Государственное бюджетное...

Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение

города Москвы "Школа Глория"

Проект по биологии

Тема:

ГМО в продуктах питания

Научные руководители: Сергеева Ольга Викторовна

учитель биологии

Дорофеева Эльвира Алексеевна

ведущий методист отдела научно-просветительной

деятельности ГАУК «Парк Зарядье»

Выполнила проект: Колесова Анастасия Дмитриевна

ученица 9к класса

Москва 2019

1

Оглавление

1. Резюме…………………………………………………………………………2

2. Введение……………………………………………………………………….3

3. Актуальность………………………………………………………………….4

4. Проблема………………………………………………………………………4

5. Цель работы…………………………………………………………………...4

6. Задачи проекта………………………………………………………………...4

7. Объект…………………………………………………………………………4

8. Предмет………………………………………………………………………..4

9. Конечный продукт…………………………………………………………….4

10. Литературный обзор………………………………………………………….5

10.1. Что такое ГМО?.......................................................................................5

10.2. История создания………………………………………………………6

10.3. Применение…………………………………………………………….6

10.4. Влияние на организм человека………………………………………...8

10.5. Методы определения наличия ГМО в пищевых продуктах………..10

11. Материалы и методы………………………………………………………...13

11.1. Опрос…………………………………………………………………..13

11.2. Проведение эксперимента по выявлению трансгенных материалов

кукурузы в опытных образцах………………………………………..15

11.2.1. Выделение ДНК из опытных образцов……………………..15

11.2.2. Проведение качественной полимеразной цепной реакции

(ПЦР)……………………………………………………………..18

11.2.3. Постанова электрофореза…………………………………...20

11.2.4. Проведение количественной полимеразной цепной реакции

в реальном времени (ПЦР-РВ)………………………………….22

12. Результаты…………………………………………………………………...24

13. Заключение…………………………………………………………………..28

14. Выводы………………………………………………………………………29

15. Список литературы…………………………………………………………30

2

Резюме

На сегодняшний день проблема генно-модифицированных продуктов

занимает одно из первых мест в обсуждении общественности. Вопрос о

влиянии ГМО на организм человека до сих пор остается открытым, из-за

неоднозначности исследований. Поэтому, правительства разных стран

пришли к мнению, что продукты питания должны содержать информацию о

наличии ГМО в своем составе, чтобы обеспечить свободный выбор населения

на употребление или отказ.

Данный проект направлен на определение содержания либо отсутствия

биоматериала трансгенной кукурузы в продуктах питания, а также на

определение распространения продуктов с содержанием ГМ кукурузы в

ассортименте российских магазинов.

Чтобы достичь поставленных целей, была проведена большая работа, которая

включала в себя изучение информационных источников по данной теме. Были

изучены как схожие, так и диаметрально противоположные мнения ученых.

Проводился социологический опрос населения об отношении к продуктам

питания с содержанием ГМО. По результатам были составлены диаграммы,

отображающие отношение людей к данной проблеме. Проводился

эксперимент по выявлению трансгенных материалов кукурузы в опытных

образцах с использованием различных методов определения содержания ГМО

в продуктах. Работа проводилась на базе лаборатории «Заповедного

посольства» парка «Зарядья».

В процессе проведения проекта из полученных результатов сформировалось

мнение о необходимости более глубокого изучения данной темы и увеличение

контроля за нанесением маркировки о содержании ГМО на продуктах

питания, так как основная масса производителей такой информацией

пренебрегает.

3

Введение

На данный момент в мире происходит активное развитие общества, которое в

свою очередь требует внедрения в нашу жизнь новых технологий.

Производство генно-модифицированных продуктов – это важнейшее

достижение современной науки. Оно может принести как пользу, так и

огромный вред. Как известно, человек есть то, что он ест и конечно же

качество питания – это основополагающий фактор нашего здоровья и

долголетия. Относительно недавно люди научились изменять гены живых

организмов, что открыло огромный простор для экспериментов. Но развитие

генной инженерии вызвало волнение в обществе, как и у любого

нововведения, у него появились свои сторонники и противники. Возможно,

генно-модифицированные продукты помогут избавиться от угрозы голода,

нависшей над человечеством, будут содержать ценные питательные вещества,

которые в обычных продуктах были в недостатке. Естественно, они будут

иметь более привлекательный вид и наконец, они станут источниками успеха

экономики. Но вероятно и то, что новое «чудо науки» может вызвать волну

опасных заболеваний, экологических катастроф и мутаций человека. На

сегодняшний день употребление ГМО – это своего рода эксперимент, потому

продукты питания должны содержать информацию о наличии ГМО в составе,

это обеспечит свободу выбора человека.

