Extração Pitanga
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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DBORA NASCIMENTO E SANTOS
Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio
dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia unifloraL.)
Pirassununga
2012
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DBORA NASCIMENTO E SANTOS
Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio
dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia unifloraL.)
Verso Corrigida
Dissertao apresentada Faculdade deZootecnia e Engenharia de Alimentos daUniversidade de So Paulo, como parte dosrequisitos para a obteno do Ttulo deMestre em Cincias.
rea de Concentrao: Cincias daEngenharia de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lopes deOliveira.
Pirassununga
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao
Servio de Biblioteca e Informao da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos daUniversidade de So Paulo
Santos, Dbora Nascimento eS237e Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo
da composio dos extratos de sementes de pitanga(Eugenia uniflora L.) / Dbora Nascimento e Santos. -Pirassununga, 2012.
99 f.Dissertao (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos Universidade de So Paulo.Departamento de Engenharia de Alimentos.rea de Concentrao: Cincias da Engenharia de
Alimentos.Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lopes de
Oliveira.
1. Extrao supercrtica 2. Eugenia uniflora L.3. GC/MS 4. Atividade antioxidante 5. Leishmaniose.I. Ttulo.
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AGRADECIMENTOS
Acho maravilhoso olhar pra trs nesses dois anos e pensar que, se pudesse voltar no tempo
e ter a chance de mudar como tudo aconteceu, s tiraria a dor que causei pela ausncia (e
claro, anteciparia todas as bolsas de estudos de todos os meus amigos e a minha!!), apenas
isso. Foram momentos de alegria, pesar, inquietao, e sobretudo MUITO aprendizado, em
todos os sentidos.
Agradeo a Deus por nunca soltar a minha mo e s colocar pessoas maravilhosas na
minha vida, comeando pela minha querida orientadora Prof Dr. Alessandra Lopes de
Oliveira, qual faltam palavras para agradecer tamanho carinho, orientao, confiana e
ateno dispensadas. Foi uma honra ser a sua primeira orientanda de Ps-Graduao,
espero ter correspondido s suas expectativas e tomara que no futuro eu possa repetir com
muitos tudo o que aprendi com voc.
minha famlia, namorido e amigos (Amanda, Csar Henrique, Davison, Frankeline,
Janana, Lucas, Mariana de Morais, Mariana Sfora, Marina, Robson e tantos outros
queridos) da minha amada terra, que durante esse tempo me encheram de coragem e
persistncia.
todos os professores do Departamento de Engenharia de Alimentos da FZEA, obrigada
pelos ensinamentos e orientaes. Um agradecimento especial a Prof. Dr.Eliana Setsuko,
que na ausncia da minha orientadora, me ajudou bastante no incio desta caminhada. Aos
professores Dr. Carlos Augusto Fernandes de Oliveira e Dr. Edson Roberto da Silva, pelo
uso dos seus laboratrios nas anlises de perfil antimicrobiano e inibio da enzima
arginase, respectivamente.
Aos meus queridos amigos e colegas: Adja, Camila, Diane, Eliane, Graziella, Gisele e
Fausto, Josianne, Jlio, Keliani, Maira, Mariana C. e K., Mirelle, Mirian, Naira, Natali, Noemi,
Paola, Paula, Samira, Sarah, Thaise, e Volnei; obrigada pelos momentos de alegria,
descontrao, apoio e torcida. Sei que tudo foi de corao. Essas palavras so tambm
para a maravilhosa equipe do LTAPPN (minha segunda casa), Nilsone estagirios.
Aos queridos tcnicos Guilherme, Keila, Marcelo, Mrcio e Roice, obrigada pelo apoio
tcnico prestado e palavras de amizade.
querida graduanda Larissa Lima de Sousa, por me acompanhar em todo o projeto e pelas
horas de descontrao que tornaram o trabalho menos cansativo. Sua seriedade no trabalho
te levar para longe, assim espero.
CAPES pela concesso da bolsa de estudos e FAPESP pelo financiamento do projeto.
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RESUMO
Santos, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio
dos extratos de sementes de Pitanga (Eugenia uniflora L.). 2012. 99 f. Dissertao
(Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So
Paulo, Pirassununga, 2012.
A semente de Pitanga resduo do processamento da polpa e suco da fruta e os poucos
trabalhos existentes sobre sua composio denotam grande valor nutricional. A extrao
com fluido supercrtico, pelos benefcios que apresenta, constitui uma excelente ferramenta
para a obteno e estudo de extratos. Assim, os objetivos deste trabalho foram obter
extratos de sementes de Pitanga utilizando CO2 supercrtico (SC-CO2), caracteriz-los e
avaliar possveis atividades biolgicas in vitro. As sementes lavadas, secas e trituradasforam caracterizadas e apresentaram umidade de 12,73%, granulometria de 0,48mm e
extrato etreo de 0,52%. As sementes foram colocadas em contato com o SC-CO2 em
diferentes condies de presso (P) e temperatura (T), conforme um Delineamento
Composto Central Rotacional com P e T como variveis independentes. A condio
operacional de rendimento mais elevado foi repetida com etanol como co-solvente (SC-
EtOH). Para todos os extratos determinou-se o perfil de volteis por cromatografia gasosa
com espectrmetro de massas (CG/EM), a concentrao de compostos fenlicos totais
(CFT), a atividade antioxidante pela inativao dos radicais DPPH e ABTS, e a presena de
terpenos por cromatografia em camada delgada (CCD). Nos extratos, obtidos via SC-CO2,
Soxhlet e SC-EtOH, alm de sua frao purificada, foram determinadas a concentrao
inibitria mnima (CIM) com S. aureus, E. coli, B. subtilise P. aeruginosa, e a inibio da
enzima arginase de Leishmania e de rato. O rendimento dos extratos variou de 0,16 a
0,48%, sendo P a nica varivel que influenciou no processo (p
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enzima arginase foi baixa para o extrato supercrtico, Soxhlet e a frao purificada, porm o
extrato SC-EtOH inibiu em at 48% o que indica forte ao contra o desenvolvimento da
Leishmania. Ainda, a inibio da arginase em mamferos tem funo vasodilatadora. O
extrato SC-EtOH possui compostos diferentes dos demais devido modificao da
polaridade pelo co-solvente (EtOH). Esta hiptese tambm constatada pela atividade
antioxidante, que foi menor para os extratos supercrticos que para aqueles obtidos com SC-
EtOH que apresentou maior concentrao em equivalente de Trolox e inibio do radical
DPPH de 94%. Os resultados mostram extratos de semente de Pitanga altamente
promissores para aplicaes contra enfermidades devido ao antimicrobiana e inibitria
da arginase.
Palavras-chave: extrao supercrtica; Eugenia unifloraL.; GC/MS; atividade antioxidante;
leishmaniose.
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ABSTRACT
Santos, D. N. Supercritical extraction with carbon dioxide and study of Pitanga seeds
(Eugenia unifloraL.) extracts composition. 2012. 99 f. M.Sc. Dissertation Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So Paulo, Pirassununga, 2012.
The Pitanga seed is a waste of the fruit pulp and juice processing, and the few existing
studies on its composition denote a high nutritional value. Due to its benefits, the supercritical
fluid extraction is an excellent tool to obtain and study extracts. Therefore, the objectives of
this study were to obtain extracts of Pitanga seeds using supercritical CO2 (SC-CO2),
characterize them and evaluate potential biological activities in vitro. The washed, dried and
crushed seeds were characterized and presented 12.73% moisture, particle size of 0.48 mm
and 0.52% ether extract. The seeds were placed in contact with the SC-CO2 under differentconditions of pressure (P) and temperature (T), according to a Central Composite Design
with P and T as independent variables. The operational condition of higher yield was
repeated with ethanol as co-solvent (SC-EtOH). For all extracts were determined: the profile
of volatiles by gas chromatography with mass spectrometer (CG/ EM), the concentration of
total phenolics compound (CFT), the inactivation of antioxidant activity by DPPH and ABTS
radicals and the presence of terpenes by layer chromatography (CCD). In the extracts
obtained by SC-CO2, Soxhlet and SC-EtOH and its purified fraction, the minimum inhibitory
concentration (CIM) with S. aureus, E. coli, B. subtilisand P. aeruginosawere determined,
as well as the inhibition of the enzyme arginase of Leishmaniaand rat. The yield of extracts
ranged from 0.16 to 0.48%, being P the only variable that influenced the process (p
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due to the modification of their polarity with the co-solvent (EtOH). This hypothesis is also
confirmed by the antioxidant activity, which was lower for the supercritical extracts compared
with the extracts obtained with SC-EtOH, with the highest equivalent concentration of Trolox
and DPPH radical inhibition of 94%. The results show that extracts of Pitanga seeds are
highly promising for applications against diseases, due to antimicrobial activity and inhibition
of arginase.
Keywords: Supercritical extraction; Eugenia uniflora L.; GC/ MS; antioxidant activity;
leishmaniasis.
