Sistemas de expresión génica en bacterias

Existe un interés en el conocimiento de la expresión de genes en bacterias tanto desde el punto de vista básico como aplicado.

Desde el punto de vista básico, se requiere disponer de las proteínas para la caracterización bioquímica y este conocimiento resulta crítico en proyectos tendientes a su utilización biotecnológica.

Sistemas de expresión destinados a investigación básica raramente superan los 10 litros de cultivo, mientras que la producción de una proteína recombinante en la industria incrementará cientos de veces estos volumenes.

Sistemas de laboratorioNo tienen en cuenta costos, ni problemas con el inductor, marcador de selección, inestabilidad genética, la resina de purificación o la transferencia de calor en el sistema.

A escala industrialCada paso será analizado por la relación con el costo de producción.Alta producción.Relación entre los niveles de proteína soluble e insoluble.Relación de forma activa o inactiva. Costos de las soluciones y medios de cultivos.

Legislación e impacto ambiental.

Escherichia coli es la elección inicial, se disponen de herramientas sofisticadas y un conocimiento amplio de su genética y bioquímica

Puede no ser la elección adecuada si el producto final requiere de modificaciones postraduccionales específicas

Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Streptomyces

Porque utilizar un sistema de expresión bacteriano?

Lactococcus lactis posee característica de ser seguro para el consumo humano eso lo hace atractivo para el diseño de nuevos alimentos

Proteinas y diferentes compuestos producidas en Bacterias

Compuesto MicroorganismoEnzimas de Restriccón E. coliL- Acido Ascorbico Erwinia herbicola(Vitamina C) Sintesis de pigmentos E. coli(pigmento azul) Aminoacidos Corynebacterium glutamicumLipasas Pseudomonas alcaligenesAntibioticos Streptomyces, PenicilliumBiopolimeros E. coli

Extremófilos como nuevas fuentes de proteínas y compuestosAlta o baja temperatura, pH ácidos o alcalinos

Medicamentos

Expresión de Proteínas en Sistemas procarióticos

Estrategia general

Utilización de un vector para el clonado y la expresión del gen de interés.

Componentes del sistema de expresión

• ADN codificante de interés:• Genómico• cDNA

• Vector Expresión (plásmidos):• Señales transcripcionales (Promotor, Terminador)• Señales traduccionales

• Hospedador (E. coli, L. lactis, vegetal, animal):

Expresión de genes eucariotas requiere la eliminación de los intrones

cDNA

Componentes del sistema de expresión

• ADN codificante de interés:• Genómico• cDNA

• Vector Expresión (plásmidos,fagos):• Señales transcripcionales (Promotor, Terminador)• Señales traduccionales

• Hospedador (E. coli, L. lactis, vegetal, animal):

Cuantos sistema de expresión y condiciones podemos evaluar?

Un cálculo aproximado….

Ejercicio 1 Por ejemplo, si disponemos de :

4 vectores3 Fusiones a péptidos diferentes para purificar (podemos hacer al Ct o Nt)6 cepas hospedadora y 3 medios de cultivos a 3 temperaturas

Vamos a necesitar….

varios meses de trabajo!

Existen numerosos sistemas de expresión tanto en bacterias como en células eucarióticas

Cual selecciono?

Recomendación:

La selección es empírica, pero se puede acotar o seleccionar algunos sistemas mas probables, teniendo en cuenta los resultados de los experimentos.

.- Consultar la bibliografía, analizar los resultados.

Vectores de expresión

ori

Elementos de un plásmido de expresión

• Orígen de Replicación

ColE1, p15A

• Marcador Seleccionable

Ampicilina, kanamicina, cloramfenicol

Marcadores grado alimentario

Resistencia a la infección con fagos, nisina, auxotrofias, metabolismo de azúcares.