4

Актуальность: генно-модифицированные продукты уже давно занимают

место на прилавках наших магазинов. Однако, общественное мнение по этому

поводу неоднозначно и ученые по всему миру еще не сумели окончательно

доказать пользу или вред ГМО. Поэтому на сегодняшний день употребление

ГМО – это своего рода эксперимент. Несмотря на это многие производители

тщательно скрывают истинный состав их продукции от потребителей.

Проблема: в связи со стремительным ростом населения Земли возникает

проблема острой нехватки производства продуктов питания, решением

которой, по мнению ученых и специалистов, является массовое создание

ГМО. В свою очередь возникает вопрос о его безопасности. В связи с этим,

необходимо оповещать население о составе потребляемой пищи.

Цель работы: определить содержание либо отсутствие биоматериала

трансгенной кукурузы в продуктах питания. Сделать выводы о

распространение продуктов с содержанием ГМ кукурузы в ассортименте

российских магазинов.

Задачи проекта:

1. Изучить информационные источники по теме ГМО

2. Изучить методы определения содержания ГМО в продуктах

3. Провести опрос населения об отношении к продуктам питания с

содержанием ГМО

4. Провести эксперимент по выявлению трансгенных материалов

кукурузы в опытных образцах

5. Сформировать выводы на основе полученных результатов

Объект: продукты растительного происхождения, содержащие кукурузу

Предмет: наличие ГМ кукурузы в продуктах питания

Конечный продукт: Результаты диагностики продуктов питания на наличие

ГМО

5

Литературный обзор

1.1. Что такое ГМО?

Генетически модифицированные организмы (ГМО) – это организмы, генотип

которых был искусственно изменен при помощи методов генной инженерии.

Это определение применяют для растений (ГМР), животных (ГМЖ) и

микроорганизмов (ГММ). Также существует более узкое определение этому

понятию. ГМО – это организмы, чей генетический материал (ДНК) был

изменен, при условии того, что такие изменения были бы невозможны в

природе в результате размножения или естественной рекомбинации. [4]

Генетические изменения, как правило, производятся в научных или

хозяйственных целях. Продовольственные и сельскохозяйственные

организации рассматривают использование методов генной инженерии для

создания трансгенных сортов растений как необходимую часть развития

сельского хозяйства. Прямой перенос генов, отвечающих за полезные

признаки, - естественный этап развития работ по селекции растений и

животных, эта технология помогает расширить наши возможности по части

создания новых сортов и передачи полезных признаков между

нескрещивающимися видами. [4]

Основным видом генетической модификации в настоящее время является

использование трансгенов для создания трансгенных организмов. Три

четверти всех модификаций направлены на повышение устойчивости к

пестицидам (средствам против сорняков или насекомых). Другое важное

направление – это, создание растений устойчивых к самим насекомым, а также

к различным вирусам, которые они переносят. Форму, цвет и вкус

сельскохозяйственных культур изменяют реже, а вот выведением растений с

повышенным количеством витаминов и микроэлементов сейчас занимаются

очень активно. Например, в модифицированной кукурузе содержится в 8 раз

больше витамина C и в 169 раз бета-каротина чем обычной. На сегодняшний

день большинство модифицированных продуктов – это, конечно же кукуруза,

соя, хлопок, рапс, пшеница и картофель. Плантации по выращиванию ГМО

6

занимают более 80 млн. га. и занимаются этим более чем в 20 странах мира.

[4]

1.2. История создания

История создания ГМО начинается в далеком 1972 году. Американский

инженер, ученый биохимик Пол Наим Берг, смог соединить два чужеродных

гена в один, который самостоятельно в природе никак не смог бы

образоваться. Это открыло путь для экспериментов с различными живыми

организмами. Полученным трансгенным организмам стали давать различные

названия: «ГМО», «рекомбинантные», «генно-инженерные», «живые

измененные» и даже «химерные». [5]

В 1978 году биохимик Герберт Бойер открыл компанию, которая создала,

трансгенный продукт, производящий инсулин человека. Спустя 14 лет, в 1992

году, в Китае приступили к выращиванию табака, устойчивого к насекомым.

Через 2 года, в 1994 году, благодаря фирме «Monsanto» из США, появился

первый трансгенный помидор, который в дальнейшем был выпущен в

массовое производство. Овощ не боялся транспортировок, мог сохранять

презентабельный вид в течении 6 месяцев и дозревать в помещение при

повышении температуры воздуха до +23-25 градусов Цельсия. Именно 1994

год считают началом массового производства трансгенных продуктов

питания.[5]

1.3. Применение

В настоящее время генетически модифицированные организмы широко

используются в фундаментальных и прикладных научных исследованиях. С

помощью генно-модифицированных организмов исследуются

закономерности развития некоторых заболеваний, например, болезнь

Альцгеймера или рак, процессы старения и регенерации, изучается

функционирование нервной системы, решается ряд других актуальных

проблем биологии и современной медицины. [6]

В фармацевтической промышленности и медицине.

