Εργαστηριακές Μέθοδοι

Ανάλυσης Πρωτεϊνών

Πουλάς Κωνσταντίνος Σιδέρης Σωτήριος

ΠΟΥΛΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ

ΣΙΔΕΡΗΣ ΣΩΤΗΡΙΟΣ

Εργαστηριακές Μέθοδοι

Ανάλυσης Πρωτεϊνών

Εργαστηριακές Μέθοδοι Ανάλυσης Πρωτεϊνών

Συγγραφή

Πουλάς Κωνσταντίνος

Σιδέρης Σωτήριος

Κριτικός αναγνώστης

Λαγουμιντζής Γεώργιος

Συντελεστές έκδοσης

ΓΛΩΣΣΙΚΗ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Καλλιάρας Δημήτριος

ΓΡΑΦΙΣΤΙΚΗ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Πουλάς Κωνσταντίνος

ΤΕΧΝΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ: Πουλάς Κωνσταντίνος

Copyright © ΣΕΑΒ, 2015

Το παρόν έργο αδειοδοτείται υπό τους όρους της άδειας Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική

Χρήση - Όχι Παράγωγα Έργα 3.0.

ΣΥΝΔΕΣΜΟΣ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ

Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο

Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 15780 Ζωγράφου

www.kallipos.gr

ISBN: 978-960-603-126-7

http://www.kallipos.gr/

Ο Οδηγός αυτός αφιερώνεται σε όλους τους προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς μας φοιτη-

τές, που καθημερινά αγωνιούν σε δύσκολες συνθήκες για την απόκτηση της γνώσης. Ω-

στόσο, θα ήταν παράλειψη να μην το αφιερώσουμε και σε όλους τους εκλεκτούς δασκάλους

μας, που μας μύησαν στη βιοχημική έρευνα με επιμονή και μεράκι. Τους χρωστάμε πολλά.

Περιεχόμενα

Περιεχόμενα .......................................................................................................................................... 4

Πίνακας συντομεύσεων-ακρωνύμια ................................................................................................... 9

Πρόλογος ............................................................................................................................................. 10

Εισαγωγή ............................................................................................................................................ 11

Κεφάλαιο 1. Εισαγωγικά στοιχεία - προετοιμασία και χειρισμός των πρωτεϊνικών δειγμάτων 14

1.1 Προετοιμασία για την απομόνωση της πρωτεΐνης .................................................................... 14

1.1.1 Ρυθμιστικά Διαλύματα ............................................................................................................................................ 14

1.1.1.1 Επιλογή Ρυθμιστικών Διαλυμάτων ..................................................................................................................... 14

1.1.1.2 Κανόνες προετοιμασίας των ρυθμιστικών διαλυμάτων .................................................................................... 15

1.1.1.3 Περιορισμοί των Βασικών Ρυθμιστικών Διαλυμάτων ...................................................................................... 16

1.1.2 Άλατα, Μεταλλικά ιόντα και Χηλικά άλατα ......................................................................................................... 17

1.1.2.1 Ιοντική ισχύς ......................................................................................................................................................... 17

1.1.2.2 Δισθενή κατιόντα (Divalent Cations) .................................................................................................................. 17

1.1.2.3 Χηλικοί παράγοντες (Chelators) .......................................................................................................................... 17

1.1.3 Απορρυπαντικά (Detergents) .................................................................................................................................. 18

1.1.3.1 Γενικές Αρχές ........................................................................................................................................................ 18

1.1.3.2 Ταξινόμηση απορρυπαντικών .............................................................................................................................. 18

1.1.4 Επίδραση του μικροπεριβάλλοντος στην πρωτεϊνική λειτουργία ....................................................................... 20

1.1.4.1 Επίδραση επιφάνειας (Surface effect) ................................................................................................................. 20

1.1.4.2 Επίδραση θερμοκρασίας ...................................................................................................................................... 20

1.1.4.3 Επίδραση συνθηκών αποθήκευσης ..................................................................................................................... 20

1.1.5 Αναστολείς πρωτεάσης ............................................................................................................................................ 21

1.2 Πρωτεϊνική απομόνωση και διαλυτοποίηση ............................................................................. 22

1.2.1 Πρωτεϊνική απομόνωση .......................................................................................................................................... 22

1.2.1.1 Ομογενοποίηση Ιστού - Λύση Κυττάρων............................................................................................................ 22

1.2.1.2 Υπέρηχοι ................................................................................................................................................................ 23

1.2.1.3 Αναδεύοντας με γυάλινα σφαιρίδια ..................................................................................................................... 24

1.2.1.4 Ενζυμικές μέθοδοι ................................................................................................................................................. 24

1.2.1.5 Άλλες μέθοδοι κυτταρικής λύσης ........................................................................................................................ 25

1.2.2 Διαλυτοποίηση των έγκλειστων σωματίων ........................................................................................................... 26

1.2.2.1 Αύξηση διαλυτότητας της πρωτεΐνης των έγκλειστων σωματίων ................................................................... 26

1.2.2.2 Παρεμπόδιση σχηματισμού έγκλειστων σωματίων ........................................................................................... 28

1.3 Υπολογισμός πρωτεϊνικής συγκέντρωσης ................................................................................. 28

1.3.1 Απορρόφηση στα 280 nm (A280) .............................................................................................................................. 28

1.3.1.1 Γενικές αρχές ......................................................................................................................................................... 29

1.3.1.2 Τεχνικές πληροφορίες ........................................................................................................................................... 29

1.3.1.3 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 29

1.3.1.4 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 29

1.3.2 Μέθοδος Bradford ................................................................................................................................................... 30

1.3.2.1 Τεχνικές πληροφορίες ........................................................................................................................................... 30

1.3.2.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 30

1.3.2.3 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 31

1.3.2.4 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 31

1.3.2.5 Σχεδιάζοντας μια Πρότυπη Καμπύλη ................................................................................................................. 31

1.3.2.6 Αξιοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη .................................................................................................................. 32

1.3.3 Μέθοδος Lowry ........................................................................................................................................................ 33

1.3.3.1 Τεχνικές πληροφορίες ........................................................................................................................................... 33

1.3.3.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 33

1.3.3.3 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 34

1.3.3.4 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 34

1.3.4 Μέθοδος Βικινχονινικού οξέος (BCA, Bicinchoninic Acid) .................................................................................. 35

1.3.4.1 Τεχνικές πληροφορίες ........................................................................................................................................... 35

1.3.4.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 35

1.3.4.3 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 35

1.3.4.4 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 36

1.4 Συμπύκνωση πρωτεϊνικών διαλυμάτων .................................................................................... 36

1.4.1 Καθίζηση τριχλωροξικού οξέος (Tricloroacetic Acid, TCA) ............................................................................... 36

1.4.1.1 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 37

1.4.1.2 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 37

1.4.1.3 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 37

1.4.2 Καθίζηση θειικού αμμωνίου - Εξαλάτωση (Salting out) ...................................................................................... 37

1.4.2.1 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 38

1.4.2.2 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 38

1.4.2.3 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 38

1.4.3 Καθίζηση πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG) .............................................................................................................. 38

1.4.3.1 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 39

1.4.3.2 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 39

1.4.3.3 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 39

1.4.4 Διαπίδυση (Dialysis) ................................................................................................................................................ 39

1.4.4.1 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 39

1.4.4.2 Αντιδραστήρια ...................................................................................................................................................... 39

1.4.4.3 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 40

Βιβλιογραφία ...................................................................................................................................... 40

Κεφάλαιο 2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ........................................................................................ 42

2.1 Ηλεκτροφόρηση πηκτής σε αποδιατακτικές συνθήκες ............................................................ 42

