de líneas celulares
La línea celular MIN6B1 (cedida por el laboratorio del Dr P.Halban), derivada a
partir de la línea de insulinoma de ratón MIN6 [143, 144], se cultivó utilizando un
medio específico (Tabla 4) y en adherencia en frascos de cultivo de 175 cm2 (Corning).
Cuando las células llegaron a una confluencia alta, de un 80%, fueron despegadas
mediante el uso de tripsina (0,05% tripsina; 200 mg/L EDTA) a 37ºC durante 5
minutos, inactivándose con medio en presencia de suero. Posteriormente, las células
fueron cultivadas en nuevos frascos realizando pases de 1:3 ó 1:4.
2. Extracción y cultivo de islotes de Langerhans murinos
2.1 Obtención de islotes de Langerhans
Para la extracción de islotes murinos utilizamos ratones machos de las cepas
C57BL/6J salvaje (C57 WT) y C57BL/6J CT-1 knock-out (C57 CT-1-/-), ratones
modificados genéticamente que no expresan el gen que codifica para la Cardiotrofina-1
en ninguno de sus órganos. Todos los ratones utilizados tenían una edad comprendida
entre 6-9 semanas. Los animales fueron sacrificados mediante dislocación cráneo-
cervical. A continuación se realizaron dos secciones horizontales inmediatamente por
debajo de los rebordes costales inferiores para proceder retirando la pared abdominal.
Posteriormente, se retiró el hígado y se fijó a la pared costal mediante una gasa o una
tira de papel de filtro, de tal forma que quedó expuesta la vesícula biliar y la porción
proximal del conducto biliar. A continuación, se procedió a ligar la desembocadura del
conducto pancreático principal a nivel de la ampolla de Water para evitar la salida de la
solución con colagenasa al duodeno. Se realizó una pequeña incisión en la porción
proximal del conducto biliar, dos o tres milímetros por debajo de la vesícula biliar. Por
esta incisión se introdujo una aguja de calibre 30G previamente doblada formando un
ángulo recto y con punta en forma roma. Para evitar que la aguja se desplazara al
introducir la solución con colagenasa se fijó al conducto biliar mediante un hilo de
sutura. La solución de aislamiento utilizada durante todo el procedimiento de extracción
de islotes consistió en un medio basal Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, GIBCO
14025) pH=7,4 suplementado con 5,6 mM de glucosa (SIGMA, G-7021) y 1%
albúmina sérica bovina fracción V (SIGMA, A-7906) mantenido constantemente en
MATERIAL Y MÉTODOS
56
hielo. Posteriormente, utilizando una jeringa de 20 ml, se procedió a inyectar en el
páncreas 8 ml de la solución de aislamiento en la cual se había resuspendido
previamente 8 mg de colagenasa tipo V (SIGMA, C9263) con una actividad de
digestión de 448 unidades/mg (solución de digestión). De este modo se logró un buen
acceso de la colagenasa a todo el páncreas mediante su distensión facilitando su llegada
a los islotes. Durante todo el proceso fue necesario hidratar continuamente la cavidad
abdominal utilizando suero fisiológico.
Después de extraer el páncreas de la cavidad abdominal por disección, se
transfirió a un tubo de 15 ml que fue incubado en un baño a 37ºC durante 10 minutos,
agitando ocasionalmente. Una vez transcurrido ese tiempo, se detuvo la digestión
mediante la adición de solución de aislamiento a 4ºC. El tejido digerido se agitó
suavemente con una pipeta para conseguir disgregarlo y fue sometido a centrifugación
(1.200 rpm durante 2 minutos) para proceder descartando el sobrenadante y
resuspendiendo de nuevo el precipitado en solución de aislamiento. Este proceso se
repitió dos veces.
A continuación se purificaron los islotes obtenidos a partir del tejido digerido
mediante un gradiente de Ficoll. Para ello, el tejido se resuspendió en 10 ml de
Histopaque 1077 (SIGMA, 10771) sobre el que se añadió una capa de HBSS. El
gradiente se realizó centrifugando la muestra a 2.400 rpm durante 20 minutos, con
deceleración controlada. Los islotes se localizaron en la interfase formando un halo
fácilmente distinguible que fue recogido mediante su aspiración con una pipeta pasteur
de vidrio. Con el fin de eliminar la solución del gradiente, los islotes fueron lavados dos
veces con HBSS. Posteriormente, éstos se seleccionaron manualmente utilizando una
pipeta pasteur de vidrio y con ayuda de una lupa binocular (Olympus SZ51).
Finalmente, los islotes fueron cultivados en placas Petri directamente, o sometidos a
tratamiento con tripsina para obtener así una suspensión celular.
2.2 Cultivo de islotes de Langerhans murinos
Una vez obtenidos los islotes, éstos fueron cultivados (tanto íntegros como tras
el tratamiento con tripsina) en placas de 96 (FALCON, 353072) o 48 pocillos
(COSTAR, 3548) o placas de 35 cm2 (FALCON, 353001) previamente tratadas con L-
polilisina (110 μg/ml), (SIGMA, P1339).
MATERIAL Y MÉTODOS
57
Tabla 4. Medios de cultivo empleados
Composición de medio de cultivo para línea MIN6B1
Producto Casa Comercial
(Referencia)
Concentración
Stock
Concentración
final
DMEM-alto en glucosa GIBCO (41966) 82%
Suero Ternera Fetal (FBS) Biochrom (S-
0115) 100% 15%
β-mercaptoetanol GIBCO (31350) 50 mM 71 µM
L-Glutamina Biowhitaker (17-
605E) 200 mM 2 mM
Penicilina/Estreptomicina Biowhitaker
(DE17-602E) 100X 1X
Piruvato Sódico SIGMA (P2256) 110 mg/ml 110 μg/ml
Composición de medio de cultivo para las células de islotes de ratón
Producto Casa Comercial
(Referencia)
Concentración
Stock
Concentración
final
DMEM- alto en Glucosa GIBCO (41966) 62%
DMEM- bajo en Glucosa GIBCO (31885) 25%
Suero Ternera Fetal (FBS) Biochrom (S-
0115) 100% 10%
Penicilina/Estreptomicina Biowhitaker
(DE17-602E) 100X 1X
Gentamicina SIGMA (G1397) 50 mg/ml 50 μg/ml
Piruvato Sódico SIGMA (P2256) 110 mg/ml 110 μg/ml
Para la obtención de suspensiones celulares a partir de los islotes, éstos se
centrifugaron y el pellet obtenido fue resuspendido en 900 µl de PBS (BioWhittaker-
Lonza ,17-512F) y tratado con 600 µl de tripsina/EDTA (0,05% tripsina, 200 mg/ml
EDTA. (Biowhitaker, BE17-161E) en un baño a 37ºC durante 3 minutos, agitándolos
suavemente cada 30 segundos. La tripsina fue inactivada con medio suplementado con
suero (Tabla 4) y las células se lavaron con HBSS para posteriormente ser contadas en
MATERIAL Y MÉTODOS
58
una cámara de Newbauer descartando las células que incluyeron la tinción con azul
tripán (SIGMA, T8154).
3. Protocolos de inducción de apoptosis
Tanto la línea celular MIN6B1 como los islotes de ratón fueron sometidos a
diversos estímulos proapoptóticos que se describen en los siguientes apartados:
3.1 Deprivación de suero
Para la inducción de apoptosis utilizando este estímulo, la línea celular MIN6B1
y los islotes fueron sometidos a la deprivación completa de suero durante 96 y 120
horas. Para comprobar el posible efecto protector de la CT-1 y moléculas de la misma
familia, como la IL-6, se realizaron tratamientos con 100 ng/ml de CT-1 de rata (DRO
biosystems) o IL-6 (AbD-Serotec, PMP15B). Las determinaciones de los niveles de
apoptosis se realizaron midiendo la actividad Caspasa 3 y utilizando la técnica de
TUNEL (ver Material y Métodos, sección 4.2, página 59).
3.2 Tratamiento con citoquinas proinflamatorias
Tal y como han descrito diversos autores [124, 145], el tratamiento de las células
MIN6B1 o islotes pancreáticos murinos con una combinación de citoquinas
proinflamatorias es capaz de inducir apoptosis en estos tipos celulares. En nuestro
modelo experimental, sometimos a las células a un tratamiento combinado con las
siguientes citoquinas: IL-1β (50 U/ml, eBioscience, 14-8012), TNF-α (1000 U/mL,
eBioscience, 14-8321-61) e IFN-γ (1000 U/mL) (eBioscience, 14-8311-63),
combinación que denominamos Citomix, durante tiempos de entre 6 y 24 horas. Los
niveles de apoptosis se determinaron de mediante la medición de la actividad Caspasa 3
(ver Material y Métodos, sección 4.1, página 59).
MATERIAL Y MÉTODOS
59
4. Determinación de niveles de apoptosis
4.1 Actividad Caspasa 3
La actividad Caspasa 3 ha sido utilizada por diversos autores para determinar el
nivel de apoptosis presente en diferentes muestras biológicas [146]. En nuestros
modelos experimentales, para medir el nivel de apoptosis mediante este ensayo, se
plaquearon las células MIN6B1 a razón de 25.000-50.000 células/cm2 en placas de 48 o
96 pocillos. En cuanto a las células derivadas de islotes, éstas se cultivaron en placas de
96 pocillos, a razón de 60.000 células/pocillo.
Los niveles de Caspasa 3 activa se determinaron utilizando el Kit Caspase-Glo
3/7 Assay (Promega, G7571), siguiendo las indicaciones del fabricante. El sustrato del
kit es catabolizado por la actividad del enzima Caspasa 3 activa presente en las células
en apoptosis objeto de determinación, generando así un compuesto luminiscente
(longitud de onda de emisión 530 nm), que se cuantificó mediante un luminómetro
(FluorStar Optima).
4.2 TUNEL (Tdt-mediated dTUP nick end labelling)
La técnica de TUNEL nos permite detectar células en apoptosis, tanto en cultivo
como en tejidos [147]. Este método se basa en la detección de fragmentos de ADN
originados durante el proceso de apoptosis. Estos fragmentos son detectados gracias a la
unión en sus extremos 3´OH de nucleótidos marcados con rodamina mediante la acción
de la enzima transferasa terminal (TdT).
Para las determinaciones de apoptosis en células MIN6B1 e islotes utilizamos el
kit In Situ Cell Detection Kit TMR Red (Roche, 12 156 792 910). Además, en las
muestras de islotes combinamos este método junto con la incubación de las células con
un anticuerpo específico para la detección de insulina (Tabla 9) que nos permitirá
identificar las células beta.
Brevemente, las células fueron sembradas en placas de 35 mm2 previamente
tratadas con L-polilisina (110 μg/ml, 37ºC, 30 min). Transcurridos los diferentes
tiempos de tratamiento, las células fueron fijadas con PFA 4% (SIGMA, P6148) durante
20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron lavados con PBS para
eliminar el exceso de PFA y se procedió a permeabilizar las células con Tritón 0,5%
MATERIAL Y MÉTODOS
60
(SIGMA, triton X-100). Tras ser sometidas a lavados con PBS, las muestras se
incubaron con el reactivo del Kit de marcaje con TUNEL durante 1 hora a 37ºC y se
lavaron con PBS, para posteriormente realizar el tratamiento de bloqueo en PBS con
0,5% BSA durante 30 minutos. A continuación, las muestras se incubaron con el
anticuerpo específico para la detección de insulina (Tabla 9) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron durante 45 minutos con un
anticuerpo secundario Alexa Fluor-488 (Invitrogen, A11054) marcado con FITC que
reconocía específicamente el anticuerpo primario. Por último, tras lavar con PBS, las
preparaciones se montaron con solución 4’,6-diamino-2-fenilidol (DAPI) (Vector
Laboratorios; H-1200) como marcador nuclear. Para el recuento y determinación del
número de células beta en apoptosis, se obtuvieron imágenes representativas de la
muestra analizada utilizando el microscopio de fluorescencia (Axio Image M1, Zeiss).
Cuantificación del porcentaje células en apoptosis
Con objeto de determinar el porcentaje de núcleos positivos para el marcaje con
la técnica de TUNEL se semiautomatizó el análisis fijando las condiciones de estudio
utilizando el programa ImageJ (Wayne Rasband, NIH, USA). Esto nos permitió
cuantificar el número de células en apoptosis frente al total de células presentes en la
muestra.
Para definir las células tanto marcadas con la técnica de TUNEL como con la
tinción para núcleos DAPI, se seleccionó un umbral de intensidad a partir de las
imágenes captadas por el microscopio anteriormente mencionado. Este umbral fue
elegido de forma arbitraria y específica para cada marcaje. Debido a la presencia de
células agrupadas, se incluyó una herramienta que permitió la corrección manual del
número de núcleos que aparecían juntos en la imagen. Posteriormente las partículas
detectadas dentro del límite seleccionado eran contabilizadas. Por último, realizamos el
cálculo del porcentaje de células positivas para el marcaje con TUNEL respecto al
número de células totales detectadas por DAPI. Para la cuantificación se tomaron 5
imágenes representativas, englobando cada una de ellas aproximadamente 500 células, a
partir de 3 experimentos independientes.
MATERIAL Y MÉTODOS
61
5. Medidas de viabilidad celular: actividad ATPasa
Para medir la viabilidad mediante este ensayo, se plaquearon las células
MIN6B1 a razón de 25.000-50.000 células/cm2 en placas de 48 o 96 pocillos. En cuanto
a las células obtenidas a partir de islotes, éstas se cultivaron en placas de 96 pocillos, a
razón de 60.000 células/pocillo.
Este método, basado en la cuantificación de ATP mediante el kit (PROMEGA,
G7571) [148] como medida de la presencia de actividad metabólica, nos permitió
detectar el número de células viables. La medición se basa en una reacción que requiere
ATP y genera un producto luminiscente que puede ser detectado mediante un
luminómetro (longitud de onda de emsión, 530 nm) (FluorStar Optima).
6. Análisis de la secreción de insulina
Para llevar a cabo los experimentos de secreción de insulina, las células
MIN6B1 se cultivaron a una densidad de 50.000 células/cm2 en placas de 24 pocillos
durante 48 horas hasta la realización del ensayo de secreción. Transcurrido este tiempo,
las células fueron lavadas e incubadas durante 2 horas en solución de lavado (HBSS,
1% BSA y 2,8 mM de glucosa) a 37ºC. Posteriormente se incubaron durante 1 hora con
la misma solución de lavado, para obtener el sobrenadante que corresponde a la
secreción basal de insulina. En la siguiente hora, las células se incubaron en soluciones
de HBSS suplementado con 1% BSA y diferentes agentes según el experimento:
principalmente altas concentraciones de glucosa (16,7 mM) en combinación con CT-1
(a diferentes concentraciones), antagonistas de la secreción de insulina (Nifedipina,
SIGMA, N7634 y Neomicina B, SIGMA 72133) e inhibidores de rutas metabólicas
relacionadas con la secreción de insulina (Inhibidor de ERK, PD9809, Invitrogen,
PHZ1164).
Finalmente, las células fueron lisadas en una solución de etanol/ácido acético
(95/5) (MERCK, K34620483 / Panreac, 141008) para poder analizar su contenido total
de insulina.
Los sobrenadantes fueron recogidos en microtubos y guardados a -20ºC hasta su
utilización para realizar el ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
diluciones utilizadas de los sobrenadantes fueron de 1:50 para fracción basal y
estimulada, y de 1:250 para el contenido total.
MATERIAL Y MÉTODOS
62
La detección de insulina se realizó mediante un kit de ELISA (Mercodia AB,
10-1149-01) [149]. El método de detección (ELISA Sandwich) se basa en el uso de dos
anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos diferentes de la molécula de
insulina. Tras la incubación de los sobrenadantes derivados de las células MIN6B1 en
pocillos recubiertos con un anticuerpo que detecta la presencia de la molécula de
insulina, se añade un segundo anticuerpo específico para insulina que se encuentra
conjugado con la enzima peroxidasa. A continuación se realizan una serie de lavados
que eliminan los anticuerpos conjugados que no se han unido específicamente a la
insulina. Por último, se añade el sustrato, 3,3’, 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), que
reacciona con la peroxidasa dando lugar a un sustrato que presenta una coloración
medible (450 nm) gracias un espectrofotómetro (Magellan, TECAN). Así, la medida de
la absorbancia es proporcional a la cantidad de anticuerpo unido y, por tanto, de insulina
presente en la muestra. La concentración de insulina se obtiene mediante la realización
de una recta patrón con controles positivos de concentraciones conocidas incluidas en el
kit de ELISA utilizado.
2h 1h 1h
Pre-incubación HBSS 2,8 mM glucosa
incubación HBSS 16,7 mM glucosa
ERK inhibidorNifedipinaNeomicina
+/- CT-1 (100 ng/ml)
incubación HBSS 2,8 mM glucosa
BASALPRELAVADO ESTIMULADO
2h 1h 1h
Pre-incubación HBSS 2,8 mM glucosa
incubación HBSS 16,7 mM glucosa
ERK inhibidorNifedipinaNeomicina
+/- CT-1 (100 ng/ml)
incubación HBSS 2,8 mM glucosa
BASALPRELAVADO ESTIMULADO
Figura 11. Diseño experimental para el análisis de la secreción de insulina en presencia de CT-1 y los diferentes antagonistas de la secreción (Nifedipina o neomicina) e inhibidores de la vía de ERK (PD98059) en la línea celular MIN6B1.
MATERIAL Y MÉTODOS
63
7. Análisis de la expresión génica
7.1 Extracción ARN
La extracción de ARN total a partir de las células se realizó mediante la
utilización del kit de columnas para extracción de ARN, RNeasy Mini Kit (Qiagen,
Hilden, 74104). Tras someter a las células a un tratamiento con tripsina, éstas se
centrifugaron a 600g durante 6 minutos. Se desechó el sobrenadante para congelar el
pellet con las células a -80°C hasta el momento de la extracción. Durante todo el
proceso se utilizaron microtubos tratados con H2ODEPC (libre de ARNasas) y, tanto las
superficies de trabajo, como las pipetas y centrífugas se trataron con RNase ZAP
(SIGMA R-2020), para minimizar posibles contaminaciones con ARNasas que podrían
degradar el ARN. Para el protocolo de extracción del ARN se siguieron las
instrucciones del fabricante, según las cuales el precipitado de células se resuspende en
un tampón de lisis RLT, complementado con β-mercaptoetanol (SIGMA, M6250),
seguido de una serie de lavados con tampones RW1 y RPE. Previo a la elución final, se
procedió a la degradación del ADN genómico contaminante tratando las muestras con la
enzima ADNasa (AMBION, AM8170G). Finalmente, el ARN se eluyó en 30 μl de
H2ODEPC. Para obtener un mayor rendimiento, la muestra volvió a añadir a la columna
para realizar una última centrifugación a 13.000g. El ARN se guardó a -80°C hasta su
retrotranscripción, después de haber sido cuantificado utilizando el espectrómetro
NanoDrop (Nucliber, ND-1000).
7.2 Retrotranscripción
Para la retrotranscripción se empleó la enzima SuperScript II RNase H
transcriptasa reversa (Invitrogen, 18064-014) purificada de E. coli, que contiene el gen
POL de Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV). El rendimiento de esta enzima es
mayor que el de otras transcriptasas, permitiendo sintetizar ADNc de más de 12,3 Kb.
Para todas las muestras se partió de 1 μg de ARN en 30 μl de H2ODEPC. En primer lugar,
se preparó una solución con 3 μl de hexámeros de secuencia aleatoria (Amersham,
27216601) a una concentración de 200 ng/ml y 3 μl de dNTPs (Life tech. Gibco,
MATERIAL Y MÉTODOS
64
10297018) a una concentración de 10 mM. El ARN total se incubó con esta disolución
durante 5 minutos a 65°C para desnaturalizarlo y después se introdujo rápidamente en
hielo para evitar su renaturalización. Se preparó, entonces, otra solución con 14 μl de
tampón Strand 5x suministrado con el kit de retrotranscripción (Invitrogen, 18064-014),
6 μl de 0,1 M DTT (ditiotreitol), 1 μl de RNA Out (40 unidades/ml) (Gibco,. 10777019)
y 1 μl de enzima retrotranscriptasa SuperScript II (Invitrogen, 18080-051). Una vez
añadida esta solución a cada una de las muestras, éstas se retro-transcribieron en el
termociclador (Applied GeeAmp PCR system modelo 2700). El programa utilizado para
la retrotranscripción fue de 42°C durante 2 minutos, 25ºC durante 15 minutos, 42ºC
durante 50 minutos, 70ºC durante 15 minutos (para desnaturalizar la enzima) y 4°C
hasta la conservación del ADNc a -20°C.
7.3 PCR en tiempo real
Para la detección de la señal de amplificación del ADNc en tiempo real se
empleó el agente intercalante Syber Green (Applied Biosystems, AB 4309155). Los
cebadores sentido y antisentido se diseñaron utilizando el programa de acceso libre en
Internet Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) y fueron sintetizados por la casa
comercial SIGMA. Cada par de cebadores fue diseñado en exones diferentes, separados
por un intrón lo suficientemente grande para evitar una posible amplificación del ADN
genómico, que pudiera estar presente como contaminante en alguna de las muestras de
ADNc. Los cebadores usados para las reacciones de PCR en tiempo real se muestran en
la Tabla 5.
La amplificación por PCR se realizó en un volumen de 12 μl que contenía: 1 μl
de ADNc, 6 μl de tampón Syber Green 2X, 0,5 μl de una mezcla con cebadores (sentido
y antisentido 10 μM), y 4,5 μl de agua destilada estéril. Como control negativo se
utilizó la misma composición sustituyendo la muestra de ADNc por el mismo volumen
de agua.