7

Генетически модифицированные организмы используются в прикладной

медицине с 1982 года. В этом году зарегистрирован в качестве лекарства

генно-инженерный человеческий инсулин, получаемый с помощью

генетически модифицированных бактерий. На данный момент

фармацевтическая промышленность выпускает большое количество

лекарственных средств на основе рекомбинантных белков человека: такие

белки производят генетически модифицированные микроорганизмы, либо

генетически модифицированные клеточные линии животных. Генетическая

модификация в этом случае заключается в том, что в клетку интродуцируется

ген белка человека (например, ген инсулина, ген интерферона, ген бета-

фоллитропина). Эта технология позволяет выделять белки не из донорской

крови, а из ГМ-организмов, что снижает риск инфицирования препаратов и

повышает чистоту выделенных белков. Ведутся работы по созданию

генетически модифицированных растений, продуцирующих компоненты

вакцин и лекарств против опасных инфекций (чумы, ВИЧ). На стадии

клинических испытаний находится проинсулин, полученный из генетически

модифицированного сафлора. Успешно прошло испытания и одобрено к

использованию лекарство против тромбозов на основе белка из молока

трансгенных коз. Бурно развивается новая отрасль медицины — генотерапия.

В её основе лежат принципы сходные с использующимися при создании ГМО,

но в качестве объекта модификации выступает геном соматических клеток

человека. В настоящее время генотерапия — один из главных методов лечения

некоторых заболеваний. Так, уже в 1999 году каждый четвёртый ребёнок,

страдающий тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), лечился

с помощью генной терапии. Также генотерапию, кроме использования в

лечении, предлагают использовать для замедления процессов старения. [6]

В сельском хозяйстве и животноводстве.

Генная инженерия используется для создания новых сортов растений,

устойчивых к засухе, низким температурам и вредителям, обладающих

лучшими ростовыми и вкусовыми качествами. Проходят испытания

8

генетически модифицированных сортов лесных пород со значительным

содержанием целлюлозы в древесине и быстрым ростом. Созданы сорта и

породы продуктов, которые обладают высокой питательной ценностью и

содержат повышенные количества незаменимых аминокислот и витаминов.

Создаваемые новые породы животных отличаются, в частности, ускоренным

ростом и продуктивностью. Методом генного редактирования удалось создать

свиней, которые потенциально устойчивы к африканской свиной чуме.

Изменение пяти «букв» в коде ДНК гена RELA у выращиваемых на фермах

животных, позволило получить вариант гена, который, предположительно

защищает их диких сородичей: бородавочников и кустарниковых свиней от

этого заболевания. [6]

Другие направления применения ГМО.

Разрабатываются генетически модифицированные бактерии, способные

производить экологически чистое топливо.

В 2003 году на рынке появилась GloFish — первый генетически

модифицированный организм, созданный с эстетическими целями, и первое

домашнее животное такого рода. Благодаря генной инженерии популярная

аквариумная рыбка Данио рерио получила несколько ярких флуоресцентных

цветов на своем брюшке. [6]

В 2009 году выходит в продажу ГМ-сорт розы «Applause» с цветами синего

цвета. Таким образом, сбылась многовековая мечта селекционеров,

безуспешно пытавшихся вывести «синие розы». [6]

1.4. Влияние на организм человека

Экспериментальные исследования на млекопитающих, к которым относится и

человек, показали, что современные ГМО могут привести к бесплодию,

онкологическим заболеваниям, генетическим уродствам, аллергическим

реакциям, появлению неизвестных болезней.

Аллергенность.

Первые тревожные сведения стали поступать при использовании кукурузы

«СтарЛинк» с повышенным содержанием токсичного белка, уничтожающего

9

кукурузного червя. Производителем кукурузы была компания «Авентис»,

один из крупнейших производителей питания в Америке. Этот белок

представляет собой сильный человеческий аллерген: он практически не

переваривается, плохо разрушается при высокой температуре и является

причиной развития аллергической реакции вплоть до анафилактического

шока. Скандал был вызван в первую очередь тем, что фирма продавала

«СтарЛинк» под видом обычной кукурузы. Семена опасной кукурузы

случайно попали на поля кукурузы пищевой – у сотни людей возникла сильная

аллергия. Несколько тысяч тонн зерна ГМ-кукурузы было выведено из

пищевого оборота, выращивание «СтарЛинк корн» прекращено. Однако в

небольших примесях её до сих пор находят в некоторых партиях кукурузы. И

действительно, в Швеции, где трансгенные культуры практически запрещены,

число людей, страдающих аллергией, составляет всего 7%, в США же, где

запретов на использование ГМО нет, – в 10 раз больше, почти 70%. [3]

Онкология.