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LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 -Pitangueira. ......................................................................................................... 27
Figura 2 -Biossntese de compostos terpnicos a partir de isopentil difosfato em tecidos
vegetais. ............................................................................................................................ 31
Figura 3 -Semente de Pitanga seca inteira (A) e triturada (B). ............................................ 41
Figura 4 -Extrao da semente de Pitanga utilizando Soxhlet (A). Detalhe do arraste de
lipdios pelo solvente lquido (B). ........................................................................................ 42
Figura 5 -Sistema de extrao com CO2supercrtico do LTAPPN, FZEA/USP (A). Extrato
supercrtico de semente de Pitanga (B). ............................................................................ 44
Figura 6 Curva padro de Limoneno para o clculo da concentrao de sesquiterpenos
expresso em Equivalente de Limoneno (EqLim) dos extratos de semente de Pitanga. ...... 49Figura 7 -Curva padro de cido glico para determinao quantitativa de compostos
fenlicos totais. .................................................................................................................. 50
Figura 8 -Curva padro que relaciona a concentrao de Trolox com a resposta da inibio
do ABTS+ com leitura feita a 734 nm. .............................................................................. 51
Figura 9 Rendimento das extraes de semente de Pitanga em funo da densidade do
CO2 supercrtico. ................................................................................................................ 58
Figura 10 -Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas no rendimento de extratos
supercrticos de semente de Pitanga. ................................................................................ 59
Figura 11 -Superfcie de resposta gerada pelo modelo de segunda ordem que mostra os
efeitos das variveis independentes no rendimento da extrao. ................. ..................... 61
Figura 12 Massa acumulada de extrao em funo do tempo de extrao. .............. ..... 62
Figura 13 Massa acumulada de extrao em funo do volume acumulado de CO2. ....... 63
Figura 14 ndice de refrao dos extratos SFE de sementes de Pitanga a 20 e 40C. ..... 64
Figura 15 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel
60 F254 com fase mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo para
a deteco de terpenos. .................................................................................................... 65
Figura 16 Cromatograma dos extratos das sementes de Pitanga em Cromatografia de
Camada Delgada, em placa de Slica Gel 60 F254com fase mvel tolueno e acetato de etila
(93:7 v:v) e revelador uma soluo 0,05% do radical DPPH. .......... ............ ....................... 67
Figura 17 -Cromatograma de ons total (total ion chromatography, TIC) dos extratos de
semente de Pitanga (ensaio 1 ao 8, de baixo pra cima), coluna capilar Rtx-5MS; fase
mvel metanol. Detalhe na seo ampliada, em que so evidenciados os principais picos.
.......................................................................................................................................... 69
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Figura 18 -Cromatograma de ons total (total ion chromatography, TIC) da frao Soxhlet e
dos extratos supercrticos (ensaios 9, 10 e 11 de baixo para cima) de semente de Pitanga;
coluna capilar Rtx-5MS; fase mvel metanol. Os picos em destaques esto igualmente
mostrados na Figura 17. .................................................................................................... 70
Figura 19 Espectros de massa (EM) dos compostos majoritrios dos extratos de semente
de Pitanga. A: EM do gama-elemeno dos extratos. B: EM do gama-elemeno da biblioteca
NIST. C: EM do furanodieno dos extratos. D: EM do curzereno da biblioteca NIST. E: EM
do germacrone dos extratos. F: EM do germacrone da biblioteca NIST............................. 72
Figura 20 -Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na obteno de
germacrone (A) e -elemeno (B) nos extratos supercrticos de semente de Pitanga. ......... 74
Figura 21 -Superfcie de resposta gerada pelo modelo de segunda ordem que mostra os
efeitos das variveis independentes na concentrao de germacrone (21.A) e -elemeno
(21.B) nos extratos............................................................................................................. 76Figura 22 -Diagrama de Pareto das variveis (P e T) estudadas na quantidade de
compostos fenlicos dos extratos de semente de Pitanga. ................................................ 77
Figura 23 -Diluio seriada do extrato supercrtico de semente de Pitanga para
determinao da concentrao inibitria mnima. .............................................................. 82
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -Comparao de algumas propriedades fsicas do gs, lquido e fluido
supercrtico. ....................................................................................................................... 19
Tabela 2-Propriedades crticas de solventes que podem ser usados na extrao
supercrtica. ....................................................................................................................... 20
Tabela 3-Nveis dos dois fatores, presso e temperatura, no DCCR. ................................. 44
Tabela 4 -Matriz do DCCR de dois fatores incluindo trs pontos centrais para o estudo do
efeito da presso e temperatura nos extratos da semente de Pitanga. .............................. 45
Tabela 5 Diluio e contedo dos tubos de ensaio para determinao da Concentrao
Inibitria Mnima. ............................................................................................................... 53
Tabela 6 -Umidade e extrato etreo da semente de Pitanga seca e triturada. .................... 55Tabela 7 -Densidade aparente da amostra de semente de Pitanga seca e triturada. .... ..... 55
Tabela 8 Massa de sementes de Pitanga secas e trituradas retidas nas peneiras usadas
na determinao do dimetro mdio das partculas. ................... ....................................... 56
Tabela 9 -Matriz do Delineamento Composto Central Rotacional de dois fatores (P e T) com
trs pontos centrais para o estudo do efeito da presso e temperatura no rendimento (R),
concentraes de compostos fenlicos totais (CFT) e volteis dos extratos de semente de
Pitanga. ............................................................................................................................. 57
Tabela 10 -Coeficientes de regresso significativos para modelos linear e quadrtico que
simulam o rendimento dos extratos de semente de Pitanga obtidos com CO2supercrtico.
.......................................................................................................................................... 60
Tabela 11 -ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR para o
rendimento (%) dos extratos. ............................................................................................. 60
Tabela 12 ndice de reteno dos compostos revelados pela Cromatografia em Camada
Delgada dos extratos das sementes de Pitanga, em placa de Slica Gel 60 F254com fase
mvel tolueno e acetato de etila (93:7 v:v) e revelador Anisaldedo. .................................. 66
Tabela 13 -Composio da frao voltil dos extratos supercrticos da semente de Pitanga
(Eugenia uniflora) obtidos por anlise em GC/MS em coluna Rtx-5MS. .......................... 70
Tabela 14 -Coeficientes de regresso para modelos linear e quadrtico que simulam a
concentrao dos sesquiterpenos (Germacrone e -elemeno) nos extratos de semente de
Pitanga obtidos com CO2supercrtico. ........................................ ....................................... 74
Tabela 15 -ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR com dois
fatores para a concentrao de germacrone (ppm EqLim) dos extratos. ........................... 75
Tabela 16 -ANOVA para os modelos de primeira e segunda ordem do DCCR com dois
fatores para a concentrao de -elemeno (ppm EqLim) dos extratos. .................... .......... 75
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Tabela 17 Atividade antioxidante dos extratos de semente de Pitanga pelo percentual de
inibio do radical DPPH em trs concentraes e pelo mtodo de varredura do radical
ABTS. ................................................................................................................................ 79
Tabela 18 -Concentrao inibitria mnima (ppm) dos diferentes extratos de semente de
Pitanga. ............................................................................................................................. 83
Tabela 19 -Porcentagem (%) da atividade de inibio da arginase isolada de fgado de rato
e da Leishmania ................................................................................................................ 84
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABTS
Acetil-CoA
AI
ASR
CCD
CFT
CG/ EM
CIM
CLAE
CO2DCCR
DPPH
EFS
EM
EqLim
ER
ESA
EtOH
FRAP
GAE
GRAS
HMG-CoA
IPP
KI
MeOH
ORAC
P
SC-CO2
SC-EtOH
SLCC
T
TIC
UFC
Radical 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)
acetil-co-enzima-A
ndice de Van der Dool e Kratz
Anlise de superfcie de resposta
Cromatografia em camada delgada
Compostos fenlicos totais
Cromatografia gasosa com espectrmetro de massas acoplado
Concentrao inibitria mnima
Cromatografia lquida de alta eficincia
Dixido de carbonoDelineamento Composto Central Rotacional
Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
Extrao com fluido supercrtico
Espectro de massa
Equivamente de Limoneno
Equivalente de retinol
Extrao por solvente avanado
Etanol
Capacidade de reduo de ons ferro em plasma
Equivalente de cido glico
Geralmente Reconhecidos como Seguros
3-hidroxi-3-metilglutaril-Co-A
Isopentenil difosfato
ndice de Kovatz
Metanol
Capacidade de absoro de radicais de oxignio
Presso
Dixido de carbono supercrtico
Extrao supercrtica com etanol como co-solvente
Sucos de Laranja Concentrado e Congelado
Temperatura
Total ion chromatography
Unidade formadora de colnias
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SUMRIO
1 INTRODUO .................................................................................................................. 16
2 REVISO DA LITERATURA ............................................................................................. 18
2.1EXTRAO COM FLUIDOS SUPERCRTICOS...................................................................................... 18
2.1.1 O uso de co-solvente ............................................................................................................ 222.1.2 O estudo da cintica de extrao ......................................................................................... 24
2.2PITANGA (EUGENIA UNIFLORAL.) .................................................................................................... 26
2.3COMPOSTOS TERPNICOS.............................................................................................................. 29
2.4ENSAIOS PARA DETECO DE BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE MATRIZES VEGETAIS......................... 33
2.4.1 Atividade antioxidante........................................................................................................... 332.4.2 Atividade antimicrobiana ....................................................................................................... 352.4.3 Inibio da enzima arginase ................................................................................................. 38
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 40
4 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................ 41
4.1OBTENO E PREPARAO DA SEMENTE DE PITANGA..................................................................... 41
4.2CARACTERIZAO DA AMOSTRA..................................................................................................... 41
4.2.1 Umidade................................................................................................................................ 414.2.2 Extrato etreo ....................................................................................................................... 424.2.3 Granulometria ....................................................................................................................... 424.2.4 Densidade aparente ............................................................................................................. 43
4.3OBTENO DOS EXTRATOS COM CO2SUPERCRTICO...................................................................... 434.3.1 Processo de extrao ........................................................................................................... 434.3.2 Delineamento Composto Central Rotacional ....................................................................... 444.3.3 Extrao supercrtica com co-solvente (SC-EtOH) .............................................................. 454.3.4 Purificao do extrato supercrtico obtido com co-solvente ................................................. 454.4.5 Cintica de extrao ............................................................................................................. 46
4.4CARACTERIZAO DOS EXTRATOS.................................................................................................. 46
4.4.1 ndice de refrao ................................................................................................................. 464.4.2 Caracterizao dos extratos em cromatografia em camada delgada (CCD) ....................... 464.4.3 Anlise do perfil de volteis por cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de
massas (CG/EM) ........................................................................................................................... 474.4.4 Anlise de compostos fenlicos totais (CFT) ....................................................................... 494.4.5 Atividade antioxidante pelo mtodo DPPH........................................................................... 504.4.6 Atividade antioxidante pelo mtodo ABTS ........................................................................... 514.4.7 Determinao da atividade antimicrobiana - concentrao inibitria mnima ...................... 524.4.9 Inibio da enzima arginase ................................................................................................. 53
4.5ANLISE ESTATSTICA..................................................................................................................... 54
5 RESULTADOS E DISCUSSES ...................................................................................... 55
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5.1CARACTERIZAO DA SEMENTE DE PITANGA................................................................................... 55
5.2DETERMINAO DE RENDIMENTO GLOBAL....................................................................................... 56
5.3DETERMINAO DE CINTICA DE EXTRAO.................................................................................... 61
5.4CARACTERIZAO DOS EXTRATOS.................................................................................................. 63
5.4.1 ndice de refrao e cromatografia em camada delgada ..................................................... 645.4.2 Composio voltil dos extratos ........................................................................................... 67
5.5ANLISE DA BIOATIVIDADE DO EXTRATO SUPERCRTICO DE SEMENTE DE PITANGA............................ 77
5.5.1 Quantificao dos compostos fenlicos totais...................................................................... 775.5.2 Quantificao da atividade antioxidante ............................................................................... 785.5.3 Determinao da atividade antimicrobiana .......................................................................... 815.5.4 Determinao da inibio da enzima arginase .................................................................... 83
6 CONCLUSES ................................................................................................................. 85
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................. 86
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1 INTRODUO
A Pitanga, uma fruta de crescente importncia no cenrio brasileiro, composta depolpa e semente, a qual responsvel por 31% do peso total da fruta. A fruta e a polpa so
detentoras de substncias com inmeras propriedades funcionais, visto a sua elevada
concentrao em carotenides. Sendo resduo do processamento da polpa em suco ou
polpa congelada, as sementes atualmente no apresentam nenhuma aplicao industrial. O
estudo da composio dos extratos das sementes e suas atividades biolgicas vo de
encontro s perspectivas da indstria de alimentos, que prezam pelo total aproveitamento
das matrias-primas (SANTOS et al., 2011).