2.1.1 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης παρουσία δωδεκυλο-θειικού νατρίου (Sodium Dodecyl Sulfate-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) ........................................................................................................ 43

2.1.1.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 43

2.1.1.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 44

2.1.1.3 Μορφοποιώντας - πακετάροντας μια πηκτή ...................................................................................................... 44

2.1.1.4 Προετοιμάζοντας και φορτώνοντας (loading) δείγματα .................................................................................... 49

2.1.1.5 Hλεκτροφορητικός διαχωρισμός των δειγμάτων ............................................................................................... 50

2.1.1.6 Χρωματίζοντας μια πηκτή με χρωστική Coomassie blue ................................................................................. 51

2.1.1.7 Χρωματίζοντας μια πηκτή με χρωστική αργύρου ............................................................................................. 53

2.1.1.8 Αφυδάτωση πηκτής .............................................................................................................................................. 55

2.1.1.9 Πιθανά προβλήματα.............................................................................................................................................. 55

2.1.2 Πηκτές διαβαθμιζόμενης συγκέντρωσης (gradient gels) σε αποδιατακτικές συνθήκες .................................... 57

2.1.2.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 57

2.1.2.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 57

2.1.2.3 Προετοιμασία πηκτής ........................................................................................................................................... 57

2.1.3 SDS - πηκτές ουρίας ................................................................................................................................................ 57

2.1.3.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 57

2.1.3.2 Προετοιμασία πηκτών .......................................................................................................................................... 58

2.1.4 Άλλες μέθοδοι ........................................................................................................................................................... 58

2.1.4.1 Ανίχνευση ραδιοϊσοτόπων δειγμάτων ................................................................................................................. 58

2.1.4.2 Προσδιορισμός μοριακού βάρους ........................................................................................................................ 59

2.1.4.3 Ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης (Πυκνομετρία) ....................................................................................................... 60

2.1.4.4 Εξαγωγή και συλλογή πρωτεϊνικών κλασμάτων από πηκτή ............................................................................ 60

2.2 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή σε μη-αποδιατακτικές συνθήκες ................................................... 61

2.2.1 Εισαγωγή .................................................................................................................................................................. 61

2.2.2 Ηλεκτροφόρηση σε ασυνεχή πηκτή σε μη-αποδιατατικές συνθήκες .................................................................. 61

2.2.2.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 61

2.2.2.2 Προετοιμασία πηκτής ........................................................................................................................................... 61

2.2.2.3 Απαιτούμενοι όγκοι για την παρασκευή πηκτών διαφορετικού πάχους (για δυο πηκτές 6 × 8 cm) .............. 63

2.2.2.4 Υπολογισμός για πηκτή διαχωρισμού Χ% συγκέντρωσης πολυακρυλαμίδης ................................................ 63

2.2.2.5 Μεταγγίζοντας την πηκτή διαχωρισμού στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ........................................................ 63

2.2.2.6 Μεταγγίζοντας την πηκτή επιστοίβασης στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ........................................................ 63

2.2.2.7 Προετοιμασία Δείγματος ...................................................................................................................................... 63

2.2.2.8 Παραλλαγή: Ηλεκτροφόρηση σε συνεχή πηκτή σε αποδιατακτικές συνθήκες ............................................... 64

2.3 Ισοηλεκτρική Εστίαση και πηκτές ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων .................................. 64

2.3.1 Ισοηλεκτρική Εστίαση (Ιsoelectric Focusing, IF) ................................................................................................. 64

2.3.1.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 64

2.3.1.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 64

2.3.1.3 Προετοιμασία πηκτής ισοηλεκτρικής εστίασης ................................................................................................. 64

2.3.1.4 Προετοιμασία και φόρτωση δείγματος ............................................................................................................... 66

2.3.1.5 Πειραματική διαδικασία ισοηλεκτρικής εστίασης ............................................................................................ 67

2.3.1.6 Χειρισμοί μετά την ισοελεκτρική εστίαση – χρώση - αποχρωματισμός πηκτής ............................................. 67

2.3.2 Πηκτές ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων (2D electrophoresis gels) .................................................................. 68

2.3.2.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 68

2.3.2.2 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 68

2.3.2.3 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 68

Βιβλιογραφία ...................................................................................................................................... 69

Κεφάλαιο 3. Χρωματογραφία συγγένειας ........................................................................................ 71

3.1 Εισαγωγή ...................................................................................................................................... 71

3.2 Προετοιμάζοντας μια στήλη συγγένειας .................................................................................... 72

3.2.1 Επιλογή υποστρώματος ........................................................................................................................................... 73

3.2.2 Γενικά χαρακτηριστικά υλικών με ρόλο υποστρώματος ...................................................................................... 73

3.2.3 Επιλογή προσδέτη .................................................................................................................................................... 73

3.2.4 Γενικά για τον σχεδιασμό προσδετών και την επιλογή τους ................................................................................ 73

3.2.5 Ακινητοποίηση προσδέτη σε σεφαρόζη (Sepharose) ενεργοποιημένη από βρωμιούχο κυάνιο (CNBr) ........... 74

3.2.6 Πειραματική διαδικασία ......................................................................................................................................... 75

3.2.7 Στρατηγικές μη ειδικής εξαγωγής του προσδέματος από τη στήλη .................................................................... 76

3.3 Εξειδικευμένες τεχνικές καθαρισμού με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας .................. 76

3.3.1 Καθαρισμός αντισωμάτων με τη χρήση αντιγόνου ............................................................................................... 76

3.3.1.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 76

3.3.1.2 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 77

3.3.1.3 Ανοσοκαθαρισμός ................................................................................................................................................. 79

3.3.1.4 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 79

3.3.2 Χρωματογραφία συγγένειας νουκλεϊκού οξέος ..................................................................................................... 80

3.3.2.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 80

3.3.2.2 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 81

3.3.3 Χρωματογραφία συγγένειας λεκτίνης .................................................................................................................... 83

3.3.3.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 83

3.3.3.2 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 83

3.3.4 Χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου ................................................................................... 84

3.3.4.1 Εισαγωγή ............................................................................................................................................................... 84

3.3.4.2 Πειραματική διαδικασία ...................................................................................................................................... 85

3.3.5 Χρωματογραφία υδρόφοβης αλληλεπίδρασης ...................................................................................................... 86

Βιβλιογραφία ...................................................................................................................................... 86

Κεφάλαιο 4. Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής ............................................................................. 88

4.1 Καθαρισμός πρωτεΐνης................................................................................................................ 88

4.1.1 Εισαγωγή .................................................................................................................................................................. 88

4.1.1.1 Αρχές ιοντοανταλλαγής ........................................................................................................................................ 89

4.1.1.2 Γενικές οδηγίες ...................................................................................................................................................... 91

4.1.2 Μέθοδοι .................................................................................................................................................................... 93

4.1.2.1 Εξοπλισμός ............................................................................................................................................................ 93

4.1.2.2 Επιλέγοντας ένα υπόστρωμα ................................................................................................................................ 95

4.1.2.3 Προετοιμάζοντας το υπόστρωμα και στοιβάζοντας τη στήλη .......................................................................... 96

4.1.2.4 Έγχυση δείγματος ................................................................................................................................................. 98

4.1.2.5 Έκπλυση της στήλης και έκλουση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει............................................................ 99

4.1.2.6 Ανασύσταση/αναγέννηση και αποθήκευση του υποστρώματος της στήλης .................................................. 100

4.1.2.7 Προβλήματα και λύσεις ...................................................................................................................................... 100

4.2 Συμπυκνώνοντας ένα πρωτεϊνικό διάλυμα .............................................................................. 103

4.3 Ασυνεχής χρωματογραφία ......................................................................................................... 103