Ещё в конце 20 века появились научные работы, в которых указывалось на

связь ГМО с онкологией. В работе немецкого учёного Доерфлера (Doerfler,

1995), которая так и называется «Проникновение чужеродной ДНК в геном

млекопитающих и его последствия: концепция онкогенеза», рассказывается о

механизмах возникновения новообразований в результате употребления ГМО.

В работе Эвена и Пуштая (Ewen & Pusztai, 1999) описывается образование

опухоли в тонком кишечнике при добавлении в корм лабораторных животных

ГМ-картофеля с геном лектина подснежника. В последние годы наблюдается

всплеск онкологических заболеваний, особенно желудочно-кишечного тракта.

Во много раз увеличилось количество детей, больных лейкемией. Существует

много случаев, когда у матерей, которые питались трансгенными продуктами,

рождались дети с этим страшным заболеванием. [3]

Инвалидность и гибель людей.

Другая история связана с использованием в качестве пищевой добавки

аминокислоты L-триптофана, полученной из генно-инженерной бактерии

10

Bacillus amyloliquefaciens (Кузнецов с соавт., 2004). В США у нескольких

тысяч человек был обнаружен синдром эозинофилии-миалгии (eosinophilia-

myalgya, EMS) в результате использования в пище L-триптофана. Умерли 37

человек, и более тысячи людей стали инвалидами. Неизвестный фактор оказал

влияние на иммунную систему человека. Суставы и мускулы болели,

конечности распухали. Изучение генетически модифицированной бактерии –

продуцента L-триптофана – прояснило ситуацию. Оказалось, что в результате

генетических манипуляций эта бактерия приобрела способность образовывать

в небольших количествах этилен-бистриптофан, который и явился причиной

развития заболевания и гибели людей (Glick&Pasternak, 1998). [3]

Однако существует и другое мнение:

В.Кузнецов в интервью журналу «Наука и жизнь» говорит: «…Ситуация не

столь трагична, как может показаться на первый взгляд. Далеко не каждый

ГМ-продукт опасен для человека. Скорее наоборот, подавляющее

большинство допущенных к продаже ГМ-продуктов безопасны, но при этом

сохраняются некоторые потенциальные негативные риски. С учётом того, что

визуально невозможно отличить нормальный (традиционный) продукт от

генетически модифицированного, ориентироваться нужно лишь на

маркировку. Таким образом производители предупреждают потребителя о

том, что пока не получены окончательные доказательства безопасности

данного конкретного продукта и, следовательно, на данный конкретный

момент времени производитель и продавец не дают гарантий полной

безопасности продаваемого товара.» [1]

1.5. Методы определения наличия ГМО в пищевых продуктах

Их разработка началась одновременно с выходом пищевой продукции из ГМО

на мировой продовольственный рынок. В настоящее время подавляющее

большинство ГМО растительного происхождения, представленных на рынке,

как было сказано выше, отличается от исходного традиционного сорта

растения наличием в геноме рекомбинантной ДНК — гена, кодирующего

синтез белка, который определяет новый признак, и последовательностей

11

ДНК, регулирующих работу этого гена, а также собственно нового белка. В

качестве мишени для определения ГМО в пищевом продукте могут

рассматриваться как новый модифицированный белок, так и рекомбинантная

ДНК. [2]

Химические методы анализа продуктов из ГМО. Если в результате

генетической модификации меняется химический состав пищевого продукта,

для ее определения могут применяться химические методы исследования —

хроматография, спектрсфотометрия, спектрофлюориметрия и другие, которые

и выявляют заданное изменение химического состава продукта. [2]

Анализ нового белка. Присутствие в продукте нового белка дает возможность

применять для определения ГМО иммунологические методы. Они наиболее

просты в исполнении, имеют относительно низкую стоимость и позволяют

определить конкретный белок, несущий новый признак. В настоящее время

разработаны тест-системы, применяя которые можно проводить

количественное определение модифицированного белка в таких продуктах,

как изоляты и концентраты соевого белка и соевая мука. Однако в случае

анализа пищевых продуктов, при производстве которых исходное сырье

подвергается значительной технологической обработке, иммунологический

анализ может давать нестабильные или плохо воспроизводимые результаты

из-за денатурации белка. Учитывая это, в большинстве стран основные

способы определения ГМИ в продуктах — методы, основанные на

определении рекомбинантной ДНК, например, метод полимеразной цепной

реакции (ПЦР). [2]

Полимеразная цепная реакция. Строение ДНК одинаково во всех клетках

организма, поэтому любая часть растения может быть использована для

идентификации ГМО, что невозможно в случае определения

модифицированного белка.