La PCR en tiempo real se llevó a cabo en un equipo ABI PRISM 7700 de
Perking Elmer/Applied biosystems. El programa utilizado consistió en una primera
desnaturalización de 10 minutos a 95°C, seguida de 40 ciclos de: 95°C durante 15
segundos, 60°C durante 1 minuto. Para las muestras se utilizó una concentración de
entre 20-40 ng de ADNc. La cuantificación de la expresión de los genes fue
MATERIAL Y MÉTODOS
65
determinada usando el método de curva estándar relativa. Los niveles de ARNm se
normalizaron utilizando GAPDH como gen control de carga y los resultados se
mostraron como aumento de expresión de ARNm frente a un control positivo: la línea
de carcinoma P19, ARN total y ARN derivado de islotes.
Tabla 5. Cebadores utilizados para la RT-qPCR
Gen Sentido (5’-3’)
Antisentido (3’-5’) Tamaño amplicón (pb)
Gapdh
[NM_008084] AppliedBiosystem (#4308313) 177
Cardiotrofina
[NM_007795]
5’GAGCCAGAGGGAGGGAAGTC3’
3’CAGCCGCGGTGGTGAGAAG5’ 187
LifR
[NM_013584]
5’CGGGTCAGCCCTGGAACTG3’
3’CTCCCAGGTGGCATTGGAG5’ 190
Gp130R
[NM_010560]
5’GATCGAGCAGAATGTGTATGG3’
3’ACTTCTCTGTTGCCCACTCTG5’ 161
8. Análisis de expresión de proteínas por Western Blot
Las células MIN6B1 (1-2x106 células) y los islotes de Langerhans (200-300
islotes) se recogieron y lavaron con PBS y HBSS, respectivamente, para ser incubados
15 minutos a 4ºC en 50-100 μl de tampón de lisis para la extracción de proteínas (PBS,
Tritón X-100, Complete Mini 1X de Roche). Posteriormente se centrifugaron a 21.000-
30.000g (20 minutos, 4ºC), descartándose el precipitado y recogiendo el sobrenadante
rico en proteínas.
La cuantificación de proteínas de cada muestra se realizó por triplicado en placas
de 96 pocillos. Utilizamos el reactivo BCA (Pierce, Perbio) para cuantificar por
colorimetría la cantidad de proteína por muestra mediante su medida a 562 nm en un
espectrofotómetro (Maguellan, Tecan).
Una vez determinada la concentración de proteína por muestra, utilizamos 15 μg
de la misma para cargar en el gel de electroforesis. La muestra se preparó en tampón de
MATERIAL Y MÉTODOS
66
carga 1X, calentándola durante 5 minutos a 100ºC para desnaturalizar las proteínas y se
cargó en geles de poliacrilamida con SDS preparados al 12% (para detectar BCL-xL)
utilizando los accesorios proporcionados en el kit Mini-Protean III (BIO RAD). La
electroforesis se realizó a un voltaje de 150-200 V a temperatura ambiente.
Posteriormente las proteínas del gel fueron transferidas a una membrana de
nitrocelulosa mediante una transferencia realizada a una intensidad de 150 mA a
temperatura ambiente durante toda la noche. Transcurrido este tiempo, la membrana fue
tratada con solución de bloqueo (Tropix al 0.2% en PBT) y se sometió a la incubación
con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla 6).
Tras la primera incubación, la membrana se lavó tres veces con PBT (0.1%
Tween-20 en PBS) y se incubó durante 1 hora con el anticuerpo secundario específico
para la fracción constante del anticuerpo de la especie animal en el que se obtuvo el
anticuerpo primario: Anti-rabbit IgG polyclonal (SIGMA) para BCL-xL; Anti-mouse
IgG polyclonal (SIGMA) para TUBULINA y ACTINA.
El revelado se realizó mediante detección de actividad fosfatasa alcalina con el
kit revelador de Tropix. Previo al revelado se equilibró la membrana en tampón (0.1 M
NaCl y 0.1 Tris pH 9.5). Posteriormente se expuso la membrana con la placa de
radiografía (Hyperfilm de Amersham) en oscuridad durante el tiempo oportuno para el
revelado cada anticuerpo (1-10 minutos).
Las membranas de nitrocelulosa pudieron ser rehibridadas posteriormente con
otros anticuerpos primarios. Para ello, las membranas se sometieron a la técnica de
stripping, incubándose 30 minutos a 65ºC en tampón de stripping (Tris 0,5M pH 6.8,
SDS 2%, β-mercaptoetanol 0.7%).
Las bandas resultantes en la placa de radiografía fueron escaneadas para realizar
la cuantificación de su densidad mediante el uso del programa Quantity One (BIO-
RAD).
MATERIAL Y MÉTODOS
67
Tabla 6. Anticuerpos utilizados en ensayos de Western Blot
Nombre
proteína
Peso Molecular
(KDa)
Casa
Comercial
Dilución y Tiempo
incubación
PARP 89 Chemicon
#3564
Toda la noche, 4ºC
1:1000
BCL-xL 34 BD
#556361
Toda la noche, 4ºC,
1:500
ERK1/2 42, 44 Cell Signaling
#9102
Toda la noche, 4ºC,
1:1000
pERK1/2 42, 44 Cell Signaling
#9101
Toda la noche, 4ºC,
1:1000
AKT 60 Cell Signaling
#9272
Toda la noche, 4ºC
1:1000
pAKT 60 Cell Signaling
#9271
Toda la noche, 4ºC
1:1000
STAT3 80 Cell Signaling
#9132
Toda la noche, 4ºC
1:1000
pSTAT3 80 Cell Signaling
#9131
Toda la noche, 4ºC
1:1000
TUBULINA 50 SIGMA
T9026
1h, temperatura ambiente,
1:2000
ACTINA 42 SIGMA
A5316
1h, temperatura ambiente,
1:1000
Anticuerpor Secundarios
Anti rabbit IgG
polyclonal
SIGMA
A8205
45min, temperatura ambiente,
1:5000/1:10000
Anti mouse IgG
polyclonal
SIGMA
A1293
45min, temperatura ambiente,
1:5000/1:10000
MATERIAL Y MÉTODOS
68
9. Modelos animales de diabetes
Todos los animales utilizados para lo estudios in vivo de este trabajo se
mantuvieron en condiciones estándar de estabulación (humedad, temperatura,
alimentación y luz) específicas para cada zona de los animalarios del Centro de
Investigación Médica Aplicada (CIMA) y de la Universidad de Navarra.
Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité de Ética
para la Experimentación Animal de la Universidad de Navarra, bajo el protocolo
CEEA/079-06.
9.1 Modelos de inducción de diabetes mediante tratamiento con STZ en
ratones C57 WT y C57 CT-1-/-
Ratones C57 WT y C57 CT-1-/- machos de 6 a 9 semanas de edad fueron
agrupados en cohortes de 8-10 ratones y sometidos a la inyección intraperitoneal en
ayunas de diferentes dosis de STZ (según el modelo a estudiar):
◊ Modelo Agudo: En una primera aproximación, con el objeto de
determinar una diferente sensibilidad de los ratones C57 WT vs. C57 CT-1-/- al
agente inductor de diabetes STZ, se inyectaron tres dosis distintas de STZ: 100,
150 y 200 mg/kg. Finalmente la dosis utilizada siguiendo este modelo fue de
150 mg/kg de STZ en una única administración.
◊ Modelo Crónico: Este modelo se caracteriza por la inducción de diabetes
debido a un daño progresivo de los islotes pancreáticos mediante el uso de dosis
repetidas de STZ. Para tal propósito, se realizaron inyecciones intraperitoneales
consecutivas de dosis bajas de STZ (50 mg/kg), durante 4 días [150].
La STZ es un agente alquilante del ADN análogo de la glucosa que se introduce
en las células pancreáticas mediante el receptor de alta afinidad de glucosa (GLUT-2)
presente en estas células [151]. Por esta razón, para conseguir el máximo efecto de la
STZ, previamente a su administración, los ratones se dejaron en ayunas durante al
menos 6 horas. La administración de STZ se realizó intraperitonealmente, previamente
habiendo sido resuspendida en tampón citrato pH 4,5 (FLUKA, 82585). Una vez
resuspendida, la vida media de la STZ es muy baja, razón por la que todos los ratones
MATERIAL Y MÉTODOS
69
debían ser tratados con una misma dosis preparada de STZ en un periodo no superior a
10 minutos.
En cada estudio los ratones fueron monitorizados diariamente mediante la
medición de sus niveles de glucosa en sangre (Accucheck Aviva, Roche) y su peso,
durante un periodo de entre 5 y 30 días, dependiendo del tipo de estudio. Esta medición
se realizó siempre a primera hora de la mañana (9-11 am).
Tanto para el modelo agudo como el crónico, una vez concluido el estudio, los
ratones fueron sacrificados y se procedió a la extracción de páncreas para su posterior
análisis inmunohistoquímico (ver Material y Métodos, sección 9.4, página 71), así como
para la extracción de ARN.
9.2 Efecto de la dieta hipercolesterolémica en ratones C57 WT y CT-1-/-
El uso de dietas hipercolesterolémicas ha sido ampliamente utilizado como
modelo de DM2, ya que como consecuencia de la dieta se observa una pérdida de
respuesta a la insulina) [152]. Ratones C57 WT y C57 CT-1-/-, machos de 6 a 9
semanas de edad fueron agrupados en cohortes de 8-10 ratones y sometidos a una dieta
hipercolesterolémica durante 9 meses. El contenido de la dieta se refleja en la Tabla 7.
Tabla 7. Composición de la dieta hipercolesterolémica
Ingredientes % Composición
Pienso 65
Colesterol (Roig) 0,1
Mantequilla 16
Maizena 1,2
Agua 17,7
Durante este periodo se monitorizaron la glicemia y peso de ambos grupos de
ratones de forma semanal (método descrito Material y Métodos, apartado 9.1, página
68) y una vez al mes se realizó una curva de tolerancia a glucosa, tal y como se detalla
en el siguiente apartado.
MATERIAL Y MÉTODOS
70
Test de Tolerancia a Glucosa (TTG)
Para la realización del TTG, los ratones fueron privados de alimento desde la
tarde anterior a la realización de la prueba. A la mañana siguiente (9-11 am) se les
administró, de forma intraperitoneal, 3 mg/kg de una solución de suero glucosado al
20%, y se realizaron determinaciones de glicemias cada 5 minutos durante al menos los
primeros 45 minutos, con medidas posteriores cada 15 min, hasta ver una completa
recuperación de los niveles de glucosa basales. Al final de estudio, los ratones fueron
sacrificados y se extrajeron muestras de páncreas para su posterior estudio
inmunohistoquímico (ver Material y Métodos, sección 9.4, página 71).
9.3 Tratamiento sistémico con CT-1 en ratones C57 WT y CT-1-/-
Ratones C57 WT y C57 CT-1 -/-, machos de 6 a 9 semanas de edad, fueron
distribuidos en 4 grupos (n=6-8 ratones/grupo) (Tabla 8). Todos ellos fueron sometidos
a una inyección intraperitoneal de STZ (150 mg/kg) siguiendo el modelo agudo de
inducción de diabetes (ver Material y Métodos, sección 9.1, página 68). A uno de los
grupos WT y CT-1-/- se administró diariamente por vía intraperitoneal CT-1 en forma
de proteína recombinante a una dosis de 500 μg/kg.
Tabla 8. Distribución grupos experimentales para tratamiento sistémico con CT-1
PBS Ratones
C57 WT CT-1 (ip, 500 μg/kg)
PBS
MODELO AGUDO
(STZ) Ratones
C57 CT-1-/- CT-1 (ip, 500 μg/kg)
Todos los ratones incluidos en este estudio fueron monitorizados durante 30
días, midiendo glucemia y peso diariamente.
Al final del estudio, todos los ratones fueron sacrificados y se extrajeron
muestras de páncreas para su estudio inmunohistoquímico (ver Material y Métodos,
sección 9.4, página 71), así como para la extracción de ARN.
MATERIAL Y MÉTODOS
71
9.4 Análisis histológico: Inmunohistoquímica
Las muestras de tejido se fijaron directamente con PFA 4% durante 6 horas a
4ºC. Tras la fijación, las muestras se lavaron con PBS (5 minutos, 3 veces) y se
mantuvieron en alcohol 70% hasta su posterior inclusión en parafina. Se realizaron
cortes de 3 μm mediante micrótomo, y las muestras obtenidas se colocaron sobre portas
superfrost (tres cortes/porta con muestras separadas 30 μm).
Para el desparafinado de las muestras, los portas se mantuvieron 15 minutos a
55ºC en estufa. Transcurrido este tiempo, las muestras se sumergieron en xilol durante
30 minutos para eliminar los restos de parafina, seguido de un segundo lavado de 5
minutos en xilol nuevo. A continuación se trataron con alcohol al 100% durante 5
minutos, tras lo cual se procedió a eliminar la actividad peroxidasa endógena mediante
la incubación de los portas durante 20 minutos en una solución de metanol y agua
oxigenada al 10%. Posteriormente, se rehidrataron pasando por diluciones decrecientes
de alcohol en agua (100º, 96º, 80º, 70º) durante 2 minutos cada una.
Tras su rehidratación, depediendo del anticuerpo empleado (Tabla 9), se
procedió a la exposición de antígenos mediante irradiación utilizando microondas
(Sharp. R-216) 5 minutos a máxima potencia (dos ciclos) seguida de 2 minutos a
mínima potencia (dos ciclos) en diferentes tampones, según el anticuerpo utilizado
(Tabla 9). Tras este paso, se bloquearon las uniones inespecíficas con 1% BSA en TBS
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
El anticuerpo primario se diluyó a la concentración adecuada en 1% de BSA en
TBS. Las muestras fueron incubadas durante 14 horas a 4ºC en presencia del anticuerpo
primario de estudio. A continuación, se procedió a eliminar el exceso de anticuerpo
sometiendo las muestras a 3 lavados consecutivos con TBS durante 5 minutos en
agitación.
Posteriormente se utilizó un anticuerpo secundario IgG (Dako) específico para la
detección de la parte constante de anticuerpo primario. Este anticuerpo se encuentra
unido a peroxidasa, lo que permite el proceso de revelado. Para todos los anticuerpos
secundarios se utilizó una dilución 1:100, incubándose 30 minutos a temperatura
ambiente. Para eliminar el exceso de anticuerpo secundario se realizaron 3 lavados con
TBS (5 minutos/lavado).
Para el revelado se empleó DiAminoBencidina (DAB, Dako, K3468), molécula
que es catabolizada por la peroxidasa y da lugar a un producto que precipita siendo
MATERIAL Y MÉTODOS
72
posible su detección colorimétricamente. A continuación, las muestras fueron tratadas
con hematoxilina (Sigma-Aldrich, GHS1128) para contrastar los núcleos de las células.
Por último, las muestras fueron sometidas a un proceso de deshidratación mediante su
incubación en gradientes crecientes de alcohol (70º, 80º, 96º 100º, 1 minuto cada
lavado) para finalmente dejarlas en xilol al menos 15 minutos. Para poder visualizar las
muestras en el microscopio, éstas fueron montadas utilizando el fijador DPX (BDH,
360294H).
Tabla 9. Anticuerpos empleados en Inmunohistoquímica
Anticuerpo Casa
Comercial
Concentración
uso
Pre-
tratamiento
Tiempo y
Tª de
incubación
Amplificación de
señal
Rabbit
Policlonal
anti PDX1
Abcam
(ab47267) 1:10.000
Microondas
(Citrato
Sódico 10
mM, pH3)
14 horas,
4ºC
Envision + System-
HPR Anti.Rabbit
(Dako, K4003)
Guinea Pig
Anti-Swine
INSULIN
Dako
(A0564) 1:100 No
14 horas,
4ºC
Anti-Guinea Pig
Inmunoglobulins/HRP
(Dako, P0141)
Rabbit
Monoclonal
Antibody
Ki67 (Clone
SP6)
NeoMarkers
(RM-9106) 1:200
Microondas
(Tris/EDTA
10 mM, pH
9)
14 horas,
4ºC
Envision + System-
HPR Anti.Rabbit
(Dako, K4003)
9.5 Cuantificación histológica
En todos los estudios animales se realizó un análisis inmunohistoquímico del
estado funcional de los islotes, analizando la masa beta pancreática mediante la
detección de insulina y la presencia de marcadores de progenitores pancreáticos y de
proliferación, como PDX1 y Ki67. Para todos ellos se observaron las muestras en el
microscopio Nikon Eclipse E600 y se tomaron fotografías de los tejidos con cámara
AxioCam MRc5 (Zeiss) acoplada al microscopio Zeiss AxioImager M1 (Zeiss). Para las
MATERIAL Y MÉTODOS
73
cuantificaciones se tomaron al menos 30 imágenes a partir de 6 cortes transversales
(separadas 30 μm cada una) por cada páncreas.
9.6.1 Cuantificación de células PDX1+ y proliferación celular (células
Ki67+)
Para el estudio de regeneración en el modelo in vivo utilizando el modelo agudo
(ver Material y Métodos, sección 9.1, página 68) se utilizaron cortes histológicos de
páncreas marcados con anticuerpos específicos para PDX1 y Ki67 (6 muestras por
ratón).
Se realizó la cuantificación del porcentaje de núcleos positivos para PDX1 y
Ki67 por islote mediante el contaje directo del número de núcleos positivos frente al
número total de núcleos por islote en cada una de las muestras, siendo cada uno de los
estudios realizados por el mismo observador y utilizando el mismo microscopio (Nikon
Eclipse E600).
9.6.2 Cuantificación de la masa de células beta en muestras de páncreas:
programa analySIS®
Para el estudio del estado funcional de los islotes en los diferentes modelos
animales utilizados se determinó el área de cada uno de los islotes presentes en cada uno
de los cortes histológicos. Los resultados se muestran como área media total de islotes
por grupo. Además, se cuantificó el área marcada por inmunohistoquímica con un
anticuerpo específico para insulina con respecto al área total de cada islote. Para ello,
realizamos fotografías a 40X de todos los islotes presentes en cada corte analizado (6
muestras por ratón). Los resultados se muestran como porcentaje de área de insulina con
respecto al área total de islote. Todas las determinaciones se realizaron mediante el
programa analySIS® (Soft Imaging System).
MATERIAL Y MÉTODOS
74
40x 40xIns 40x 40xIns 40x 40xIns
Figura 12. Ejemplo de cuantificación de área marcada con insulina dentro de un islote en un corte de páncreas de ratón contrastado con hematoxilina. En el panel de la izquierda se observa la imagen inmunoteñida con el anticuerpo específico para insulina y en el panel de la derecha se muestra la misma imagen modificada para su posterior cuantificación, donde se resalta el perímetro del islote (en rojo) y el área correspondiente a la insulina (en gris).
10. Estadística
El análisis estadístico se realizó utilizando el programa GraphPad Instat versión
3.00 para Windows (GraphPad Software, SanDiego California, USA). Para comprobar
la normalidad de las muestras se realizó el test de Kolmogorov and Smirnov. En las
muestras que seguían una distribución normal, los datos se expresaron como media ±
desviación estándar de la media. Las comparaciones entre varios grupos se realizaron
mediante el test de ANOVA, mientras que para comparaciones entre 2 grupos se utilizó
el estadístico t de student de muestras no pareadas. En el caso de comparaciones no
paramétricas, debido a la ausencia de una distribución normal, se aplicaron el test de
Kruskal-Wallis y el test U de Mann-Whitney para comparaciones de 2 grupos.
El nivel de significación estadístico se fijó en 0,05, considerando diferencias
correspondientes a una probabilidad menor de 0,05 (P<0,05) como significativas (*),
muy significativas (**) cuando era menor de 0,01 (P<0,01) y extremadamente
significativas (***) en el caso de una probabilidad menor de 0,005 (P<0,005).
RESULTADOS. BLOQUE I
75
RESULTADOS BLOQUE I
RESULTADOS. BLOQUE I
77
Estudio del efecto de la CT-1 en la línea de insulinoma MIN6B1 e islotes
murinos
1. Caracterización de la línea celular MIN6B1 e islotes de Langerhans
La célula beta es un tipo celular muy complejo, ya que desarrolla funciones
reguladoras muy específicas. Además, presenta una baja tasa de proliferación,
dificultando su cultivo en el laboratorio.
Por tanto, para nuestros estudios in vitro fue necesario la selección de fuentes de
células que presentaran las características propias de células beta maduras y funcionales,
que pudieran aportarnos resultados reproducibles y acordes con los que se obtengan con
la utilización de cultivos primarios de islotes, obtenidos a partir de muestras de páncreas
de ratón.
En concreto, utilizamos la sublínea celular derivada de insulinoma de ratón
MIN6B1. Estas células fueron aisladas como un subclon de la línea celular
transformada MIN6 altamente diferenciado, que ha sido ampliamente utilizada en
estudios de regulación de la secreción de insulina, adhesión y morfología [143, 144].
Por otra parte, para confirmar los resultados obtenidos con la línea celular MIN6B1, fue
también necesaria la obtención y cultivo de islotes de ratón C57/BL6J.
1.1 Niveles de expresión génica de la vía de señalización de CT-1
En primer lugar comprobamos que tanto la línea celular MIN6B1 como los
islotes de ratón expresaban el receptor para la citoquina CT-1. Éste está compuesto por
tres subunidades, de las cuales se han caracterizado dos proteínas transmembrana
compartidas con el resto de citoquinas de la familia de IL-6 [128]: GP130 y LIFR. La
tercera subunidad específica del receptor de la CT-1 todavía se desconoce [116]. En los
tejidos donde se ha descrito una función protectora de la CT-1, como es el caso del
tejido cardíaco [126] o hepático [134], esta citoquina se expresa en condiciones
normales, y se ha demostrado que su expresión aumenta tras la inducción de daño [153].
Por esta razón, también analizamos si en condiciones normales la línea celular MIN6B1
y los islotes murinos podían expresar CT-1.