O Brasil tem lugar de destaque na produo de leos essenciais, ao lado da ndia,
China e Indonsia, que so considerados os quatro grandes produtores mundiais. A posio
do Brasil deve-se aos leos essenciais de ctricos, que so subprodutos da indstria de suco
de laranja concentrado e congelado (SLCC). No passado, o pas teve destaque como
exportador de leo essencial de pau-rosa, sassafrs e menta. Nos dois ltimos casos,
passou condio de importador (BIZZO; HOVELL; REZENDE, 2009).
Na obteno de leos essenciais, alm do enfoque dado s matrizes vegetais, como a
semente de Pitanga, por exemplo, a escolha do mtodo de extrao fundamental para a
preservao das suas caractersticas. Dentre os novos mtodos de extrao existentes, o
que utiliza fluido supercrtico tm se tornado foco de estudos, j que este possui vrias
vantagens em relao aos demais mtodos, pelas condies brandas de operao,
ausncia de resduos aps a extrao, dentre outras (SANTOS et al., 2011). Inmeros
trabalhos mostram que a qualidade dos extratos obtidos pela extrao supercrtica so
superiores aos obtidos pelos mtodos convencionais. Porm, quando se remete a
tecnologia supercrtica, sabe-se que o investimento inicial de uma planta industrial possui
custo mais elevado tendo em vista as particularidades de um sistema que opera a alta
presso. Para se chegar a condies otimizadas de operao e baratear o produto final,
crucial o estudo das variveis que interferem no processo, para que se possam obter os
rendimentos mximos, o que se consegue atravs de um planejamento experimental eanlise de superfcie de resposta das variveis estudadas na operao.
A busca por produtos naturais com propriedades biolgicas e que no ofeream riscos
aos consumidores crescente e tem sido tema de trabalhos de inmeros grupos de
pesquisa. As diversas metodologias existentes para a avaliao e comprovao de
atividades bioativas (antimicrobiano, antioxidante, antineoplsica, antimutagnica, dentre
outras) auxiliam na pesquisa de aplicaes de tais produtos e justificam etapas posteriores,
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SANTOS, D. N. Extrao com dixido de carbono supercrtico e estudo da composio dos extratos de sementes de Pitanga ( Eugenia unifloraL.)
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quando necessrias, como a purificao destes produtos naturais ou mesmo a aplicao em
testes in vivo, os quais so bem mais complexos.
Neste trabalho foram obtidos extratos supercrticos de semente de Pitanga, sob
condies pr-estabelecidas de presso e temperatura. Foi realizado o estudo destes
extratos avaliando sua composio voltil, quantidade de compostos fenlicos totais, alm
de ensaios de bioatividade, tais como a antimicrobiana, antioxidante e de inibio da enzima
arginase.
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2 REVISO DA LITERATURA
2.1 Extrao com Fluidos Supercrticos
Desde os primrdios histricos praticou-se a extrao de substncias a partir de
matrizes vegetais, com fins alimentcios, aromticos e medicamentosos. A finalidade sempre
foi obter um produto mais especfico, puro e padronizado (MAUL; WASICKY; BACCHI,
1986). O fracionamento de misturas naturais complexas para a obteno de compostos
puros ou concentrados de interesse tem sido objeto de pesquisas. Os mtodos tradicionais
de obteno de extratos so destilao a vapor (com ou sem vcuo), extrao por solvente
lquido, cromatografia preparativa, adsoro e processos seletivos por membranas. O uso
da extrao com fluido supercrtico e, em particular com o dixido de carbono supercrtico,
uma alternativa interessante devido s vrias vantagens que apresenta (GAN;
BRIGNOLE, 2011).
Nos ltimos anos, tem havido um interesse crescente na recuperao de compostos
bioativos de fontes naturais para o desenvolvimento de alimentos funcionais. A extrao
com fluido supercrtico (EFS) tem sido reconhecida como um procedimento promissor para
aplicaes em alimentos, na rea farmacutica e cosmtica, pois proporciona maior
seletividade, menores tempos de extrao e no utiliza solventes orgnicos txicos (SERRA
et al., 2010).O potencial do fluido supercrtico como solvente foi inicialmente estudado na dcada
de 60, por uma equipe de pesquisadores russos em Kniipp, e nos Estados Unidos pelo
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, na Califrnia. Os equipamentos em
pequena e grande escala surgiram no mercado na dcada de 70 e as primeiras plantas em
escala industrial surgiram na dcada de 80 na Alemanha, para a descafeinao de caf e
para a extrao de lpulo. Esta operao, embora ainda no tenha uma aplicao industrial
mundialmente disseminada, tem despertado grande interesse de pesquisas devido s suas
vantagens que refletem na qualidade dos produtos extrados quando comparados com
aqueles extrados por tcnicas convencionais (PENEDO, 2007).
A tecnologia com fluidos supercrticos tem se desenvolvido consideravelmente em um
grande nmero de setores industriais. Fluidos supercrticos so empregados para extrao
de vrias substncias tais como a cafena do caf, nicotina do tabaco, leos de alimentos,
em corantes de tecidos fabris ou como fase mvel em cromatografia de fluidos supercrticos
(MARSAL et al., 2000).
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O fluido quando submetido presso e temperatura acima de seu ponto crtico torna-
se supercrtico. Vrias propriedades dos fluidos so alteradas sob essas condies,
tornando-se parecidas com as de alguns gases e lquidos. A densidade do fluido supercrtico
similar dos lquidos, sua viscosidade assemelha-se dos gases e sua capacidade de
difuso intermediria entre os dois estados. Portanto, o estado supercrtico de fluidos pode
ser definido como o estado no qual lquido e gs so indistinguveis entre si. Devido sua
baixa viscosidade e alta capacidade de difuso (Tabela 1), os fluidos supercrticos
apresentam propriedades de transporte melhores que os lquidos, permitindo que as taxas
de extrao aumentem. Podem se difundir facilmente atravs de materiais slidos,
resultando em melhores rendimentos nas extraes (ANDREO; JORGE, 2006; BERNA et al.
2000).
Tabela 1 - Comparao de algumas propriedades fsicas do gs, lquido e fluidosupercrtico.
Propriedades fsicasGs
(1atm, 15 30C)
Fluido supercrtico Lquido
15 30CTC, PC TC, 4PC
Coeficiente de difuso (cm.s-1) 0,1-0,4 0,7 x 10-3 0,2 x 10-3 (0,2-2) x 10-5
Viscosidade (g.cm-1.s-1) (1-3) x 10-4 (1-3) x 10-4 (3-9) x 10-4 (0,2-3) x 10-2
Densidade (g.L-1) (0,6-2) x 10-3 0,2-0,5 0,4-0,9 0,6-1,6
autodifuso para gs e gs denso; mistura binria para lquido.FONTE: TZIA; LIADAKIS, 2003.