ДНК более стабильна, чем белок, и в меньшей степени разрушается при

технологической или кулинарной обработке пищевых продуктов, что делает

возможным определение в них ГМО.

12

Метод идентификации рекомбинантной ДНК включает несколько этапов:

• выделение ДНК из пищевого продукта

• умножение (амплификация) специфической ДНК, характерной для

определенного сорта генетически модифицированного растения

• электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и

фотографирование результатов электрофореза.

При создании трансгенного растения в геном вносится генетическая

конструкция, которая состоит не только из гена, определяющего новый

признак, но и последовательностей ДНК, регулирующих работу гена. Для этих

целей используется метод ПЦР с маркерами на последовательность ДНК (ген),

определяющий новый признак. В России в 2000 году метод ПЦР был

утвержден Минздравом РФ в качестве основного для идентификации ГМИ

растительного происхождения в пищевых продуктах. Чувствительность этого

способа позволяет определить ГМИ в продукте, даже если его содержание не

превышает 0,9%. Такой подход соответствует рекомендациям ВОЗ, принятым

в большинстве стран мирового сообщества. [2]

13

Материалы и методы

Опрос

Мной проводился опрос с целью получения сведений об отношении населения

к проблеме генно-модифицированных продуктов. В опросе участвовало 30

человек. Опрашиваемые отвечали на следующие вопросы:

1. Знаете ли Вы, что такое продукты, содержащие ГМО?

a) Да

b) Нет

c) Затрудняюсь ответить

2. Считаете ли Вы, что продукты, содержащие ГМО, могут быть опасны

для здоровья человека?

a) Да

b) Нет

c) Затрудняюсь ответить

3. Обращаете ли Вы внимание на маркировку состава продукта, покупая

его в магазине?

a) Да, всегда

b) Иногда

c) Не обращаю внимая

4. При выборе равнозначных продуктов какому из них Вы отдадите

предпочтенье?

a) Более дорогому без ГМО

b) Менее дорогому, с содержанием ГМО

c) Мне все равно

d) Я буду ориентироваться на цену продукта

5. На что чаще всего Вы обращаете внимание при выборе продуктов?

(свободный ответ)

6. Какие продукты питания, по Вашему мнению, обязательно должны

иметь маркировку о содержании ГМО? (свободный ответ)

14

После проведения социологического исследования, по полученным данным

мной были составлены следующие диаграммы:

Проведение эксперимента по выявлению трансгенных материалов

кукурузы в опытных образцах

Работа проводилась на базе лаборатории «Заповедного посольства» парка

«Зарядья».

Для проведения эксперимента мной были выбраны продукты питания в состав

которых входила кукуруза:

1. Кукурузные хлопья («Любятово») – ХЛ

2. Чипсы («Lays») – Ч

3. Кукурузная мука («Гарнец») – М

4. Поп корн («MIX BAR») – ПОП

5. Кукурузные палочки – ПЛ

6. Консервированная кукуруза («Фрау Марта») – КК

На упаковке данных образцов не указана информация о присутствии или

отсутствие ГМО в составе.

71%

10%

19% Считают вредным

Считают безвредным

Не могут определится

45%

16%

39%

Всегда обращают внимание

Не обращают внимания

Иногда обращают внимание

15

Ход работы:

I. Выделение ДНК из опытных образцов

Выделение ДНК мною проводилось по регламенту: «Набор реагентов для

выделения ДНК на сорбенте S-СОРБ (Синтол).

1. Внесение образца

1.1. Я измельчила по 3-4 г каждого образца.

1.2. Промаркировала 12 пробирок объемом 2 мл в соответствии с

количеством анализируемых проб и дополнительной пробиркой

для отрицательного контроля выделения «ОКО-В». Во все

пробирки (кроме «ОКО-В») внесла по 100 мкл образца.

16

2. Лизис материала и сорбция ДНК

2.1. В каждую пробирку внесла 300 мкл лизирующего раствора (1).

Перемешала содержимое на вортексе. Прогрела при 65 градусах C

5 мин. Сбросила капли с крышки пробирки краткосрочным

центрифугированием.

2.2. Тщательно перемешала суспензию сорбента. Добавила в пробирку

по 30 мкл Сорбента (4).

2.3. Перемешала на вортексе и оставила в штативе на 2 мин. После

чего снова перемешала и оставила на 2 мин.

