Expose de Biochimie Clinique_ Dosage Du Glucose, Uree, Mycoglobine, Creatinine
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UE : BIOCHIMIE CLINIQUE
TRAVAIL PERSONNEL DE L’ETUDIANT
THEMES A DEVELOPER :
1. Principe et méthode de l’électrophorèse
2. Principe de méthode de dosage du glucose
3. Technique et principe de dosage de la créatinine,
4. Technique et principe de dosage de l’urée
5. Technique et principe de dosage l’acide urique
6. Les méthodes immunométriques dans le dosage de la myoglobine
Rédigé par :
KAGNING TSINDA Emmanuel
Matricule: 08N042FS
Niveau : Etudiant en Master 1
Option : Bactériologie et virologie médicale
Enseignant
Dr Jules Clément Nguedia Assob
Année académique : 2011-2012
UNIVERSITE DE NGAOUNDERE
FACULTE DES SCIENCES
Département des Sciences Biomédicales
Filière Sciences Biomédicale-Option : Bactériologie et Virologie médicale
UNIVERSITY OF NGAOUNDERE
FACULTY OF SCIENCES
Department of Biomedical Sciences
Biomedical Sciences-Option: Medical Bacteriology and Virology
Travail Personnel de l’Etudiant Kagning Tsinda Emmanuel
SOMMAIRE
SOMMAIRE.........................................................................................................................................1
INTRODUCTION GENERALE...........................................................................................................3
THEME 1 : LE PRINCIPE ET LA PROCEDURE DE REALISATION DE.........................................4
I. INTERET DE L’ELECTROPHORESE................................................................................4
II. PRINCIPE GENERAL (1)..................................................................................................4
III. PROCEDURES DE REALISATION DE L’ELECTROPHORESE : méthode avec les Instruments MIDIGEL©................................................................................................................6
IV. APPLICATIONS DE L’ELECTROPHORESE..............................................................12
VI.1 Application de l’Electrophorèse à l’identification des phénotypes moléculaires et des génotypes ; cas de la drépanocytose (3)....................................................................................12
VI.2 Application de l'électrophorèse en immunologie : séparation des anticorps sériques.........14
Thème 2 : PRINCIPE ET PROCEDURE DE DOSAGE DU GLUCOSE...........................................18
I. Intérêt clinique de la mesure de la Glycémie.......................................................................18
II. Méthode de Dosage :..............................................................................................................18
II.1 Principe se basant sur la méthode enzymatique de Trinder...........................................18
II.2 Procédure............................................................................................................................19
THEME 3 : PRINCIPE ET DOSAGE DE L'UREE PAR LA METHODE CINETIQUE....................22
I. Intérêt du dosage...................................................................................................................22
II. Principe du dosage enzymatique......................................................................................22
III. Méthode de dosage.............................................................................................................22
THEME 4 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LA CREATININE..................................25
I. INTERET CLINIQUE (10)................................................................................................25
II. PRINCIPE ET METHODE DU DOSAGE : méthode photométrique colorimétrique selon la réaction de JAFFE...........................................................................................................................25
II.1 Principe...................................................................................................................................25
II.2 Méthode de dosage (8)...........................................................................................................25
THEME 5 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE L’ACIDE URIQUE (10).........................30
I. INTERET DU DOSAGE.......................................................................................................30
II. PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE.......................................................................30
II.1 Principe................................................................................................................................30
II.b Méthode Uricase de dosage...................................................................................................30
THEME 6 : TECHNIQUES IMMUNOMETRIQUES DU DOSAGE DE LA MYOGLOBINE.........34
I. Généralités et Intérêt clinique du dosage de la myoglobine (11).......................................34
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Travail Personnel de l’Etudiant Kagning Tsinda Emmanuel
II. Méthodes du dosage...........................................................................................................34
1. Immunoprécipitation.............................................................................................................35
2. Immuno-turbidimetrie et immuno-néphélométrie..............................................................35
a. Immuno-turbidimetrie..........................................................................................................35
b. immuno-néphélométrie : Cas particulier de la néphélémétrie (2)......................................36
c. Méthode du dosage via l’Immuno-turbidimetrie et immuno-néphélométrie....................37
CONCLUSION GENERALE..............................................................................................................38
BIBLIOGRAPHIE..............................................................................................................................39
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Travail Personnel de l’Etudiant Kagning Tsinda Emmanuel
INTRODUCTION GENERALE
La Biochimie clinique est l’application des aspects chimiques de la vie de l’homme
sain ou malade et l’application des méthodes chimiques employées au laboratoire pour le
diagnostic, le control d’un traitement, et la prévention des maladies. Pour ce faire, la
connaissance des principes et procédures de diagnostic des différents composés marqueurs
de pathologies est indispensable. Le cours sur la grande majorité de méthodes de dosages
biochimiques nous a été dispensé par le Dr Jules Clément Assob Nguedia. Cependant, il nous
est demande, dans le cadre d’un travail Personnel de l’étudiant, de présenter le principe et
méthode de réalisation de l’électrophorèse, le principe de méthode de dosage du glucose, la
technique et principe de dosage de la créatinine, de l’urée, de l’acide urique, et enfin, le
principe et méthode immunométriques dans le dosage de la myoglobine.
