EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS

Ivson CassianoMayla Abrahim

O que são proteínas heterólogas

heterólogo (he-te-ró-lo-go) adj (hétero+logo) 1 Que consiste em elementos diferentes. Expressão heteróloga de proteína significa que uma proteína é experimentalmente colocado em uma célula que normalmente não fazem (ou seja, expressa) a proteína.

A expressão de proteínas funcionais em hospedeiros heterólogos é um desafio da biotecnologia moderna.

Proteínas e sua importância

A sequência de aminoácidos bem como a função da proteína, são determinadas pela sequência de pares de bases no gene que a codifica. As proteínas são essenciais à estrutura, à função, e ao regulamento celular e são também responsáveis pela homeostasia do organismo.

 A expressão heteróloga de proteínas é muito importante quando se pretende proceder ao estudo funcional das mesmas.  

A utilização de microrganismos geneticamente modificados, capazes de sintetizar proteínas em grande quantidade, apresenta, sob o ponto de vista econômico, uma vantagem considerável em relação aos processos clássicos de produção.

Os sistemas de expressão heteróloga em proteínas têm vindo a ser extensivamente utilizados nos dias de hoje, nomeadamente na produção de proteínas de interesse do ponto de vista biotecnológico e medicinal .

EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS

Expansão e desafios da indústria de biotecnologia: produção eficiente e controlada de proteínas

recombinantes

diferentes sistemas de expressão: procariotos e eucariotos

inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica e de prevenção (vacinas)

Tecnologia de DNA recombinante: obter e combinar genes de uma variedade de fontes

clonar e expressar genes em diferentes hospedeiros

produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes

A clonagem de expressão permite obter o produto do gene clonado.

O produto é utilizado para diferentes fins:

O transcrito da sequência clonada (transcrição in vitro) pode servir como sonda de hibridação.

•A proteína expressa pode servir para identificar o gene clonado, numa biblioteca de expressão, por hibridação com o anticorpo específico.

•O DNA recombinante pode servir para produzir proteínas de valor comercial.

Relembrando:

Clonagem gênica: isolamento, amplificação e purificação de um gene ou de genes, a partir do material genético de um dado organismo.

Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada.

Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras, células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).

Sistemas de expressão de proteínas recombinantes:

bactérias (Escherichia coli)

leveduras (Pichia pastoris)

baculovírus/células de inseto

cultura de células de mamíferos

células de plantas e plantas transgênicas

animais transgênicos

Processo: Escolhendo o vetorAplicação da proteína expressada

Características da proteínaSolubilidade e localização celular

Tags

Preparar o vetorDigestão ou Método LIC

Preparar o Inserto Plasmídeo ou DNA

PCRClonar o Inserto no Vetor

AnelamentoTransformação

Transformação em célula

de expressão

InduçãoDeterminação tempo e

temperaturaSDS-PAGE

Cultura de células

ExtraçãoDetergentes

Métodos Físicos

PurificaçãoColuna afinidadeProtases - Tags

Procedimento: Isolar e preparar o DNA;

Escolher o vetor apropriado;

O fragmento de DNA a clonar é introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante.

O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira – transformação, que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese protéica;

Selecção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante;

Verificar se a proteína foi expressa;

Remoção e purificação das proteínas.

Escolhendo o vetor

Organismos como plasmídeos, bacteriófagos, cosmídios, BAC (Bacterial Artificial Chromosome) e YAC (Yeast Artificial Chromosome) utilizados para transferir DNA/RNA para uma celular hospedeira.

Considerações importantes para escolher o melhor vetor de expressão:

- Aplicação da proteína expressada;

- Informações específicas sobre a proteína a ser expressada (sequência extra de amina terminal)

- Estratégia de clonagem – preparo do inseto (compatibilidade entre sítio de restrição e a região de leitura).

- Solubilidade e localização celular (citoplasma, periplasma ou corpo de inclusão)

- um local de reconhecimento onde as endonucleases o irão cortar.

Preparando o inserto de DNA

DNA de interesse

Utilizar uma enzima de alta fidelidade;Limitar o número de ciclos da reação;Aumentar a concentração do DNA;Aumentar a concentração de primers.

Células para clonagem E. coli

Vantagens:Vasto conhecimento da genética e fisiologia de E. coliDiversidade de vectores de clonagem Fácil controlo da expressão génica Fácil crescimento com elevadas produçõesSecreção do produto no meio de cultura

Desvantagens:Não realiza modificações pós-traducionais e tem capacidade limitada de formar pontes dissulfídricasAtividade biológica e imunogenicidade podem diferir da proteína naturalElevado conteúdo de endotoxinas Falta de um mecanismo de secreção

Escolhendo a melhor célula

A escolha da melhor célula competente depende da natureza da proteína de interesse:

Proteínas mais sensíveis a ação de proteases;

Proteínas eucarióticas que possuem códons próprios, também chamados de raros;

Proteínas insolúveis;

Proteínas tóxicas;

Deficiência de Protease

Linhagens B834, BL21, BLR, Origami ™B, Rosetta™ 2, Tuner™;São deficientes em proteases que possam degradar as proteínas durante o processo de purificação;Proteínas se tornam mais estáveis nessas linhagens;

Um pedaço de DNA pode ser inserido em um plasmídeo, se tanto o plasmídeo circular e a fonte de DNA têm sítios de reconhecimento para a mesma endonuclease de restrição.