Alguns fluidos tm sido examinados como solventes em estado supercrtico. Por
exemplo, hidrocarbonetos como hexano, pentano e butano, xido nitroso, hexafluoreto de
enxofre e hidrocarbonetos fluorados. Entre estes, o dixido de carbono (CO2) o mais
popular solvente supercrtico porque ele seguro, facilmente disponvel e tem um baixo
custo (REVERCHON; DE MARCO, 2006). Na anlise dos valores de presso e temperatura
crtica de diferentes solventes (Tabela 2) nota-se que existem substncias que possuem
condies muito brandas de operao, como o etano, etileno e clorotrifluormetano. Porm,
desvantagens como ser reativo, caro, pouco disponvel e deixar resduos aps o processo,
fizeram do dixido de carbono a opo melhor empregvel.O uso da extrao com dixido de carbono supercrtico (SC-CO2) como solvente tem
um interesse crescente para a recuperao de compostos benficos sade, sendo por
isso, adequado para aplicao nas indstrias alimentcia e farmacutica. Dixido de carbono
um solvente ideal para a extrao de produtos naturais, porque de baixa toxicidade, no
explosivo, prontamente disponvel e fcil de remover a partir de produtos extrados. Por
fazer parte de um mtodo de extrao livre de solventes orgnicos, o uso do CO 2
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favorvel ao meio ambiente e, alm disso, por possuir uma temperatura crtica de 31C
oferece a possibilidade de recuperar com o mnimo de danos possveis os compostos
naturais termossensveis, preservando suas propriedades bioativas. A desvantagem do
dixido de carbono supercrtico que os compostos polares muitas vezes so difceis de
extrair. Essa dificuldade pode ser facilmente resolvida usando pequenas quantidades de
modificadores orgnicos ou co-solventes (DANH et al., 2009; LAROZE et al., 2010; SALGIN,
2007).
Tabela 2 - Propriedades crticas de solventes que podem ser usados na extraosupercrtica.Solvente Temperatura Crtica (C) Presso Crtica (bar)
Dixido de carbono 31,10 73,76
Etano 32,30 48,84
Etanol 240,75 61,40Etileno 9,30 50,36
Propano 96,70 42,45
Propileno 91,90 46,20
Ciclohexano 280,30 40,73
Benzeno 289,00 48,94
Tolueno 318,60 41,14
Clorotrifluormetano 28,90 39,21
Triclorofluormetano 198,10 44,70
Amnia 132,50 112,77
gua 374,20 220,48
FONTE: DIEHL, 2008.
Um empecilho propagao industrial desta tecnologia reporta-se ao custo inicial de
montagem da planta de operao. O equipamento que opera alta presso mais caro que
aqueles dos processos de separao convencionais, contudo, conforme Goodarznia e
Eikani (1998), o custo de funcionamento geralmente inferior, e isto faz com que o custo
total sejam comparveis quando o processo for conduzido em condies otimizadas e comvolume de extrao adequado.
Para possveis aplicaes industriais, a otimizao e avaliao do processo de
extrao com modelagem matemtica so fundamentais. Em mtodos clssicos, os
parmetros de processo so otimizados atravs da realizao de experimentos
concentrando-se em um fator de cada vez, o que mais trabalhoso e demorado, e tambm
ignora o efeito da interao entre os parmetros do processo. Comparado aos mtodos
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clssicos, a metodologia de superfcie de resposta (ASR) mais eficiente pois, requer
menos dados e fornece os efeitos da interao entre as variveis na resposta. Por isso, tem
sido amplamente aplicada para aperfeioar os parmetros de processamento na produo
de alimentos e medicamentos, por exemplo (XIA et al., 2011).
Sobrepujando a dificuldade de custos e operando em condies de altos rendimentos,
o produto extrado atravs desta tecnologia de boa qualidade e pouco necessita de
operaes de refino posteriores. Portanto, os extratos obtidos via extrao com CO 2
supercrtico so geralmente reconhecidos como seguro (Generally Recognised as Safe -
GRAS) para ser usado na produo de alimentos. A tecnologia de extrao com SC-CO 2
tem sido aplicada na extrao de leos a partir de um grande nmero de materiais e seus
extratos tm demonstrado um alto potencial para futuras aplicaes em frmacos e
alimentos (ZHANG et al., 2010).
No processo de extrao, vrios fatores interferem no rendimento final, como o tipo dematriz envolvida, por exemplo. Estudos comparativos de diferentes procedimentos de
secagem das matrizes vegetais mostraram que o melhor rendimento do soluto em estudo
obtido a partir da biomassa seca naturalmente (exposio ao ar), enquanto que o material
seco em estufa fornece menor rendimento. Anlises de microscopia eletrnica de varredura
mostraram que a amostra seca em estufa tem uma pelcula superficial slida que contrasta
com a superfcie porosa das matrizes secas ao ar (MOLYNEUX; COLEGATE, 2008).
Outro fator que influencia no rendimento da extrao o tamanho das partculas da
matriz vegetal. Como uma tendncia geral, a diminuio do tamanho das partculas gera um
aumento do rendimento de extrao. O menor tamanho de partcula facilita o acesso do
solvente de extrao at o soluto, reduzindo as limitaes de transferncia de massa. A
reduo das partculas , provavelmente, associada a uma quebra mais intensa da parede
celular e o rompimento da parede celular facilita a difuso do soluto (LAROZE et al., 2010).
Por exemplo, os leos so armazenados dentro de vesculas celulares. Aps a moagem,
estas vesculas podem ser danificadas levando a uma liberao mais rpida dos leos.
Assim, quanto mais as vesculas so danificadas, mais acessvel o soluto fica para o dixido
de carbono supercrtico, levando a um maior rendimento de extrao (MHEMDI et al., 2001).
A quantidade de gua disponvel presente no substrato tambm pode condicionar o
rendimento final do processo de extrao. Sahena et al. (2009) reportam que o alto teor de
umidade reduz o contato da matriz com o SC-CO2, devido consistncia pastosa que a
amostra apresenta, e nesses casos a umidade atua como uma barreira para a difuso da
SC-CO2na amostra, assim como para a difuso de lpidos para fora desta. O aumento da
recuperao lipdica com a diminuio do contedo de umidade tem sido demonstrada em
amostras midas tais como a carne e de peixe, embora a umidade no afeta a
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extratabilidade destes a nveis baixos. Assim, amostras com alto teor de umidade so
geralmente liofilizadas antes da extrao com SC-CO2para melhorar a sua eficincia.
Ainda na reduo de partculas, a utilizao do CO2como agente de extruso pode
anteceder a prpria operao de extrao. Alguns autores propuseram um pr-tratamento
original para a extrao do leo de sementes que consistiu de uma rpida despressurizao
do sistema contendo a matriz vegetal e o CO2pressurizado no sentido de quebrar as clulas
das sementes. Foi mostrado que a despressurizao em poucos segundos a partir de
20MPa e 35C em condies atmosfricas aumentou a quantidade de leo recuperado na
extrao (BOUTIN; BADENS, 2009).
Outra aplicao que vem ganhando espao o processo de tingimento com CO2
supercrtico. Esta tecnologia limpa se tornou uma alternativa vivel para o tingimento
convencional de tecidos, o qual utiliza quantidades excessivas de gua. As vantagens do
CO2 supercrtico neste processo referem-se ao fato de poder ser reciclado, ser barato,essencialmente no-txico, no inflamvel e ter fcil acesso s condies crticas. Alm
destas vantagens comuns a todas as suas aplicaes neste processo, os restos de corante
dissolvido no fluido supercrtico podem ser recuperados quando o fluido expandido.
Estudos mostram o sucesso desta tcnica no tingimento de polmeros (poli tereftalato de
etileno e polipropileno) e fibras naturais (algodo e l). Neste sentido, pesquisas seguem
estudando as condies operacionais que favorecem uma melhor solubilidade dos corantes
no fluido supercrtico, aperfeioando o processo (CABRAL et al., 2007).
Demonstrando algumas das aplicaes essenciais do CO2supercrtico em diferentes e
relevantes processos, vale revisar quelas que correlacionam o emprego de co-solventes ou
modificadores nos processos de extrao, mesmo porque tambm enfoque deste trabalho.
2.1.1 O uso de co-solvente
O uso de co-solventes em extrao com fluido supercrtico (pequenas quantidades de
solventes orgnicos combinados com CO2supercrtico) tem sido empregado para melhorar
a eficincia da extrao, aumentando a produtividade e modificando a seletividade do
processo. O co-solvente pode alterar algumas caractersticas da mistura de solventes (CO 2e co-solvente), tais como polaridade e interaes especficas com o soluto, formando pontes
de hidrognio ou interagindo com stios ativos da matriz slida (DALMOLIN et al., 2010).
Propano/butano, metanol, etanol e outras substncias podem ser usadas como co-
solventes (POKORNY; YANISHLIEVA; GORDON, 2001). Alguns autores estudaram o uso
de etanol (EtOH) como co-solvente para obter extratos supercrticos e observaram que a
solubilidade do extrato aumentou com o aumento da concentrao deste co-solvente
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(DALMOLIN et al., 2010). A presena de etanol afeta positivamente a extrao de polifenis.
Este fato est relacionado com as interaes covalentes (ligaes de hidrognio) e dipolo-
dipolo que aumentam a solubilidade de compostos fenlicos. Outros autores j mostraram
que a solubilidade de polifenis em (SC-CO2 + etanol) depende da polaridade final adquirida
pelo sistema de extrao (SERRA et al., 2010).
Os resultados do rendimento de extratos constituintes de compostos fenlicos na
extrao com fluido supercrtico aumentam diretamente com a polaridade do solvente. O
uso de etanol como co-solvente demonstrou-se particularmente vivel para melhorar o
rendimento desta frao fenlica. A uma temperatura constante, o aumento da presso
aumentou o rendimento devido ao aumento da densidade, j para uma presso constante, o
rendimento total e da frao fenlica decresceu quando a temperatura aumentou devido
reduo da densidade do solvente (GARCIA-SALAS et al., 2010).