Βιβλιογραφία .................................................................................................................................... 103

Κεφάλαιο 5. Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή ....................................................................... 105

5.1 Καθαρισμός πρωτεΐνης.............................................................................................................. 105

5.1.1 Εισαγωγή ................................................................................................................................................................ 105

5.1.1.1 Αρχές της χρωματογραφίας διήθησης .............................................................................................................. 106

5.1.1.2 Ενδεικτικό πρωτόκολλο ανάλυσης δείγματος .................................................................................................. 107

5.1.1.3 Επιλέγοντας το υπόστρωμα διήθησης σε πηκτή .............................................................................................. 108

5.1.2 Μέθοδοι .................................................................................................................................................................. 109

5.1.2.1 Εξοπλισμός .......................................................................................................................................................... 109

5.1.2.2 Προετοιμάζοντας το υπόστρωμα και στοιβάζοντας τη στήλη ........................................................................ 111

5.1.2.3 Εφαρμογή και εξαγωγή του δείγματος .............................................................................................................. 112

5.1.2.4 Αναγέννηση και αποθήκευση της χρωματογραφικής στήλης ......................................................................... 114

5.1.2.5 Προβλήματα και λύσεις ...................................................................................................................................... 114

5.2 Αντικαθιστώντας το ρυθμιστικό διάλυμα μιας πρωτεΐνης .................................................... 116

Βιβλιογραφία .................................................................................................................................... 117

Γλωσσάρι επιστημονικών όρων ...................................................................................................... 118

Ευρετήριο Ελληνικών Όρων ........................................................................................................... 120

Ευρετήριο Αγγλικών Όρων ............................................................................................................. 121

Πίνακας συντομεύσεων-ακρωνύμια

ADA N-(Carbamoylmethyl) iminodiacetic acid

BCA Bicinchoninic Acid

BSA Bovine Serum Albumin

CMC Critical micelle concentration

CM-CELLULOSE Carboxymethyl cellulose

Con A Concanavalin Α

DEAE-CELLULOSE Diethylaminoethyl cellulose

DOC Deoxycholate

ECGF Endothelial Cell Growth Factor

EDTA ethylenediaminetetraacetate

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FGF Fibroblast Growth Factor

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid

HIC Hydrophobic Interaction Chromatography

HPLC High-performance liquid chromatography

IF Ιsoelectric Focusing

MOPS 3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid sodium salt

OG Octyl glucoside

PEG Polyethylene glycol

PEG Polyethylenglycol

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

RIA Radioimmunoassay

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TCA Trichloroacetic Acid

TEMED N,N,N’,N’-tetramethylene-ethylenediamine

Tris 2-hydroxymethyl-2methyl-1,3-propanediol

Triton X-100 Octylphenoxypolyethoxyethanol

Triton X-114 Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether

Tween 20 Polyethylene glycol sorbitan monolaurate

Πρόλογος

Τα τελευταία τριάντα χρόνια η Βιοχημεία ερευνά, καταγράφει και εξηγεί βασικούς κυτταρικούς και μοριακούς

μηχανισμούς που τελικά ερμηνεύουν την ίδια τη ζωή. Μετακινούμενη σε όλο και νεότερα πεδία προσφέρει

στον σύγχρονο επιστήμονα την πραγματική εικόνα των μακρομορίων και μέσα από τη γνώση της δομής ερμη-

νεύει τελικά τη λειτουργία τους. Η μελέτη των νουκλεϊκών οξέων και των πρωτεϊνών, κυρίως, αποκαλύπτει

θαυμαστά μυστικά και επιτρέπει τον μετασχηματισμό της γνώσης σε λύσεις για πολλές πτυχές της ίδιας της

ανθρώπινης (και όχι μόνο) ζωής.

Η Βιοχημεία όμως είναι πρωταρχικά πειραματική και όχι περιγραφική επιστήμη. Η γνώση προσεγγί-

ζεται μέσα από το πείραμα. Μέσα από απλά αλλά πλέον και πολυσύνθετα πειράματα επιτυγχάνεται η κατανό-

ηση και η ερμηνεία των φαινομένων.

Ο παρών Εργαστηριακός Οδηγός επιχειρεί να παρουσιάσει με αναλυτικό τρόπο μια σειρά από απλές

εργαστηριακές μεθόδους που επιτρέπουν τη μελέτη και την ανάλυση των πρωτεϊνών, των μακρομορίων αυτών

που διαθέτουν αξιοθαύμαστη ποικιλία και αξιοπρόσεκτη ετερογένεια.

Οι συγγραφείς Κ. Πουλάς και Σ. Σιδέρης θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τον Δρ. Γεώργιο Λαγουμιντζή

για τις πολύτιμες υποδείξεις και διορθώσεις ως κριτικού αναγνώστη του Οδηγού, καθώς και τους εκλεκτούς

συνεργάτες και φίλους Ηλία Μπολτσή, Ζωή Ζαγορίτη, Αναστασία Σιωρά και Ευαγγελία Κωνσταντίνου, για τις

σημαντικές προσθήκες και υποδείξεις κατά την περίοδο προετοιμασίας του Οδηγού.

Εισαγωγή

Η σπουδαιότητα του μαθήματος της βιοχημείας στη συγκρότηση επαρκούς γνωστικού υποβάθρου, με σκοπό

την μετέπειτα εμβάθυνση σε επιμέρους τομείς τόσο των θετικών επιστημών, όσο και των επιστημών υγείας,

αποτυπώνεται στην ένταξή του στα βασικά μαθήματα μιας σειράς τμημάτων διαφορετικών σχολών της τριτο-

βάθμιας εκπαίδευσης. Η ραγδαία ενσωμάτωση νέας γνώσης στο σχετικό επιστημονικό πεδίο επιβάλλει επι-

πλέον τη συνεχή ανανέωση και ενημέρωση των εγχειριδίων σε θεωρητικό αλλά και τεχνικό-εργαστηριακό επί-

πεδο. Παρόλα αυτά, υπάρχουν ορισμένες διαχρονικά χρήσιμες και αξιόπιστες μέθοδοι, που συνδυάζουν την

ευρύτητα εφαρμογών και τη σχετική ευκολία εκτέλεσης, με το προνόμιο να αποτελούν απαραίτητο προκαταρ-

κτικό στάδιο για μια σειρά περαιτέρω βημάτων επεξεργασίας και ανάλυσης. Οι εργαστηριακές τεχνικές που

αναλύονται διεξοδικά και εμπεριστατωμένα στον παρόντα εργαστηριακό οδηγό, ανήκουν στην παραπάνω κα-

τηγορία και μολονότι υπάρχουν διαθέσιμες αξιόλογες σχετικές εκδόσεις, έντυπες και ηλεκτρονικές, κάθε νέα

θεώρηση και προσπάθεια συνεισφέρει τα ελάχιστα στην πληρέστερη απόδοση των όρων και των εννοιών, με

σκοπό την εις βάθος κατανόηση του γνωστικού αντικειμένου.