Los resultados obtenidos mediante RT-qPCR utilizando cebadores específicos
indican que, tanto el receptor como la propia citoquina, se expresan en ambos tipos
RESULTADOS. BLOQUE I
78
celulares, y que además sus niveles son similares. La cuantificación se realizó en
comparación con la línea derivada de teratoma embrionario murino P19 [154], tejido
donde se detecta la presencia de la CT-1, además de los diferentes componentes de su
receptor (Figura 13).
MIN6B1 ISLOTES
CT-1 338,07 (+/- 32,66) 345,87 (+/-123,00)
LIFR 214,16 (+/- 28,50) 189,50 (+/- 38,47)
GP130 454,15 (+/- 143,00) 567,79 (+/- 114,00)
Figura 13. Análisis de la expresión de CT-1 y de dos componentes de su receptor (LifR y Gp130) en la línea celular MIN6B1 e islotes murinos, mediante RT-qPCR utilizando cebadores específicos. Los niveles de ARNm se expresaron como porcentaje respecto a un control positivo (teratocarcinoma de ratón P19) normalizados mediante el gen constitutivo Gapdh. Entre paréntesis se muestra la desviación estándar tras analizar dos experimentos independientes por triplicado.
1.2 Presencia y actividad del receptor de CT-1
Por otra parte quisimos comprobar la funcionalidad del receptor LIFR/GP130 en
los islotes obtenidos a partir de páncreas de ratón C57/BL6J tras el tratamiento con CT-
1. Estudios anteriores demostraron en diversos tejidos que la presencia de CT-1 actúa
sobre el receptor activando diversas rutas de señalización. Las citoquinas de la familia
de IL-6 realizan su acción a través de su receptor de membrana que a su vez activa la
fosforilación de los miembros de la vía de JAK/STAT, conduciendo a la fosforilación
de diversas isoformas de la familia de factores de transcripción STAT [155]. En
concreto, diversos autores han descrito la activación de STAT3 como indicio de
activación y funcionalidad del receptor de CT-1 en varios tejidos, así como la activación
de la ruta de ERK y AKT. En presencia de CT-1, la proteína STAT3 es fosforilada y
dimeriza, siendo así activa para actuar como factor de transcripción en el núcleo [155].
Por tanto, quisimos detectar la fosforilación de STAT3 en los islotes murinos tras el
tratamiento con CT-1. La dosis de CT-1 utilizada fue la descrita en estudios
previamente realizados en hepatocitos (100 ng/ml) [134]. Tras 15, 30 y 60 minutos de
incubación con CT-1 (100 ng/ml) obtuvimos lisados de proteínas de los islotes y, tras
separar las proteínas por electroforesis, detectamos la presencia de la proteína STAT3 y
RESULTADOS. BLOQUE I
79
STAT3 en su estado fosforilado (pSTAT3) mediante la técnica de Western Blot gracias
al uso de anticuerpos específicos (Figura 14).
El resultado obtenido nos indica que, tras el tratamiento de los islotes murinos
con CT-1, tiene lugar la activación de STAT3, teniendo un pico máximo de
fosforilación comprendido entre los tiempos 15 y 30 minutos tras la incubación (Figura
14).
Figura 14. Activación de la vía de STAT3 en presencia de CT-1 (100 ng/ml). A. Imagen representativa de la detección de la proteína STAT3 y su forma fosforilada, pSTAT3, en células de islote de ratón mediante la técnica de Western Blot utilizado anticuerpos específicos. B. Cuantificación de la proteína pSTAT3 respecto a la proteína total. Los resultados se muestran como la media y desviación estándar de 3 experimentos independientes.
2. Estudio de la activación de rutas de señalización a través de la CT-1
y su receptor
Las citoquinas de la familia de IL-6 activan principalmente 3 vías de
señalización intracelular: JAK/STAT, MAP kinasas y PI3K/Akt, responsables de la
activación de diferentes procesos dependiendo del tipo celular, las condiciones
fisiológicas y la presencia de otras citoquinas [156].
La célula beta es un tipo celular altamente especializado donde la activación de
las rutas anteriormente descritas puede estar implicada en múltiples procesos, tales
como la secreción de insulina, apoptosis, mecanismos antiapoptóticos y proliferación.
ctrl 15’ 30’ 1h
pSTAT3
STAT3
β-ACTINA02468
1012
Ctrl 15' 30' 1h
CT-1 (100 ng/ml)BA
CT-1 (100 ng/ml)
pSTA
T3/S
TAT3
ctrl 15’ 30’ 1h
pSTAT3
STAT3
β-ACTINA02468
1012
Ctrl 15' 30' 1h
CT-1 (100 ng/ml)BA
CT-1 (100 ng/ml)
pSTA
T3/S
TAT3
RESULTADOS. BLOQUE I
80
Por esta razón, quisimos comprobar la posible activación de la ruta de las MAP
kinasas y de PI3K/Akt en presencia de CT-1 en muestras de islotes obtenidas a partir de
páncreas murinos.
Del mismo modo que en el estudio de la activación de STAT3 (ver Resultado
Bloque I, sección 1.2, página 78), los islotes se incubaron en presencia de CT-1 (100
ng/ml) y, transcurrida una hora, se recogieron los lisados de proteína que fueron
separados mediante electroforesis. Posteriormente, se utilizaron anticuerpos específicos
para detectar la presencia de ERK1/2, principal proteína de la ruta de las MAP kinasas y
su forma fosforilada (pERK1/2), así como anticuerpos contra la proteína AKT, de la vía
PI3K/Akt y su forma fosforilada.
Observamos que, tras la estimulación con CT-1 en los islotes murinos, se
produce una activación de ERK, con un pico máximo entre 15 y 30 minutos (Figura 15).
Sin embargo, este fenómeno no fue observado en el caso de AKT (datos no mostrados).
La activación de ERK está implicada en diversos procesos, incluidos
mecanismos de protección en muchos tipos celulares. Además, la fosforilación de esta
proteína se produce tras la presencia de agentes estimuladores de la producción de
insulina como la glucosa o ciertos factores de crecimiento [157], lo que nos indica que
quizás la CT-1 también podría jugar un papel relevante en la regulación de su secreción.
Figura 15. Activación de la vía de las MAP kinasas mediante la detección de ERK1/2 fosforilado tras el tratamiento de islotes pancreáticos con CT-1 (100 ng/ml). A. Imagen representativa de la detección de las proteínas ERK1/2 y sus formas fosforiladas, pERK1/2 en células de islote de ratón mediante la técnica de Western Blot utilizando anticuerpos específicos. B. Cuantificación de la proteína pERK1/2 respecto a la proteína total. Los resultados se muestran como la media y desviación estándar de 4 experimentos independientes.
ctrl 15’ 30’ 1h
pERK
ERK
β-ACTINA0
2
4
6
8
10
Prom ERK1 Prom ERK2
Ctrl
15'
30'
1h
ERK1 ERK2
BA
pER
K/E
RK
CT-1 (100ng/ml)
ctrl 15’ 30’ 1h
pERK
ERK
β-ACTINA0
2
4
6
8
10
Prom ERK1 Prom ERK2
Ctrl
15'
30'
1h
ERK1 ERK2
BA
pER
K/E
RK
CT-1 (100ng/ml)
RESULTADOS. BLOQUE I
81
3. Medida del efecto antiapoptótico de la CT-1 en islotes de
Langerhans y células MIN6B1
La apoptosis celular es un mecanismo complejo presente en todos los tipos
celulares y forma una parte esencial en el proceso de recambio celular necesario en la
homeostasis de los tejidos del organismo. Sin embargo, también es un proceso que
puede estar alterado y ser causa de diversas enfermedades [158].
En el caso de la célula beta pancreática, se ha descrito que el proceso de
apoptosis está presente tanto en DM1 como DM2. La glucolipotoxicidad y la resistencia
a insulina en DM2 y los procesos inflamatorios desencadenados en DM1 parecen ser los
responsables de los procesos apoptóticos que ocurren en ambas enfermedades [158]
Para realizar el estudio de la apoptosis in vitro utilizando la línea celular
MIN6B1 y los islotes de ratón, decidimos ensayar diversos estímulos proapoptóticos ya
descritos por otros autores, tales como la deprivación de suero [159] , el uso de
citoquinas proinflamatorias [124] y agentes citotóxicos como la estreptozotocina (STZ)
[160]. Finalmente, analizamos el efecto protector de la CT-1 utilizando, por una parte,
la deprivación de suero como estímulo apoptótico y, por otro lado, el uso de una
combinación de citoquinas proinflamatorias compuesta por IL-1β, IFNγ y TNFα
(Citomix).
3.1 Tratamiento con CT-1 en deprivación de suero
La deprivación de suero in vitro impide el acceso por parte de la célula a
múltiples nutrientes esenciales para su supervivencia, lo que desencadena el proceso
apoptótico. Uno de los principales objetivos que nos planteamos consistió en estudiar si
la CT-1 era capaz de ejercer un efecto protector frente al estímulo apoptótico inducido
por la deprivación de suero tanto en la línea celular MIN6B1 como en los islotes de
ratón. Para ello tratamos estas poblaciones celulares con CT-1 (100 ng/ml) en medio de
cultivo en ausencia de suero a diferentes tiempos. Mediante un ensayo de
bioluminiscencia capaz de detectar la actividad de Caspasa 3, mediador esencial en el
proceso de apoptosis, comparamos la señal apoptótica entre los cultivos sometidos a
deprivación de suero en presencia o ausencia de CT-1. Observamos una reducción
significativa de los niveles de apoptosis en MIN6B1, tanto a 96 como a 120 horas
RESULTADOS. BLOQUE I
82
(Figura 16), cuando esta línea celular es tratada en presencia de CT-1. Este efecto
protector de la CT-1 ocurre de forma similar en los islotes murinos (Figura 16), en los
que observamos que el porcentaje de apoptosis también se reduce significativamente en
presencia de esta citoquina.
De forma paralela se realizó el ensayo utilizando como molécula protectora la
IL-6, citoquina ya descrita por otros autores como agente antiapoptótico en islotes
[124]. Comprobamos su efecto protector en la línea MIN6B1 (Figura 16) que también
resultó significativo, aunque los porcentajes de reducción de apoptosis fueron menores
que en el caso de la CT-1. Sin embargo, en el caso de los islotes, el tratamiento con IL-6
no indujo un efecto protector significativo a las mismas dosis y tiempos utilizados para
la CT-1 (datos no mostrados).
*
+CT-1 0
20
40
60
80
100
% A
popt
osis
Deprivación suero 96h
Control +IL-6 +CT-1 Control +IL-6
n.s.
18,69%
***
24,81%
n.s. **
***
n.s.
41,74%
23,83%
MIN
6B1
ISLO
TES
***
0
20
40
60
80
100
Control CT-1 (100 ng/ml)+CT-1 Control
***
45,99 %
+CT-1 Control
% A
popt
osis
Deprivación suero 120h
Deprivación suero 120h
0
20
40
60
80
100
Control CT-1 (100 ng/ml)
14,0 %
+CT-1 Control
Deprivación suero 96h
A
B*
+CT-1 0
20
40
60
80
100
% A
popt
osis
Deprivación suero 96h
Control +IL-6 +CT-1 Control +IL-6
n.s.
18,69%
***
24,81%
n.s. **
***
n.s.
41,74%
23,83%
MIN
6B1
ISLO
TES
***
0
20
40
60
80
100
Control CT-1 (100 ng/ml)+CT-1 Control
***
45,99 %
+CT-1 Control
% A
popt
osis
Deprivación suero 120h
Deprivación suero 120h
0
20
40
60
80
100
Control CT-1 (100 ng/ml)
14,0 %
+CT-1 Control
Deprivación suero 96h
A
B
Figura 16. Análisis del porcentaje de apoptosis medido en islotes y la línea celular MIN6B1 mediante la detección de Caspasa 3 activa, en deprivación de suero tras el tratamiento con IL-6 (100 ng/ml) o CT-1 (100 ng/ml). Los niveles de Caspasa 3 se normalizaron respecto al control en deprivación de suero y ausencia de IL-6 o CT-1. Los resultados se muestran como media y desviación estándar de 4 experimentos independientes en triplicado para la línea celular MIN6B1 y 3 experimentos independientes en triplicado para los islotes murinos. * : P<0,05; ** : P<0,01; ***: P<0,005
RESULTADOS. BLOQUE I
83
Como estudio complementario analizamos, mediante la técnica de
inmunofluorescencia de TUNEL, el porcentaje de células apoptóticas en la línea celular
MIN6B1, en las mismas condiciones de deprivación de suero y tras el tratamiento con
CT-1. Esta técnica permite visualizar los núcleos de las células que se encuentran en
apoptosis mediante la detección de los extremos amino-terminales del ADN
fragmentado. Comprobamos que, tras 120 horas de deprivación de suero en presencia de
CT-1, observamos una reducción muy significativa del porcentaje de células apoptóticas
(Figura 17), similar a la obtenida mediante la medida de Caspasa 3 (Figura 16).
0
1
2
3
4
Ctr S.D. S.D. + CT
0
20
40
60
80
100
Ctr S.D. S.D. + CT
120H
Control CT (100ng/ml)
DAPI
TUNEL
20x
***
***
**
**
DAPI
TUNEL
DAPI
TUNEL
20x 20x
A
B
C
% C
élul
as e
n ap
opto
sis
38%
Deprivación de suero
48H
39,6%
0
1
2
3
4
Ctr S.D. S.D. + CT
0
20
40
60
80
100
Ctr S.D. S.D. + CT
120H
Control CT (100ng/ml)
DAPI
TUNEL
20x
***
***
**
**
DAPI
TUNEL
DAPI
TUNEL
20x 20x
A
B
C
% C
élul
as e
n ap
opto
sis
38%
Deprivación de suero
48H
39,6%
Figura 17. Detección del porcentaje de células apoptóticas mediante TUNEL en la línea celular MIN6B1 sometida al estímulo de la deprivación de suero. Cuantificación del porcentaje de células MIN6B1 en apoptosis tras 48 horas (A) o 120 horas (B) en deprivación de suero y en presencia o ausencia de CT-1 (100 ng/ml). C. Imágenes representativas de TUNEL en la línea celular MIN6B1 donde observamos un aumento en el número de núcleos positivos para TUNEL tras 120 horas en deprivación de suero, que disminuye tras el tratamiento con CT-1. Los resultados se muestran como media y desviación estándar de 3 experimentos independientes. **: P< 0,01; ***: P< 0,005
RESULTADOS. BLOQUE I
84
3.2 Tratamiento con CT-1 en presencia de citoquinas proinflamatorias
La presencia de citoquinas proinflamatorias es el desencadenante de procesos
apoptóticos responsables de diversas patologías, tales como la DM1. De hecho, el uso
de una combinación de citoquinas proinflamatorias es un modelo de inducción de
apoptosis in vitro utilizado en diversos estudios [124].
Por tanto, quisimos analizar el posible papel protector de la CT-1 frente a este
estímulo apoptótico, tanto en la línea celular MIN6B1 como en islotes de ratón. Para
ello incubamos previamente las células con CT-1 durante 1 hora, y a continuación
sometimos al cultivo al tratamiento con Citomix (IL-1β (50 U/ml), TNF-α (1000 U/mL)
e IFN-γ (1000 U/mL)), durante tiempos comprendidos entre 6 y 24 horas. Los niveles
de apoptosis se determinaron mediante la medición de la actividad de Caspasa 3 (ver
Material y Métodos, sección 4.1, página 59).
Los resultados obtenidos con la línea MIN6B1 muestran, en contra de lo
esperado, un incremento de los niveles de apoptosis en presencia de CT-1, que fue
significativo a las 24 horas (Figura 18A). Este dato sugiere un posible papel sinérgico
deletéreo de la CT-1 cuando ésta se combina con la acción de citoquinas
proinflamatorias, tales como la IL-1β, TNF-α o IFN-γ.
Sin embargo, en los ensayos realizados con islotes murinos volvemos a observar
un descenso en los niveles de apoptosis en presencia de CT-1 que resulta ser
significativo en presencia de CT-1 (Figura 18B). Estos datos indican que la CT-1 ejerce
un efecto protector en islotes murinos cuando éstos son sometidos a daño por
deprivación de suero o presencia de citoquinas proinflamatorias, mientras que en la
línea celular MIN6B1 parece tener un papel dual: protector en deprivación de suero,
pero citotóxico en presencia de las citoquinas proinflamatorias.
RESULTADOS. BLOQUE I
85
0
40
80
120
160
Control CT-1 6H CT-1 24HControl +CT-1 [6h] +CT-1 [24h]
**n.s.
% A
popt
osis
MIN
6B1
ISLO
TES
35.8%
Citomix
0102030405060708090
100
Citomix Citomix + CT-1 (100ng/ml)Control +CT-1 [24h]
35,8%
**
A
B Citomix
% A
popt
osis
40%
0
40
80
120
160
Control CT-1 6H CT-1 24HControl +CT-1 [6h] +CT-1 [24h]
**n.s.
% A
popt
osis
MIN
6B1
ISLO
TES
35.8%
Citomix
0102030405060708090
100
Citomix Citomix + CT-1 (100ng/ml)Control +CT-1 [24h]
35,8%
**
A
B Citomix
% A
popt
osis
0
40
80
120
160
Control CT-1 6H CT-1 24HControl +CT-1 [6h] +CT-1 [24h]
**n.s.
% A
popt
osis
MIN
6B1
ISLO
TES
35.8%
Citomix
0102030405060708090
100
Citomix Citomix + CT-1 (100ng/ml)Control +CT-1 [24h]
35,8%
**
A
B Citomix
% A
popt
osis
40%
Figura 18. Detección de la apoptosis en la línea celular MIN6B1 (A) e islotes murinos (B) tras el tratamiento con CT-1 (100 ng/ml), en presencia de Citomix. Los resultados se muestran como media y desviación estándar de 4 experimentos independientes en el caso de la línea celular MIN6B1 y 3 experimentos para los islotes murinos. **: P< 0,01
3.3 Incremento de los niveles de proteína BCL-xL tras el tratamiento
con CT-1 bajo deprivación de suero
Una medida del posible efecto antiapoptótico de la citoquina CT-1 en
condiciones de deprivación de suero consiste en la detección de moléculas que ya se
conoce su papel en la protección frente a estímulos proapoptóticos, como es el caso de
BCL-xL. Diversos grupos de investigación han demostrado la estimulación de esta
RESULTADOS. BLOQUE I
86
proteína en células beta pancreáticas tratadas con una citoquina de la familia de CT-1, la
IL-6 [124].
Por tanto, determinamos la presencia de la proteína BCL-xL mediante la técnica
de Western Blot, usando un anticuerpo específico. Los islotes de ratón y la línea celular
MIN6B1 fueron incubados con CT-1 (100 ng/ml) y sometidos a deprivación de suero
como estimulo apoptótico. Se compararon los niveles de expresión de BCL-xL entre las
muestras incubadas con la citoquina CT-1 y las muestras sólo sometidas a la
deprivación de suero. Observamos un claro incremento en la expresión de la proteína
antiapoptótica BCL-xL en las muestras de islotes pancreáticos y la línea celular
MIN6B1 tratadas con CT-1 (Figura 19).
Así mismo, realizamos la incubación de la línea MIN6B1, en presencia de CT-1
y de IL-6, tanto a 48 como a 120 horas de deprivación de suero. Comprobamos que el
aumento de la expresión de BCL-xL se produce de forma similar tanto en la incubación
con CT-1 como con IL-6, y su expresión se sigue manteniendo a tiempos más largos,
como 120 horas (Figura 20).
Figura 19. Presencia de la proteína BCL-xL en células MIN6B1 (A) e islotes de ratón (B) en presencia de CT-1 (100 ng/ml) tras 40 horas de deprivación de suero. La expresión de BCL-xL fue normalizada frente a la proteína de expresión constitutiva β-ACTINA. Los resultados se muestran como la media y desviación estándar de 4 experimentos independientes. *: P<0,05, *** P<0,005
MIN6B1 ISLOTES
Deprivación de suero (40h)
A B
0
10
20
30
40
50
Ctrl S.D. 48H S.D. + CT 48H
***
0
10
20
30
40
50
60
Ctrl S.D. 48H S.D. + CT 48H
*
Control Control CT-1
Bcl-xL
β-actina
CT-1
Deprivación de suero (40h)
% E
xpre
sión
Bcl
-xL
MIN6B1 ISLOTES
Deprivación de suero (40h)
A B
0
10
20
30
40
50
Ctrl S.D. 48H S.D. + CT 48H
***
0
10
20
30
40
50
60
Ctrl S.D. 48H S.D. + CT 48H
*
Control Control CT-1
Bcl-xL
β-actina
CT-1
Deprivación de suero (40h)
% E
xpre
sión
Bcl
-xL
RESULTADOS. BLOQUE I
87
05
101520253035404550
48H 120H
% E
xpre
sión
Bcl
-xL
CtrlS.D.CT-1IL-6
Deprivación de suero (48h)
Deprivación de suero (120h)
Deprivación de suero (48h)
Deprivación de suero (120h)
CT-1 CT-1IL-6 IL-6BCL-xL
β-ACTINA
10% FCS
10% FCS
A
B
%Ex
pres
ión
BC
L-xL
05
101520253035404550
48H 120H
% E
xpre
sión
Bcl
-xL
CtrlS.D.CT-1IL-6
Deprivación de suero (48h)
Deprivación de suero (120h)
Deprivación de suero (48h)
Deprivación de suero (120h)
CT-1 CT-1IL-6 IL-6BCL-xL
β-ACTINA
10% FCS
10% FCS
A
B
%Ex
pres
ión
BC
L-xL
Figura 20. Comparación de los niveles de BCL-xL en el tratamiento de células MIN6B1 con CT-1 y IL-6 (100 ng/ml) tras 48 y 120 horas de deprivación de suero. A. Imagen representativa de la expresión de la proteína BCL-xL mediante el uso de la técnica de Western Blot. B. Cuantificación normalizada de la expresión de BCL-xL utilizando β-ACTINA como proteína de expresión constitutiva. Los resultados se muestran como la media y desviación estándar de 2 experimentos independientes.