Trabalhos de pesquisa que indicam a influncia de etanol como co-solventereceberam especial ateno j que estes resultados serviram como parmetros indicativos
de procedimentos adaptados neste trabalho. Somado a isso, o EtOH foi escolhido como co-
solvente tambm por ser GRAS e por ser o Brasil um dos maiores produtores. Fatores como
este tambm devem ser considerados no estudo de processo.
Em estudo proposto por Sun e Temelli (2006) para a extrao de carotenides, foi
utilizado leo de canola como co-solvente, por possuir alta solubilidade em SC-CO2 se
comparada ao -caroteno. Alm disso, leos vegetais constituem bons solventes para
carotenos. Nesta pesquisa, o rendimento de e -caroteno aumentou em duas vezes e o de
lutena aumentou cerca de quatro vezes com a incorporao de leo de canola como co-
solvente no processo de extrao.
Na pesquisa realizada por Vasapollo et al.(2004), foi utilizado leo de avel como co-
solvente da extrao de licopeno de tomates. As justificativas para a escolha do leo foram
baixo custo e sua baixa acidez que evita degradao do carotenide durante a extrao,
alm de reproduzir os mais altos rendimentos dentre os demais testados (amendoim,
amndoa e girassol). Os ndices de extrao de licopeno em condies otimizadas e na
presena de co-solvente chegaram a 60% sob a frao total extravel. Em outro trabalho
semelhante, foi verificado que a presena de leos vegetais como co-solvente aumentaram
o rendimento de extrao e contribuiram para a estabilidade do licopeno (YI et al., 2010).
O uso de co-solventes em condies especiais tambm tem sido proposto para
melhorar a solubilidade de diferentes solutos e/ou para aumentar a seletividade de extrao.
Um exemplo a aplicao de extrao por solvente avanado (ESA). Esta tcnica envolve o
uso de CO2, gua e/ ou solventes orgnicos a temperaturas e presses elevadas, de 40 a
200C, e de 3,3 a 20,3 MPa. Esta tcnica tem sido aplicada com sucesso na extrao de
solutos polares, incluindo as antocianinas do bagao de sabugueiro (SERRA et al., 2010).
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Assim como o emprego de co-solvente na modificao da polaridade do CO2
supercrtico e consequente modificao da solubilidade e seletividade do soluto, no h
como desenvolver estudos de extrao sem acompanhar o comportamento da cintica de
extraes. A cintica aponta a influncia do equipamento e condies operacionais na
extrao e caracteriza o processo especificamente para a matriz vegetal em estudo.
2.1.2 O estudo da cintica de extrao
O estudo das curvas de extrao supercrtica e o conhecimento dos efeitos das
variveis operacionais permitem a definio do volume do extrator e vazo de solvente.
Segundo a literatura, as curvas de extrao so claramente divididas em trs perodos,
controlados por diferentes mecanismos de transferncia de massa (MEZZOMO; MARTNEZ;
FERREIRA, 2009; PIANTINO et al., 2008):
(a) A curva inicia-se com o perodo de taxa de extrao constante: nesta fase a
superfcie externa das partculas coberta com soluto (de fcil acesso) e a
conveco o mecanismo de transferncia de massa dominante;
(b) No segundo perodo ocorre a taxa de extrao Falling, nesta etapa as falhas
do soluto na camada externa da superfcie da matriz aparecem e ento
inicia-se o mecanismo de difuso, fenmeno que atua combinado com a
conveco;(c) Finalmente, ocorre o perodo de difuso controlada, onde a camada de
soluto na superfcie externa praticamente desapareceu e a transferncia de
massa ocorre principalmente por difuso do interior das partculas da matriz
slida.
O objetivo principal da modelagem das curvas de cinticas de extrao com fluido
supercrtico definir parmetros para desenho de processos, como as dimenses do
equipamento a ser projetado, fluxo do solvente e tamanho de partcula da matriz. Esses
parmetros so usados para predizer a curva total de extrao e dessa forma estimar a
viabilidade de processo em escala industrial. Vrios modelos matemticos so apresentados
na literatura para descrever a extrao com fluido supercrtico. Um modelo deve ser um
instrumento matemtico que reflete o comportamento fsico da estrutura slida e as
observaes experimentais. Desta forma, poder ser usado como uma ferramenta de
simulao para as curvas de cintica de EFS e depois, para aplicaes industriais desta
tecnologia (MEZZOMO; MARTNEZ; FERREIRA, 2009).
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Os principais parmetros da EFS so a vazo do solvente, o tamanho da partcula do
slido e a durao do processo de extrao. Outros fatores determinantes do processo so
o poder de solubilizao e a seletividade do solvente com relao aos componentes de
interesse e a capacidade de difuso destes no fludo (BRUM, 2010).
Zizovic et al.(2007) discutem em sua reviso bibliogrfica que o modelo matemtico
amplamente utilizado no estudo de processo foi introduzido por Sovov. O pressuposto
bsico deste modelo que parte das clulas, unidades contendo hipoteticamente o soluto
so abertas pela moagem. O soluto facilmente acessvel a partir destas clulas trituradas
extrado primeiro, e a frao mais protegida pelas paredes celulares segue sendo extrada
mais lentamente. As vantagens deste modelo que ele pode ser aplicado em qualquer tipo
de matriz vegetal contendo diferentes tipos de solutos, lipdios ou leos essenciais, por
exemplo. A contribuio significativa para a modelagem da extrao supercrtica de leo
essencial foi dada por Reverchon, Donsi e Sesti (1993), que introduziram modelos baseadosno balano de massa diferencial no vaso extrator, fazendo analogia transferncia de calor.
Operaes de extrao supercrtica de leos essenciais foram modeladas e preditas em
macro-escala por muitos autores, e os resultados experimentais foram ajustados e descritos
em modelos posteriormente propostos. Mais recentemente, Sovov (2005) introduziu um
novo modelo para a extrao supercrtica de produtos naturais, o qual tambm se baseia no
conceito de clulas intactas e trituradas e com dois perodos de extrao, o primeiro regido
pelo equilbrio de fases e o segundo governado por difuso interna nas partculas.
Na extrao de leo de sementes peletizadas ou esmagadas, diz-se que a cintica de
extrao dividida em duas principais etapas. O leo livre extrado inicialmente a partir da
superfcie das partculas de semente a uma taxa constante que parcialmente determinada
por mecanismos de transferncia externa de massa. Na segunda etapa, quando o leo livre
na superfcie da partcula se esgota, a taxa de extrao determinada por mecanismos de
transferncia de massa interna do leo aprisionado nas clulas (del VALLE et al., 2004).
A modelagem matemtica da extrao com fluido supercrtico de solutos com alto
valor agregado a partir de matrizes vegetais, tais como ervas, sementes, folhas ou casca
dificultada pela existncia de estruturas diferenciadas para cada material. Antes da extrao,
o material geralmente modo para aumentar a superfcie em contato com o solvente SC-
CO2e tambm aumentar a acessibilidade do soluto aprisionado nas estruturas celulares e
com isso fornecer a cintica de transferncia de massa que tambm influenciada pela
forma das partculas. Na modelagem, normalmente empregam-se formas geomtricas
bsicas (cilindro, placa ou esfera). Para reduzir a complexidade do modelo, tambm
necessrio fazer suposies simplificadas sobre como o soluto distribudo dentro da matriz
slida que pode estar adsorvido na rede de poros, aprisionado dentro de estruturas
celulares ou distribudo de forma homognea dentro das partculas. As resistncias
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envolvidas nos mecanismos de transferncia de massa tambm devem ser consideradas
como a resistncia de transferncia interna de massa, resistncia de transferncia externa
de massa ou uma combinao de vrias resistncias (OLIVEIRA; SILVESTRE; SILVA,
2011).
2.2 Pitanga (Eugenia unifloraL.)
A Pitanga, fruto da pitangueira (Eugenia unifloraL.) pertence famlia botnica das
Myrtaceae. uma planta frutfera nativa do Brasil, mas encontrada tambm no Norte da
Argentina e Uruguai. Apesar de constituir um cultivo tradicional das regies Sul e Sudeste
do Brasil, nos ltimos anos a regio Nordeste iniciou um cultivo mais tecnificado para
explorao comercial desta fruta de alto potencial econmico. A pitangueira (Figura 1)
frutifica de outubro a janeiro, sendo que a principal forma de comercializao a polpa
congelada (EMBRAPA, 2006). No que concerne produo e comercializao da fruta, no
se dispe de dados oficiais, tanto no Brasil quanto no mundo, no entanto estima-se que o
Brasil seja o maior produtor mundial. Os maiores plantios esto localizados no Estado de
Pernambuco, onde a regio possui cerca de 300 ha cultivados (BEZERRA et al., 2004;
SANTOS et al., 2002).
O fruto uma baga globosa, com sete a dez sulcos longitudinais de 1,5 a 5,0 cm de
dimetro e coroado com spalas persistentes, possuindo um aroma caracterstico intenso esabor doce e cido. No processo de maturao, o epicarpo passa de verde para amarelo,
alaranjado, vermelho, vermelho-escuro, podendo chegar at quase negro. No Brasil no se
conhecem variedades perfeitamente definidas de pitangueiras e em Pernambuco, comum
encontrar pitanga de colorao variando de alaranjada a avermelhada (LIMA; MLO; LIMA,
2002).