Οι πρωτεΐνες αποτελούν το περισσότερο άφθονο από όλα τα κυτταρικά συστατικά. Στην υπερομάδα

τους συγκαταλέγονται δομικά μόρια, μεταφορικές πρωτεΐνες, ορμόνες, ένζυμα, αντισώματα και σειρά άλλων

λειτουργικών μορίων, κρίσιμων για την κυτταρική συγκρότηση και λειτουργία. Κάθε πρωτεΐνη απαιτεί ιδιαί-

τερη μεταχείριση όταν απομακρύνεται από το φυσιολογικό βιολογικό περιβάλλον της. Οι απαιτήσεις αυτές

πρέπει να ικανοποιούνται σε σημαντικό βαθμό, διότι σε διαφορετική περίπτωση η πρωτεΐνη ενδέχεται να χάσει

τον λειτουργικό της ρόλο. Για την απομόνωση ή την ταυτοποίηση μιας ενδοκυττάριας πρωτεΐνης πρέπει να

αναπτυχθεί μια αποτελεσματική μέθοδος λύσης του κυττάρου, η οποία να απελευθερώνει την πρωτεΐνη σε

διαλυτή μορφή από το κύτταρο. Επειδή το βήμα αυτό είναι το αρχικό βήμα για όλες τις επόμενες διαδικασίες,

η μέθοδος λύσης δεν πρέπει να καταστρέφει την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Η πρωτεϊνική συγκέντρωση

μπορεί να υπολογιστεί από μια πληθώρα διαθέσιμων μεθόδων. Παράμετροι όπως η ποσότητα της πρωτεΐνης

που είναι διαθέσιμη, η εξειδίκευση και η ευαισθησία της τεχνικής, η παρουσία παρεμποδιστικών ουσιών και η

αξιοπιστία κάθε τεχνικής καθορίζουν κάθε φορά την κατάλληλη προς εφαρμογή μέθοδο. Επιπλέον, η ποσοτι-

κοποίηση μίας πρωτεΐνης μικρής συγκέντρωσης ή η απομάκρυνση ανεπιθύμητων χημικών ενώσεων απαιτεί

την εφαρμογή επιπρόσθετων τεχνικών.

Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμίδης αποτελεί ευρύτατα διαδεδομένη μέθοδο για

τον διαχωρισμό διαφορετικών πρωτεϊνών που συνυπάρχουν σε ένα δείγμα και επίσης για τον έλεγχο της καθα-

ρότητας πρωτεϊνικών δειγμάτων και την ανίχνευση ανεπιθύμητων προσμίξεων. Επιπλέον, η διαδικασία αποτε-

λεί ουσιαστικό προπαρασκευαστικό στάδιο για την ενδελεχέστερη μελέτη των πρωτεϊνών, όπως κατά την ανο-

σοχημική τους ταυτοποίηση με την εφαρμογή της ανοσοαποτύπωσης. Αρχή λειτουργίας της μεθόδου αποτελεί

ο διαχωρισμός των μορίων ανάλογα με το μέγεθος ή το φορτίο τους ή συνδυασμό των παραμέτρων, κατά τη

μετακίνησή τους εντός ομογενούς ηλεκτρικού πεδίου. Η περισσότερο διαδεδομένη παραλλαγή της μεθόδου

είναι με τη χρήση του δωδεκυλοθειικού νατρίου σε αποδιατακτικές συνθήκες, όπου είναι επιπλέον δυνατός και

ο προσδιορισμός των μοριακών μαζών των πρωτεϊνικών υπομονάδων. Ο διαχωρισμός πραγματοποιείται με

βάση τη μοριακή τους μάζα. Η πηκτή βαθμίδωσης ακρυλαμιδίου πλεονεκτεί έναντι της ομοιογενούς πηκτής,

καθώς επιτρέπει τον διαχωρισμό πρωτεϊνών ευρύτερης κλίμακας μοριακών μαζών.

Στη μη αποδιατακτική πηκτή, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται τόσο βάσει του μεγέθους, όσο και του ηλε-

κτρικού τους φορτίου. Παραλλαγή του ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού αποτελεί και η ισοηλεκτρική εστίαση.

Στην ισοηλεκτρική εστίαση ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με τη μετακίνηση των πρωτεϊνών, υπό την επίδραση

ηλεκτρικού πεδίου, σε πηκτή διαβαθμιζόμενης τιμής pH. Κάτω από αυτές τις συνθήκες, η πρωτεΐνη μετακινεί-

ται μέχρι να φτάσει σε ένα σημείο στην πηκτή, όπου η τιμή pH γίνεται ίση με το ισοηλεκτρικό σημείο της

πρωτεΐνης.

Η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση είναι ιδιαίτερα σημαντική στην περίπτωση που απαιτείται ανάλυση και

διαχωρισμός σε ιδιαιτέρως πολύπλοκα μείγματα.

Βιομόρια με μικρό μοριακό βάρος, όπως αμινοξέα, ολιγοσακχαρίτες και διάφορα είδη λιπιδίων, ανι-

χνεύονται, διαχωρίζονται και ποσοτικοποιούνται με τη χρήση χρωματογραφικών μεθόδων. Οι χρωματογραφι-

κές μέθοδοι χρησιμοποιούν μια κινητή φάση και μία στατική φάση, ενώ για τον διαχωρισμό των διαφόρων

βιομορίων εκμεταλλεύονται τις διαφορές τους ως προς το ηλεκτρικό φορτίο και τις οξεοβασικές τους ιδιότητες,

το μέγεθος των μορίων, την προσρόφησή τους σε διάφορα μέσα ή την κατανομή τους μεταξύ δύο φάσεων,

αλλά και διαφορές στον βαθμό προσροφήσεώς τους σε διάφορα υλικά.

Η χρωματογραφία συγγένειας εκμεταλλεύεται τη χημική συγγένεια ορισμένων πρωτεϊνών για ειδικές

χημικές ομάδες και εφαρμόζεται σε εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις. Περιλαμβάνει μια διαφορετική σειρά από

μεθόδους καθαρισμού, οι οποίες βασίζονται σε μια εξειδικευμένη σχέση μεταξύ ορισμένης πρωτεΐνης και του

προσδέτη της. Ο προσδέτης μπορεί να είναι κάποιο εξειδικευμένο βιομόριο, όπως ένα πεπτίδιο ή μπορεί να

αλληλεπιδρά μη ειδικά με το μόριο - στόχο (π.χ. λεκτίνες).

Στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής, η οποία αποτελεί την περισσότερο διαδεδομένη και κοινά χρη-

σιμοποιούμενη μέθοδο χρωματογραφίας για τον καθαρισμό των πρωτεϊνικών μορίων, οι πρωτεΐνες διαχωρίζο-

νται κυρίως βάσει του καθαρού ηλεκτρικού τους φορτίου. Η αρχή λειτουργίας της μεθόδου επιτρέπει στην

πρωτεΐνη να δεσμευτεί, ακόμα και αν αυτή περιέχεται σε αρκετά μεγάλο όγκο φέροντος διαλύματος, οπότε η

μέθοδος καθίσταται ιδιαίτερα χρήσιμη στα πρώτα βήματα απομόνωσης και καθαρισμού του μορίου-στόχου

από το ακατέργαστο μίγμα στο οποίο συνυπάρχει με πλειάδα άλλων μορίων.

Στη χρωματογραφία διήθησης ή μοριακού αποκλεισμού σε πηκτή, ο διαχωρισμός πραγματοποιείται με

μοναδικό κριτήριο τη μοριακή μάζα των υπό διαχωρισμό μορίων. Κατά τον διαχωρισμό, τα ευμεγέθη πρωτεϊ-

νικά μόρια εκλούονται σε μικρότερους χρόνους συγκριτικά με τα μικρομοριακά πρωτεϊνικά συστατικά, διότι

δεν εισχωρούν στο εσωτερικό των κόκκων του υλικού πλήρωσης της στήλης. Σε αυτήν την παραλλαγή χρωμα-

τογραφικής ανάλυσης δεν απαιτείται η χρήση εξειδικευμένου προσδέτη και έτσι μειώνεται αισθητά ο κίνδυνος

απώλειας της πρωτεΐνης, λόγω μη αναστρέψιμης πρόσδεσης στον προσδέτη, καθώς και η πιθανότητα ελάττω-

σης της λειτουργικότητάς της, λόγω εφαρμογής ακραίων συνθηκών έκλουσης.