Vetor de expressão

Clonagem num vector de expressão plasmídico

Um pedaço de DNA pode ser inserido em um plasmídeo, se tanto o plasmídeo circular e a fonte de DNA têm sítios de reconhecimento para a mesma endonuclease de restrição.

O plasmídeo e o DNA estranho são cortados por esta endonuclease de restrição (EcoRI neste exemplo).

Os dois intermediários recombinar por base o emparelhamento e estão ligadas pela ação da DNA ligase.

O vector de expressão tem um promotor forte, adjacente ao gene que codifica a proteína, que origina grandes quantidades de mRNA.

O DNA recombinante é introduzido em bactérias, leveduras, células de inserto, ou células de mamífero, onde o gene clonado é transcrito e traduzido eficientemente.

Tag

O tag é uma curta sequência de nucleotídeos que codifica um peptideo com poucos aminoácidos.

Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto do gene clonado.

Permite a detecção e purificação de proteínas.

Péptideos de fusão específicos conferem vantagens à proteína alvo durante a expressão: aumentam a solubilidade, protegem da proteólise, melhoram a conformação, aumentam a produção.

São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem:His6 Glutationa-S-transferase (GST) Proteína de ligação a maltose (MBP)Proteína verde fluorescente (GFP)Epítopos

Tag adicionado ao inserto

Por engenharia genética, uma tag (epítopo) pode ser adicionado ao inserto.

Detecção de proteínas

A identificação do DNA clonado é feita por hibridação com um anticorpo específico da proteína expressa.

Recuperando a Proteína

Lise celular

Remoção dos Ácidos Nucléicos

Otimizar a Purificação

Remover os Tags

Armazenar as proteínas em tampão apropriado.

Lise celular convencional

Detergentes para Extração

Buster Family

É uma mistura de detergentes, própria para o rompimento da parede celular de E.coli e liberação das proteínas ativas.

Purificação de proteínas com tag

Após obtenção da proteína, esses resíduos devem ser purificados;Podem prejudicar a função / forma da proteína;São removidos por uma protease específica e / ou coluna cromatográfica.

Proteases de remoção

Proteases específicas promovem remoção eficiente dos resíduosda proteínas.São altamente específicas e podem ser ativadas em baixastemperaturasEvita desnaturação da proteína.

Fractogel

Purificação eficiente e econômica das protéinas

Purificação de proteínas em larga escala;Purificação de proteínas recombinantes

obtidas da cultura celularPurificação de vírusRemoção de resíduos e toxinasAlta estabilidade química

Corpos de Inclusão – Fração Insolúvel

Corpos de inclusão: tornam a proteína inativa devido a formação de agregados insolúveis (ácidos nucléicos, fosfolipídios, etc); Consequentemente a proteína deve ser rearranjada para retomar sua atividade;Métodos convencionais de purificação de corpos de inclusão são empíricos e consomem muito tempo do usuário.

iFOLD ™ Protein Refolding System

É um método rápido ereprodutível deidentificar as condiçõesde rearranjo da proteína.

Gene repórterGene repórter é um gene que produz uma proteína que pode ser detectada e quantificada utilizando um teste simples.

Utilização de genes repórter na localização de proteínas recombinantes

Ratinho transgénico com GFP em fusão com uma proteína epitelial

O ratinho contém um transgene marcado com GFP expresso no corpo; o ratinho fluoresce quando iluminado com luz UV.

Atualmente

É possível realizar este processo (com modificações especificas para cada célula, proteína de interesse e genoma) em:

Leveduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, entre outras).

células de mamífero (células COS, células CV1, etc)

baculovírus/células de inseto

células de plantas e plantas transgênicas

animais transgênicos

A produção de insulina humana porENGENHARIA GENÉTICA

bactéria E. coli Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001

vetor de expressão pLMT8.5 construído para a produção da pró-insulina humana em E. coli.

Aumentando a estabilidade da proteína

Utilize células deficientes de proteases;

Adicione inibidores de proteases durante o processo de extração

Encontre o melhor tampão de armazenagem

Bibliografia

Como melhorar sua Expressão de Proteínas Recombinantes em E.coli. Paola de Carvalho Braga, 2008.

Clonagem de expressão.

PROTEÍNAS RECOMBINANTES PRODUZIDAS EM LEVEDURAS. Fernando Araripe Gonçalves Torres. Revista Biotecnologia.

A produção de insulina humana por ENGENHARIA GENÉTICA. Beatriz Dolabela de Lima. Revista Biotecnologia.

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Ivson CassianoMayla Abrahim