EXTRACCIÓN DE ADN

•Es un ácido capaz de formar sales con iones cargados positivamente (cationes).

• Es soluble en soluciones concentradas de sales.

•Es insoluble en alcoholes (tipo etanol o isopropanol).

•El ADN es destruido (depurinado) a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble a pH 5.6, pero es soluble a pH 8,0.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

CONCENTRACIÓN SALINA

La mayor concentración de iones positivos en elmedio neutraliza la carga negativa de losfosfatos del esqueleto fosfodiester,disminuyendo las fuerzas de repulsión yestabilizando la estructura de la doble hélice.

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

HIDROLISIS QUIMICA

La hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas(hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiéster del esqueleto nucleotídico.

A pH alcalino, el ADN es resistente, mientras que el ARN se hidroliza completamente (presencia de –OH en el C2 de la pentosa).

OBTENCIÓN DEL ADN

SELECCIÓN DEL MATERIAL DE DONDE PODEMOS AISLAR EL ADN DE INTERÉS

SELECCIÓN DEL MÉTODO ADECUADO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ADN

MATERIAL DE ORIGEN DE LA MUESTRA

Sangre

Bacterias

Orina

Pelos

Tejidos

Plantas

Hisopados bucales

Mancha hematica

ETAPAS GENERALES DE LA EXTRACCIÓN

•ROMPER PARED CELULAR Y/O LAS MEMBRANAS PLASMATICAS

•ROMPER LA MEMBRANA NUCLEAR

•PROTEGER AL ADN DE ENZIMAS QUE PUEDAN DEGRADARLO

•PRECIPITAR EL ADN

LISIS DE TEJIDOS O CÉLULAS

Tiene que ser suficientemente fuerte para romper elmaterial inicial complejo (Ej: un tejido), pero suficientementesuave para preservar el ácido nucleico.

•rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.)

•tratamiento químico (detergentes, reducción con tioles, etc.)

•digestión enzimática (Proteinasa K, etc.)

PROTEGER AL ADN DE ENZIMAS QUE PUEDAN DEGRADARLO

DNA debe ser disociado de :

•Proteínas

•Ciertas enzimas (ej nucleasas) deben ser inactivadas por desnaturalización : •Detergentes ej: Dodecil sulfato sódico

(SDS) • Enzimas ej: Proteinasa K • Solventes ej: Cloroformo, Fenol •Sales ej: acetato de amonio, NaCl

ADN

Proteínas

PRECIPITAR EL ADN

La precipitación permite su purificación y concentración

Se basa en la deshidratación de la molécula mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol, lo cual lleva a su precipitación.

La precipitación es un fenómeno reversible.

Precipitado de ADN

EVALUACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO

ESPECTROFOTOMETRIA ELECTROFORESIS

Espectrofotometría (260/280 nm)

Evalúo cantidad de ADNNo evalúo calidad

Gel de Agarosa / Poliacrilamida

Evalúo cantidad de ADN Evalúo calidad

ELECTROFORESISLa electroforesis en gel es un método utilizado para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas.

CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN GEL DE AGAROSA

Buena resolución

Separación de moléculas grandes (200-50000 pb)

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

Alta resolución

Sus Componentes son tóxicos

Separación menor de 500 pb

COLORANTE

Los fragmentos , una vez teñidos, pueden ser visualizados utilizando un Transiluminador de Luz Ultravioleta

Intercalantede bases Bromuro de EtGelRed

Gel de Poliacrilamida revelo con luz UV

ETAPAS DE LA MUESTRA

Extracción de ADN

Obtención del ADN

Evaluación del ADN obtenido

Uso posterior (PCR, clonación, RT-PCR, transferencia, etc.)