Aislamiento de BacteriófagosUNIVERSIDAD DE SONORA

LABORATRIO DE VIROLOGIA

Introducción Los Fagos, son virus que infectan específicamente

bacterias.

Fueron descritos por Frederick Twort (1915)

Existen 13 familias de fagos que se clasifican de acuerdo a su naturaleza genómica y características morfológicas

Mecanismos de Replicación del Fago

Objetivo

Lograr el aislamiento y la cuantificación de bacteriófagos utilizando técnicas adecuadas.

Materiales y métodos

Materiales Aguas negras Cepa de E. coli

Material de laboratorio

Tubos de ensaye de 16 X150 mm estériles

Tubo de ensaye de 16 X 150 mm con 10 mL de caldo nutritivo más extracto de levadura al 1%.

Tubo de ensaye de 16 x150 mm con 10 ml de sol. Salina estéril

Tubos de ensaye de 13x100 mm estériles

Tubos de ensaye de 13x100 mm con 3 ml de agar al 0.75% de agar (fundido)

Cajas de Petri con agar nutritivo más extracto de levadura al 1%.

Pipetas de 1, 2 y 5 ml estériles

Hisopos estériles

Pipetas Pasteur estériles

Embudo de vidrio de 6 cm de diámetro

Papel filtro Whatman

Vaso de precipitados

Filtro com membrana de 0.45 mm

Jeringa de 5 ml

Centrífuga y tubos de centrífuga de 10 ml

Benzal 1:1000 o hipoclorito al 1%

Mechero Bunsen

Tripié

Metodología

Aislamiento de fagos1. Agregar 3 ml de solución salina estéril en una

caja con crecimiento masivo de la bacteria hospedera. (aislada y purificada previamente de la muestra)

2. Cosechar el crecimiento con un hisopo estéril y colocar la suspensión gruesa en un tubo de 15 x 150 mm con una pipeta Pasteur estéril.

3. Colocar en otro tubo de 16 x 150 mm estéril 2 ml de la muestra previamente filtrada por papel Whatman y membrana de 0.45 mm. Añadir 2 ml de caldo nutritivo con extracto de levadura y 0.5 ml de la suspensión gruesa de bacterias.

4. Incubar el sistema durante 24 h a 37°C

5. después de incubar, centrifugar el contenido del tubo a 10000 rpm durante 10 minutos. Separar el sobrenadante por decantación.

6. Agregar benzal al tubo que contiene el sedimento antes de desecharlo

7. Filtrar el sobrenadante a través de una membrana de 0.45 mm.

8. Preparar una suspensión gruesa a partir de cultivos de la bacteria de 18 horas, igual que en el punto 2.

9. Sembrar esta suspensión gruesa en una caja, usando un hisopo estéril.

10. Dejar secar el inóculo por 30 min.

11. Con una pipeta Pasteur colocar unas gotas del sobrenadante que se espera contenga fagos, en la caja sembrada con la bacteria.

12.Incubar a 37°C durante 24 h.

13.Observar las cajas en búsqueda de placas líticas. 

Titulación de fagos

1. Hacer una serie de diluciones decimales de la suspensión del bacteriófago, de 10^-1 hasta 10^-6 en caldo nutritivo más extracto de levadura (0.1:0.9 ml)

2. Tomar 0.1 ml de cada una de las tres últimas diluciones y adicionarlo a tubos de ensaye con 3 ml de agar al 0.75 fundido (45°C). a partir de este momento, trabajar rápidamente para evitar que solidifique el agar y no se homogenice bien.

3. Una vez añadido el fago, agregar a cada tubo 0.1 ml de la suspensión concentrada de una bacteria sensible al fago.

4. Homogenizar el contenido del tubo por rotación entre las manos y vaciar rápidamente en una caja de agar enriquecido con extracto de levadura.

5. Distribuir el contenido del tubo en toda la superficie, por rotación de la caja sobre la mesa.

6. Dejar solidificar e incubar a 37°C por 24 horas.

7. Observar las cajas, e interpretar el resultado, si es positivo habrá placas líticas que se observan como zonas claras que indican la destrucción de las bacterias.

8. Contar las placas líticas presentes en cada dilución y determinar el título del fago.

9. Calcular el título fágico con la siguiente fórmula:

Título fágico =