Πέρα όμως από τις παραπάνω, κλασικές θα τολμούσαμε να πούμε μεθόδους ανάλυσης πρωτεϊνών, οι

οποίες και θα αναλυθούν διεξοδικά στον παρόντα εργαστηριακό οδηγό, υπάρχουν και άλλες σύγχρονες, περισ-

σότερο ειδικές και αναλυτικές προσεγγίσεις στην ίδια κατεύθυνση, στις οποίες θα κάνουμε μια σύντομη ανα-

φορά χάριν της γνωστικής πληρότητας του πονήματος και της σφαιρικότερης και ενιαίας αντίληψης περί του

τρόπου επεξεργασίας και ανάλυσης των πολυσύνθετων αυτών βιομορίων.

Η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέθοδος (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) απο-

τελεί μια ευαίσθητη και ειδική αναλυτική μέθοδο για εντοπισμό και ποσοτική εκτίμηση διαλυτών βιομορίων-

αντιγόνων (κυρίως πρωτεϊνικής φύσεως). Η χρήση συζευγμένου ενζύμου που παράγει σήμα με χρωμοαντί-

δραση αντί ραδιενέργειας καθιστά την ELISA όχι μόνο περισσότερο ευαίσθητη, αλλά και ασφαλέστερη από τη

RIA (βλ. παρακάτω), ενώ διατηρεί την υψηλή ειδικότητα που προσδίδει ο δεσμός παράτοπου - επίτοπου (ο

παράτοπος είναι η ειδική θέση του αντισώματος στην οποία γίνεται η πρόσδεση του επιτόπου του αντιγόνου).

Το σεσημασμένο αντίσωμα καθίσταται ορατό µε την προσθήκη χρωμογόνου. Η ποσότητα του εξεταζόμενου

αντισώματος μετριέται εκτιμώντας την ποσότητα του έγχρωμου τελικού προϊόντος µε σάρωση της οπτικής

πυκνότητας των φρεατίων του πλακιδίου αντίδρασης.

Η RIA (Radioimmunoassay) αποτελεί ιδιαίτερα ευαίσθητη ανοσοχημική μέθοδο, ευρέως εφαρμοζό-

μενη για τη μέτρηση - ποσοτικοποίηση πρωτεϊνικών αντιγόνων χαμηλής συγκέντρωσης. Κατά την εφαρμογή

της μεθόδου, γνωστή ποσότητα αντιγόνου ραδιοσημαίνεται με τη χρήση συνήθως I125. Γνωστή ποσότητα σε-

σημασμένου αντιγόνου και ποσότητα δείγματος (που πιθανόν να περιέχει το ελεύθερο αντιγόνο) επωάζονται

με ειδικό αντίσωμα, συνήθως μονοκλωνικό. Το σεσημασμένο αντιγόνο, ανταγωνίζεται με το αντιγόνο του δείγ-

ματος για πεπερασμένο αριθμό παρατόπων του αντισώματος. Τα προσδεμένα αντιγόνα διαχωρίζονται με κα-

τάλληλο τρόπο από τα ελεύθερα και μετράται η ραδιενέργεια είτε του υπολειπόμενου ελεύθερου σεσημασμένου

αντιγόνου στο υπερκείμενο υγρό είτε η ραδιενέργεια του συμπλοκοποιημένου αντιγόνου στο ίζημα. Υψηλά

ποσά ραδιενέργειας καταδεικνύουν χαμηλή συγκέντρωση του αντιγόνου στο δείγμα και αντίστροφα. Έτσι, η

μετρούμενη ραδιενέργεια είναι αντιστρόφως ανάλογη με τη συγκέντρωση του υπό μελέτη αντιγόνου στο

δείγμα.

Η ανοσοδιάχυση είναι μέθοδος ποιοτικής και/ή ποσοτικής μέτρησης της συγκέντρωσης πρωτεϊνικών

συστατικών σε κάποιο βιολογικό υγρό. Είναι μια εξαιρετικά δημοφιλής τεχνική λόγω της ευρείας διαθεσιμό-

τητας και της απλότητάς της. Η αρχή της μεθόδου είναι απλή: το αντιγόνο διαχέεται σε πηκτή αγαρόζης, στην

οποία το αντίσωμα είναι ομοιόμορφα κατανεμημένο. Η περιοχή του ιζήματος που σχηματίζεται όταν η διάχυση

ολοκληρωθεί (διάμετρος δακτυλίου), είναι ανάλογη με την ποσότητα του παρόντος αντιγόνου. Η διπλή ανοσο-

διάχυση χρησιμοποιείται για την εύρεση της συγγένειας μεταξύ αντιγόνου - αντισώματος και επίσης για τον

ποσοτικό προσδιορισμό του αντιγόνου σε ένα δείγμα.

Η ανοσοκαθήλωση αποτελεί ποιοτική μέθοδο με αισθητά υψηλότερη ευαισθησία συγκριτικά με την

ανοσοηλεκτροφόρηση. Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται ανάλογα με τα φορτία τους σε πήκτωμα αγαρόζης. Στη

συνέχεια γίνεται ταυτοποίηση των πρωτεϊνών μέσω ανοσοκαθήλωσης, χρησιμοποιώντας ειδικούς μονοδύνα-

μους αντιορούς. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται όχι μόνο η ταυτοποίηση της μονοκλωνικής πρωτεΐνης αλλά

και ο καθορισμός του τύπου των ελαφρών και βαριών αλυσίδων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται ιδιαίτερα σε

περιπτώσεις που πρέπει να ανιχνευθούν εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών.

Ο ανοσοφθορισμός αποτελεί ανοσοϊστοχημική τεχνική κατά την οποία το ειδικό σύμπλεγμα αντιγόνου-

αντισώματος (Ag-Ab complex) γίνεται ορατό στο μικροσκόπιο φθορισμού, με τη βοήθεια τροποποιημένου α-

ντισώματος που φέρει προσδεμένη φθοροχρωστική. Ο παράτοπος προσδένεται στον επίτοπο, με αποτέλεσμα

τον ειδικό εντοπισμό του φθοροχρώματος σε αυτόν. Υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας, το φθορό-

χρωμα εκπέμπει φως στην ορατή περιοχή, με αποτέλεσμα την ευκρινή και ειδική διάκριση του επιτόπου.

Η αποτύπωση αποτελεί μια ευρεία μέθοδο ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυσης βιολογικών μακρομο-

ρίων, στην οποία, μόρια που έχουν ήδη διαχωριστεί μεταξύ τους, μεταφέρονται σε σταθερό υπόστρωμα, συνή-

θως μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή πολυβινυλοχλωριδίου, όπου και αφήνουν το αποτύπωμά τους (στύπωμα). Τα

μεταφερθέντα μόρια υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία για τον ποιοτικό και ποσοτικό τους προσδιορισμό. Η

μέθοδος που εφαρμόζεται για την ανάλυση πρωτεϊνικών μορίων αναφέρεται ως ανοσοαποτύπωση ή ανάλυση

κατά Western. Οι πρωτεΐνες που έχουν μεταφερθεί στη μεμβράνη ανιχνεύονται εν συνεχεία με τη χρήση κα-

τάλληλων αντισωμάτων σε δυο στάδια. Προηγείται η στόχευση της υπό εξέταση πρωτεΐνης με ειδικό, έναντι

αυτής αντίσωμα και ακολουθεί η προσθήκη δεύτερου αντισώματος, που αναγνωρίζει το πρώτο και διαθέτει

συζευγμένο ένζυμο που μπορεί να αντιδρά με ορισμένο υπόστρωμα και να παράγει οπτικά διακριτό προϊόν

(αντίδραση χημειοφωταύγειας). Η ένταση του σήματος είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση της υπό α-

νάλυση πρωτεΐνης.