O valor nutricional da Pitanga relevante, j que ela apresenta elevado teor em
carotenides (225,9 mg.g-1) com valor de pr-vitamina A de 991 ER.100 g-1 e teor de
vitamina C de 29,4 mg.100mg-1, podendo contribuir para o requerimento dirio destas
vitaminas na alimentao (MLO; LIMA; NASCIMENTO, 1999). Alm disso, a Pitanga
contm grandes quantidades de clcio, fsforo e antocianinas (SILVA, 2006). Devido ao seu
sabor altamente particular e seu contedo de carotenides, o cultivo da cereja brasileira,
como tambm chamada, tem-se demonstrado promissor aos programas de explorao
sustentvel na Mata Atlntica brasileira, um dos pontos de Conservao Internacional da
Biodiversidade do Cerrado. Esta ateno dada Pitanga nestes programas de explorao
sustentvel se deve ao fato da Mata Atlntica ser uma rea caracterizada pela baixa
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atividade econmica e pela Pitanga ser cultivada, em sua grande maioria, em pomares
domsticos ou como atividade agrcola de pequena escala, ou ainda colhidas selvagemente
(CELLI; PEREIRA-NETTO; BETA, 2011).
Figura 1 -Pitangueira.
A polpa congelada da Pitanga tem elevado contedo de compostos fenlicos, os quais
so conhecidos pela sua atividade antioxidante. Dentro do grupo dos carotenides, no
estudo realizado por Filho et al.(2008), foram encontrados no extrato supercrtico da polpa
de Pitanga os seguintes compostos: All-trans-lutena, All-trans-zeaxantina, All-trans-rubixantina, cis-rubixantina I, cis-rubixantina II, All-trans--criptoxantina, All-trans-licopeno,
13-cis-licopeno,All-trans--caroteno, All-trans--caroteno, (all-trans+9-cis)--caroteno e (13-
cis+15-cis)--caroteno. A respeito dos compostos fenlicos, a frao aquosa de frutos de
Pitanga contm antocianinas antioxidantes (BAGETTI et al., 2009).
O emprego das folhas de Eugenia uniflora L., cuja infuso tem sido utilizada na
medicina popular como anti-hipertensiva e antireumtica, bem conhecido no Brasil. As
folhas e frutos so empregados na medicina popular em vrias regies do pas, por serem
considerados excitantes, febrfugos, aromticos e antidisentricos. O extrato alcolico
utilizado em bronquites, tosses, febres, ansiedade e verminoses (AURICCHIO et al., 2007).
O extrato hidroalcolico das folhas diminuiu os nveis da enzima xantina oxidase,
supostamente envolvida no desencadeamento da gota, alm de ter apresentado
caractersticas de vaso-relaxante, antioxidante, antidiarrico, hipotrigliceridmico,
hipoglicmicos e propriedade bactericida, este ltimo tambm observado no leo essencial
(AMORIM et al., 2009). Ogunwande et al. (2005) demonstram efeitos como abaixamento
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dos nveis de glicose sangunea e, diurtico, antifebril, anti-inflamatrio e contra doenas
estomacais.
H uma gama de fitoqumicos j identificados nas folhas da Pitanga, so eles os
compostos fenlicos da famlia dos flavonides como o miricitrina, quercetina e seus
derivados como a quercitrina 3-l-ramnosdeos, terpenides como monoterpenos, triterpenos,
sesquiterpenos, taninos hidrolisados como o eugeniflorina D1 e o eugeniflorina D2
(EMBRAPA, 2006). Em estudo com as cascas da rvore da Pitanga, realizado por Brandelli
et al. (2009), observou-se que essa tem a capacidade de inativar trofozotos de Giardia
lamblia(um dos mais comuns parasitas intestinais), com uma concentrao mnima inibitria
de 0,313 mg.mL-1 de extratos. Alguns taninos hidrolisados presentes no extrato da folha
inibem o vrus Epstein-Barr, conhecido por estar intimamente associado ao carcinoma naso-
farngeo (LEE et al., 2000).
Um trabalho pioneiro realizado por Oliveira et al. (2006) mostra que o fruto dapitangueira possui monoterpenos como componentes volteis majoritrios, sendo trans--
ocimeno, cis-ocimeno, -ocimeno e -pineno em sua composio e o fato do suco da
Pitanga ser usado na medicina popular brasileira contra diarreia, reumatismo, febre e
diabetes, pode estar relacionado ao fato do fruto possuir compostos volteis semelhantes
queles presentes nas folhas, cuja bioatividade tem sido comprovada cientificamente.
Considerando esta particularidade do fruto, o mesmo grupo de pesquisa estudou a
otimizao do processo de obteno de extratos de pitanga pelo emprego de CO2
supercrtico (MALAMAN et al.,2011). Anlises sensoriais revelaram que os extratos ricos
em compostos volteis, principalmente os -damascenone, 5,6,7,7a-tetraidro-4-4-7a-trimetil-
2(4H)-benzofuranone, germacrene B, espatulenol, selina-1,3,7(11)-trien-8-one, 10-(1-
metiletenil)-(E, E)-3,7-ciclodecadien-1-one, farnesil acetone e 2-etil-2-metil-tridecanol
contriburam para a percepo da maior intensidade do aroma caracterstico da fruta, os
quais tambm esto presentes nas folhas como revelado pela literatura (PINO et al., 2003).
Neste estudo, a otimizao do processo revelou que as melhores condies de extrao
supercrtica foram aquelas que empregavam 200 bar e 50C.
Segundo Ogunwande et al. (2005) e Costa et al. (2009) o leo essencial da folha e do
fruto de Pitanga contm sesquiterpenos oxigenados dentre estes os principais so
isofurano-germacreno, germacreno B e germacrone. Componentes do leo essencial de
folhas de Pitanga foram identificados por CG/EM, o seu aroma foi classificado como
semelhante a "cogumelo", "madeira" e "especiarias", devido presena de furanodieno e
notas de "ervas daninhas" e "pepino", devido a presena de selinatrienone (selina-1, 3,7
(11)- trien-8-one), o componente em maior concentrao, recentemente sintetizado. Muitos
compostos volteis das folhas de Pitanga tambm so evidenciados no fruto, incluindo
selina-1, 3 , 7 (11)- trien-8-one. (OLIVEIRA; KAMIMURA; RABI, 2009).
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Com relao a sua semente, existem poucos trabalhos que relatam a sua composio.
Bagetti e colaboradores (2009) avaliaram a composio nutricional e a atividade
antioxidante destas sementes e os resultados revelaram os carboidratos como a classe mais
abundante, compostos principalmente de fibras insolveis. A frao protica muito
reduzida e dentre os cidos graxos presentes, 45 a 47% destes so polinsaturados,
desejveis dieta humana por exercer efeito sobre a reduo da incidncia de doenas
cardiovasculares. Em outro estudo com semente de Pitanga realizado por Luzia, Bertanha e
Jorge (2010), foi obtido extrato etanlico das sementes para investigar seu potencial
antioxidante. A concentrao do extrato que alcanou uma atividade antioxidante de 50% foi
de 30,72 ppm. A concentrao de compostos fenlicos presentes nos extratos etanlicos de
semente de Pitanga tambm elevada, de 75,64mg.g-1extrato.
Segundo Andrade et al.(2009), a semente de Pitanga ainda possui uma protena, a
lectina, que exibe uma notvel atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa eKlebsiellasp. com uma concentrao inibitria mnima de 1,5
g.mL-1, e moderadamente inibe o crescimento de Bacillus subtilis, Streptococcus sp. e
Escherichia colicom uma concentrao mnima inibitria de 16,5 g.mL-1.
Considerando a informao escassa da composio das sementes de Pitanga, a sua
possvel aplicao industrial, visto ao fato de ser resduo do processamento do fruto, o
histrico deste grupo de pesquisa na investigao da composio dos extratos supercrticos
das folhas e do fruto da Pitangueira e as informaes bibliogrficas que revelam sua alta
atividade antioxidante e antimicrobiana geraram o estmulo para o desenvolvimento deste
trabalho.
2.3 Compostos Terpnicos
Os leos volteis de plantas so conhecidos e utilizados desde a antiguidade por suas
propriedades biolgicas, especialmente antibacteriana, antifngica e antioxidante (SOUZA et
al., 2007). leos essenciais, tambm denominados leos volteis, geralmente extrados por
destilao das plantas, so lquidos hidrofbicos contendo compostos aromticos volteis.
Os leos essenciais so amplamente utilizados em perfumes, cosmticos, bem como em
alimentos e bebidas como aditivos de flavor. Alguns leos essenciais mostram vrias
atividades farmacolgicas e so considerados as fraes ativas mais importantes de
medicamentos fitoterpicos (DANG et al., 2010).
leos essenciais, com ou sem resinas e gomas so encontrados em estruturas
secretoras especializadas situadas dentro dos tecidos vegetais ou na superfcie da planta
(tricomas). O tipo de estrutura secretora especfico para a famlia ou espcie vegetal. O
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processo de isolamento do leo essencial quer por extrao ou destilao, deve ser
dependente da forma como o leo est armazenado na estrutura vegetal e do tipo de
estrutura secretora. Estruturas secretoras no tecido da planta podem ser clulas secretoras,
cavidades secretoras ou canais secretores. Uma cavidade secretora normal em vegetais
so os dutos, os quais se alongam na forma de uma rede se estendendo desde as razes
atravs do caule at as folhas, flores e frutos (ZIZOVIC et al., 2007).
De acordo com a sua disposio na matriz vegetal, os leos essenciais so
classificados como leos superficiais ou subcutneos. O primeiro secretado pelas
glndulas superficiais, e o subcutneo secretado bem abaixo da superfcie externa do
material vegetal, como pela casca de rvores, entre as fissuras da madeira, nas flores secas
e brotos, nas sementes, razes e frutos (ARAUS; URIQUE; del VALLE, 2009). Os leos
essenciais tm uma composio complexa, contendo de algumas dezenas a centenas de
constituintes, especialmente hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos) e compostosoxigenados (lcoois, aldedos, cetonas, cidos, fenis, xidos, lactonas, teres e steres).
Ambos os hidrocarbonetos e compostos oxigenados so responsveis pelos odores e
sabores caractersticos. O aroma de um leo o resultado da combinao dos aromas de
todos os seus componentes (POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGHI, 2007).