3. Отмывка сорбента от ингибиторов

3.1. Центрифугировала пробирки 30 с при 5 тыс/об. Удалила

надосадочную жидкость с помощью автоматической пипетки.

17

3.2. Добавила к осадку 300 мкл Отмывочного раствора 1 (2) и

перемешала на вортексе.


надосадочную жидкость с помощью автоматической пипетки.

3.4. Добавила к осадку 500 мкл Отмывочного раствора 2 (3) и

перемешала на вортексе.


надосадночную жидкость с помощью автоматической пипетки.

3.6. Повторила пункт 3.4. и 3.5.

3.7. Подсушила сорбент в термостате при 65 градусах C 15 мин.

18

4. Элюция ДНК

4.1. Добавила к осадку 100 мкл Элюирующего раствора (5).

Перемешала на вортексе и подогрела в термостате при 65 градусах

C 5 мин.

4.2. Центрифугировала пробирки при 13 тыс/об 2 мин. Надосадочную

жидкость содержащую ДНК перенесла в чистую пробирку.

II. Проведение качественной полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий

добиться значительного увеличения малых концентраций определённых

фрагментов ДНК в биологическом материале.

Полученные мной концентрации ДНК образцов (Таблица 1) в основном имеют

маленькие значения, поэтому для сравнения результатов ПЦР я взяла

дополнительные образцы с концентрацией ДНК приведенной к 100 ng/mkl.

Дополнительные образцы:

Чипсы («Lays») – L

Мука – М1

«Начос» – Н

Хлопья – ХЛ1

Хлебцы – ХБ

Качественную ПЦР ставила с использованием набора (Синтол) «ПЦР-Микс».

19

1. Провожу вычисления для определения объема специальной смеси для

ПЦР, в которую уже включены ДНК-полимераза, dNTP и MgCl2

1.1. Общее количество образцов – 11

n= 11+1 (берем с запасом)

1.2. V1 (одного образца) = 50 mkl

1.3. V= n*V1 = 12*50 = 600 mkl

1.4. V2,5PC (PC – реакционная смесь) = V/2,5 = 600/2,5 = 240 mkl

1.5. F=R (праймеры (F – форвард-прямой), (R – реверс-обратный)) =

n*10/100 = 0,1*n = 0,1*12 = 1,2 mkl (где n*10 – требуемое кол-во моль;

100 – концентрация праймера)

1.6. ddH2O = V-2,5PC-F-R = 600-240-1,2-1,2 = 357,6 mkl

2. В одной пробирке смешала 357,6 mkl ddH2O, 240 mkl PC, 1,2 mkl F b 1,2

mkl R

3. Перемешала полученную смесь на вортексе

4. В 11 пустых пробирок разлила по 50 mkl смеси и в каждую добавила по 2-

5 mkl (зависит от образца) соответствующего образца

5. Каждую пробирку перемешала на вортексе

6. Все образцы поместила в специальный прибор – амплификатор, который

образует дополнительные копии участков ДНК, содержащие искомые

гены

20

После проведения качественной ПЦР образцы отправляются на электрофорез.

III. Постановка Электрофореза

Электрофорез – это электрокинетическое явление перемещения частиц

дисперсной фазы в жидкой или газообразной среде под действием внешнего

электрического поля.

1. Подготовка к электрофорезу

1.1. Агарозный гель:

0,6 г Агарозы + 60 ml Tae (буферный раствор) + 3,5 mkl EtBr (бромистый

этидий)

1.2. Буфер для камеры для электрофореза:

300 ml Tae + 3,5 mkl EtBr ( маркер размера М 100 – 3 mkl на образец)

21

1.3. Подкрашиваю образцы красителем 6x TriTrack DNA Loading Dye в

количестве 3 mkl на образец

1.4. Вношу образцы в камеру для электрофореза ( выдержка примерно 60

мин при вольтаже = 90 Вольт)

1.5. Образцы помещаю в гельдокументирующую систему

IV. Проведение количественной полимеразной цепной реакции в

реальном времени (ПЦР-РВ)

ПЦР-РВ проводилась по регламенту «Растения/35S+FMV/NOS скрининг»

(Синтол). Этот набор реагентов позволяет одновременно выявить в одной

реакционной смеси специфичные фрагменты регуляторных

последовательностей ГМ растений терминатора NOS – по каналу

флуоресценции FAM/Green, промоторов 35SCaMV и 35SFMV – по каналу

флуоресценции ROX/Orange, специфичный фрагмент ДНК растений – по

22

каналу флуоресценции R6G/HEX/JOE/Yellow, а также внутренний

положительный контроль (ВПК) – по каналу флуоресценции Cy5/Red.