Η χημειοφωταύγεια ως φυσικοχημικό φαινόμενο λαμβάνει χώρα, όταν ενέργεια υπό τη μορφή φωτός,

απελευθερώνεται από υλικά, κατά τη διάρκεια μιας χημικής αντίδρασης. Σημαντικός αριθμός μορίων διαθέτει

την ικανότητα εκδήλωσης χημειοφωταύγειας, μεταξύ αυτών, η λουμινόλη, εστέρες της ακριδίνης, παράγωγα

του ρουθενίου κ.λπ. Στις χημειοφωταυγιομετρικές μεθόδους, αντί χρωμογόνων ή φθοριζόντων υποστρωμάτων,

χρησιμοποιούνται υποστρώματα τα οποία φωταυγάζουν, έχουν δηλαδή την ιδιότητα να μετατρέπουν μέρος της

ενέργειας από μία χημική αντίδραση σε φωτεινή ακτινοβολία. Η διάρκεια εκπομπής ποικίλλει και κυμαίνεται

από στιγμιαία αναλαμπή, μέχρι εκπομπή σημαντικά μεγάλης χρονικής διάρκειας. Είναι κατάλληλη για την επι-

σήμανση και μέτρηση πρωτεϊνικών μορίων, τόσο αντιγόνων όσο και αντισωμάτων. Η ποσότητα του εκπεμπό-

μενου φωτός είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης του υπό μελέτη και στοχευόμενου μορίου. Σημαντικές

εφαρμογές της μεθόδου στη σύγχρονη διαγνωστική αποτελούν η χρήση της για την ποιοτική και ποσοτική

ανάλυση αντιθυρεοσφαιρινικών αντισωμάτων (anti-TG) και αντισωμάτων κατά της θυρεοειδικής υπεροξειδά-

σης (anti-TPO), σε πολύ κοινές θυρεοειδοπάθειες κ.α.

Κεφάλαιο 1. Εισαγωγικά στοιχεία - προετοιμασία και χειρισμός των

πρωτεϊνικών δειγμάτων

Σύνοψη

Οι πρωτεΐνες αποτελούν εξαιρετικά ετερογενή κατηγορία βιολογικών μακρομορίων. Συχνά παρουσιάζονται ως

ασταθείς, ιδιαίτερα όταν βρίσκονται στο φυσικό τους περιβάλλον, το οποίο ποικίλλει σημαντικά τόσο μεταξύ πε-

ριοχών εντός του κυττάρου όσο και στον εξωκυττάριο χώρο. Οι πρωτεΐνες διακρίνονται σε διαλυτές ή μεμβρανικές

(ανάλογα με το πού εντοπίζονται), και ανάλογα με τη δράση τους, σε αυτές που έχουν καταλυτικό και σε εκείνες

που διαδραματίζουν καθαρά δομικό ρόλο. Κάθε πρωτεΐνη απαιτεί ιδιαίτερη μεταχείριση όταν απομακρύνεται από

το φυσιολογικό βιολογικό περιβάλλον της. Οι απαιτήσεις αυτές πρέπει να ικανοποιούνται, διαφορετικά η πρωτεΐνη

ενδέχεται να χάσει τον λειτουργικό της ρόλο. Έτσι, ο προσδιορισμός αυτών των απαιτήσεων είναι συχνά δύσκολος

κατά την απομόνωση των πρωτεϊνών. Η δυσκολία έγκειται είτε στη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης έναντι της

εξωτερικής πρωτεόλυσης που μπορεί να υποστεί είτε στη διατήρηση της ενζυμικής της ενεργότητας ή των προσ-

δετών της. Για την απομόνωση ή την ταυτοποίηση μιας ενδοκυττάριας πρωτεΐνης πρέπει να αναπτυχθεί μια απο-

τελεσματική μέθοδος λύσης του κυττάρου, η οποία να απελευθερώνει την πρωτεΐνη σε διαλυτή μορφή από το

κύτταρο σε ένα διάλυμα με καλώς προσδιοριζόμενη σύσταση. Επειδή το βήμα αυτό είναι το αρχικό βήμα για όλες

τις επόμενες διαδικασίες, η μέθοδος λύσης δεν πρέπει να καταστρέφει την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Υπάρχουν

συγκεκριμένες διαδικασίες λύσης για συγκεκριμένους τύπους ιστών ή κυττάρων, αλλά σε μερικές περιπτώσεις,

είναι απαραίτητο να εξετάζονται εναλλακτικές μέθοδοι με στόχο τη βελτίωση της καθαριότητας των πρωτεϊνικών

προϊόντων και τη μεγιστοποίηση του ποσοστού ανάκτησης των ενεργών πρωτεϊνών. Μερικές φορές, κατά την

κυτταρική λύση δεν απελευθερώνεται ενεργός πρωτεΐνη στο διάλυμα. Αυτή είναι η περίπτωση των έγκλειστων

σωματίων (συσσωρεύσεις αδιάλυτης πρωτεΐνης), τα οποία συχνά σχηματίζονται στο εσωτερικό βακτηριακών κυτ-

τάρων, που έχουν γενετικά τροποποιηθεί ώστε να παράγουν την πρωτεΐνη αυτή σε πολύ υψηλά επίπεδα. Σε αυτές

τις περιπτώσεις πρέπει να λαμβάνονται μέτρα για τη μετατροπή της πρωτεΐνης σε ενεργή διαλυτή μορφή σε κάποιο

σημείο πριν ή κατά τη διάρκεια του καθαρισμού της. Η πρωτεϊνική συγκέντρωση μπορεί να υπολογιστεί από μια

πληθώρα διαθέσιμων μεθόδων. Παράμετροι όπως η εξειδίκευση και η ευαισθησία της τεχνικής, η παρουσία πα-

ρεμποδιστικών ουσιών, καθορίζουν κάθε φορά την κατάλληλη προς εφαρμογή μέθοδο. Επιπλέον, η ποσοτικοποί-

ηση μίας πρωτεΐνης μικρής συγκέντρωσης ή η απομάκρυνση ανεπιθύμητων χημικών ενώσεων απαιτεί την εφαρ-

μογή επιπρόσθετων τεχνικών. Στην ενότητα «Προετοιμασία για την απομόνωση της πρωτεΐνης», θα γίνει αναφορά

ενός αριθμού αυτών των παραμέτρων και θα δοθούν γενικές οδηγίες και πηγές για την εργαστηριακή ενασχόληση

με τις πρωτεΐνες. Η ενότητα «Πρωτεϊνική απομόνωση και διαλυτοποίηση» αναφέρεται στις θεμελιώδεις τεχνικές

κυτταρικής λύσης. Στις ενότητες «Υπολογισμός πρωτεϊνικής συγκέντρωσης» και «Συμπύκνωση πρωτεϊνικών δια-

λυμάτων» θα αναφερθούμε στον προσδιορισμό της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης και στην συμπύκνωση των πρωτε-

ϊνικών διαλυμάτων αντίστοιχα.

Προαπαιτούμενη γνώση

Οι πρωτεΐνες αποτελούν μια ετερογενή ομάδα βιολογικών μακρομορίων με ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην κυτ-

ταρική δομή και λειτουργία. Η ετερογένειά τους απαιτεί μια σειρά χειρισμών που μπορεί και να εξειδικεύονται

κατά περίπτωση και συνεπώς προαπαιτούν τη γνωστική κατάρτιση σε βασικές αρχές παρασκευής σύνθετων δια-

λυμάτων, καθώς και μια ουσιαστική επαφή με το κατεξοχήν «χημικό» κομμάτι της βιοχημείας των σύνθετων

πρωτεϊνικών δομών. Ένα πολύτιμο βοήθημα σε αυτή την κατεύθυνση θα ήταν το ακόλουθο σύγγραμμα: John

McMurry (Τόμος ΙΙ). Οργανική Χημεία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. Πέμπτη Έκδοση, 2005.