Terpenos podem ser originados tanto do metabolismo de carboidratos quanto de
lipdios e so classificados pelo nmero de unidades de isopreno que contm.
Monoterpenos contm duas unidades de isopreno (10 carbonos), sesquiterpenos contm
trs unidades de isopreno (15 carbonos) e diterpenos contm quatro unidades de isopreno
(20 carbonos). Desses grupos, os monoterpenos, e mais especificamente, os monoterpenos
oxigenados, so considerados os mais importantes na constituio do aroma de certas
frutas, como por exemplo, as ctricas. Limoneno, um hidrocarboneto monoterpnico que
possui um odor suave, o principal terpeno na maioria dos leos ctricos representando at
95%. Os terpenos oxigenados, muitas vezes, compreendendo menos de 5% do leo,
geralmente fornecem o sabor caracterstico de espcies ctricas diferentes. Por exemplo,
citral considerado o componente de impacto no sabor que caracteriza o leo de limo,
mas raro encontrar mais de 2% de citral neste leo essencial (REINECCIUS, 2006).
A via biossinttica proposta para a sntese de isopentenil difosfato (IPP) combina trs
molculas de acetil-co-enzima-A (acetil-CoA) para formar molculas de 3-hidroxi-3-
metilglutaril-Co-A (HMG-CoA) que por sua vez, so reduzidos a cido mevalnico e depois
fosforilados e descarboxilados para formar o IPP, o elemento chave na sntese natural dos
terpenos. Sabe-se que o IPP tambm pode ser formado atravs de uma via que no inclui o
cido mevalnico, mas ainda faltam evidncias para amparar a existncia desta alternativa.
A prxima etapa desta sntese envolve a combinao de unidades de IPP para formar
geranil difosfato, farnesil difosfato e geranil-geranil difosfato, que servem como precursores
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das famlias mono-, sesqui- e diterpenos, respectivamente (Figura 2). Os demais membros
dessas famlias surgem a partir da ciclizao secundria ou modificao destes trs
precursores (REINECCIUS, 2006).
Figura 2 -Biossntese de compostos terpnicos a partir de isopentil difosfato em tecidosvegetais.Adaptado de REINECCIUS, 2006.
Sesquiterpenos so uma das classes estruturalmente mais diversificadas de produtos
naturais isolados de plantas, fungos, bactrias e invertebrados marinhos. Nas plantas eles
podem atuar contra parasitas, como predadores, ou para atrair polinizadores. Todas as
dezenas de milhares de sesquiterpenos conhecidos presentemente so derivados a partir
2x
1x
OPP
TetraterpenosFitoeno
Dipertenos
Geranilgeranildifosfato
Poliprenis
Politerpenos
2x
CH2OPP
Isopentenildifosfato
CH2OPP
Dimetilalildifosfato
Hemiterpenos
3x
Sesquiterpenos
Esqualeno Triterpenos2xOPP
Farnesil difosfato
OPP
Geranil difosfato
Monoterpenos
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de trezentas estruturas de hidrocarbonetos bsicos gerados por sesquiterpenos adenilato
sintases usando farnesil difosfato como substrato (GARMS; KLLNER; BOLAND, 2010).
Dentre os mtodos de obteno de leos essenciais a partir de fontes vegetais, a
destilao a vapor tem sido a mais tradicionalmente aplicada. Uma das desvantagens dos
mtodos de arraste a vapor ou hidrodestilao que os leos essenciais sofrem alterao
qumica j que os compostos sensveis ao calor podem ser facilmente destrudos. Portanto,
a qualidade do leo essencial extremamente prejudicada. Nesse nterim, os mesmos
autores relatam que a extrao dos componentes de leos essenciais com a utilizao de
solventes a alta presso, ou fluidos supercrticos, tem recebido muita ateno nos ltimos
anos, especialmente na indstria de alimentos, farmacutica e cosmtica, porque apresenta
uma alternativa aos processos convencionais, que normalmente empregam alta temperatura
(BOCEVSKA; SOVOV, 2007; POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGHI, 2007).
Alm da degradao trmica, a hidrodestilao de compostos volteis torna-seineficiente tambm por alguns desses componentes se dissolverem parcialmente na gua e
sua distribuio entre as fases leo essencial e gua no separador do aparelho de
destilao ficar desfavorecida. Assim, a extrao com SC-CO2mostra-se ser a tcnica de
escolha para o isolamento de steres monoterpnicos, alguns de seus lcoois, e
sesquiterpenos de plantas (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).
A extrao com CO2supercrtico tambm uma ferramenta poderosa na pesquisa de
fragrncias e de leos essenciais, especialmente porque o isolamento de componentes
volteis usando mtodos tradicionais, como a destilao a vapor ou de amostragem de
headspacedinmico produz extratos com fragrncia que podem no refletir as propriedades
de aroma do material natural. Com as condies de extrao que empregam temperaturas
brandas, a extrao com fluido supercrtico a mais adequada para isolar leos essenciais
de especiarias, flores, ervas, folhas, sementes e razes. Os extratos obtidos so geralmente
considerados como sensorialmente superiores aos concentrados produzidos pelas tcnicas
tradicionais. Uma desvantagem da extrao com CO2supercrtico, no entanto, a presena
de outros compostos no extrato que no contribuem para a impresso de fragrncia, tais
como hidrocarbonetos de cadeia longa ou lcoois parafnicos (MARSILI, 2002).
A co-extrao de substncias de baixa volatilidade como ceras cuticulares juntamente
com o leo essencial voltil tpico para extrao com SC-CO2de leos essenciais a partir
de material herbceo. Uma possibilidade de obter um leo essencial relativamente puro a
utilizao de separao em dois estgios. No primeiro estgio as substncias de baixa
volatividade e indesejadas so precipitadas e separadas do CO2 supercrtico baixa
temperatura e o leo essencial, sendo mais solvel ao solvente, se separa deste aps uma
alterao na presso e temperatura no segundo separador (BOCEVSKA; SOVOV, 2007).
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A extrao com fluido supercrtico do leo essencial melhora a qualidade do leo
evitando o estresse trmico dos componentes terpnicos. No entanto, as condies de
extrao, principalmente presso e temperatura, responsveis pelo poder de solvente do
fluido supercrtico devem ser otimizadas, uma vez que estas variveis so diretamente
responsveis pela composio do extrato e, portanto, por suas propriedades funcionais. No
entanto, outros fatores como a geometria do leito fixo, o nmero de estgios de extrao e
separao, e o fluxo de solvente podem influenciar no desempenho do processo (LANGA et
al., 2009). Goodarznia e Eikani (1998) afirmam que a presso e a temperatura tima de
extrao para a obteno de alto rendimento de leos essenciais, resultando em
solubilidade insignificante dos outros componentes esto nas faixas de 80 a 100 bar e de 40
a 50 C.
Esta faixa de presso e temperatura foi estudada neste trabalho. Assim como o estudo
da extrao supercrtica, o estudo da aplicao dos extratos complementa os resultados deforma a justificar a viabilidade da tecnologia empregada. Deste modo, anlises da
bioatividade dos extratos supercrticos das sementes de Pitanga foram contempladas neste
trabalho.
2.4 Ensaios para Deteco de Bioatividade de Extratos de Matrizes Vegetais
2.4.1 Atividade antioxidante
Em humanos, o desequilbrio entre espcies oxidantes e antioxidantes pode provocar
uma srie de desordens celulares, tais como peroxidao lipdica, danos protico-
enzimticos e inclusive, alteraes no DNA, as quais podem estar associadas a inmeros
processos deletrios, como o cncer, aterosclerose, diabetes mellitus, artrite reumatide,
distrofia muscular, catarata, desordens neurolgicas e do trato respiratrio alm de
envelhecimento precoce (BIANCO; SANTOS, 2010).
Recentemente, tem havido um interesse crescente em espcies reativas de oxignio
em sistemas biolgicos e seus papis como agentes causais implcitos na etiologia de uma
variedade de doenas crnicas. Assim, a ateno est sendo focada nas funes
bioqumicas de proteo dos antioxidantes naturais nas clulas dos organismos que os
contenham (MENSOR et al., 2001).
Para medir a capacidade antioxidante de alimentos e amostras biolgicas, diferentes
ensaios foram introduzidos. O conceito de capacidade antioxidante foi primeiro originado
para a qumica e mais tarde adaptado para a biologia, medicina, epidemiologia e nutrio.
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Ele descreve basicamente a habilidade de molculas eletronicamente instveis em
neutralizar os radicais livres de sistemas biolgicos atravs de reaes de oxido-reduo
(redox). Este conceito fornece um quadro mais amplo dos antioxidantes presentes em uma
amostra biolgica, uma vez que considera os efeitos aditivo e sinrgico de todos os
antioxidantes e no somente o efeito de um dos compostos isolados, e podem, portanto,
causar benefcios sade como antioxidantes potenciais contra doenas mediadas pelo
estresse oxidativo (FLOEGEL et al., 2011).
Nos ltimos anos, vrios ensaios espectrofotomtricos foram adotados para medir a
capacidade antioxidante de alimentos, sendo os mais populares os ensaios que utilizam os
radicais 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) e o 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
(DPPH). Alm daquele que mede a capacidade de absoro de radicais de oxignio (ORAC)
e a capacidade de reduo de ons ferro em plasma (FRAP). A maioria destes ensaios
emprega o mesmo princpio, um composto radicalar sinttico de cor ou oxi-redutor geradoe a capacidade de uma amostra biolgica para eliminar os radicais ou para reduzir o
composto redox-ativo monitorado por espectrofotmetro, juntamente com a aplicao de
um padro adequado para quantificar esta capacidade antioxidante, por exemplo, por
equivalente de Trolox (TEAC) ou equivalente de vitamina C (VCEAC). Alm disso, existem
dois tipos bsicos de mecanismos. Um deles baseia-se na transferncia de eltrons e
envolve a reduo de um oxidante de cor, como o ABTS, DPPH e ensaio FRAP. O outro
aborda uma transferncia de tomo de hidrognio, como no teste ORAC, em que os
antioxidantes e o substrato competem termicamente pelos radicais peroxila gerados
(FLOEGEL et al., 2011).