4. Estudio del efecto de la CT-1 en la secreción de insulina en la línea
celular MIN6B1
La CT-1, al igual que otros miembros de la familia de IL-6, es una citoquina que
puede ejercer múltiples funciones actuando sobre un mismo tipo celular.
En el estudio de la activación de rutas de señalización inducidas por CT-1 (ver
Resultados Bloque I, sección 2, página 79) observamos que la actividad antiapoptótica
de la CT-1 podría depender de la activación de la ruta de las MAP kinasas y la vía de
JAK/STAT, tanto en la línea MIN6B1 como en los islotes murinos. Puesto que ambas
rutas convergen en multitud de procesos, la CT-1 podría estar implicada en otras
funciones de la célula beta, tales como la secreción de insulina.
RESULTADOS. BLOQUE I
88
4.1 Efecto de la CT-1 en la secreción de insulina
El principal agente inductor de la secreción de insulina en la célula beta
pancreática es la glucosa. Para mantener unos niveles adecuados de este metabolito en
sangre, la célula beta secreta insulina en función de su concentración en el organismo.
Quisimos determinar si el tratamiento con CT-1 en la línea celular MIN6B1
alteraba de algún modo la vía de estimulación de la insulina iniciada por glucosa. Para
ello, incubamos las células en un medio salino (HBSS) con concentraciones bajas de
glucosa (2,8 mM), inferiores a la necesaria para inducir la secreción de insulina.
Posteriormente incubamos las células con altas concentraciones de glucosa (16,7 mM)
en presencia o ausencia de la citoquina CT-1. Además, como control del experimento
cultivamos las células MIN6B1 en presencia de CT-1 y condiciones de baja glucosa
(2,8 mM). Se determinó el contenido de insulina en los sobrenadantes recogidos para
calcular el ratio de estimulación (Figura 21A). Los resultados indican que la presencia
de CT-1 es suficiente para inducir una secreción de insulina significativa, incluso en
ausencia de glucosa (Figura 21B). Sin embargo, en presencia de glucosa, la CT-1
produce un aumento muy significativo en la secreción de insulina en comparación con
el grupo sólo tratado con glucosa, indicando un posible efecto sinérgico (Figura 21B).
Por último, observamos que el efecto estimulador de la CT-1 en un rango de
concentraciones comprendido entre 100 ng/ml y 400 ng/ml, era similar, lo que sugiere
que su efecto es independiente de la concentración, al menos en las condiciones
estudiadas (Figura 21C).
RESULTADOS. BLOQUE I
89
2h 1h 1h
Pre-incubación HBSSs
2,8mM glucosa
incubación HBSS
2,8mM glucosa
BASAL
incubación HBSS
2,8mM glucosa
+/- CT-1
incubación HBSS
16,7 mM glucosa
+/- CT-1
Cuantificación de insulina en los sobrenadantes
A
.
0
2
4
6
8
Ctrl Ctrl Glc Ctrl CT Glc + CT
Incr
emen
to In
sulin
a
***
**
B
- + - +
- - + +
0
1
2
3
4
5
6
Ctrl CT-1 100 CT-1 200 CT-1 400
****
**
C
CT-1100 ng/ml
CT-1200 ng/ml
CT-1400 ng/ml
CT-10 ng/ml
+ Glucosa 16,7 mM
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
Glucosa 16,7 mMCT-1 estimulado
(100 ng/ml)
Ctrl Ctrl Glc Ctrl CT-1 Glc CT-1
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
Ctrl + Glc + CT-1 + Glc +CT-1
*** ***
2h 1h 1h
Pre-incubación HBSSs
2,8mM glucosa
incubación HBSS
2,8mM glucosa
BASAL
incubación HBSS
2,8mM glucosa
+/- CT-1
incubación HBSS
16,7 mM glucosa
+/- CT-1
Cuantificación de insulina en los sobrenadantes
A
.
0
2
4
6
8
Ctrl Ctrl Glc Ctrl CT Glc + CT
Incr
emen
to In
sulin
a
***
**
B
- + - +
- - + +
0
1
2
3
4
5
6
Ctrl CT-1 100 CT-1 200 CT-1 400
****
**
C
CT-1100 ng/ml
CT-1200 ng/ml
CT-1400 ng/ml
CT-10 ng/ml
+ Glucosa 16,7 mM
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
Glucosa 16,7 mMCT-1 estimulado
(100 ng/ml)
Ctrl Ctrl Glc Ctrl CT-1 Glc CT-1
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
Ctrl + Glc + CT-1 + Glc +CT-1
*** ***
Figura 21. Medida de la secreción de insulina en la línea celular MIN6B1 en presencia de CT-1 (100 ng/ml). A. Esquema de los experimentos de estimulación de la secreción de insulina realizados. B. Incremento de la secreción de insulina, mediante el cálculo del ratio entre el contenido estimulado y basal de las diferentes muestras, donde se observa el efecto estimulador de la CT-1, tanto en presencia como ausencia de glucosa. C. Análisis del efecto de la concentración de la CT-1 en la secreción de insulina en presencia de glucosa. Los resultados se muestran como media y desviación estándar de 3 experimentos independientes. **: P<0,01; ***: P< 0,005
RESULTADOS. BLOQUE I
90
4.2 Estudio del mecanismo de acción de la CT-1 en la secreción de
insulina en la línea celular MIN6B1
La secreción de insulina por parte de las células beta pancreáticas es un
complejo y fino mecanismo regulado por múltiples factores. La glucosa es el principal
efector, pero su secreción puede estar mediada por otras moléculas, como factores de
crecimiento, incretinas y aminoácidos. La acción de estas moléculas estimuladoras de la
secreción inician una serie de procesos intracelulares en los que están implicados
diversos eventos, tales como cambios en el potencial de membrana, cascadas de
señalización, entrada de calcio al citoplasma, activación de factores de transcripción,
etc...
En el apartado anterior observamos que la CT-1 tiene un claro efecto en la
secreción de insulina. Además, detectamos previamente su capacidad para activar
diversas rutas de señalización como la vía de ERK y JAK/STAT. Por tanto, quisimos
determinar a qué nivel podría actuar la CT-1 en el mecanismo de secreción de insulina.
La CT-1 activa la vía de ERK en los islotes murinos (Figura 15). Está descrita la
implicación de esta vía en diversos procesos de la célula beta, entre ellos la
transcripción del gen de la insulina. Por tanto, analizamos cómo afectaría la inhibición
de esta vía en presencia de CT-1 en cuanto a la secreción de insulina, tanto en ausencia
como en presencia de altas concentraciones de glucosa. Para ello, utilizamos un
inhibidor de la vía de ERK, PD98059, utilizado en estudios previos en células beta
pancreáticas [161]. Observamos que, en ausencia de glucosa, la inhibición de ERK
impide el efecto estimulador de la CT-1; sin embargo, en presencia de altas
concentraciones de glucosa la estimulación de la secreción mediada por CT-1 parece
aumentar de forma independiente a la presencia de PD98059 (Figura 22). Por tanto,
estos datos sugieren que la vía de ERK está implicada en la secreción de insulina
mediada por CT-1 sólo en ausencia de glucosa.
En segundo lugar, un mecanismo muy importante en la secreción de insulina
ligado a la entrada de calcio es la activación de la Fosfolipasa C, que inicia una serie de
procesos implicados en la salida de calcio a través del retículo y la activación de otras
enzimas que juegan un papel en la exocitosis del gránulo de secreción, como la
Fosfoquinasa C [162]. Por esta razón, nos propusimos estudiar la acción de la CT-1 en
RESULTADOS. BLOQUE I
91
la secreción de insulina en la línea celular MIN6B1 en presencia de Neomicina B, un
inhibidor de la actividad de la Fosfolipasa C. Los resultados obtenidos muestran que, en
concentraciones bajas de glucosa, la Neomicina es capaz de revertir el efecto de la CT-1
sobre la secreción de insulina; del mismo modo, en presencia de altas concentraciones
de glucosa, el efecto sinérgico en la secreción por parte de la CT-1 es contrarrestado por
la presencia de este inhibidor (Figura 22B). Estos datos indican que el mecanismo de
acción de la CT-1 en la secreción de insulina puede estar relacionado de algún modo
con la activación de la Fosfolipasa C, o alguno de los mecanismos que prosiguen tras su
estimulación.
Por último, los inhibidores de la secreción de insulina como la Nifedipina,
actúan bloqueando la entrada de calcio a través de los canales de calcio tipo L, que se
activan tras la entrada de glucosa en la célula. Quisimos estudiar hasta qué punto un
inhibidor de la secreción de insulina como la Nifedipina podría influir en la acción de la
CT-1 en presencia de altos niveles de glucosa. Analizamos diferentes concentraciones
del inhibidor, desde 0,01 μM hasta 5 μM. Los resultados nos mostraron que, en
concentraciones de Nifedipina inferiores a 0,01 μM, la CT-1 era capaz de revertir el
efecto inhibitorio de la Nifedipina, alcanzando niveles de secreción de insulina similares
a los obtenidos en presencia de altas concentraciones de glucosa (Figura 22C). Sin
embargo, en concentraciones superiores a 0,01 μM de Nifedipina, la CT-1 no es capaz
de inducir la secreción de insulina.
RESULTADOS. BLOQUE I
92
0
1
2
3
4
Control + CT-1 Neom Neom + CT-1
0
1
2
3
4
Control + CT-1 + ERK inh ERKinh + CT-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Control CT-1 ERK + G ERK + G + CT
0
1
2
3
4
5
6
7
Control CT-1 Neo + G Neo + G + CT
0
1
2
3
4
Control CT-1 Nif 0.01 Nif 0.01 + CT Nif 0.1 Nif 0.1 + CT Nif 5 Nif 5 + CT
- Glucosa + Glucosa
Incr
emen
to se
crec
ión
insu
lina
Incr
emen
to in
sulin
a
Control
+ PD98059
+ CT-1 Control + CT-1
Control + CT-1 Control + CT-1
Control + CT-1 + CT-1 + CT-1 + CT-1
Nif [0,01 μM] Nif [0,1 μM] Nif [5 μM]
*
*
*
*
**
*
A
B
C
Control + CT-1
+ PD98059
Control + CT-1
Control + CT-1
Neom
Control + CT-1
Neom
0
1
2
3
4
Control + CT-1 Neom Neom + CT-1
0
1
2
3
4
Control + CT-1 + ERK inh ERKinh + CT-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Control CT-1 ERK + G ERK + G + CT
0
1
2
3
4
5
6
7
Control CT-1 Neo + G Neo + G + CT
0
1
2
3
4
Control CT-1 Nif 0.01 Nif 0.01 + CT Nif 0.1 Nif 0.1 + CT Nif 5 Nif 5 + CT
- Glucosa + Glucosa
Incr
emen
to se
crec
ión
insu
lina
Incr
emen
to in
sulin
a
Control
+ PD98059
+ CT-1 Control + CT-1
Control + CT-1 Control + CT-1
Control + CT-1 + CT-1 + CT-1 + CT-1
Nif [0,01 μM] Nif [0,1 μM] Nif [5 μM]
*
*
*
*
**
*
A
B
C
Control + CT-1
+ PD98059
Control + CT-1
Control + CT-1
Neom
Control + CT-1
Neom
Figura 22. Estudio del efecto de la CT-1 en la línea celular MIN6B1 en presencia de efectores implicados en el mecanismo de secreción de insulina. A. Medida de la secreción de insulina en presencia del inhibidor de ERK PD98059 (10 μM) en combinación con la CT-1 (100 ng/ml) y/o concentraciones estimulatorias de glucosa (16,7 mM). B. Efecto de la Neomicina (10 μM) en combinación con CT-1 (100 ng/ml) en la secreción de insulina en presencia de bajas y altas concentraciones de glucosa. C. Secreción de insulina en presencia de diferentes concentraciones de Nifedipina en combinación con CT-1 (100 ng/ml) y altas concentraciones de glucosa. Los resultados se muestran como media y desviación estándar de 3 experimentos independientes. *: P< 0,05; **: P< 0,01
RESULTADOS. BLOQUE II
93
RESULTADOS BLOQUE II
RESULTADO BLOQUE II
95
Estudio del efecto de la CT-1 in vivo. Utilización de la cepa murina C57BL/6J CT-1-/-
La utilización del ratón transgénico que no expresa el gen que codifica para la
cardiotrofina (CT-1-/-) y el grupo salvaje (WT) de la misma cepa, C57BL/6J, nos ha
permitido estudiar el papel que juega la CT-1 en la protección de los islotes pancreáticos
frente a un daño. Para ello, hemos evaluado el efecto de la toxina STZ en dos modelos
murinos de inducción de diabetes, así como el efecto nocivo de la dieta
hipercolesterolémica; comparando de este modo el efecto de los estímulos dañinos
sobre la glicemia y estado de los islotes en ambos grupos de ratones.
5. Estudio morfológico de los islotes pancreáticos de ratones WT y
CT-1-/- en condiciones normales
Para determinar si las diferencias morfológicas observadas en futuros
experimentos tenían su origen en los estadios iniciales de los islotes pancreáticos
presentes en los ratones WT y CT-1-/- en condiciones normales, realizamos un estudio
histológico de su estado en ambos grupos de ratones (Figura 23). Para ello obtuvimos
muestras de páncreas de ratones WT (n=5) y CT-1-/- (n=5) machos de 6 semanas de
edad con el objeto de determinar la masa de células beta, medida como el área de
insulina por islote y el área total de islotes. Los resultados obtenidos demuestran que la
masa de células beta con respecto a la masa total del islote (representado como % de
área marcada por insulina con respecto al área total del islote) no presentaba diferencias
significativas entre ambos grupos (Figura 23C). Sin embargo, al realizar la
cuantificación del área media total de islote, observamos un tamaño promedio del islote
significativamente mayor (P=0,017) en el caso de los ratones CT-1-/- con respecto al
ratón WT (Figura 23B). Estos datos demuestran que la masa de células beta presente en
islotes de ratones CT-1-/- es mayor que en los islotes WT, sugiriendo que algún
mecanismo de compensación en la producción de insulina podría estar implicado en la
homeostasis de la glicemia en los ratones CT-1-/-, en condiciones normales.
RESULTADO BLOQUE II
96
CT-1 -/-
Ins 40x
40x
WT
Ins
A
C 0
5000
10000
15000
20000
25000
WT (n=5) CT-1 (n=5)
Áre
a (s
lote
(um
2)
*
Áre
a is
lote
(μm
2 )
CT-1-/-WT
40x
CT-1 -/-
Ins %Á
rea
insu
lina/
Islo
te
01020304050607080
WT (n=5) CT-1 -/- (n=5)
% Á
rea
insu
lina
/Islo
te
WT CT-1-/-
%Á
rea
insu
lina/
Islo
te
01020304050607080
WT (n=5) CT-1 -/- (n=5)
% Á
rea
insu
lina
/Islo
te
WT CT-1-/-
n.s.
% Á
rea
insu
lina/
islo
te
B
C
Figura 23. Cuantificación de la masa de células beta en páncreas de ratones WT y CT-1-/-. A. Imagen representativa de los islotes donde puede apreciarse la expresión de insulina puesta de manifiesto utilizando un anticuerpo específico mediante técnicas de inmunohistoquímica. B. Cuantificación del tamaño de los islotes, medido como área total de islote. C. Cuantificación del porcentaje del área de insulina con respecto al área total del islote en ratones WT (n=5) y CT-1-/- (n=5). *: P< 0,05
6. Modelo agudo de inducción de diabetes en ratones WT y CT-1-/-
Uno de los modelos comúnmente utilizado para la inducción de diabetes es el
tratamiento con STZ siguiendo diferentes regímenes de administración. El primero de
los modelos que utilizamos se basa en la administración de una dosis única del tóxico,
que denominamos ‘modelo agudo’. En estudios previos no mostrados determinamos la
dosis efectiva de STZ en ratones WT y CT-1-/-, siendo ésta de 150 mg/kg. Esta dosis es
significativamente inferior a la utilizada por la mayoría de autores (180-200 mg/kg)
[163, 164]. Siguiendo este modelo, administramos una única dosis de STZ (150 mg/kg)
en grupos de ratones WT (n=10) y CT-1-/- (n=10) y procedimos a realizar un
seguimiento diario de los niveles de glucosa en sangre y peso durante 30 días.
Transcurrido este tiempo, sacrificamos los animales para el estudio inmunohistoquímico
de las muestras de páncreas obtenidas.
RESULTADO BLOQUE II
97
6.1 Monitorización de la glicemia y el peso
El valor de la glicemia de los ratones, tomado diariamente entre las 8 y 11 am es
considerado el reflejo del grado de daño que han sufrido los islotes tras la
administración de STZ. Los resultados obtenidos en el modelo agudo aplicado en
ratones WT y CT-1-/- nos indican que, tan solo tres días después de la administración
de STZ, los ratones del grupo CT-1-/- presentan glicemias superiores a 300 mg/dl,
mientras que la mayoría de los ratones del grupo WT no superan este valor (Figura
24A). El porcentaje de ratones que muestran un fenotipo diabético, considerando un
límite en la glicemia superior a 300 mg/dl de glucosa en sangre, fue significativamente
mayor en el grupo CT-1-/- (Figura 24B). En este grupo, un 90% de los ratones
mostraron niveles de glucosa por encima de 300 mg/dl trascurridos 30 días desde la
administración de STZ, mientras que en el grupo WT solo un 30% desarrollaron
hiperglicemia.
Estos datos demuestran que los ratones CT-1-/- presentan una mayor
predisposición al daño frente a STZ en comparación con los ratones WT, sugiriendo la
posible alteración de los mecanismos de protección frente a la destrucción de las células
beta en ausencia de CT-1.
La determinación del peso de los ratones al inicio del estudio nos demuestra que
los ratones del grupo CT-1-/- presentan un peso significativamente superior (P<0,05) al
grupo WT (Figura 24C) durante los primeros 3 días tras la administración de la STZ. La
medida del peso durante los 30 días que duró el estudio nos muestra una clara tendencia
a la ganancia de peso en ambos grupos, siendo el peso medio de los ratones CT-1-/-
siempre mayor respecto a los ratones WT.
RESULTADO BLOQUE II
98
182022242628303234
0 5 10 15 20 25 30 35Días
Peso
(g)
WTCT-1-/-
B
C
0100200300400500600700
0 5 10 15 20 25 30 35
Días
Glu
cosa
(m
g/dl
A
Glu
cosa
(mg/
dl)
*
*** *
30%
90%
70%
10%
0
20
40
60
80
100
120
WT (n=10) CT-1-/- (n=10)
% ra
tone
s di
abét
icos
< 300 mg/dl Glc> 300 mg/dl Glc
% r
aton
es d
iabé
ticos
B
WT CT-1-/-
182022242628303234
0 5 10 15 20 25 30 35Días
Peso
(g)
WTCT-1-/-
B
C
0100200300400500600700
0 5 10 15 20 25 30 35
Días
Glu
cosa
(m
g/dl
A
Glu
cosa
(mg/
dl)
*
*** *
30%
90%
70%
10%
0
20
40
60
80
100
120
WT (n=10) CT-1-/- (n=10)
% ra
tone
s di
abét
icos
< 300 mg/dl Glc> 300 mg/dl Glc
% r
aton
es d
iabé
ticos
B
WT CT-1-/-
Figura 24. Medida de glicemia y peso en el modelo agudo de diabetes inducida por STZ. A. Promedio de los niveles de glucosa en sangre (mg/dl) medidos a diario tras la administración de STZ (día 0) en dosis única (150 mg/kg) en ratones WT (n=10) y CT-1-/- (n=10). B. Porcentaje de ratones diabéticos en cada grupo considerando glicemias superiores a 300 mg/dl. C. Monitorización del peso de los ratones WT y CT-1-/- tras la administración con STZ en dosis única. *: P< 0,05; **: P< 0,01
RESULTADO BLOQUE II
99
6.2 Análisis inmunohistoquímico
La STZ es un tóxico que es captado por el receptor de glucosa. Puesto que la
secreción de insulina por parte de la célula beta es dependiente de receptores de glucosa
(GLUT-2), ésta constituye la célula diana principal de la STZ. Por tanto, las alteraciones
en los niveles de glucosa en sangre pueden ser debidas a una menor proporción de
células beta dentro de los islotes como consecuencia del daño inducido por la STZ en
los ratones que desarrollan diabetes.
Para comprobar el efecto de la STZ sobre la masa de células beta en los islotes,
detectamos la presencia de células beta que expresan insulina mediante el uso de un
anticuerpo específico mediante técnicas de inmunohistoquímica. Posteriormente
cuantificamos este área con respecto al área total de islotes. En condiciones normales la
masa de célula beta suele representar el 60-80% del islote (Figura 23, grupo WT). Los
resultados obtenidos demuestran que, tras la administración de STZ, el área del islote en
el grupo CT-1-/- se ve significativamente reducida respecto al grupo WT (Figura 25B,
P=0,0304). En cuanto a la cuantificación del área de insulina con respecto al área total
del islote, también observamos una reducción significativa en el grupo CT-1-/- respecto
al grupo WT (Figura 25C, P=0,0171). Estos datos sugieren que las diferencias en
glicemias observadas entre los grupos CT-1-/- y WT (Figura 24) pueden tener su origen
en una mayor disminución de la masa de células beta presente en los islotes de los
ratones CT-1-/- respecto a los ratones WT tras la administración de STZ. Los resultados
obtenidos respecto al tamaño del área del islotes y cuantificación de masa de célula beta
en ratones WT y CT-1-/- sanos previo a la inducción de daño con STZ demuestran que
el área total de cada islote en condiciones normales es mayor en ratones CT-1-/- con
respecto al valor del área en los ratones WT (Figura 23; tamaño del islote un 33%
mayor). Sin embargo, tras la administración del tóxico, tiene lugar una notable
reducción del área de islote que es significativamente mayor en los ratones CT-1-/-
(1936 μm2 vs. 9214 μm2; 78,98% de reducción del área del islote) frente a la reducción
de área observada en los ratones WT (2477 μm2 vs. 6905 μm2; 64,41%). Del mismo
modo, el porcentaje de masa de célula beta presente por islote se encuentra reducido en
un 64,8% en los ratones CT-1-/- tratados con STZ, con respecto a ratones CT-1-/- sanos,
mientras que, en el caso de los ratones WT, está reducción resulta ser menor (50,35%).