1.1 Προετοιμασία για την απομόνωση της πρωτεΐνης

1.1.1 Ρυθμιστικά Διαλύματα

1.1.1.1 Επιλογή Ρυθμιστικών Διαλυμάτων

Ρυθμιστικά διαλύματα ονομάζονται τα διαλύματα εκείνα των οποίων το pH παραμένει πρακτικά σταθερό, όταν

μικρή αλλά υπολογίσιμη ποσότητα ισχυρών οξέων ή βάσεων προστεθεί σε αυτά. Το περιεχόμενο των διαλυ-

μάτων αυτών είναι ένα ασθενές οξύ και η συζυγής του βάση (ΗΑ/Α-) ή μια ασθενής βάση και το συζυγές της

οξύ (Β/ΒΗ+). Η επιλογή του κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος είναι σημαντική ώστε να επιτευχθεί και να

διασφαλιστεί το επιθυμητό pH της πρωτεΐνης καθώς και να εξασφαλιστεί ότι τα πειραματικά αποτελέσματα

μπορούν να αναπαραχθούν.

Οκτώ βασικά χαρακτηριστικά πρέπει να λαμβάνονται πάντοτε υπόψη κατά την επιλογή ενός ρυθμιστι-

κού διαλύματος:

η τιμή pKa,

η διακύμανση της pKa σε σχέση με τη θερμοκρασία,

η διακύμανση της pKa σε σχέση με την αραίωση,

η διαλυτότητα της πρωτεΐνης,

η αλληλεπίδραση με άλλα συστατικά (όπως μεταλλικά ιόντα ή/και ένζυμα),

το κόστος των υλικών,

η απορρόφηση που εμφανίζει στο υπεριώδες φως (UV),

η διαπερατότητα των βιολογικών μεμβρανών.

Έτσι, διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα με παρόμοιο pKa πρέπει να χρησιμοποιούνται σε παράλληλα

πειράματα, ώστε να εντοπίζονται τυχόν ανεπιθύμητες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του κύριου συστατικού του ρυθ-

μιστικού διαλύματος και της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Επίσης, ένα ρυθμιστικό διάλυμα είναι καλύτερο να χρησι-

μοποιείται στη χαμηλότερη δυνατή συγκέντρωση, ώστε να αποφεύγονται ανεπιθύμητα αποτελέσματα που προ-

κύπτουν λόγω υψηλής ιονικής ισχύος. Ιδανική συγκέντρωση για ένα ρυθμιστικό διάλυμα θεωρείται η συγκέ-

ντρωση των 50 mM. Η ρυθμιστική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος ελαττώνεται σημαντικά πέρα από 1 μο-

νάδα pH πάνω ή κάτω από την τιμή pKa. Σημειώνεται ότι πολλά ένζυμα μετουσιώνονται μη αναστρέψιμα σε

υψηλές τιμές pH. Το φυσιολογικό pH στα περισσότερα ζωικά κύτταρα είναι 7,0-7,5 στους 37 οC. Εξαιτίας της

επίδρασης της θερμοκρασίας, αυτή η τιμή αυξάνεται περίπου στο 8,0 κοντά στους 0 οC (Scopes, 1982).

Η επιλογή του ρυθμιστικού διαλύματος εξαρτάται επίσης από τη μέθοδο που πρόκειται να εφαρμοστεί:

Για χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σχεδόν κάθε ρυθμι-στικό διάλυμα το οποίο είναι συμβατό με την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει.

Για χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων, προτείνονται τα ρυθμιστικά διαλύματα κατιόντων, όπως το Tris.

Για χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων ή ορυκτού φωσφορικού ασβεστίου (hydroxyapatite), προτείνονται τα ρυθμιστικά διαλύματα ανιόντων, όπως το φωσφορικό άλας.

1.1.1.2 Κανόνες προετοιμασίας των ρυθμιστικών διαλυμάτων

Πρακτικά, το ρυθμιστικό διάλυμα παρασκευάζεται σε θερμοκρασία δωματίου και το pH ρυθμίζεται έτσι ώστε

να είναι σωστό όταν το διάλυμα φτάσει στην επιθυμητή θερμοκρασία. Αντίθετα, το pH μπορεί να ρυθμιστεί

κατευθείαν στη θερμοκρασία που θα χρησιμοποιηθεί το ρυθμιστικό διάλυμα. Σε αυτήν την περίπτωση απαιτεί-

ται το ηλεκτρόδιο του πεχαμέτρου να εξισορροπηθεί στη συγκεκριμένη θερμοκρασία (συνήθως στους 4 οC).

Πρέπει να σημειωθεί ότι η επίδραση της θερμοκρασίας στο pH του ρυθμιστικού διαλύματος μπορεί να ποικίλει.

Ένα αξιοσημείωτο παράδειγμα είναι το Tris, το οποίο έχει pKa που κυμαίνεται από 8,06 στους 25 οC σε 8,85

στους 0 οC. Επίσης, ένα διάλυμα πρέπει να ελέγχεται για την τιμή του pH εφόσον έχουν προστεθεί όλα τα

συστατικά του [π.χ. EDTA (ethylenediaminetetraacetate), DTT, Mg2+] αφού η τιμή του μπορεί να αλλάξει μετά

την προσθήκη αυτών.

Συνηθέστερα, το pH του ρυθμιστικού διαλύματος ρυθμίζεται σε χαμηλές τιμές με προσθήκη HCl και

στις υψηλές τιμές με προσθήκη NaOH ή ΚΟΗ, εκτός αν έχουν δοθεί διαφορετικές οδηγίες. Η βασικότητα του

υδροξειδίου του τετραμεθυλαμμωνίου είναι ισοδύναμη με αυτή του NaOH ή του ΚΟΗ και ως εκ τούτου αυτό

μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη ρύθμιση του pH ενός διαλύματος στο οποίο απαιτείται η ολοκληρωτική απουσία

μονο-, δι-, ή τρισθενών μεταλλικών ιόντων.

Επίσης, διαλύματα όμοιας συγκέντρωσης ρυθμιστικών διαλυμάτων που περιέχουν ή όχι πρωτόνια

(protonated and unprotonated forms) είναι άμεσα διαθέσιμα και μπορούν να αναμειχθούν μέχρι να επιτευχθεί

το επιθυμητό pH. Είναι προτιμότερη η χρήση υπαρχόντων πινάκων ή υπολογισμών για τα αναμειγνυόμενα

συστατικά, αν και συνίσταται η επαλήθευση με ένα πεχάμετρο όπως στο ακόλουθο παράδειγμα:

Προετοιμασία ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού άλατος μεταξύ pH 5,8 και 7,8 σύμφωνα με το

“Buffers” booklet της εταιρείας Calbiochem:

Αποθηκευμένο (μητρικό) διάλυμα Α (0,2 M NaH2PO4). Διαλύουμε 27,6 g NaH2PO4 σε 1 L απιονισμένο νερό.