Первая реакция позволяет обнаружить терминатор нопалин синтазы NOS

агробактерии (Agrobacterium tumefaciens). Вторая реакция предназначена для

выявления промоторов 35SCaMV вируса мозаики цветной капусты и 35SFMV

вируса мозаики норичниковых. Терминатор NOS, промоторы 35SCaMV и

35SFMV являются основными регуляторными последовательностями,

выстраиваемых в генетические конструкции ГМ растений. Обнаружение этих

регуляторных последовательностей позволяет выявить около 90% ГМ

растений. Третья реакция позволяет определить ген, кодирующий NADH-

дегидрогеназу растений. Четвертая реакция – Внутренний Положительный

Контроль (ВПК) – необходима для исключения ложноположительных

результатов.

1. Проведение анализа

1.1. Подготовка к проведению ПЦР-РВ

1. Разморозим необходимое количество пробирок с реакционной

смесью «Растения/35S+FMV/NOS скрининг», выдержать 15 мин

при комнатной температуре, перемешали на вортексе и

центрифугировали в течение нескольких секунд для сброса

капель.

2. В отдельной чистой пробирке подходящего размера смешали:

21*(11+2) mkl реакционной смеси «Растения/35S+FMV/NOS скрининг»

0,5*(11+2) mkl Tag ДНК-полимеразы,

где 11 – где 11 – это количество исследуемых образцов, включая ОКО-В, 2 –

количество контролей (ПКО, ОКО).

Полученную смесь перемешали на вортексе и центрифугировали в течение

нескольких секунд. Разлили полученную смесь по 20 mkl в 0,2 мл пробирки.

3. ПКО, ОКО и исследуемые образцы разморозили, перемешали на

вортексе и центрифугировали.

23

4. Внесли в подготовленные 0,2 мл пробирки по 5 mkl ОКО,

исследуемых образцов и, в последнюю очередь, ПКО, используя

наконечники с аэрозольным барьером, плотно закрыли крышки и

центрифугировали пробирки для сброса капель.

5. Поместили пробирки в амплификатор.

1.2. Запускаем программу прибора АНК-32 (Амплификатор) без

использования встроенного шаблона.

24

Результаты исследования

После выделения ДНК и спектрофотометрии, была определена концентрация

ДНК в каждом образце. Результаты представлены в Таблица 1.

Таблица 1

Название образца Увеличение (lid) Концентрация ДНК

(ng/mkl)

ХЛ 10 7,15

Ч* 50 1000

М 10 4,3

ПОП 10 2,7

ПЛ 10 4

КК 10 2,95

*Образец – «Ч» имел очень сильную концентрацию, поэтому я разбавила его дистиллированной

деминерализированной водой (ddH20) в 10 раз и перемешала на вортексе.

После постановки электрофореза были получены следующие результаты (см.

таблица 2).

Таблица 2

Название образцов Наличие или отсутствие ГМО

ХЛ +

Ч +

М +

ПОП -

ПЛ -

КК -

L -

М1 -

Н -

ХЛ1 +

ХБ -

25

После проведения ПЦР-РВ мной была получена следующая таблица

результатов: (Таблица 3). Затем мы проводим интерпретацию таблицы по

регламенту и получаем уже окончательные результаты: (Таблица 4).

Таблица 3

Поз

.

Описание Реактор Тип Ct

FAM

Ct R6G Ct ROX Ct

Cy5

A1 ПКО Реактор 1 ПКО 30.78 20.21 30.16 31.26

A2 ОКО Реактор 1 ОКО 36.27 35.57 34.48 31.86

A3 Чипсы Реактор 1 ИО 37.34 29.45 38.84 31.43

A4 Попкорн Реактор 1 ИО 36.88 28.71 33.56 31.19

A5 Палочки Реактор 1 ИО 36.45 28.59 32.79 31.59

A6 Хлопья Реактор 1 ИО - 29.89 33.47 31.5

A7 Консерв.к

.

Реактор 1 ИО - 29.54 34.53 30.73

A8 Мука Реактор 1 ИО 35.63 23.13 34.07 31.2

B1 Lays Реактор1 ИО 35.09 25.21 32.45 31.44

B2 Начос Реактор1 ИО 38.96 24.24 33.93 31.64

B3 Хлебцы Реактор1 ИО 35.92 29.81 33.27 31.06

B4 Хлопья 1 Реактор1 ИО - 25.09 33.09 31.66

B5 Мука 1 Реактор1 ИО - 25.32 33.45 32.98

Таблица 4

Образец Ct FAM

(NOS)

Ct R6G

(внутр.

полож.