En resumen, estos resultados (porcentaje de masa de célula beta y promedio del área de
islote) muestran una mayor disminución de la masa de células beta en los islotes de
RESULTADO BLOQUE II
100
ratones CT-1-/- tras el daño producido por STZ, dato que correlaciona con el mayor
grado de hiperglicemia presentado por éstos (Figura 24A, B).
05
101520253035404550
WT CT-1
WT (n=9) CT-1 -/- (n=8)Ins
40xIns
40x
WT
CT-1 -/-Groups
A
C0
500100015002000250030003500400045005000
WT (n=9) CT 1 / (n=8)Á
rea
Islo
te (u
m2)
*
WT CT-1-/-
% Á
rea
insu
lina/
islo
te
B
*Á
rea
islo
te (μ
m2 )
C
05
101520253035404550
WT CT-1
WT (n=9) CT-1 -/- (n=8)Ins
40xIns
40x
WT
CT-1 -/-Groups
A
C0
500100015002000250030003500400045005000
WT (n=9) CT 1 / (n=8)Á
rea
Islo
te (u
m2)
*
WT CT-1-/-
% Á
rea
insu
lina/
islo
te
B
*Á
rea
islo
te (μ
m2 )
C
Figura 25. Análisis de los islotes presentes en páncreas de los ratones WT (n=10) y CT-1-/- (n=10) tras ser sometidos a daño con una dosis única de STZ (150 mg/kg). A. Imágenes representativas de islotes donde se detecta la presencia de insulina mediante el uso de un anticuerpo específico. B. Promedio de área de islote C. Porcentaje de masa de célula beta (área de insulina respecto al área de islote). *: P<0,05
7. Modelo crónico de diabetes en ratones WT y CT-1-/-
En segundo lugar utilizamos un modelo de daño crónico mediante el uso de la
STZ. Siguiendo este modelo, administramos en días consecutivos dosis bajas de STZ
(50 mg/kg, 4 días) en grupos de ratones C57BL/6 WT (n=10) y CT-1-/- (n=10). Este
modelo animal presenta un daño más progresivo en los islotes a lo largo del tiempo,
mostrando la activación de mecanismos de inflamación propios de la DM1 [91]. Del
mismo modo que en el estudio anterior, monitorizamos diariamente los niveles de
glucosa en sangre y peso durante 30 días. Transcurrido este tiempo realizamos el
sacrificio de los animales para estudios inmunohistoquímicos de las muestras de
páncreas.
RESULTADO BLOQUE II
101
7.1 Monitorización de la glicemia y el peso
La monitorización de la glicemia (Figura 26A) nos indicó que el daño producido
por la STZ fue más atenuado en comparación con el modelo agudo (Figura 24). Estos
resultados se reflejan en la adquisición de hiperglicemia siendo más moderada en el
tiempo (Figura 26A). Los valores superiores a 300 mg/dl de glucosa en sangre se
alcanzan transcurrida una semana tras la administración de STZ y de manera más
acusada en el caso de los ratones CT-1-/-. Observamos que el 90% de los ratones CT-1-
/- adquieren una claro fenotipo diabético, mientras que en el grupo WT sólo el 44% de
los ratones alcanza niveles de glucosa por encima de 300 mg/dl (Figura 26B), de igual
manera que ocurre con los resultados obtenidos en el modelo agudo (Figura 24B).
En cuanto a la determinación del peso de los ratones al inicio del estudio, éste
nos demuestra que los ratones del grupo CT-1-/- presentan un peso significativamente
superior en el inicio del estudio (P<0,05) respecto al grupo WT (Figura 26C). Al igual
que en el estudio del modelo agudo (Figura 24C), la medida del peso durante los 30 días
que duró el estudio nos muestra una clara tendencia a la ganancia de peso en ambos
grupos, siendo el peso medio de los ratones CT-1-/- siempre mayor respecto a los
ratones WT.
RESULTADO BLOQUE II
102
0100200300400500600700
0 5 10 15 20 25 30 35
días
Glu
cosa
(mg/
dl
20
22
24
26
28
30
32
0 5 10 15 20 25 30 35Días
Peso
(g)
WT (n=9)CT-1 (n=11)
Glu
cosa
(mg/
dl)
*
A
91%
44%
9%
56%
0
20
40
60
80
100
120
WT (n=9) CT-1-/- (n=11)
% ra
tone
s di
abét
icos
<300 mg/dl Glc>300 mg/dl Glc
% R
aton
es d
iabé
ticos
WT CT-1-/-
DíasB
C
* *
Figura 26. Medida de glicemia y peso en el modelo crónico de diabetes inducida por STZ. A. Promedio de los niveles de glucosa en sangre (mg/dl) medidos a diario tras la administración de STZ en dosis repetidas de 50 mg/kg durante 4 días en ratones WT (n=10) y CT-1-/- (n=10). B. Porcentaje de ratones diabéticos en cada grupo considerando glicemias superiores a 300 mg/dl. C. Monitorización del peso de los ratones WT y CT-1 /- tras la administración con STZ en dosis repetidas. *: P< 0,05
RESULTADO BLOQUE II
103
7.2 Análisis inmunohistoquímico
Del mismo modo que en el anterior estudio, realizamos el estudio
inmunohistoquímico de los cortes histológicos de los páncreas de los ratones del
estudio, determinando la presencia de insulina. La cuantificación del promedio del área
del islote, así como del porcentaje de área de insulina con respecto al área total de islote
nos indican que hay una gran pérdida tanto de área de islote como de masa de célula
beta en ambos grupos.
Ins 40x
WT
40xIns
CT-1-/-
Gráfica Área insulina
0500
100015002000250030003500400045005000
WT (n=9) CT-1-/- (n=11)
Áre
a Is
lote
(um
2)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
WT (n=9) CT-1-/- (n=11)
%m
asa
célu
la b
eta/
islot
eA B
WT CT-1-/-
Áre
a is
lote
(μm
2 )
***
***
% Á
rea
insu
lina/
islo
te
CIns 40x
WT
40xIns
CT-1-/-
Gráfica Área insulina
0500
100015002000250030003500400045005000
WT (n=9) CT-1-/- (n=11)
Áre
a Is
lote
(um
2)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
WT (n=9) CT-1-/- (n=11)
%m
asa
célu
la b
eta/
islot
eA B
WT CT-1-/-
Áre
a is
lote
(μm
2 )
***
***
% Á
rea
insu
lina/
islo
te
C
Figura 27. Análisis de los islotes presentes en páncreas de los ratones WT (n=10) y CT-1-/- (n=10) tras ser sometidos a daño mediante administración repetida de dosis bajas de STZ. A. Imágenes representativas de islotes de ratón CT-1-/- y WT donde se detecta la presencia de insulina mediante el uso de una anticuerpo específico. B. Porcentaje de masa de célula beta (área de insulina respecto al área de islote). C. Promedio del área de islote presente de ratones CT-1-/- y WT. ***: P<0,001
RESULTADO BLOQUE II
104
Sin embargo, la disminución del área promedio del islote resultó ser
significativamente mayor en el grupo CT-1-/- (Figura 27B, P<0,001). En cuanto a la
cuantificación del área de insulina con respecto al área total de islote, también
observamos una reducción muy significativa de la masa de célula beta en el grupo CT-
1-/- con respecto al grupo WT (Figura 27B, P<0,001).
Estos datos sugieren que el modelo crónico también produce un daño sobre los
islotes que se traduce en una disminución de la masa de células beta y, por tanto, un
aumento de las glicemias que es notablemente mayor en los ratones CT-1-/-, lo que de
nuevo corrobora la mayor sensibilidad de sus islotes pancreáticos a la STZ.
8. Análisis de la glicemia en ratones WT y CT-1-/- sometidos a dieta
hipercolesterolémica
Los estudios de inducción de diabetes mediante la administración de una toxina
que daña directamente los islotes, como es el caso de la STZ [150], nos indica que la
presencia de CT-1 puede ejercer algún tipo de efecto protector in vivo, ya que
observamos claras diferencias en la predisposición de la adquisición de la diabetes entre
ratones CT-1-/- y WT.
Nos planteamos utilizar otro tipo de factores que no solo ejercen un efecto
dañino directo sobre los propios islotes, sino que también afectan al metabolismo
general de la glucosa en el islote, así como en el mecanismo de regulación de la
respuesta a insulina en tejidos periféricos. La presencia en la dieta de un alto contenido
en colesterol y grasas está descrito como un factor principal en el desarrollo de la DM2
ya que participa en la alteración de la regulación en la secreción de la insulina y puede
ejercer un efecto citotóxico sobre las células beta [152, 165].
Por tanto, sometimos a los dos grupos de ratones, CT-1-/- y WT, a una dieta rica
en grasas y colesterol durante 37 semanas, periodo durante el cual realizamos un
seguimiento semanal del peso y glicemia. Además, de manera mensual, realizamos un
control de la regulación del metabolismo de la glucosa en sangre mediante el test de
tolerancia a glucosa.
RESULTADO BLOQUE II
105
8.1 Monitorización de la glicemia y el peso
Ratones WT (n=9) y CT-1-/- (n=9) fueron sometidos a la dieta
hipercolesterolémica a partir de su destete (3 semanas de edad), junto con dos grupos
control WT y CT-1-/- llevados en paralelo que fueron sometidos a dieta normal (n=4).
Los 4 grupos experimentales fueron monitorizados mediante la medida de su peso y
glicemia de forma semanal durante un año. En el estudio de la glicemia, los grupos
sometidos a dieta presentaron valores normoglicémicos, aunque observamos una
tendencia inicial en los ratones CT-1-/- a presentar glicemias ligeramente superiores
entre las semanas 6 y 20 de edad, aunque no llegaron a ser significativas. En tiempos
posteriores, ambos grupos mostraron valores similares (Figura 28A).
En cuanto a los registros del peso, observamos un aumento de la masa corporal
en ambos grupos con la edad. Sin embargo, este incremento de peso fue
significativamente mayor en el grupo CT-1-/- sometido a dieta hipercolesterolémica
(Figura 28B).
Transcurridas 37 semanas, realizamos el sacrificio de los animales para el
estudio inmunohistoquímico. Los resultados de marcaje con un anticuerpo específico
para la detección de insulina en los islotes no nos indicaron ninguna diferencia en
cuanto a la masa de células beta, ni el tamaño de los islotes entre ambos grupos (datos
no mostrados).
RESULTADO BLOQUE II
106
WT
CT-1-/-
Ins
Ins
40X
40X
Glic
emia
(mg/
dl)
A
B
C
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
WTCT-1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
WTCT-1Pe
so (g
)
Semanas
05
1015202530354045
3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 35 37 39
WTCT-1
Glicemia control
**
Figura 28. Monitorización de glicemia y peso en el modelo de dieta hipercolesterolémica en ratones WT y CT-1-/-. Promedio de los niveles de glucosa en sangre (mg/dl) (A) y peso (B) medidos semanalmente en ratones WT (n=9) y CT-1-/- (n=9). C. Imágenes representativas de los islotes marcados mediante el uso de un anticuerpo específico para la detección de insulina. **: P< 0,01
8.2 Test de tolerancia a la glucosa
Todos los grupos experimentales, incluyendo los respectivos grupos controles
con dieta normal, fueron sometidos a un test de tolerancia a glucosa mensualmente.
Con este experimento nuestro objetivo era medir la capacidad que tiene el
organismo para controlar la glicemia. El test consiste en determinar el perfil de la curva
de glucosa en sangre con el paso del tiempo tras la administración intraperitonal de
glucosa (3 g/kg) hasta su reversión a niveles normales. De este modo es posible analizar
la evolución de la capacidad reguladora de la insulina para la captación de la glucosa
por los tejidos periféricos (músculo esquelético, tejido adiposo e hígado) y si de algún
modo esta función se encuentra alterada con la ausencia de CT-1 en los ratones CT-1-/-.
Los resultados obtenidos nos indicaron que el perfil de glicemias difiere entre
los grupos de ratones CT-1-/- y WT, cuando son sometidos a dieta normal (Figura 29B).
RESULTADO BLOQUE II
107
En concreto, el máximo valor de glucosa en sangre para los ratones CT-1 se encuentra
retrasado unos 10 minutos con respecto a la curva detectada en los ratones WT.
Además, se observa cierta tendencia a que la normoglicemia tras el estímulo se recupere
más lentamente en los ratones CT-1-/- (Figura 29B). Por otra parte, en los grupos de
animales sometidos a la dieta hipercolesterolémica, las curvas de ratones CT-1-/- y WT
presentan unos perfiles similares; sin embargo, cuando comparamos con los grupos
sometidos a dieta normal, el grupo WT difiere considerablemente, mientras que el grupo
CT-1-/- muestra un perfil similar (Figura 29B).
Estos datos sugieren que la dieta hipercolesterolémica mantenida durante largo
tiempo es un factor que promueve alteraciones en el control de la glicemia, de modo que
la reversión de los niveles de glucosa en sangre se ve atrasada en el tiempo y la
recuperación de los niveles basales está también ralentizada. Este perfil ya es patente en
los ratones CT-1-/-, lo que nos indica el posible papel de la CT-1 en la correcta
regulación del metabolismo de la glucosa en sangre.
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (minutos)
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl WT
CT-1-/-
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (minutos)
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
WTCT-1-/-
120’Tiempo (minutos)
Determinación glicemia
cada 5’
Determinación glicemia
cada 15’45’0’
Administración de
glucosa
A
Dieta normal Dieta hipercolesterolémica
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
)
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
)
B
Tiempo (minutos) Tiempo (minutos)
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (minutos)
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl WT
CT-1-/-
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (minutos)
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
WTCT-1-/-
120’Tiempo (minutos)
Determinación glicemia
cada 5’
Determinación glicemia
cada 15’45’0’
Administración de
glucosa
A
Dieta normal Dieta hipercolesterolémica
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
)
Glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
)
B
Tiempo (minutos) Tiempo (minutos) Figura 29. Test de tolerancia a glucosa (TTG) en ratones WT y CT-1-/- sometidos a dieta normal e hipercolesterolémica. A. Esquema del procedimiento de toma de muestras para la medición de la glicemia tras la administración de glucosa (i.p., 3 g/kg) para el TTG. B. Perfil de absorción de glucosa en el tiempo durante el TTG en ratones WT y CT-1-/- (n=4) sometidos a dieta normal y ratones WT y CT-1-/- (n=4) sometidos a dieta hipercolesterolémica.
RESULTADO BLOQUE II
108
Además, obtuvimos muestras de sangre de los 4 grupos experimentales, con el
objeto de determinar los niveles de insulina en sangre, tanto en condiciones de ayuno
(tiempo 0) como transcurridos 10 minutos tras la administración intraperitoneal de
glucosa (3 g/kg). Observamos que, en el caso del tratamiento con dieta normal, los
ratones WT presentan un incremento de la secreción de insulina tras el estímulo con
glucosa significativamente mayor que los ratones CT-1-/- (Figura 30A). Sin embargo,
los valores de incremento de secreción se igualan cuando ambos grupos son sometidos a
dieta hipercolesterolémica (Figura 30A).
Está descrito que el perfil de secreción de insulina sigue una curva bifásica con
un primer pico de secreción que prosigue con una segunda fase de secreción mantenida;
sin embargo, en caso de enfermedad, especialmente DM2, esta primera respuesta se
pierde [166]. Por tanto, realizamos la medida del incremento de insulina en sangre a
diferentes tiempos para determinar este perfil en ambos grupos experimentales,
observando la pérdida de la respuesta bifásica en el caso de los ratones CT-1-/- (Figura
30B).
RESULTADO BLOQUE II
109
0
1
2
3
4
5
5' 10' 15' 35'0
1
2
3
4
5
5' 10' 15' 35'
WT CT-1-/-
0
1
2
3
4
5
WT CT-1KO
Incr
emen
to in
sulin
a
CONTROL DIETA HIPERCOLESTEROLÉMICA
0
1
2
3
4
5
w t ct-1 ko
Incr
emen
to in
sulin
a
* n.s.
WT WT CT-1 -/-CT-1 -/-
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
B
10’Tiempo (min)
Determinación glicemia
Determinación glicemia
0’
Administración de GlucosaA
35’Tiempo (min)
0’
Administración de Glucosa
15’5’ 10’
0
1
2
3
4
5
5' 10' 15' 35'0
1
2
3
4
5
5' 10' 15' 35'
WT CT-1-/-
0
1
2
3
4
5
WT CT-1KO
Incr
emen
to in
sulin
a
CONTROL DIETA HIPERCOLESTEROLÉMICA
0
1
2
3
4
5
w t ct-1 ko
Incr
emen
to in
sulin
a
* n.s.
WT WT CT-1 -/-CT-1 -/-
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
Incr
emen
to d
e se
crec
ión
insu
lina
B
10’Tiempo (min)
Determinación glicemia
Determinación glicemia
0’
Administración de GlucosaA
35’Tiempo (min)
0’
Administración de Glucosa
15’5’ 10’
Figura 30. Determinación de los niveles de insulina en ratones CT-1-/- y WT. A. Incremento de la secreción de insulina en sangre tras 10 minutos de administración de glucosa (i.p., 3 g/kg) en ratones WT (n=4) y CT-1-/- (n=4) sometidos a dieta normal (panel izquierdo) y dieta hipercolesterolémica (panel derecho). B. Perfil de secreción de insulina tras administración de glucosa (i.p., 3 g/kg) en ratones WT (n=4) y CT-1-/- (n=4) a diferentes tiempos (5, 15 y 35 minutos). *: P< 0,05
9. Tratamiento sistémico con CT-1 en ratones diabéticos WT y CT-1-/-
por inducción con STZ
Los estudios de inducción de diabetes mediante la administración de STZ en los
dos modelos estudiados, agudo y crónico, nos indican que la presencia de CT-1 ejerce
un efecto protector sobre los islotes, ya que los ratones CT-1-/- presentan una
sensibilidad al daño por STZ significativamente mayor (ver Resultados Bloque II,
secciones 6 y 7, páginas 97-103). Por otra parte, los TTG nos muestran un perfil de
absorción de glucosa alterado en los ratones modificados genéticamente carentes del
RESULTADO BLOQUE II
110
gen de la CT-1. La curva de glicemia de estos ratones presenta unas características
similares al perfil obtenido en los estudios realizados en los grupos de ratones WT y
CT-1-/- sometidos a dieta hipercolesterolémica, otro factor determinante del desarrollo
de DM2. Estos datos nos indican que la ausencia de CT-1 podría predisponer a la
pérdida de masa de célula beta ante un daño, y ser un factor limitante en función
reguladora que ejerce la insulina.
A la vista de estos resultados, quisimos estudiar cuál sería el efecto del
tratamiento con CT-1 en forma de proteína recombinante en ratones sometidos a un
daño por STZ según el modelo agudo para la inducción de diabetes. El papel protector
de la CT-1 ha sido descrito en otros tejidos. Estudios anteriores demostraron que la
administración de CT-1, mediante el uso de un vestor viral, ejerce un efecto beneficioso
en los hepatocitos de ratas sometidas a hepatectomía y ratones tratados con
concanavalina A, un inductor de hepatitis [134].
El diseño del experimento pretende determinar un posible efecto preventivo de
la CT-1, al ser administrada previo al daño con STZ, y a su vez un posible efecto
regenerativo en los islotes ya que el tratamiento se prolongó tras la administración de
STZ. Para ello sometimos a todos los grupos experimentales a la administración de STZ
en dosis única (150 mg/kg) según modelo agudo (ver Material y Métodos, sección 9.1,
página 68); dos de los cuatro grupos experimentales, ratones WT (n=8) y CT-1-/- (n=7),
fueron tratados con CT-1 (i.p., 500 μg/kg) 24 horas antes del daño con STZ.
Posteriormente se administró diariamente CT-1 (i.p., 500 μg/kg) durante 16 días. Como
grupos control se utilizaron ratones WT (n=7) y CT-1-/- (n=6) a los que se administró
PBS (Tabla 10). Los animales fueron monitorizados durante durante 35 días, tras los
cuales se realizó el sacrificio para la obtención de muestras del páncreas y su posterior
estudio histológico.
Tabla 10. Distribución grupos experimentales para tratamiento sistémico con CT-1
PBS (n= 7) Ratones
C57 WT CT-1 (ip, 500 μg/kg) (n=8)
PBS (n=6)
MODELO AGUDO
(STZ, 150 mg/kg))
Ratones
C57 CT-1-/- CT-1 (ip, 500 μg/kg) (n=7)
RESULTADO BLOQUE II
111
9.1 Monitorización de la glicemia y estado de los islotes
El seguimiento de los 4 grupos experimentales durante 35 días nos indicó que la
administración diaria de CT-1 de forma intraperitoneal a la dosis de 500 μg/kg, no
parece ejercer efecto beneficioso alguno sobre el daño producido por la STZ en el
modelo agudo en ratones CT-1-/-.