Introduction Générale Page 3/42
Travail Personnel de l’Etudiant Kagning Tsinda Emmanuel
THEME 1 : LE PRINCIPE ET LA PROCEDURE DE REALISATION DE
L’ELECROPHORESE
I. INTERET DE L’ELECTROPHORESE
De nos jours, l’électrophorèse est devenue une technique de routine dans les laboratoires
où on l’utilise pour séparer notamment les protéines et les acides nucléiques.
L’électrophorèse des protéines peut être réalisée sur des supports variés, notamment sur gel
de polyacrylamide ou sur gel d’agarose selon les informations recherchées. L’électrophorèse
de protéines sur gel d’agarose est la technique la plus aisée et la moins coûteuse à mettre en
œuvre dans un établissement d’enseignement avec un matériel limité. Elle nécessite
simplement une cuve à électrophorèse et une alimentation continue. (1)
Durant notre présentation, tout en précisant que l’électrophorèse peut aussi s’employer
pour séparer les acides nucléiques, nous tacherons de parler du principe général de
l’électrophorèse ensuite, nous présenterons ses applications selon qu’on se trouve en
hématologie et en immunologie.
II. PRINCIPE GENERAL (1)
L'électrophorèse est une technique biochimique de séparation fondée sur le fait que des
molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes
lorsqu'elles sont placées dans un champ électrique.
L’électrophorèse sur support ou électrophorèse de zones permet de stabiliser la phase
liquide grâce à l’utilisation d’un support poreux imprégné d'un solvant tamponné.
Principes de la migration électrophorétique : la migration dépend de plusieurs facteurs :
de la mobilité électrophorétique U, qui est fonction de la charge et de la géométrie de
la particule. Une particule de charge électrique Q, placée dans un champ électrique E,
est soumise à une force F qui l'entraîne vers l'électrode de signe opposé :
Des forces de frottement f, dues à la viscosité du milieu , s'opposent à la migration
de la particule, et ce d'autant plus que la particule est grosse (r = rayon) et que la
vitesse de migration (v) est grande :
Principe et méthode de réalisation de l’électrophorèse Page 4/42
Travail Personnel de l’Etudiant Kagning Tsinda Emmanuel
(N.B. Le coefficient de viscosité dépend de la température)
Il arrive un moment où ces deux forces s'équilibrent, et la particule se déplace
alors à vitesse constante; on peut alors écrire:
On définit pour chaque particule sa mobilité µ, de manière indépendante du champ électrique,
par la relation :
La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une
séparation en se basant sur cette propriété.
La charge Q est fonction du pH isoélectrique de la particule et du pH du solvant : on
appelle pH isoélectrique d'une particule (pHi ou pI) le pH pour lequel cette particule ne migre
pas dans un champ électrique (ceci est une définition expérimentale). Pour les molécules de
petite taille, on peut prévoir la valeur du pHi en calculant le pH isoionique, pH pour lequel la
charge nette est nulle, à partir des pKa des différents groupements ionisables de la molécule;
mais cela n'est pas possible pour les macromolécules, car leur environnement ionique modifie
notablement leur charge réelle. La différence pH - pHi détermine le signe de la charge Q
d'une particule. (1)
A chaque acide aminé correspond une valeur de pH isoélectrique, (pH i auquel les acides
aminés sont électriquement neutres). En dehors de ce " point isoélectrique " les acides aminés
sont globalement chargés et migrent sous l'effet d'un champ électrique. Ainsi, en travaillant à
un pH fixé (dans une solution tampon), on peut séparer différents acides aminés par
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électrophorèse. Lorsque des acides aminés sont placés dans un champ électrique, ils migrent
vers l'électrode de polarité opposée, les molécules neutres ne migrant pas. Ainsi :
quand pH>pHi, l'acide aminé a une charge globale négative : il migre vers l'électrode
positive(anode).