Αποθηκευμένο (μητρικό) διάλυμα Β (0,2 M Na2HPO4). Διαλύουμε 28,4 g Na2HPO4 σε 1 L απιονισμένο νερό.

pH %A %B pH %A %B pH %A %B

5,8 92,0 8,0 6,5 68,5 31,5 7,2 28,0 72,0

5,9 90,0 10,0 6,6 62,5 37,5 7,3 23,0 77,0

6,0 87,7 12,3 6,7 56,5 43,5 7,4 19,0 81,0

6,1 85,0 15,0 6,8 51,0 49,0 7,5 16,0 84,0

6,2 81,5 19,5 6,9 45,0 55,0 7,6 13,0 87,0

6,3 77,5 22,5 7,0 39,0 61,0 7,7 10,5 89,0

6,4 73,5 26,5 7,1 33,0 67,0 7,8 8,5 91,5

Πίνακας 1.1 Το pH ρυθμιστικών διαλυμάτων ίδιας σύστασης προερχόμενο από τον διαφορετικό βαθμό συμμετοχής των

διαλυμάτων Α και Β.

Σημείωση: οι τιμές του pH δίδονται κατά προσέγγιση και ποικίλλουν σύμφωνα με τη θερμοκρασία και την

κατάσταση των συστατικών που αναμειγνύονται και μετρούνται. Επομένως, πρέπει να επαληθεύονται με ένα

πεχάμετρο. Όμως, τα ηλεκτρόδια του πεχαμέτρου από μόνα τους υπόκεινται σε σημαντική ποικιλομορφία. Έ-

τσι, για μέγιστη επαναληψιμότητα, είναι καλύτερο να ρυθμίσουμε το pH προσθέτοντας γνωστές ποσότητες του

κάθε συστατικού, παρά να μετρούμε κάθε φορά με ένα πεχάμετρο και να διορθώνουμε.

1.1.1.3 Περιορισμοί των Βασικών Ρυθμιστικών Διαλυμάτων

Τα ρυθμιστικά διαλύματα συχνά έχουν τη μεγαλύτερη συγκέντρωση από όλα τα συστατικά σε ένα πρωτεϊνικό

διάλυμα και μπορεί να επιδρούν καθοριστικά σε μια πρωτεΐνη ή ένα ένζυμο. Τα ρυθμιστικά διαλύματα αποτε-

λούνται από ανόργανα συστατικά (φωσφορικό άλας, βορικό άλας, διττανθρακικό άλας) που μπορεί να αλλη-

λεπιδρούν με τα ένζυμα ή με τα υποστρώματα αυτών, επηρεάζοντας τις λειτουργίες τους. Ορισμένα ρυθμιστικά

διαλύματα κατά την αλληλεπίδρασή τους με δι- και τρισθενή μεταλλικά ιόντα, προκαλούν την απελευθέρωση

πρωτονίων, τη μείωση του pH, τον σχηματισμό «δακτυλιδιού» μεταλλικού ιόντος και αδιάλυτων συμπλόκων.

Τα ρυθμιστικά διαλύματα με μειωμένη ισχύ πρόσδεσης σε μέταλλα όπως τα PIPES, TES, HEPES και CAPS

προτιμώνται για τη μελέτη ενζύμων που απαιτούν την παρουσία μετάλλων κατά την επεξεργασία τους

(Blanchard, 1984).

Φωσφορικό άλας:

ανεπαρκές ρυθμιστικό διάλυμα στην κλίμακα 8-11 του pH,

καταβυθίζει ή συνδέει πολυσθενή κατιόντα,

αναστέλλει μεγάλη ποικιλία ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων κινασών και αφυδρογονασών,

παρουσιάζει εξάρτηση από το pK σε ρυθμιστικά διαλύματα.

Κιτρικό άλας:

δεσμεύει πρωτεΐνες και σχηματίζει σύνθετα μέταλλα.

Cacodylate:

τοξικό.

Ανθρακικό άλας:

περιορισμένη διαλυτότητα και όσο βρίσκεται σε ισορροπία με CO2, το πείραμα πρέπει να γί-νεται σε κλειστό σύστημα.

ADA [N-(Carbamoylmethyl) iminodiacetic acid)]:

απορροφά φως μήκους κύματος μέχρι 260 nm και συνδέει τα μεταλλικά ιόντα.

MOPS [3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid sodium salt]:

εμποδίζει τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης με τη μέθοδο Lowry, άλλα όχι με Bradford ή BCA.

HEPES [4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid]:

εμποδίζει τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης με τη μέθοδο Lowry άλλα όχι με Bradford ή BCA,

σχηματίζει ελεύθερες ρίζες κάτω από ποικίλες συνθήκες και πρέπει να αποφεύγεται κατά τη μελέτη οξειδοαναγωγικών συστημάτων.

Tris:

ρυθμιστικό διάλυμα με pH χαμηλότερο του 7,0,

συμμετέχει σε ποικίλες ενζυμικές αντιδράσεις όπως αυτές που καταλύονται από αλκαλικές φω-σφατάσες,

διαπερνά τις βιολογικές μεμβράνες,

επηρεάζεται από τη συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος και τη θερμοκρασία.

Βορικό άλας:

σχηματίζει σύμπλοκα με μόνο- και ολιγοσακχαρίδια, νουκλεϊκά οξέα, πυριδινικά νουκλεοτίδια και τη γλυκερίνη.

1.1.2 Άλατα, Μεταλλικά ιόντα και Χηλικά άλατα

1.1.2.1 Ιοντική ισχύς

Η ιοντική ισχύς του διαλύματος εκφράζει τη μέση ιοντική πυκνότητά του και άρα αποτελεί μέτρο των ηλεκτρο-

στατικών αλληλεπιδράσεων σε αυτό. ΚCL ή NaCl συγκέντρωσης 0,1 – 0,2 Μ χρησιμοποιείται σε φυσιολογικές

συνθήκες για πολλές εφαρμογές.

1.1.2.2 Δισθενή κατιόντα (Divalent Cations)

Όταν σχηματίζεται σύμπλοκο μεταξύ των συστατικών ενός ρυθμιστικού διαλύματος και ενός δισθενούς κατιό-

ντος όπως το Ca2+ ή το Mg2+, η δυνατότητα εξισορρόπησης των υδρογονοκατιόντων μειώνεται (άμβλυνση

ρυθμιστικής ικανότητας διαλύματος). Επιπροσθέτως, η διαθεσιμότητα των μεταλλικών ιόντων που συμμετέ-

χουν σε μια ενζυμική αντίδραση πιθανότατα θα μειωθεί. Έτσι, πρέπει να είμαστε προσεκτικοί με τα ρυθμιστικά

διαλύματα που δυνητικά αλληλεπιδρούν με μέταλλα. Να αποφεύγεται η χρήση ρυθμιστικών διαλυμάτων Tris-

όταν απαιτείται μεταλλικό συνένζυμο για την ενεργοποίηση ή σταθεροποίηση της ενζυμικής πρωτεΐνης.

1.1.2.3 Χηλικοί παράγοντες (Chelators)

Η χρήση χηλικών παραγόντων μεταλλo-ιόντων (δεσμεύουν μεταλλικά ιόντα) είναι απαραίτητη ώστε να περιο-

ριστούν οι επιδράσεις τους. Για να εξαλειφθούν τα ίχνη βαρέων μετάλλων από τα ρυθμιστικά διαλύματα χρη-

σιμοποιείται συνήθως EDTA συγκέντρωσης 0,1 - 5 mM (Scopes, 1982). Οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενες ου-

σίες με χηλική δράση είναι το EDTA και το EGTA. Ενώ το EDTA εμφανίζει γενικά ισχυρή και μη ειδική σχέση

για ποικιλία μετάλλων, η σχέση του EGTA με το ασβέστιο είναι σημαντικά πιο ισχυρή σε σχέση με το μαγνήσιο

(Blanchard, 1984). Το ο-Phenanthroline δεσμεύει τον ψευδάργυρο, ενώ το m-Phenanthroline όχι. Να σημειωθεί

ότι οι χηλικοί παρά