Atendiendo a los niveles de glucosa en sangre, en el grupo WT tratado con PBS,
el 57% de los ratones presentaron niveles de glucosa por encima de 300 mg/dl, frente al
37,5% de los ratones WT tratados con CT-1 (Figura 31B). Estos datos sugieren que el
tratamiento de ratones WT con CT-1 podría prevenir el desarrollo de diabetes. Sin
embargo, es necesario profundizar en este estudio para poder determinar si los efectos
observados serían extensibles a un número mayor de animales.
En cuanto al grupo CT-1-/-, al igual que en los experimentos de inducción
anteriores, su predisposición a la hiperglicemia es significativamente mayor que en el
grupo WT (un 83,3% de ratones diabéticos CT-1-/- frente a 57% de ratones WT,
tratados con PBS). En contra de los esperado, el tratamiento con CT-1 aumentó el
porcentaje de ratones con niveles de glucosa por encima de 300 mg/dl, de manera que
todos los animales incluidos en este grupo desarrollaron diabetes (Figura 31B).
Tras el sacrificio de los animales, se obtuvieron muestras de páncreas y otros
tejidos donde se realizó el análisis del estado de los islotes mediante la detección de
insulina por técnicas inmunohistoquímicas. Observamos que la pérdida de masa de
célula beta fue significativamente mayor en los ratones CT-1-/- (Figura 28C) respecto a
los ratones WT, tanto si habían recibido o no el tratamiento con CT-1. Estas
observaciones concuerdan con las glicemias presentadas por cada grupo experimental,
demostrando que la hiperglicemia presentada por los ratones CT-1-/- era originada por
una mayor pérdida de masa de célula beta en el islote.
Estos datos confirman las observaciones realizadas en el modelo agudo (ver
Resultados Bloque II, sección 6, página 96) donde se pone en manifiesto la mayor
sensibilidad de los ratones CT-1-/- al daño por STZ. Por otra parte, los resultados
indican que la CT-1 administrada de forma sistémica no parece tener un papel protector
frente al daño por STZ, ya que ni la glicemia, ni el estado histológico de los islotes en
los ratones tratados con la citoquina presentan una mejoría respecto a los controles
tratados con PBS, e incluso en el caso del grupo experimental CT-1-/-, la administración
RESULTADO BLOQUE II
112
de CT-1 parece tener un efecto deletéreo, al menos como tratamiento sistémico en la
dosis descrita.
Ins
C
40x Ins 40x
40x 40x
5737,5
83,3100
4362,5
16,70
0
20
40
60
80
100
120
No CT CT No CT CT
grupo WT grupo CT-1 KO
% R
aton
es D
iabé
ticos
<300 mg/dl>300 mg/dl
B
% R
aton
es D
iabé
ticos
CT-1
(500 μg/kgdía)
CT-1
(500 μg/kgdía)
Φ Φ
CT-1
Tratamiento previo 24h
STZ dosis única (150 mg/kg)
Administración diaria CT1 (500 μg/kg)
No administración CT-1 Sacrificio
A
Ratones CT-1-/-
CT-
1 (1
00 μ
g/kg
)PB
S
CT-1
(500 mg/kg día)
CT-1
(500 mg/kg día)
Ratones WT
CT-1
(500 mg/kg día)
Ins Ins
Ins
C
40x Ins 40x
40x 40x
5737,5
83,3100
4362,5
16,70
0
20
40
60
80
100
120
No CT CT No CT CT
grupo WT grupo CT-1 KO
% R
aton
es D
iabé
ticos
<300 mg/dl>300 mg/dl
B
% R
aton
es D
iabé
ticos
CT-1
(500 μg/kgdía)
CT-1
(500 μg/kgdía)
Φ Φ
CT-1
Tratamiento previo 24h
STZ dosis única (150 mg/kg)
Administración diaria CT1 (500 μg/kg)
No administración CT-1 Sacrificio
A
B
% R
aton
es D
iabé
ticos
CT-1
(500 μg/kgdía)
CT-1
(500 μg/kgdía)
Φ Φ
CT-1
Tratamiento previo 24h
STZ dosis única (150 mg/kg)
Administración diaria CT1 (500 μg/kg)
No administración CT-1 Sacrificio CT-1
Tratamiento previo 24h
STZ dosis única (150 mg/kg)
Administración diaria CT1 (500 μg/kg)
No administración CT-1 Sacrificio
A
Ratones CT-1-/-
CT-
1 (1
00 μ
g/kg
)PB
S
CT-1
(500 mg/kg día)
CT-1
(500 mg/kg día)
Ratones WT
CT-1
(500 mg/kg día)
Ins Ins
Figura 31. Análisis de la glicemia y estudio histológico de los islotes presentes en ratones WT y CT-1-/- sometidos a tratamiento sistémico con CT-1 (500 μg/kg) o PBS. A. Esquema del diseño experimental. B. Porcentaje de ratones diabéticos en cada grupo considerando glicemias superiores a 300 mg/dl. C. Imágenes representativas de islotes de Langerhans en cortes histológicos de páncreas obtenidos de muestras de cada uno de los grupos experimentales, marcados mediante un anticuerpo específico para la detección de insulina.
RESULTADO BLOQUE II
113
9.2 Monitorización del peso de los ratones
Con respecto al peso de los ratones, es muy destacable el efecto anoréxico que
parece presentar la CT-1 al ser administrada tanto en ratones WT como CT-1-/-. Los
datos demuestran una clara disminución del peso durante los quince días en los que se
administró CT-1 (Figura 32). Este efecto resultó ser reversible, observándose una
recuperación del peso al dejar de administrar CT-1.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35Días
Peso
(g)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35
Días
Peso
(g)
Grupo WT
PBS
CT-1 (500μg/kg, i.p.)+ CT-1 - CT-1
+ CT-1 - CT-1
Días
Días
**** **
***** ** * * n.s.
Grupo CT-1-/-
PBS
CT-1 (500μg/kg, i.p.)0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35Días
Peso
(g)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35
Días
Peso
(g)
Grupo WT
PBS
CT-1 (500μg/kg, i.p.)+ CT-1 - CT-1
+ CT-1 - CT-1
Días
Días
**** **
***** ** * * n.s.
Grupo CT-1-/-
PBS
CT-1 (500μg/kg, i.p.)
Figura 32. Monitorización del peso en los ratones WT (panel superior) y CT-1-/- (panel inferior) sometidos a tratamiento sistémico con CT-1 (500 μg/kg) o PBS durante 35 días. Transcurridos 16 días desde la inducción de diabetes con STZ se retiró el tratamiento con CT-1.*: P<0,05; **: P<0,01; ***: P<0,005
RESULTADO BLOQUE II
114
10. Análisis de los mecanismos de regeneración in vivo tras inducción de
diabetes
A la vista de los resultados obtenidos en los experimentos de inducción de
diabetes por administración de STZ, observamos que, tanto en el modelo crónico como
en el agudo (ver Resultados Bloque II, secciones 6 y 7, páginas 96-103), los ratones CT-
1-/- muestran un mayor daño en comparación con los ratones WT. Los datos sobre
glicemias y los estudios inmunohistoquímicos y morfológicos realizados indican una
mayor sensibilidad al daño en los islotes de ratones CT-1-/-. El estudio en profundidad
de este fenómeno nos permitirá dilucidar los mecanismos implicados en la protección o
posible regeneración de los islotes en este modelo experimental. Para ello, nos
planteamos analizar los fenómenos de regeneración que se desarrollan en el páncreas de
ratones CT-1-/- y WT, mediante la inducción de diabetes con STZ en un modelo agudo.
Está descrito que la inducción de un daño en los islotes puede activar mecanismos de
regeneración que compensen la pérdida de masa de células beta en el páncreas, y el uso
de tóxicos específicos como STZ o Alloxan, es uno de los modelos más utilizados
[114]. En los últimos años se han realizado numerosos estudios sobre las posibles
fuentes de nuevas células beta generadas tras un daño, y actualmente una de las
hipótesis más aceptadas postula que la mayoría de las células de nueva formación
provienen de células beta preexistentes [56].
En nuestro modelo experimental realizamos la inducción de diabetes mediante la
administración de una dosis única de STZ (150 mg/kg) en grupos de ratones C57BL/6
WT (n=6) y CT-1-/- (n=7). Monitorizamos los niveles de glucosa y peso hasta ver la
consecución del fenotipo diabético caracterizado mediante la presencia de hiperglicemia
superior a 300 mg/dl (4 días), momento en el que se realizó el sacrificio de los animales
para el estudio inmunohistoquímico, que nos permitió analizar el estado funcional de los
islotes y la presencia de otros marcadores de célula beta y proliferación.
10.1 Monitorización de la glicemia y del peso
Tras la inducción de diabetes por STZ (150 mg/kg en dosis única), se monitorizó
diariamente la glicemia y peso de los dos grupos experimentales incluidos (Figura 33A).
Al igual que en experimentos anteriores (Figura 24B), casi la totalidad del grupo de
ratones CT-1-/- (85,7%, Figura 33C) mostró glicemias superiores a 300 mg/dl, mientras
RESULTADO BLOQUE II
115
que en el caso de los ratones WT el número de ratones que desarrollaron un fenotipo
diabético transcurridos 4 días tras la administración de STZ fue sólo del 50% (Figura
33C). Estos resultados demuestran de nuevo, la mayor sensibilidad al daño por STZ del
grupo CT-1-/-, siendo patente tan sólo 4 días tras el tratamiento con STZ.
C57 WT vs. C57 CT-1-/-
Día 4
Monitorización glicemia/peso
Sacrificio
C57 WT
0100200300400500600700
0 1 2 3 4 5
Días
Niv
eles
glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
)
#1#2#3#4#5#6
C57 CT-1-/-
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4 5
Días
#1#2#3#4#5#6#7
20
22
24
26
28
30
0 1 2 3 4 5
Días
Peso
Cor
pora
l (gr
)
#1#2#3#4#5#6
20
22
24
26
28
30
0 1 2 3 4 5
Días
#1#2#3#4#5#6#7
50
85,7
50
14,3
0
20
40
60
80
100
120
WT (n=6) CT-1-/- (n=7)
% R
aton
es D
iabé
ticos
< 300 mg/dl Glc
> 300 mg/dl Glc
A
B
C
WT CT-1-/-
Peso
(g)
Administración STZ
% R
aton
es d
iabé
ticos
WT CT-1-/-
Tiempo (días) Tiempo (días)
C57 WT vs. C57 CT-1-/-C57 WT vs. C57 CT-1-/-
Día 4
Monitorización glicemia/peso
Sacrificio
C57 WT
0100200300400500600700
0 1 2 3 4 5
Días
Niv
eles
glu
cosa
en
sang
re (m
g/dl
)
#1#2#3#4#5#6
C57 CT-1-/-
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4 5
Días
#1#2#3#4#5#6#7
20
22
24
26
28
30
0 1 2 3 4 5
Días
Peso
Cor
pora
l (gr
)
#1#2#3#4#5#6
20
22
24
26
28
30
0 1 2 3 4 5
Días
#1#2#3#4#5#6#7
50
85,7
50
14,3
0
20
40
60
80
100
120
WT (n=6) CT-1-/- (n=7)
% R
aton
es D
iabé
ticos
< 300 mg/dl Glc
> 300 mg/dl Glc
A
B
C
WT CT-1-/-
Peso
(g)
Administración STZ
% R
aton
es d
iabé
ticos
WT CT-1-/-
Tiempo (días) Tiempo (días)
Figura 33. Monitorización de glicemia y peso en el modelo agudo de diabetes inducida por STZ para el estudio de la regeneración en ratones WT y CT-1-/-. A. Esquema del diseño experimental. B. Monitorización de la glicemia en ratones WT (n=6) y CT-1-/- (n=7) durante 4 días tras la administración de STZ. C. Porcentaje de ratones diabéticos en cada grupo experimental considerando valores de glucosa en sangre superiores a 300 mg/dl.
RESULTADO BLOQUE II
116
10.2 Análisis inmunohistoquímico: Cuantificación de células que
expresan insulina, PDX1 y Ki67
Tras el sacrificio de los animales se procedió al análisis mediante técnicas
inmunohistoquímicas del estado funcional y proliferativo de los islotes presentes en los
páncreas obtenidos. De este modo, evaluamos la reserva de células beta de los animales
incluidos en cada uno de los grupos experimentales y correlacionamos su estado
funcional con los niveles de glicemia. La expresión de PDX1 en el núcleo es indicativa
de células beta funcionales y también es un factor indicador de su estado de maduración
[167]. Por otro lado, la presencia del marcador Ki67 es un indicador del nivel de
proliferación.
Del mismo modo que en los estudios anteriores (Figura 25), realizamos la
cuantificación del área total de islote en ambos grupos de ratones, así como la
cuantificación del porcentaje de masa de célula beta, mediante la tinción con un
anticuerpo específico para insulina. Los resultados nos indican que, ya en los primeros
días tras la inducción de diabetes mediante la administración de STZ en dosis única, la
pérdida de masa de células beta en los ratones CT-1-/- resulta significativamente mayor
que en los ratones WT (Figura 34C). De manera similar, el tamaño del islote se ve
notablemente disminuido en los ratones CT-1-/- con respecto a la cepa salvaje (Figura
34B). Estos resultados sugieren que, al igual que en modelo agudo a largo plazo (ver
Resultados Bloque II, sección 6, página 96), los ratones CT-1-/- presentan una mayor
sensibilidad al daño inducido por STZ. El daño observado en los islotes, transcurridos
tan sólo 4 días tras la administración de STZ, parece no ser compensado por fenómenos
de regeneración a largo plazo en los ratones CT-1-/-.
RESULTADO BLOQUE II
117
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
WT CT-1-/-
Áre
a Is
lote
s (u
m2)Ins
40x
Ins
CT-1-/-
40x
40xIns
WT
A B
C
Áre
a Is
lote
s (μm
2 )%
Áre
ain
sulin
a/is
lote
***
01020304050607080
WT CT-1-/-
%Á
rea
Insu
lina
/Islo
te%
Áre
a in
sulin
a/is
lote
***0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
WT CT-1-/-
Áre
a Is
lote
s (u
m2)Ins
40x
Ins
CT-1-/-
40x
40xIns
WT
A B
C
Áre
a Is
lote
s (μm
2 )%
Áre
ain
sulin
a/is
lote
***
01020304050607080
WT CT-1-/-
%Á
rea
Insu
lina
/Islo
te%
Áre
a in
sulin
a/is
lote
***
Figura 34. Análisis inmunohistoquímico de los islotes presentes en páncreas de ratones WT y CT-1-/-, tras la administración de una dosis única de STZ (150 mg/kg). A. Imágenes representativas de la tinción histoquímica para insulina mediante el uso de un anticuerpo específico en islotes de ratones WT y CT-1-/-. B. Promedio del porcentaje de masa de célula beta por islote en ratones WT (n=6) y CT-1-/-(n=7). C. Cuantificación del promedio de área de islote en los mismos grupos experimentales. ***: P< 0,001
Además, realizamos la detección de PDX1 y Ki67 para determinar el porcentaje
de núcleos positivos por islote en ambos grupos de ratones. La cuantificación de PDX1
nos indicó que el porcentaje de células positivas para este factor de transcripción fue
significativamente mayor en los ratones WT (Figura 35A) con respecto a los ratones
CT-1-/-, confirmando la mayor pérdida de células beta en este último grupo. Sin
embargo, la cuantificación de Ki67, marcador de proliferación, no mostró ninguna
diferencia significativa entre ambos grupos experimentales (Figura 35B). Este dato
sugiere que no se han iniciado procesos de regeneración endógena tras el daño por STZ,
al menos en los tiempos analizados.
RESULTADO BLOQUE II
118
% C
élul
as P
dx1+
01020304050607080
WT CT-1-/-
% C
élul
as P
dx1
***A
20x
20x
WT CT-1-/-
Pdx1Pdx1 20X 20X
0
1
2
3
4
5
6
WT CT-1-/-
n.s.
B
Ki67 Ki67 20X20X % C
élul
as K
i67+
/islo
te%
Cél
ulas
Pdx
1+/is
lote
WT CT-1-/-
Figura 35. Análisis de la presencia de PDX1 y Ki67 en cortes histológicos de páncreas de ratones WT (n=6) y CT-1-/- (n=7) tras ser sometidos al tratamiento con STZ. A. Cuantificación del porcentaje de células positivas por islote para el factor de transcripción específico de célula beta, PDX1. B. Cuantificación del porcentaje de células positivas por islote para el marcador de proliferación Ki67. ***: P< 0,001
DISCUSIÓN
119
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
121
1. Efecto de las citoquinas en el metabolismo y función de la célula beta
Las citoquinas juegan un papel muy importante en la biología del islote de
Langerhans, tanto en procesos necesarios en condiciones normales como en situaciones
patológicas, tales como la diabetes [168]. Éstas pueden desarrollar múltiples funciones
en un mismo tipo celular haciendo que en muchas ocasiones presenten actividades
opuestas según las condiciones y el modelo de estudio [156]. Las citoquinas que actúan
sobre los islotes son producidas tanto por las propias células beta y alfa del islote, como
por células del ducto, del tejido endotelial y células del sistema inmunitario presentes en
el tejido. En situaciones normales, su presencia resulta beneficiosa para el
mantenimiento de la homeostasis del tejido pancreático, ya que participan en procesos
de reparación, renovación o adaptación a cambios fisiológicos del entorno, mediando
efectos protectores, proliferativos o de mejora de la secreción de insulina [168]; sin
embargo, cuando éstas se producen en el contexto de procesos que generan una
inflamación crónica, tiene lugar una excesiva exposición a dichas citoquinas que puede
dar lugar a efectos deletéreos que se traducen en alteraciones en la secreción de insulina
y que finalmente conducen al desarrollo de diabetes [168, 169]. Este es el caso descrito
para citoquinas como IL-1β e ΙL−6. Diversos estudios in vitro han descrito el papel dual
de la IL-1β en los islotes. Cuando éstos son tratados con esta citoquina en distintas
condiciones de dosis y tiempos, la IL-1β puede inducir efectos beneficiosos en la
función de la célula beta o efectos deletéreos que llevan a la alteración en la regulación
de la secreción de insulina y la inducción de la apoptosis [170-172]. En relación con
este último fenómeno, se ha descrito que la glucolipotoxicidad promueve la producción
de IL-1β que, a su vez, genera un efecto tóxico más pronunciado [160].
Respecto a la IL-6, ésta forma parte de un grupo de citoquinas, entre las que se
encuentra el LIF, el CNTF, la OSM y la CT-1, que comparten componentes del receptor
de membrana, compuesto por homodímeros de GP130 o heterodímeros en combinación
con LIFR. La IL-6 ejerce múltiples funciones en diversos tipos celulares [115]. Sus
propiedades pleiotrópicas le confieren tanto efectos beneficiosos como perjudiciales, y
en el caso de las células beta pancreáticas no son una excepción. Su presencia en sangre
en concentraciones elevadas es un marcador predictivo del desarrollo de DM2 y
obesidad [121]. En cuanto a su efecto en la célula beta pancreática, existen estudios que
demuestran su actividad protectora frente a la apoptosis inducida por citoquinas
DISCUSIÓN
122
proinflamatorias. Este efecto ha sido comprobado tanto en estudios in vitro como en un
modelo in vivo de trasplante de islotes en ratones diabéticos [124, 173].
Paradójicamente, también se han descrito efectos perjudiciales en la secreción de
insulina como consecuencia del tratamiento con IL-6, e incluso un posible papel en el
desarrollo de diabetes [120].
En este contexto, estudiamos el papel de una nueva citoquina, la CT-1, y sus
posibles efectos protectores, teniendo en cuenta que se trata de una proteína de la misma
familia que IL-6. En los estudios realizados en células beta pancreáticas utilizamos las
mismas concentraciones y condiciones que las descritas para IL-6, así como las mismas
fuentes celulares: islotes pancreáticos murinos y un subclon de la línea de insulinoma
MIN6, MIN6B1 [143]. Nuestros resultados in vitro indican que el tratamiento con CT-1
ejerce un claro efecto antiapoptótico a largo plazo, cuando ambas fuentes celulares son
sometidas a deprivación de suero como estímulo proapoptótico. Los resultados fueron
consistentes y corroborados mediante dos técnicas de medición de apoptosis
(determinación de actividad Caspasa 3 y la técnica de TUNEL). Además, quisimos
comparar la eficiencia de este tratamiento con el efecto ya descrito para IL-6 [124].
Nuestros resultados demuestran que la CT-1 ejerce un efecto protector mayor que la IL-
6. Por otra parte, para el análisis del efecto antiapoptótico de la CT-1 utilizamos un
segundo tratamiento proapoptótico: la incubación de células MIN6B1 o islotes murinos
con citoquinas proinflamatorias. Se ha descrito que la inflamación producida por estas
citoquinas está claramente implicada en el desarrollo de diabetes [174]. En este caso,
encontramos resultados discordantes, que pueden ser reflejo de la naturaleza
pleiotrópica de la CT-1 y de la activación de diferentes vías en los diferentes tipos
celulares utilizados. En concreto, observamos una notable protección frente a la
apoptosis en los islotes murinos; sin embargo, en la línea de insulinoma MIN6B1, el
pretratamiento con CT-1, sensibiliza a estas células frente al daño producido por la
exposición a las citoquinas proinflamatorias induciendo niveles mayores de apoptosis.
El estudio de las posibles rutas implicadas y mecanismos activados tras el tratamiento
con CT-1 podría esclarecer el origen de su efecto dual. En este sentido, se ha descrito
que la combinación de IL-6 e IL-1β produce alteraciones en la secreción de insulina
[123]. Sin embargo, el tratamiento con la CT-1 en nuestros experimentos se realizaba de
forma preventiva, previo a la administración de Citomix, la combinación de las
citoquinas proinflamatorias IL-1β, TNFα e IFNγ. Futuros experimentos donde se
combine el tratamiento de CT-1 con las citoquinas proinflamatorias, podrían dilucidar si
DISCUSIÓN
123
la CT-1 en combinación con otras moléculas deletéreas para la célula beta ejercería un
efecto protector o, por el contrario, induciría un efecto nocivo sinérgico, teniendo en
cuenta su ya mencionada naturaleza pleiotrópica.