Quand pH<pHi, l'acide aminé a une charge globale positive : il migre vers l'électrode
négative(cathode).
Quand pH=pHi, l'acide aminé est sous forme zwitterionique (neutre): il ne migre pas et
reste au point de départ. (1)
III. PROCEDURES DE REALISATION DE L’ELECTROPHORESE : méthode
avec les Instruments MIDIGEL©
II.1 Électrophorèse de protéines sur gel d’agarose supporté : protocole général
- Protocole (échantillon = Sang, le sérum, ou bien tout acide nucléique.)
Les gels prêts à l'emploi présentent l'avantage d'être coulés sur un support plastique ce
qui, d'une part, évite de les préparer et facilite leur manipulation et, d'autre part, permettent de
conserver indéfiniment les résultats après coloration et séchage. Comme pour les méthodes
spécifiques d'électrophorèse, il faut disposer d'une cuve dans laquelle est placé le gel et d'une
alimentation continue. On peut utiliser une mini-cuve identique à celle utilisée pour
l'électrophorèse de l'ADN ou une cuve pour électrophorèse clinique, de meilleur prix. Dans le
premier cas, la cuve étant conçue pour un gel immergé, on remplit les deux réservoirs avec le
tampon d'électrophorèse et on établit le contact électrique entre gel et tampon par des ponts
de papier filtre trempés dans le tampon. Il en est de même si l'on utilise une cuve pour
électrophorèse clinique car ce type de cuve est conçu initialement pour des bandes d'acétate
de cellulose suffisamment souples pour que les extrémités plongent dans les réservoirs de
tampon alors que les gels supportés sont coulés sur un support rigide.
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Travail Personnel de l’Etudiant Kagning Tsinda Emmanuel
Une cuve pour électrophorèse clinique est formée de deux réservoirs de tampon séparés
munis chacun d'une électrode de platine.
Figure 1 : Cuve pour électrophorèse clinique (couvercle enlevé. Taille réelle : 22 cm)
Chaque support de gel est placé à cheval au-dessus de la cloison qui sépare les deux
réservoirs.
Le protocole d'électrophorèse comporte en general:
- le dépôt des échantillons,
- la mise en place des gels,
- la migration électrophorétique,
- la fixation du gel et sa coloration puis une décoloration du fond.
- Une fois séchés, les gels peuvent être conservés indéfiniment.
Préparation du gel et dépôt des échantillons
Les gels supportés prêts à l'emploi sont constitués d'une mince couche d'agarose coulée sur
un support plastique de 100 mm x 75 mm permettant leur manipulation aisée.
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Une fois le gel sorti de son emballage, la zone de dépôt est essorée avec une bande de papier
filtre pour faciliter la diffusion des échantillons lors du dépôt.
La bande est ensuite retirée et jetée et on dispose à la même place un masque de dépôt
formé d'une bande de plastique comportant 10 fentes.
Un volume de 5 µL des échantillons à analyser est déposé sur les fentes et abandonné
pendant 5 minutes pour assurer leur diffusion au niveau de la zone de dépôt.
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Fig. 1 : Gel d’agarose prêt à l’emploi
Figure 2 : Essorage de la zone de dépôt
Figure 3 : Mise en place du masque de dépôt
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Le liquide non absorbé par le gel est ensuite essoré avec une autre bande de papier
filtre et le masque de dépôt est jeté.
Fig. 4 : Essorage du liquide en excès
Le gel est alors mis en place dans la cuve et le contact électrique entre le tampon placé dans
les deux réservoirs et le gel est assuré par des bandes de papier filtre trempées dans le
tampon.
Fig. 5 : Gel en place dans la cuve
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Figure 3 : Dépôt des échantillons
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Après fermeture du couvercle et mise en marche de l'alimentation, la migration des
protéines démarre. La tension appliquée au gel et le temps de migration dépendent de la
nature des échantillons à analyser.