контроль)

Ct ROX (35S) Ct Cy5 (днк

растений)

ПКО В пределах

нормы

В пределах

нормы

В пределах

нормы

В пределах

нормы

26

ОКО В пределах

нормы

В пределах

нормы

В пределах

нормы

В пределах

нормы

Чипсы нет Качественное

определение

нет ДНК

растений

присутствует

Попкорн нет Качественное


есть ДНК

растений


Палочки нет Качественное


есть ДНК

растений


Хлопья нет Качественное


есть ДНК

растений


Консерв.

Кук.

нет Качественное


нет ДНК

растений


Мука нет Качественное


нет ДНК

растений


Lays нет Качественное


есть ДНК

растений


Начос нет Качественное


нет ДНК

растений


Хлебцы нет Качественное


есть ДНК

растений


27

Хлопья 1 нет Качественное


есть ДНК

растений


Мука 1 нет Качественное


есть ДНК

растений


Таким образом, мы пришли к следующему заключению что, терминатор NOS

однозначно отсутствует во всех образцах, а это значит, что используемый в

образцах, трансгенных по 35s, вектор содержал какой-то другой терминатор.

Промоутер 35s однозначно отсутствует в «Начос» и консервированной

кукурузе (результат отрицательный и на электрофорезе, и на ПЦР-РВ), и

однозначно присутствует в кукурузных хлопьях (результат положительный и

на электрофорезе, и на ПЦР-РВ). Касаемо остальных образцов необходимы

дополнительные исследования ввиду не идеальной воспроизводимости

результатов.

28

Заключение

Соотнеся данные производителей на этикетках опытных образцов и

собственные исследования, можно сделать следующие выводы:

Образцы Состав, заявленный

производителем

Результаты

Электрофореза

Результаты

ПЦР-РВ

Итоги исследования

Чипсы Информация отсутствует + нет Доп. исследования

Попкорн Информация отсутствует - есть Доп. исследования

Кук.

палочки

Информация отсутствует - есть Доп. исследования

Хлопья Информация отсутствует + есть Содержит ГМО

Консерв.

Кук.

Информация отсутствует - нет Не содержит ГМО

Мука Информация отсутствует + нет Доп. исследования

Чипсы1 Информация отсутствует - есть Доп. исследования

Начос Информация отсутствует - нет Не содержит ГМО

Хлебцы Информация отсутствует - есть Доп. исследования

Хлопья1 Информация отсутствует + есть Содержит ГМО

Мука1 Информация отсутствует - есть Доп. исследования

На предмет содержания ГМ кукурузы были исследованы 11 образцов

продуктов, из которых только два образца не содержат биоматериал

трансгенной кукурузы – это консервированная кукуруза и «Начос».

Кукурузные хлопья («Любятово») содержат ГМ кукурузу. Для всех остальных

образцов необходимы дополнительные исследования, ввиду неидеальной

воспроизводимости результатов.

29

Выводы о проделанной работе:

1. По результатам опроса 71% людей хотят иметь осведомленность о

содержании ГМО в потребляемых продуктах питания

2. Два продукта, из исследованных, «Начос» и консервированная

кукуруза точно не содержат генно-модифицированных организмов.

3. Образец кукурузных хлопьев, («Любятово») содержит в составе ГМ

кукурузу.

4. Продукты, содержащие генно-модифицированные организмы, имеют

большое распространение в ассортименте крупных торговых сетей

российских магазинов. Однако, не все производители добросовестно

информируют покупателей о истинном составе их продукции.

30

Список литературы

1. Баранов А., Кузнецов В., Лебедев В. «Генетически модифицированные

организмы», «Наука и жизнь» № 6, 2008, Москва

http://itexts.net/files/pdf/zhurnal-nauka-i-zhizn-zhurnal-nauka-i-zhizn-2008-

6-177302.pdf

2. Глазко В.И. «Кризис аграрной цивилизации и генетически

модифицированные организмы», 2007, Москва

https://bio.wikireading.ru/285

3. Ермакова И.В. «Что мы едим? Воздействие на человека ГМО и

способы защиты», 2011, Москва

https://itexts.net/avtor-irina-vladimirovna-ermakova/150664-chto-my-edim-

vozdeystvie-na-cheloveka-gmo-i-sposoby-zaschity-irina-

ermakova/read/page-1.html

4. https://ru.wikipedia.org/wiki/Генетическая_инженерия

5. https://z-vybor.ru/istoriya-sozdaniya-gmo/

6. https://ru.wikipedia.org/wiki/Генетически_модифицированный_организм

https://ru.wikipedia.org/wiki/Генетическая_инженерия

https://z-vybor.ru/istoriya-sozdaniya-gmo/

https://ru.wikipedia.org/wiki/Генетически_модифицированный_организм

Государственное бюджетное...

Documents

Transcript of Государственное бюджетное...