Además, quisimos profundizar en los mecanismos que se activan en presencia de
la CT-1 y conducen a la protección de las células. Diversos autores han demostrado que
la proteína BCL-xL se encuentra localizada en la mitocondria y ejerce un efecto
antiapoptótico en la célula, bloqueando la liberación de citocromo C al citosol, además
de impedir la activación de PARP [175]. El incremento en su expresión en diversos
tipos celulares es mediado a través de la vía de JAK/STAT3 por las citoquinas de la
familia GP130 [117]. Se ha descrito que el efecto de la IL-6 en el aumento de la
expresión de BCL-xL es un factor clave en la proliferación y supervivencia de células
de mieloma y otras poblaciones celulares [117]. Esta proteína también se vio aumentada
tras el tratamiento de islotes murinos con IL-6 [124]. De manera similar, la presencia de
la proteína BCL-xL se ha detectado en cardiomiocitos incubados con otras citoquinas de
la familia de GP130, tales como LIF [176], así como en el tratamiento con CNTF de
células fotorreceptoras sometidas a estímulos apoptóticos [177].
A la vista de nuestros resultados en los ensayos in vitro y a pesar de las
limitaciones encontradas en estos modelos, el claro efecto protector de la CT-1 sobre la
supervivencia de los islotes indica que podría plantearse su uso en indicaciones
específicas tales como el trasplante de islotes, donde éstos se ven privados de su entorno
fisiológico, lo que induce una elevada muerte celular [178]. En estas situaciones, el
tratamiento de los islotes con CT-1 previo a su trasplante, podría mejorar su
supervivencia en el tejido hospedador.
De forma análoga al resto de citoquinas de la familia de GP130, la CT-1 activa
numerosas vías de señalización en los diversos tejidos donde se han descrito sus efectos.
Así por ejemplo, se han realizado numerosos estudios referentes al papel que juega la
CT-1 en el tejido cardíaco [126, 129, 179]. Estos estudios demuestran que la vía de
activación de las MAP Kinasas, en la que se produce la fosforilación de ERK, está
implicada en procesos de supervivencia [179]; así mismo, la vía de JAK/STAT3
también es diana de la CT-1 en los cardiomiocitos, y está implicada en procesos de
hipertrofia y de remodelado tisular [126, 179]. De igual manera, estas vías se encuentran
activadas tras la inducción de daño en el tejido hepático, estando relacionadas con
procesos antiapoptóticos [134]. Utilizando como tejido diana los islotes de Langerhans
DISCUSIÓN
124
del páncreas, en nuestros estudios pudimos observar que la CT-1 es capaz de activar las
vías de ERK y JAK/STAT en las células beta pancreáticas. Los resultados obtenidos
muestran una rápida activación de los componentes de las vías de ERK y JAK/STAT, al
igual que se había descrito con anterioridad en hepatocitos en cultivo [134]. Estos
resultados indican que la CT-1 interviene en la activación de rutas que pueden dar lugar
a muy diversos e importantes procesos como son la apoptosis, la proliferación, la
adhesión, así como procesos específicos de cada tipo celular, como es el caso de la
secreción de insulina en la célula beta pancreática.
En el presente estudio, quisimos determinar si la CT-1 tenía un efecto directo en
la secreción de insulina in vitro, tanto en presencia como en ausencia de glucosa.
Observamos que nuestra citoquina de estudio es capaz de estimular la secreción de
insulina en células MIN6B1 en ausencia de glucosa, y que además ejerce un efecto
sinérgico en combinación con ésta, de forma similar a como actúan las incretinas [180].
Este efecto resultó no ser dependiente de la dosis de CT-1. Estos datos aportan una
nueva contribución de la CT-1, en comparación con la citoquina de referencia IL-6, la
cual ha demostrado tener diferentes efectos en la secreción de insulina según
condiciones experimentales. Algunos autores han descrito que su efecto sobre la
secreción de insulina es inhibitorio [123] o dependiente de la presencia de otras
citoquinas como IL-1β [181]. Sin embargo, otros autores postulan lo contrario y
demuestran la inducción de la secreción de insulina y el aumento de la transcripción de
su gen en la línea celular HIT-T15 [182]. El estudio más reciente indica un incremento
de la secreción de insulina en la línea MIN6 y en islotes de ratón tratados con la
proteína recombinante IL-6 mediada por la activación de la vía de Fosfolipasa C [183].
Además, este mismo estudio demuestra que la sobreexpresión de IL-6 en hepatocitos de
ratones mediante el uso de un adenovirus que codifica para esta citoquina, mejora la
respuesta a glucosa, e induce una reducción del tejido adiposo. Las discrepancias
obtenidas por los diferentes estudios pueden ser debidas a las condiciones
experimentales, tales como las concentraciones utilizadas de IL-6, el tiempo de
exposición a la citoquina o la fuente celular empleada [184]. Nuestros experimentos en
relación al efecto de la CT-1 en la secreción de insulina fueron realizados íntegramente
en la línea celular MIN6B1, por tanto, un objetivo prioritario en futuros experimentos es
el análisis de la secreción de insulina en islotes pancreáticos murinos. Por otra parte, la
IL-6 es capaz de incrementar los niveles de producción de glucagón por parte de las
células alfa del páncreas, además de inducir su proliferación [185]. Por tanto, un
DISCUSIÓN
125
objetivo futuro de estudio sobre el efecto de la CT-1 sería dilucidar si ésta podría ejercer
algún efecto en la producción de glucagón u otros efectos en el resto de células que
conforman el islote de Langerhans.
La secreción de insulina es un proceso complejo que requiere de la participación
de muchos factores. Una vez que la glucosa es interceptada por los transportadores
GLUT-2 y es metabolizada, los siguientes pasos darán lugar a la liberación de los
gránulos de secreción cargados de moléculas de insulina al torrente sanguíneo y a un
aumento de la transcripción del gen que codifica para esta hormona. En nuestro estudio,
evaluamos el efecto de la CT-1 en la secreción de insulina, haciendo uso de diferentes
inhibidores que intervienen a distintos niveles de este proceso. Así mismo, está descrito
que la vía de ERK, cuya activación tiene lugar por efecto de la CT-1, está implicada en
múltiples funciones de la célula beta [157, 186] y, aunque no hay constancia de un papel
directo en la secreción, sí participa en la vía de señalización que da lugar a la
transcripción del gen de la insulina [157].
Otro de los inhibidores utilizados en el presente estudio, la Nifedipina, actúa a
nivel del transportador de calcio tipo L [187]. Este transportador es clave para que tenga
lugar la entrada de calcio exterior al citoplasma, proceso necesario para el movimiento
de las vesículas de secreción al exterior. Cuando incubamos la línea MIN6B1 con altas
concentraciones de glucosa en presencia de ciertas concentraciones del inhibidor
Nifedipina, el tratamiento con CT-1 es capaz de revertir el efecto inhibitorio de la
Nifedipina en la secreción de insulina. Puesto que la Nifedipina bloquea la entrada de
calcio al interior de la célula, nuestros resultados sugieren que la CT-1, a través de la
activación de vías alternativas, es capaz de revertir el efecto inhibidor de la Nifedipina.
Este fenómeno sobre la estimulación de la secreción de insulina también ha sido
descrito para otras moléculas como las incretinas (GLP-1) [180] y la acetilcolina [188].
En el caso de GLP-1, esta molécula actúa a través de su receptor acoplado a proteina G
en la célula beta, incrementando los niveles de AMPc y la activación de la proteína
quinasa A (PKA) [189], tratándose de un efecto dependiente de glucosa. Sin embargo,
el efecto estimulador de la acetilcolina de la secreción de insulina resulta independiente
de la presencia de glucosa, como es el caso del efecto observado para CT-1. La
acetilcolina actúa a través de su receptor muscarínico, de forma que activa la vía de
Fosfolipasa C [188, 190, 191]. Por esta razón, estudiamos si la secreción de insulina
inducida por CT-1 también podría depender de la activación de una vía dependiente de
DISCUSIÓN
126
Fosfolipasa C. Nuestros estudios demuestran que la secreción de insulina estimulada
por CT-1, tanto en presencia como en ausencia de glucosa, puede ser bloqueada
mediante el uso de Neomicina, un inhibidor de la actividad Fosfolipasa [192]. La
Fosfolipasa C se encuentra anclada en la membrana celular y actúa metabolizando la
hidrólisis de los fosfatidil inositol bifosfato (PIP2), dando lugar a dos segundos
mensajeros importantes en el proceso de secreción de insulina: fosfatidil inositol
trifosfato (PIP3) y diacilglicerol (DAG). El PIP3 estimula la liberación de calcio al
citosol a través del retículo endoplasmático, mientras que el DAG activa la enzima
Fosfoquinasa C (PKC) implicada en la exocitosis de las vesículas de insulina [162].
Nuestros resultados sugieren que la secreción de insulina estimulada por CT-1 podría
estar relacionada con esta vía (Figura 36). Aunque hasta la fecha no hay ningún estudio
que demuestre la activación de la vía de Fosfolipasa C/PIP2 por parte de la CT-1,
existen ensayos realizados con citoquinas de la misma familia, como IL-6, que han
demostrado ser capaces de inducir la activación de Fosfolipasa C en la línea celular de
feocromocitoma de rata PC12 [193]. Así mismo, se ha demostrado la participación de
otras citoquinas de la familia de GP130, tales como el CNTF, en la activación de
Fosfolipasa Cγ en una línea de sarcoma de Ewing [194]. De manera similar a nuestros
resultados, un estudio reciente ha demostrado la inducción de la secreción de insulina en
las células MIN6 en presencia de IL-6, mediada a través de la vía de Fosfolipasa C.
Mediante el uso de inhibidores específicos, Suzuki y colaboradores [183] han
demostrado la implicación del PIP3 sobre su receptor en el retículo endoplasmático,
aunque no de la activación de Fosfoquinasas por parte de la acción de DAG. Futuros
experimentos utilizando inhibidores específicos de cada componente implicado en esta
ruta nos permitirán determinar cual es el papel concreto de la CT-1 en la misma. Por
otra parte, es probable que, de algún modo, la actividad de CT-1 converja en algún
punto de la ruta de activación de la secreción de insulina, teniendo en cuenta que CT-1
es capaz de activar múltiples cascadas de señalización a través de su receptor
LIFR/GP130. Los ensayos con el inhibidor de ERK (PD98059) indican que la
activación de la ruta de las MAP Kinasas es necesaria para la estimulación de la
secreción de insulina por parte de la CT-1 en ausencia de glucosa; sin embargo, no
explica el efecto sinérgico de la CT-1 en presencia de glucosa. Probablemente la
activación de otras vías esté implicada en la secreción de insulina tras el tratamiento con
CT-1 en presencia de glucosa.
DISCUSIÓN
127
Por otra parte, es interesante observar el efecto que tiene el inhibidor PD98059
sobre la secreción de insulina inducida por el tratamiento con glucosa, ya que al inhibir
la fosforilación de ERK, observamos un aumento en la secreción de insulina, que es
independiente del tratamiento con CT-1. Este resultado coincide con lo observado por
otros autores cuando cultivan islotes de rata en presencia de PD98059 e IL-1β [195]. En
cuanto a su efecto en combinación con CT-1, podemos observar que la secreción de
insulina inducida por CT-1 en ausencia de glucosa es dependiente de la vía de ERK. Sin
embargo, no podemos concluir si la vía de ERK está involucrada en el efecto sinérgico
de la CT-1 en la secreción de insulina en presencia de glucosa, puesto que la propia
inhibición de la vía de ERK es capaz de estimular la secreción de insulina a los mismos
niveles que lo hace la CT-1 en presencia de glucosa.
Figura 36. Posible ruta de actuación de la CT-1 a través de la activación de Fosfolipasa C. El panel izquierdo representa la hipotética vía de inducción a la secreción de insulina en presencia de CT-1 y ausencia de glucosa. A través de la activación de la vía de Fosfolipasa C mediada por la activación del receptor de la CT-1 se induce la movilización de los gránulos de secreción (en rojo) que contienen insulina. El panel derecho indica la secreción de insulina mediada por la entrada de glucosa a la célula, principal efector de la secreción de insulina, junto con el efecto sinérgico de la CT-1, mostrando un mayor número de gránulos de secreción (en azul y rojo).
GL
UT
2Glucosa
PLCLI
FR
GP1
30
CT-1
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
?
+
+
Nifedipina
Des
pola
riza
ción
m
embr
ana
Bomba de K+
↑ATP/ADP
↑Ca2+
↑Ca2+
GL
UT
2
PLC
LIFR
GP1
30
CT-1
Canal de calcio tipo L
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
↑Ca2+
?
+
+
Neomicina
Bomba de K+
Secreción de insulina inducida por CT-1
- Glucosa + Glucosa
Neomicina
Canal de calcio tipo L
GL
UT
2Glucosa
PLCLI
FR
GP1
30
CT-1
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
?
+
+
Nifedipina
Des
pola
riza
ción
m
embr
ana
Bomba de K+
↑ATP/ADP
↑Ca2+
↑Ca2+
GL
UT
2
PLC
LIFR
GP1
30
CT-1
Canal de calcio tipo L
PIP2
DAGIP3
RER
PKC
↑Ca2+
?
+
+
Neomicina
Bomba de K+
Secreción de insulina inducida por CT-1
- Glucosa + Glucosa
Neomicina
Canal de calcio tipo L
DISCUSIÓN
128
A la luz de estos resultados, la capacidad de la CT-1 para inducir la secreción de
insulina de forma sinérgica en presencia de glucosa la convierte en una candidata para
su posible aplicación clínica permitiendo mejorar la secreción en los casos en que el
remanente de masa de célula beta sea insuficiente para producir el aporte necesario de la
misma.
2. Modelos experimentales de diabetes utilizando ratones C57 CT-1-/-
Los resultados obtenidos en los estudios in vitro del presente trabajo sugieren un
posible papel de la CT-1 en la fisiología del islote de Langerhans y su función. La
utilización de un modelo de ratón modificado genéticamente que no expresa el gen que
codifica para la CT-1 nos ha permitido analizar el efecto que esta citoquina ejerce sobre
el metabolismo de la glucosa in vivo, así como el estudio del papel que desarrolla en una
situación patológica como la diabetes.
En primer lugar, realizamos un estudio de las características morfológicas y
funcionales de los islotes presentes en los ratones CT-1-/- en comparación con la cepa
salvaje. Los niveles de glucosa e insulina en sangre fueron similares entre ambos
grupos. No obstante, los estudios inmunohistoquímicos en las muestras de páncreas
revelaron un tamaño promedio de islote significativamente mayor en los ratones CT-1-/-
. Además, éstos presentan una tendencia a la ganancia de peso, con independencia del
tipo de dieta al que fueron sometidos. Estos resultados sugieren la adquisición de un
fenotipo obeso en los ratones CT-1-/-, los cuales podrían presentar mecanismos que
compensen la mayor demanda de insulina, tales como la expansión de la masa de
células beta. Estudios en ratones que presentan obesidad monogénica, como los ratones
ob/ob, han demostrado que el incremento del tamaño de los islotes y del nivel de
insulina en sangre evita el desarrollo de la diabetes frente a la resistencia a insulina
inducida por las alteraciones metabólicas derivadas el fenotipo obeso [152, 196].
La aplicación de modelos animales de diabetes desarrollados mediante el uso de
tóxicos que dañan las células beta del islote, permiten tener un control del grado del
daño y monitorizarlo desde el momento en el que se induce la diabetes. En este
contexto, utilizamos la STZ, uno de los métodos más empleados en experimentación
animal en modelos de diabetes [92], que además permite el desarrollo de diferentes
modelos de esta enfermedad según el protocolo de administración. Para el desarrollo de
un modelo agudo de inducción de diabetes, se administra una alta concentración de STZ
DISCUSIÓN
129
en una única dosis, dando lugar a una hiperglicemia aguda, seguido de una destrucción
específica de las células beta en tan sólo 24 horas [114]. Por otra parte, para el
desarrollo de un modelo crónico de diabetes mediante el uso de STZ se induce un daño
continuado durante 4 días consecutivos con dosis bajas de STZ, lo que produce una
hiperglicemia gradual asociada a insulitis, simulando los mecanismos que acontecen en
la aparición de DM1 [91].
En nuestro estudio de inducción de diabetes mediante ambos modelos,
observamos que la sensibilidad a STZ difiere notablemente entre ratones CT-1-/- y
ratones normales de la misma cepa, lo que indica que, de algún modo, la presencia de
CT-1 ejerce un efecto protector en los ratones normales. El perfil de glicemias medido a
lo largo del tiempo observado en el modelo agudo sigue una distribución ya presentada
por otros autores, donde el primer día, tras la administración del tóxico, tiene lugar una
hipoglicemia transitoria, debido a la liberación masiva de insulina por las células beta
dañadas, seguida de un rápido aumento de los niveles de glucosa, alcanzando la
hiperglicemia a partir del segundo día [197]. Respecto al modelo crónico, los ratones
muestran un incremento de los niveles de glucosa de forma paulatina, tal y como
describen otros autores, donde la hiperglicemia se manifiesta tras siete días del inicio
del tratamiento con STZ de modo continuado [91]. La STZ actúa induciendo un daño
directamente en el tejido pancreático que reduce la masa de células beta, fenómeno que
puede ser puesto de manifiesto mediante técnicas de inmunohistoquímica. Nuestros
resultados demuestran que los ratones diabéticos, en mayor proporción en el grupo CT-
1-/-, presentan una clara reducción de la masa de célula beta, así como un descenso del
tamaño del islote. Por tanto, podemos concluir que la STZ es capaz de inducir un mayor
daño sobre los islotes de los ratones CT-1-/-. La disminución del porcentaje de masa de
célula beta en islotes dañados por STZ es una característica ya demostrada en otros
estudios donde la diabetes es inducida mediante la administración de este tóxico [197,
198]. Sin embargo, hasta la fecha no se ha demostrado una mayor sensibilidad a la STZ
en modelos animales que no expresen moléculas de la familia de GP130.
Estos resultados indican que la CT-1 podría estar ejerciendo algún mecanismo
de protección específico de célula beta frente al daño por STZ. La inducción de diabetes
utilizando otras moléculas tóxicas para el islote, tales como el alloxan [199] o la
utilización de otro tipo de estrategias de inducción de diabetes en los ratones CT-1-/-,
tales como la pancreatectomía [200] o la ligación del ducto pancreático [112], podrían
ayudarnos a dilucidar el papel protector que juega la CT-1.
DISCUSIÓN
130
Por otra parte, la dieta es un factor clave en el desarrollo de DM2. Los modelos
murinos donde se somete a los animales a dietas altas en contenido graso, como la dieta
hipercolesterolémica, se han utilizado ampliamente para el estudio de la fisiopatología y
el desarrollo de alteraciones en la secreción de insulina y finalmente DM2, ya que estos
animales van adquiriendo progresivamente las características fenotípicas asociadas a
esta enfermedad [152]. En nuestro estudio sometimos a los ratones CT-1-/- a este tipo
de dieta durante 37 semanas y observamos diferencias significativas con respecto al
ratón normal. En primer lugar, las glicemias basales en los ratones, tanto WT como CT-
1-/- son superiores (146,4+/-7,4 mg/dl en ratones WT y 152,6+/-14,1 mg/dl en ratones
CT-1-/-) en comparación con los ratones sometidos a dieta normal (115+/-27,3 mg/dl en
ratones WT y 112,68+/-22,3 mg/dl en ratones CT-1-/-). En cuanto al resto de
parámetros que analizamos, la adquisición de peso resultó ser significativamente mayor
en el caso de los ratones CT-1-/-. Esta tendencia a la ganancia de peso también se
observa en los ratones CT-1-/- sin dieta, sugiriendo su predisposición al desarrollo de
DM2 y obesidad. Sin embargo, al aplicar una dieta hipercalórica, las diferencias de
pesos son significativamente mayores. Diversos estudios indican que determinadas
citoquinas pueden ejercer un papel ‘hormonal’ actuando como reguladores principales
del metabolismo del tejido adiposo [201]. Este es el caso del TNF-α y la IL-6, ambas
producidas por los adipocitos y cuyos niveles se encuentran anormalmente elevados en
situaciones de obesidad [202]. Sin embargo, el caso más claro de citoquina producida
por el tejido adiposo que desarrolla un papel hormonal es la leptina [203]. La leptina
tiene un papel esencial en el metabolismo ejerciendo un control en el apetito y gasto
energético. Su acción se centra en el sistema nervioso central, concretamente en el
hipotálamo, donde ejerce su acción a través de la vía JAK/STAT. El ratón knock-out
para esta proteína, llamado ratón ob/ob, presenta un claro fenotipo obeso, ya que es
incapaz de controlar la ingesta desarrollando además alteraciones en el metabolismo de
la glucosa [204]. Los estudios en humanos han demostrado que los niveles de leptina se
encuentran incrementados en situaciones de obesidad [205].
Del mismo modo, estudios realizados en ratones modificados genéticamente que
no expresan el gen que codifica para la IL-6, proteína de la misma familia que CT-1,
demuestran que éstos adquieren un fenotipo obeso, con niveles de triglicéridos y leptina
en sangre incrementados y el metabolismo de la glucosa alterado. Así mismo, recientes
estudios indican que en los ratones IL-6-/- sometidos a una dieta hipercalórica se
activan mecanismos de inflamación en el tejido hepático y la presencia de una clara
DISCUSIÓN
131
resistencia a insulina, aunque no presentan un incremento significativo del peso ya
observado en el ratón IL-6-/- [206]. La administración de IL-6 en estos ratones revierte
parcialmente el fenotipo [121].