• Sitio de multiple clonado

• Promotor inducible o constitutivo

Lac, Trp, Tac

Origen de Replicación:

Determina el número de copias por células

Determina la estabilidad en el hospedador

Determina la compatibilidad con otros plásmidos

Para expressión conviene un número de copia intermedio

No es lineal

Coexpresión de genes: Utilizar plásmidos compatibles

La inestabilidad plasmídica en los

sistemas de expresión génica

• Los plásmidos representan una carga metabólica importante

• Los plásmidos pueden perderse, reorganizarse bajo una fuerte presión de producción o ausencia de presión de selección,

• La integración cromosómica como alternativa de los sistemas de expresión.

Componentes del sistema de expresión

• ADN codificante de interés:• Genómico• cDNA

• Vector Expresión (plásmidos):• Señales transcripcionales (Promotor,

Terminador)• Señales traduccionales

• Hospedador (E. coli):

Eficiencia de la expresión dependerá

1. Tipo de las señales transcripcionalesPromotor y terminador

2. Tipo de señales traduccionalesAfinidad del mRNA y el ribosoma

6. Número de copias del gene y su localización cromosoma o plásmido

5. Localización celular de la proteína expresada

3. Eficiencia de la traducción en el organismo productor

4. Estabilidad de la proteina en el organismo productor

Regulación de la expresión del operón lac

Vectores iniciales utilizaron el Promotor Lac y variantes mejoradas

Promotores

Secuencias de las Cajas -35 y -10, la distancia entre ambas y su secuencia.La secuencia SD y su distancia al codón de iniciación

Promotores

Promotores pueden ser:constitutivos o inducibles

Fuertes o DebilesCual usar?

El efecto tóxico de la proteinaEl proceso de purificación

Promotores regulados y fuertes suelen ser mas utilizados en general

Promotores Fágicos ( l pL)

Suele ser costosa la transferencia de calor en un cultivo a gran escala.Represor es inactivo a 42º C.

Sistema de expresión derivados del

fago T7 (Studier et al, 1984)

• Es el sistema de expresión mas utilizado a escala de laboratorio.

• Utiliza la RNA polymerasa del fago T7• Posee especificidad sobre los promotores fágicos

(Usa el promotor de gen f10 del fago T7)• Existen numerosas variantes comerciales y

adaptaciones.

Sistema de BL(DE3) y los vectores pET

Cepa BL21 posee integrada en un l la RNA polymerasa del fago T7, bajo el control del sistema lac (cepa BL21 (DE3)).

IPTG o la lactosa produce la expresión de la polimerasa específica del fago T7.

pETxx

Gene de interés es expresado de promotor F10 del fago T7 en la serie de vectores pETx

Reconoce especificamente el promotor

Como funciona el sistema

• Requiere de la RNA pol. del fago T7

• Serie (DE3) posee integrada la polimerasa del fago (es posible transducir la polimerasa a nuevas cepas)

• Existen variantes de E. coli BL21(DE3) con diferentes propiedades.

• Promotor de gen f10 del fago T7

• Copias lacI

• Problemas derivados de la utilización de los vectores pETxx• Posee inestabilidad, alta expresión y alta probabilidad de formación

de cuerpos de inclusión

No son infalibles, mas del 80 % de las proteínas cristalizadas fueron expresadas por este sistema

Algunos problemas de toxicidad de los genes

expresados pueder ser dismunuidos

• Los plásmidos pLysS

y pLysE codifican

lisosima que inhibe la

polimerasa T7

El sistema del fago T5

El sistema utiliza la polimerasa de E. coli.

En la serie pQExx, el promotor T5 se encuentra regulado por LacI.

LacI puede ser aportado en cis o trans.

pREP4 permite la regulación en otras cepas de E. coli.

Nuestra experiencia pET vs. pQEProteínas de membrana (transportadores):Caracterización funcional, difícil sobreexpresión.Ejemplos: citP, citHRecomendación: Utilizar versiones de bajo número de copias y promotoresde bajos niveles de expresión.

Factores transcripcionales: Sobreexpresan insolubles.Ejemplos: CitI, CitORecomendación: Optimizar condiciones de expresión para obtener la forma soluble.

Enzimas:Buenos resultados para ambos sistemas, Modificando de las condiciones de expresión y construyendo cepas.