Em se tratando do estudo de extratos vegetais, os quais so compostos por uma
infinidade de substncias, alm de conhecer a capacidade antioxidante total, mais
recentemente tem-se agregado outras metodologias com o intuito de identificar os
compostos que mais contribuem para tal efeito. A cromatografia em camada delgada (CCD)
combinada com ensaio de inibio do radical DPPH um mtodo que tem a capacidade de
garantir a reao de oxi-reduo suficiente a partir do isolamento de grupos de
componentes com atividade antioxidante em uma mistura. Os compostos ativos, separados
em bandas, so vistos como manchas claras contra um fundo roxo na cromatoplaca. Testes
preliminares usando CCD possibilitam direcionar a separao de compostos antioxidantes
em cromatografia de alta resoluo como a anlise por cromatografia lquida de alta
eficincia (CLAE) (ZHAO, J. et al., 2010).
O radical DPPH (DPPH) tambm tem sido utilizado em CLAE com a finalidade de
indicar a atividade antioxidante de cada componente, a qual medida pela inibio destes
radicais livres. Embora a combinao da CLAE com as reaes de oxi-reduo usando
DPPH seja eficiente, o sistema on-line pode apresentar uma cintica de reao lenta que
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permite uma caracterizao imprecisa da atividade antioxidante destes compostos. Alm
disso, esta tcnica desconsidera o efeito sinrgico que uma substncia pode exercer sob a
outra e assim, um composto que na prtica teria uma alta atividade antioxidante, por esta
tcnica (CLAE + DPPH) visualizado um baixo efeito, pois este composto analisado
individualmente (ZHAO, J. et al., 2010).
A interao de um potencial antioxidante com DPPH depende de sua conformao
estrutural. O nmero de molculas de DPPH que so reduzidas parece estar
correlacionado com o nmero de grupos hidroxila disponvel. sugerido que o DPPH livre
abstrai o hidrognio de molculas de compostos fenlicos que so doadores de eltrons.
Este poderia ser o mecanismo geral das reaes com flavonis antiperoxidativos, por
exemplo. Com base no mecanismo de reduo da molcula de DPPH extensivamente
descritos na literatura, que est correlacionada com a presena de grupos hidroxila na
molcula antioxidante, pode-se inferir que a grande atividade de extratos polares ,provavelmente, devido presena de substncias com um grupo hidroxila disponvel,
fenlico ou no. Esta exigncia estrutural poderia estar ligada presena de flavonides ou
taninos condensados, por exemplo (MENSOR et al., 2001).
O radical 2,2 azobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS+) um conhecido
composto utilizado para a anlise colorimtrica de oxidantes qumicos diversos. A molcula
de ABTS incolor convertida para a cor azul-esverdeada na sua forma radicalar, pela
oxidao de um eltron. O ABTS+mostra fortes bandas de absoro de UV-vis em 415,
648, 728 e 812 nm, e conhecido por ser uma espcie radicalar mais duradoura, pois
diferente do radical DPPH que, quando formado s pode ser usado para anlises no mesmo
dia, o radical ABTS quando em soluo pode ser estocado por at um ms sob refrigerao.
Tem sido relatado que ABTS pode ser rapidamente formado por reaes com vrios radicais
inorgnicos, como OH, Br2-e RS, e diversos radicais orgnicos, tais como radicais alcoxil
ou alcoxilperoxil. Alm disso, oxidantes no radicalares, como o cido percarboxlico,
ferrato, espcies de bromo e cloro, so conhecidos por reagir com ABTS para produzir
estequiometricamente ABTS+. Portanto, ABTS+tem sido utilizado como uma sonda cintica
para o estudo de reaes de neutralizao de radicais livres, bem como um reagente para a
anlise quantitativa de oxidantes qumicos (LEE; YOON, 2008). Este mtodo tem sido
aplicado para o estudo de fraes antioxidantes solveis em gua e antioxidantes
lipossolveis, compostos puros e extratos (RE et al., 1999).
2.4.2 Atividade antimicrobiana
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A sobrevivncia e proliferao dos micro-organismos nos alimentos um problema
importante, que pode levar deteriorao e assim prejudicar a qualidade de produtos
alimentcios ou causar infeco e doena. Estima-se que as doenas diarricas de origem
alimentar j causam cerca de 4 a 6 milhes de mortes por ano, sendo crianas a maioria.
Apesar dos conservantes qumicos serem utilizados h anos, existem controvrsias j que
alguns podem causar problemas de sade respiratria, por exemplo. Portanto, necessrio
encontrar uma nova maneira de reduzir ou eliminar micro-organismos nos alimentos e
prolongar a vida de prateleira. Somado a isto, a crescente demanda dos consumidores por
produtos naturais tem levado investigao de novos agentes antimicrobianos a partir de
matrizes vegetais (LV et al., 2011).
O estudo para a descoberta de novas substncias com capacidade antimicrobiana tem
sido estimulado pela demanda dos consumidores que relacionam extratos obtidos de fontes
vegetais com sade e alimentos mais saudveis. Produtos naturais tm sido uma fonteparticularmente rica de agentes anti-infecciosos, produzindo, por exemplo, a penicilina, em
1940, as tetraciclinas em 1948 e os glicopeptdeos em 1955 (CUSHNIE; LAMB, 2005).
Dentre os extratos de matrizes vegetais j reconhecidamente antimicrobianos, destaca-se
os leos essenciais de cravo, organo, alecrim, tomilho, slvia e vanilina. Eles tm
geralmente ao inibitria mais expressiva contra bactrias Gram-positivas do que contra
bactrias Gram-negativas (HOLLEY; PATEL, 2005).
Vrios fatores relacionados aos prprios micro-organismos condicionam a resistncia
aos agente antimicrobianos, como a complexidade da parede celular. De acordo com Lv et
al. (2011), geralmente reconhecido que as clulas da fase logartmica do crescimento
microbiano so mais sensveis aos fatores de estresse externos, enquanto as clulas da
fase estacionria so mais resistentes. Este fenmeno pode ser explicado pelas mudanas
estruturais ou conformacionais na parede celular dos micro-organismos por ser uma
estrutura dinmica que pode se adaptar a mudanas fisiolgicas. Por exemplo, tem sido
demonstrado que no peptidoglicano de clulas de Escherichia coli ocorrem alteraes
evidentes durante a transio da fase logartmica (inicio do ciclo microbiano de grande
multiplicao dos micro-organismos) para fase estacionria (final do ciclo microbiano, no
qual o nmero de bactrias originadas praticamente igual ao nmero de bactrias que
morrem), incluindo o espessamento da camada de peptidoglicano e o aumento da grau de
ligaes cruzadas deste glico-polissacardeo. Isso mostra que o aumento das ligaes
qumicas no peptidoglicano tornam as clulas cultivadas h mais tempo mais difceis de
serem danificadas.
A Organizao Mundial de Sade no tem medido esforos para padronizar os testes
de susceptibilidade antimicrobiana a nvel internacional. Estudos colaborativos publicados
na dcada de 70 tiveram o objetivo de padronizar a diluio em caldos e testes de
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susceptibilidade antimicrobiana em meios de cultura com diluio em gar. Depois, testes
de difuso em disco foram cuidadosamente padronizados para uso nos pases
escandinavos e nos Estados Unidos. Com a divulgao destes dois procedimentos, muitos
detalhes processuais passaram a ser cuidadosamente controlados e bem definidos. Uma
variedade de outros mtodos foram criados, mas houve pouco esforo para o controle de
variveis importantes, como a densidade de inculo, gar, condies de incubao, dentre
outros. Os testes padronizados de disco envolvem medir o dimetro de cada zona de
inibio e comparar com a concentrao inibitria mnima (CIM) obtida por testes de
suscetibilidade de diluio em gar ou caldo (SCHWALBE; STEELE-MOORE; GOODWIN,
2007).
Basicamente, maior poder antimicrobiano ter a substncia que conseguir um grande
halo de inibio (distncia sem crescimento microbiano) com uma baixa concentrao, o
que significa que esta substncia a uma concentrao baixa consegue reproduzir umaresposta inibitria eficiente. Em teste de inibio de micro-organismos atravs da medio
do halo de inibio, existe uma classificao com trs nveis que leva em conta a distncia
entre a substncia teste presente no disco de papel e a cultura bacteriana, sendo ela: baixa
atividade (zona de inibio 12mm), atividade moderada (12mm < zona de inibio
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antimicrobiana de um leo essencial particular, o conhecimento da composio qumica
fundamental (RATTANACHAIKUNSOPON; PHUMKHACHORN, 2010).
Na reviso publicada por Cushnie e Lamb (2005), foi abordado o mecanismo de ao
de flavonides que podem compreender trs vias principais de inativao dos micro-
organismos: uma das vias a inibio da sntese de cidos nuclicos, atravs de ligao de
hidrognio formadas entre o flavonide com a cadeia de DNA ou intercalao dos anis do
flavonide com as bases dos cidos nuclicos e essa rota leva a inibio da sntese de DNA
e RNA. Outro mecanismo a inibio do funcionamento da membrana citoplasmtica por
meio da modificao das regies hidroflicas e hidrofbicas da membrana. Algumas
catequinas interagem com a bicamada lipdica pela penet