Un perfil alterado de tolerancia a glucosa en sangre puede estar asociado a un
fenotipo de obesidad. Diversos autores han demostrado que la aplicación de una dieta
hipercalórica en diversos modelos experimentales animales conduce a la alteración del
metabolismo de la glucosa debido a la insulinorresistencia generada en los tejidos
periféricos [152, 207]. En nuestro estudio, los ratones CT-1-/- también presentan un
metabolismo alterado de la glucosa; en condiciones normales, los ratones CT-1-/-
presentan una curva de tolerancia a glucosa alterada, observándose una recuperación de
los niveles de glucosa normales en sangre menos eficiente que en un ratón normal. Sin
embargo, cuando sometemos a los ratones CT-1-/- y WT a una dieta
hipercolesterolémica, el perfil de tolerancia a la glucosa es similar en ambos grupos.
Con estos resultados podemos concluir que la ausencia de CT-1 parece ejercer un efecto
sobre la producción de insulina y/o respuesta a la misma por los tejidos periféricos, que
define un fenotipo similar al obtenido tras el desarrollo de la insulinorresistencia debido
a la dieta hipercolesterolémica. Por otro lado, en condiciones normales la respuesta a
glucosa genera un perfil bifásico en la producción de insulina en sangre [192]; sin
embargo, nuestros resultados indican que este perfil de respuesta se ve alterado en el
ratón CT-1-/-, mostrando la pérdida de la primera fase de secreción rápida de insulina y
observándose una producción mantenida de la misma. Tal y como han demostrado
algunos autores, ambas características son indicativas del desarrollo de la patología
diabética [192].
Este dato resulta discordante respecto a uno de los efectos descritos de la CT-1
cuando ésta es administrada de forma crónica sobre adipocitos, donde se ha demostrado
que CT-1 es capaz de fosforilar los residuos de tirosina del receptor de la insulina, de
modo que favorece el desarrollo de la insulinorresistencia [142]. En nuestro estudio
observamos que la ausencia de CT-1 in vivo ejerce efectos deletéreos en la regulación
del metabolismo de la glucosa.
Estudios recientes han determinado que la CT-1 también está implicada en el
metabolismo energético [141]. En concreto, se ha descrito que se expresa en el tejido
adiposo, y su producción se ve incrementada en presencia de glucosa. Además, sus
niveles en sangre se encuentran elevados en pacientes con síndrome metabólico, donde
obesidad e insulinorresistencia son los principales rasgos de esta patología [141].
DISCUSIÓN
132
Futuros experimentos donde determinemos parámetros energéticos como niveles de
lípidos, leptina y otros marcadores en sangre nos permitirán analizar el papel que juega
la CT-1 en el control del metabolismo, tal como se ha descrito en el ratón IL-6-/- [206].
La administración sistémica o local de CT-1 en forma de proteína recombinante
se ha realizado en diferentes modelos animales con el objeto de analizar su efecto
protector en diferentes tejidos. En concreto, tras la inducción de daño en el tejido
hepático mediante isquemia-reperfusión o el tratamiento con el tóxico Concavalina A en
modelos de rata y ratón, respectivamente, han demostrado que la administración de CT-
1 aumenta la supervivencia de estos animales [134, 153]. Del mismo modo, quisimos
analizar si la CT-1 podría actuar como agente protector de los islotes pancreáticos frente
al daño por STZ. El tratamiento sistémico con CT-1 no ejerció efectos beneficiosos en
el grupo CT-1-/-; sin embargo, se observa cierta tendencia a la mejoría en el grupo WT,
aunque estas diferencias no resultaron significativas.
Por otra parte, pudimos detectar un fuerte efecto anoréxico, que corrobora la
hipótesis del papel que desarrolla la CT-1 en el metabolismo energético. Como ya se ha
mencionado con anterioridad, la CT-1 muestra una naturaleza pleiotrópica siendo capaz
de desarrollar diversos efectos en múltiples tejidos [135]. El tratamiento sistémico y
crónico que realizamos puede tener efectos tanto beneficiosos como deletéreos para el
desarrollo de la enfermedad. Un incremento de la actividad metabólica previene el
desarrollo de DM2, sin embargo el efecto de la CT-1 en tejidos periféricos, como
adipocitos, puede ser deletéreo puesto que podría promover una situación de resistencia
a insulina si la exposición a esta citoquina se produce de manera crónica.
Por último, quisimos profundizar en los mecanismos por los cuales los ratones
CT-1-/- presentan una mayor sensibilidad al daño por STZ. Diversos estudios han
demostrado la capacidad regenerativa del tejido pancreático tras ser sometido a un daño
[10]. Puesto que el tóxico ejerce un efecto deletéreo directamente sobre los islotes, es
posible que la CT-1 participe en algún mecanismo de regeneración y/o en la prevención
de la apoptosis, tal y como sugieren nuestros resultados in vitro. Los mecanismos de
regeneración celular suponen la activación de muchos procesos, entre los cuales se
encuentran la replicación celular, aumento de la masa de la célula beta, descenso de los
niveles de apoptosis y diferenciación de posibles progenitores de células beta [208].
Diversos autores han analizado los cambios a nivel histológico que son indicativos de
una mayor actividad regenerativa en modelos in vivo [208-210]. Algunas de las
estrategias más utilizadas para la inducción de procesos regenerativos en modelos
DISCUSIÓN
133
animales son la pancreatectomía parcial, ligación del ducto pancreático, sobreexpresión
de TNF-α bajo un promotor específico de células beta pancreáticas, y como en el caso
de nuestro estudio, la utilización de tóxicos específicos como STZ o alloxan [92].
La presencia de posibles progenitores pancreáticos remanentes en el tejido
adulto es una hipótesis que presenta cierta controversia, pues algunos autores indican la
posible existencia de precursores de las células alfa y beta no secretoras de hormonas
que expresan el factor de transcripción PDX1 [211]; estos progenitores se localizarían
en zonas ductales, pero sin pertenecer al epitelio del ducto [212]. Así mismo también se
han descrito células de origen mesenquimal como posibles precursoras pancreáticas
que, bajo la influencia de determinados estímulos, sufrieran algún tipo de
transdiferenciación [213]. La dificultad de esta afirmación radica en la falta de
marcadores específicos para detectar estas subpoblaciones y la escasa presencia de estas
células que impide su identificación por ‘trazado de linaje’ [208]. Por otra parte, otros
estudios han determinado que la regeneración pacreática tras un daño y la renovación
del tejido en condiciones normales es debida a la propia duplicación de la célula beta
adulta, a pesar de que se considera una población celular altamente especializada con
una muy baja tasa de replicación [56].
En nuestro estudio sobre los mecanismos de regeneración en los islotes de
Langerhans de ratones CT-1-/-, quisimos observar las posibles diferencias a nivel
histológico que explicaran la mayor sensibilidad de éstos al daño por STZ en el modelo
agudo. Por ello, realizamos el análisis de los siguientes parámetros: la morfología del
islote y su porcentaje de masa de célula beta, así como la detección del marcador
específico de célula beta PDX1 y el marcador de proliferación Ki67. Estos parámetros
fueron analizados al inicio del desarrollo de la enfermedad, cuando los posibles
mecanismos de prevención, regeneración y/o reparación se hubieran iniciado. A los 4
días de la inducción de diabetes, las diferencias en cuanto al número de ratones
diabéticos entre los grupos CT-1-/- y WT eran máximas, observándose que el fenotipo
diabético se había alcanzado en la mayoría de los ratones CT-1-/- y sólo en un bajo
porcentaje de los ratones WT. Observamos unas características similares a las
presentadas en los grupos tratados con STZ monitorizados a largo plazo (un mes), en
relación a la masa de célula beta y el tamaño promedio de islote, donde estos valores
son significativamente inferiores en el ratón CT-1-/- respecto al ratón WT. Por tanto,
desde la aparición de la hiperglicemia, la histología ya muestra el efecto del tóxico,
siendo éste más agresivo en el grupo CT-1-/-. Por otra parte, la cuantificación de
DISCUSIÓN
134
núcleos PDX1 positivos dentro del islote muestra un menor porcentaje en el grupo CT-
1-/- en comparación con el grupo WT. Además, realizamos una búsqueda de núcleos
positivos para el marcador PDX1 en zonas cercanas a los ductos, con el objeto de
detectar la presencia de los posibles precursores pancreáticos descritos en estudios
anteriormente mencionados [111], sin llegar a observar su presencia en ninguno de los
casos. Existe la posibilidad de que nuestro modelo no indujera la activación de este tipo
de precursores, aunque también el tiempo de finalización del estudio y posterior análisis
de las muestras derivadas del experimento puede no ser el adecuado para detectar esta
hipotética subpoblación. Por último, el análisis de núcleos positivos para el marcador de
proliferación Ki67 dentro del islote nos indicó que no había diferencias significativas en
el estado proliferativo de los islotes en el momento del análisis del estudio. Además, la
tasa de proliferación resultó ser muy baja y no observamos un incremento de este
marcador en los núcleos del tejido exocrino ni en áreas cercanas a los ductos
pancreáticos. En los estudios in vitro realizados previo al uso de animales de
experimentación, pudimos observar que la CT-1 tiene un efecto claramente protector
frente a la apoptosis, pero sin embargo, no observamos una mayor tasa de proliferación
celular de los islotes en presencia de esta citoquina. Por esta razón, la hipótesis más
plausible es que la CT-1 actúa en las células beta mediante un mecanismo de prevención
de la muerte celular, sin incrementar el ratio de proliferación como mecanismo de
reparación, al menos en los tiempos analizados.
El análisis de los tejidos tras 24 horas del daño, además del análisis de un mayor
número de marcadores a nivel inmunohistoquímico, como Caspasa 3, para analizar el
grado de apoptosis, o el comarcaje de moléculas de proliferación como Ki67 y de
posibles precursores como PDX1 podrían aportar datos para determinar un posible
mecanismo de acción de la CT-1 frente al daño por STZ. Así mismo, sería interesante
analizar la presencia de proteínas cuya expresión en situaciones de inducción de
apoptosis ya ha sido descrita [117, 175]. Este es el caso de la presencia de BCL-xL en el
tejido pancreático, tal y como demostramos en nuestros estudios in vitro.
Por último, cabe destacar que en los estudios sobre el efecto protector de la CT-1
en el tejido hepático se ha observado un aumento en la presencia de la propia CT-1 tras
24 horas de inducción de daño por hepatectomía parcial [134]. Estos datos sugieren que,
de forma similar, podría tener lugar la expresión de CT-1 en el tejido pancreático de los
ratones WT tras el daño con STZ. Futuros estudios podrían confirmar esta hipótesis.
DISCUSIÓN
135
3. Aplicación de la CT-1 en diabetes
A la vista de los resultados derivados de este trabajo podemos corroborar que la
CT-1 es capaz de desarrollar múltiples efectos, jugando un papel relevante en la
homeostasis de la glucosa. En este sentido, varios estudios han puesto de manifiesto su
efecto en muy diversos tejidos, siendo destacable su efecto protector tanto en
cardiomiocitos [129] como en ciertas poblaciones del sistema nervioso [137], muscular
[214] y el tejido hepático [153]. Además, recientemente se ha demostrado que también
está implicada en el metabolismo energético, ya que es producida por los adipocitos
[142] y participa en el remodelamiento del tejido óseo [140]. Sin embargo, hasta la
fecha no se ha demostrado el papel de la CT-1 en relación a la función de la célula beta
in vitro, ni sobre su posible papel protector en el tejido pancreático. Por primera vez,
este trabajo demuestra que la actividad protectora frente a la apoptosis de la CT-1 es
extensible a la célula beta, que responde mediante las vías específicas por las que actúan
las citoquinas de la familia GP130 y además actúa a través de moléculas implicadas en
mecanismos de supervivencia celular. Además, también hemos demostrado que tiene un
efecto específico en la secreción de insulina, que será analizado con mayor profundidad
en estudios posteriores.
En cuanto a los resultados con animales de experimentación observamos que el
modelo de ratón CT-1-/- presenta unas características fenotípicas muy similares al ratón
modificado genéticamente que no expresa la citoquina IL-6 [121]. Una de las
características de las citoquinas de la familia de GP130, es la redundancia en sus
funciones y efectos en el organismo. Además, la CT-1 presenta cierta dualidad en sus
efectos tanto en los modelos in vivo que hemos estudiado, como en los datos recogidos
en pacientes, en relación al metabolismo de la glucosa [141]. Respecto al papel
regulador y/o protector de la CT-1, demostramos que su ausencia sensibiliza al tejido
pancreático al daño por STZ, siendo los ratones CT-1-/- más susceptibles al desarrollo
de diabetes. Por otro lado, estudios clínicos anteriormente mencionados indican que, en
pacientes obesos con síndrome metabólico, los niveles de CT-1 se encuentran
anormalmente elevados [141]. Estos datos presentan un gran paralelismo con los
estudios con IL-6 y leptina [201], lo que sugiere que la CT-1 también podría estar
implicada en el metabolismo energético. Otro dato adicional que recoge nuestro estudio
y que apoya esta hipótesis es el significativo efecto anoréxico asociado al tratamiento
sistémico con CT-1. En el caso del ratón IL-6-/-, el tratamiento sistémico con la
DISCUSIÓN
136
citoquina era capaz de reducir el peso de estos ratones, siendo esta disminución
significativamente mayor en los ratones IL-6-/- respecto a los ratones de la cepa salvaje
[121]. Por otra parte, es interesante mencionar que otra citoquina de la misma familia, la
CNTF, está muy relacionada con el metabolismo energético, puesto que se ha
demostrado que su receptor activa las mismas vías de acción que la leptina en el
hipotálamo. La administración de CNTF en ratones db/db que presentan una alteración
en los receptores de la leptina permite revertir el fenotipo diabético [215].
En resumen, la CT-1 presenta una serie de características muy interesantes para
profundizar en su estudio en relación con la patología diabética. En cuanto a su
aplicabilidad clínica, hemos comprobado que, por su naturaleza pleiotrópica y sus
múltiples efectos tanto beneficiosos como deletéreos, según dosis y condiciones en
diversos sistemas, su aplicación clínica se centraría en una terapia dirigida
específicamente al tejido pancreático. Para poder determinar si el efecto de la CT-1 se
debe a la presencia de múltiples factores, tanto en el tejido pancreático como en otros
tejidos adyacentes, o a la acción directa de ésta, el uso de un modelo experimental de
trasplante de islotes en ratones diabéticos nos ayudaría a demostrar su efecto
beneficioso in vivo, así como iniciar los pasos para una posible aplicación clínica.
Actualmente la terapia mediante el trasplante de islotes es la alternativa más
prometedora al trasplante de páncreas y ofrece un control de los niveles de glucosa que
libera al paciente del tratamiento con insulina y las complicaciones derivadas de los
picos de hipoglucemia y otros efectos no controlables con la terapia convecional [54].
Sin embargo, durante el proceso de extracción, cultivo y trasplante, las células de islote
sufren diversas agresiones que las abocan a procesos apoptóticos: deprivación de las
condiciones de su nicho original, como la presencia de una matriz o del tejido
mesenquimal, el procesamiento para aislar los islotes, su cultivo ex vivo, su trasplante y
el consecuente desencadenamiento de una respuesta inmunitaria del tejido hospedador.
Todas estas alteraciones activan procesos que llevan a la muerte celular y, por tanto, a la
pérdida de muchos de estos islotes. El estudio de estrategias que protejan a los islotes
durante su manipulación podría permitir mejorar la calidad del trasplante.
En este contexto, la CT-1 podría ser una molécula candidata a ser aplicada con
esta función preventiva de la apoptosis en islotes destinados al trasplante. Un estudio
similar ya fue realizado en un modelo murino de ratones diabéticos mediante la
inducción por STZ, en el que se realizó el pretratamiento de los islotes con la citoquina
IL-6 previo al trasplante, siendo el ratio de trasplantes con éxito del 100% [124].
DISCUSIÓN
137
Por otra parte, el empleo de la CT-1 para el tratamiento de la diabetes tendría
una posible aplicación mediante el uso de técnicas que permitan su expresión y acción
específica en el tejido pancreático dentro del propio organismo. Para ello, sería
necesario el empleo de estrategias de ingeniería genética, a través del diseño de vectores
que porten el gen de la citoquina de forma que sólo se exprese en las células beta del
páncreas. En diversos estudios ya se han empleado construcciones con vectores virales
que codifican para el gen de la CT-1. En concreto, la administración vía intravenosa del
adenovirus recombinante AdCT-1 en ratas aumenta significativamente su supervivencia
tras la inducción de un daño hepático fulminante por una hepatectomía parcial [134].
Sin embargo, el tratamiento sistémico con adenovirus no resulta tan eficiente en el caso
del páncreas, pues este vector facilita preferentemente la transducción del tejido
hepático. Diversos autores han realizado estudios sobre el uso de adenovirus y otros
vectores virales comparando su eficiencia de infección mediante su inyección directa
sobre el tejido pancreático en modelos animales [216, 217]. Estos estudios han definido
estrategias para optimizar el rendimiento de la transducción en las células beta
pancreáticas, tales como el bloqueo de la circulación hacia el páncreas durante la
administración del adenovirus a través de la vena pancreático-duodenal en un modelo
canino [218], o bien la inyección sistémica del adenovirus en un modelo de ratón donde
se ha bloqueado la circulación hacia el hígado a través de la vena porta, la arteria
hepática [219]. Sin embargo, a pesar de las mejoras en la eficiencia de transducción, la
expresión resulta ser temporal, debido a la respuesta inmunitaria del organismo
hospedador desencadenada frente a la presencia del vector viral [220].
El uso de adenovirus en combinación con el trasplante de islotes es otra
alternativa que permite la expresión de genes beneficiosos para la supervivencia del
tejido trasplantado, como es el caso de la transfección con un adenovirus que porta el
factor HGF en los islotes y su posterior trasplante. El HGF está descrito como inductor
de la proliferación en la célula beta y, por tanto, permite una mayor supervivencia y
mejora la función de los islotes trasplantados siendo necesario un menor número de
islotes para recuperar la normoglicemia [221]. Por tanto, la aplicación de esta técnica
para la transducción del gen de la CT-1 en los islotes destinados al trasplante podría ser
una estrategia que permitiría preservarlos de la apoptosis inducida por el proceso de
aislamiento y su posterior trasplante.
En conclusión, la CT-1 se presenta como una interesante proteína de estudio, no
sólo por las múltiples funciones que desarrolla en diferentes tipos celulares, sino
DISCUSIÓN
138
también por su posible papel en el metabolismo general del organismo. La búsqueda de
metodologías que permitan su futura aplicación clínica combinando estrategias de
terapia celular junto con terapia génica podría suponer un importante avance en diversas
patologías, incluida la diabetes.
CONCLUSIONES
139
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
141
Las conclusiones obtenidas de este trabajo son las siguientes:
1. La CT-1 protege a las células de islote pancreático de ratón y a la línea
celular MIN6B1 frente a la apoptosis inducida por deprivación de suero. Su
efecto protector se extiende al cultivo de los islotes murinos sometidos al
daño inducido por la presencia de citoquinas proinflamatorias.
2. Bajo el estímulo de la deprivación de suero, la protección frente a la
apoptosis ejercida por la CT-1 en la línea celular MIN6B1 es superior a la
IL-6.
3. La proteína antiapoptótica BCL-xL está involucrada en el mecanismo
protector iniciado por la CT-1, tanto en islotes como en las células MIN6B1,
cuando éstos son sometidos al daño por deprivación de suero.
4. La CT-1 es capaz de activar múltiples vías de señalización a corto plazo,
induciendo la activación de la vía de ERK y JAK/STAT. Sin embargo, no
juega un papel revelante en la activación de la vía de PI3K/AKT.
5. La CT-1 estimula la secreción de insulina en la línea celular MIN6B1,
ejerciendo un efecto sinérgico en presencia de glucosa. La activación de la
vía de la Fosfolipasa C está involucrada en la secreción de insulina mediada
por CT-1, tanto en presencia como en ausencia de glucosa. Además, en
presencia de glucosa, la CT-1 es capaz de revertir el efecto inhibitorio sobre
la secreción de insulina de determinadas concentraciones de Nifedipina. En
ausencia de glucosa, el bloqueo de la vía de ERK inhibe la secreción de
insulina estimulada por CT-1.
6. Los ratones CT-1-/- presentan una mayor predisposición al desarrollo de
diabetes tras la administración del tóxico STZ, tanto en un modelo de daño
agudo como crónico. En ambos modelos experimentales, el porcentaje de
ratones que desarrollan diabetes es mayor en el grupo de ratones CT-1-/- en
comparación con la cepa salvaje.
7. El análisis morfológico de los islotes de Langerhans de los ratones CT-1-/-
tras el tratamiento con STZ, tanto en el modelo agudo como crónico de
inducción de diabetes, indica que el fenotipo diabético adquirido por los
ratones se correlaciona con un descenso de la masa de célula beta y la
disminución del tamaño del islote.
CONCLUSIONES
142
8. Los ratones CT-1-/- presentan una curva de tolerancia a la glucosa alterada,
mostrando un retraso en el pico máximo de glucosa y un enlentecimiento en
la adquisición de los valores normales en comparación con los ratones WT.
9. Los ratones CT-1-/- sometidos a dieta hipercolesterolémica muestran una
mayor ganancia de peso en comparación con los ratones WT. Además, el
patrón de la curva de tolerancia a glucosa presente en ratones WT tras ser
sometidos a dieta hipercolesterolémica muestra un perfil similar a la de los
ratones CT-1-/- sometidos a dieta normal.
10. La administración sistémica de CT-1 en ratones diabéticos CT-1-/- y WT
inducidos mediante administración de STZ no previene la adquisición del
fenotipo diabético. Sin embargo, el tratamiento con CT-1 ejerce un fuerte
efecto anoréxico en ambos grupos de ratones.
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143
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