Péptidos o Proteínas de fusión

• La fusión de nuestra proteína a otra

– Incrementa la expresión

– Facilita la purificación

– Mejora su solubilidad

• Donde dirijo la fusión al N terminal o al C terminal?

Expression Vector Producing

Fusion Protein

insert in the His6 ORF

Some Fusion Systems Used to Facilitate the

Purification of Foreign Proteins Produced in E. coli

Factor Xa Protease

• Blood coagulation factor protease Xa cleaves only at a

specific amino acid sequence

Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg

Otros factores que afectan la expresión

• Frecuencia de uso de codones

• Medio de cultivo (LB y medio mínimo) Sistemas proteolíticos

• Condiciones de cultivo / inducciónReducción de la temperatura de crecimiento y / o de inducción ( 16 - 20 grados)

Obtención de cepas deficiente en los sistemas de proteasas

La cepa de E. coli BL21, es deficiente en lon (cytoplasmic) and ompT (periplasmic) genes.

Estas mutaciones generan en general problemas, las cepas son mas sensibles al estrés, crecen mucho mas lento y poseen

alteraciones en el metabolismo.

Donde se localizará la proteina expresada?Tener en cuenta donde estamos expresando

(E. coli, L. lactis o B. subtilis)

Cuerpos de Inclusión(insoluble)

Citoplasma (soluble)

Espacio Periplasmatico(soluble or insoluble)

Secretada

Electron micrograph of an inclusion body of the protein prochymosin in an E. coli cell

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Protein Folding

Good side of inclusion bodies

1) inclusion bodies can be accumulated in the cytoplasm

to much higher level (greater than 25%)

than production as soluble form;

2) inclusion bodies is initially isolated

in a highly purified, solid, and concentrated state

by simple physical operation (centrifugation).

3) inclusion bodies have no biological activity.

For toxic proteins it may be the only one available;

4) inclusion bodies are resistant to proteolysis

That results in the high yield of protein production.

Recovery of proteins from

inclusion bodiesIs not a straightforward process, but road of trials and errors

Solubilization Refolding

Choice of solubilizing agents,

e.g., urea,

guanidine HCl,

or detergents,

plays a key role

in solubilization

efficiency

-- Refolding is initiated

by reducing concentration

of denaturant used to solubilize IBs.

Guandinium

-- Refolding competes with other reactions,

such as misfolding and aggregation

(both are leading to bad results)

-- Chaperones are helpful in refolding

(including chemical chaperones)

FUSION PROTEIN BOUND TO GLUTATHIONE SEPHAROSE

Glutathione

GST

FOREIGN PEPTIDE

SEPHAROSE

Purification is simple :

-- WASH COLUMN EXTENSIVELY

-- ELUTE WITH REDUCED GLUTATHIONE

-- RESULTS IN PURE GST FUSION

PROTEIN

Uso del codon

Codon Usage Problems

Uno de los problemas mas comunes en la selección del gen es la

diferencia en el uso de los codones. Esto aumenta por las

diferencias en el contenido de GC o diferencias evolutivas

Correcting Codon Usage Issues

• Over express tRNA genes corresponding to the

required codons

• Amino acid production and/or charging enzymes may

also need to be modified in some cases

E. coli comerciales que codifican raros codones

AGG/AGA (arginine),

CGG (arginine), AUA (isoleucine)

CUA (leucine)CCC (proline), and GGA (glycine)

(AT-rich compatible)

Rosetta or Rosetta (DE3)

arginine (AGG, AGA)

and proline (CCC)

BL21 (DE3) CodonPlus-RP

(GC-rich compatible)

arginine (AGG, AGA),

isoleucine (AUA) and leucine (CUA)

BL21 (DE3) CodonPlus-RIL

(AT-rich compatible)

Solución, uso de

tRNAs

Factores que afectan la estabilidad de las proteinas

1. Actividad de la actividades de proteasas(intra o extracelulares)

2. Dominios de señalización o estabilidad afecta la estabilidad

Resumen