Fixation et coloration
Une fois la migration électrophorétique terminée, le gel est plongé pendant dix minutes
dans le fixateur, séché puis plongé pendant 10 minutes dans le colorant. Une succession de
bains dans la solution de décoloration permet ensuite d'éliminer la coloration du fond de
façon à faire apparaître les bandes correspondant aux diverses protéines séparées.
Fig. 7 : Décoloration du fond
Principe et méthode de réalisation de l’électrophorèse Page 10/42
Fig. 6 : Ensemble du dispositif
d'électrophorèse
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Le gel est ensuite séché ce qui permet de le conserver dans de bonnes conditions.
Fig. 8 : Séchage final du gel
Les Solutions utilisées sont :
o Tampon Tris barbital :
Tris (hydroxy méthyl)
aminométhane : 7,2 g
Acide diéthylbarbiturique : 1,82 g
Diéthylbarbiturate de sodium :
10,2 g
Ethylmercurithiosalicylate : 0,02
g
Eau distillée : 1 L
o Fixateur :
Méthanol : 90 ml
Acide acétique glacial : 20 ml
Eau distillée : 90 ml
o Colorant :
Noir amidon : 1,25 g
o Décolorant : Acide acétique à 5 %
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Acide acétique à 5 % : 500 ml
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IV. APPLICATIONS DE L’ELECTROPHORESE
L’électrophorèse peut être appliquée dans plusieurs domaines tels que la biochimie,
l’hématologie, et l’immunologie. En d’autres termes, cette technique peut servir dans :
L’estimation du poids moléculaire de fragment d'ADN après une digestion par des
enzymes de restriction (2)
L’Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par PCR (2)
La Séparation de fragments ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le
cas de Northern Blot. (2)
L’identification des phénotypes moléculaires et des génotypes (Ex : cas de la
drépanocytose) (1)
La séparation des protéines plasmatiques (1)
Pour être un peu plus explicite et illustratif, nous allons retenir les 2 derniers cas, afin
de présenter leurs principes spécifiques, la procédure.
.
VI.1 Application de l’Electrophorèse à l’identification des phénotypes moléculaires
et des génotypes ; cas de la drépanocytose (3)
a. intérêt clinique
Plusieurs maladies héréditaires qualifiées d'hémoglobinopathies, comme les thalassémies
et la drépanocytose, affectent l'un des deux gènes codant les chaînes de l'hémoglobine
humaine adulte, hémoprotéine tétramérique constituée de deux chaînes alpha et de deux
chaînes bêta. La drépanocytose est une affection génétique due à une mutation ponctuelle
dans le gène codant la chaîne bêta. Elle est caractérisée par la substitution de l'acide
glutamique en position 6 de la structure primaire par une valine. Il en résulte une
hémoglobine anormale (HbS) qui a tendance à polymériser lorsque la pression partielle en
dioxygène diminue, en particulier dans le sang périphérique, contrairement à l'hémoglobine
normale (HbA) qui ne présente pas cette propriété. La présence de cette hémoglobine
anormale dans les globules rouges aboutit à une pathologie qui peut être plus ou moins grave
en fonction de divers autres facteurs génétiques et environnementaux, principalement chez les
homozygotes, et elle peut être détectée par l'observation microscopique du sang qui contient
des hématies déformées, qualifiées de falciformes (en forme de faucille).
Principe et méthode de réalisation de l’électrophorèse/Applications de l’électrophorèse Page 13/42
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La simple substitution de la valine en position 6 dans la structure primaire de la chaîne bêta
confère à l'hémoglobine S une charge électrique globale inférieure à celle de l'hémoglobine
A. Il en résulte que lorsque les deux hémoglobines sont placées sur un gel d'électrophorèse,
elles ne migrent pas de la même façon ce qui permet de les identifier dans un simple
hémolysât de globules rouges. On peut aisément en déduire le phénotype moléculaire du
porteur et en déduire son génotype.
b. Protocole spécifique
Le protocole de réalisation est semblable à celui détaillé ci-dessus. Cependant, on
utilise du sang total qu’on dilue dans de l’eau physiologique afin de lyser les hématies et
libérer l’hémoglobine en solution. Les échantillons utiliser pour mener l’électrophorèse sont
donc des solutions réalisées artificiellement avec des hémoglobines A ou S dissoutes a raison
de 2,5 mg/ml dans du tampon d'électrophorèse préalablement oxygéné par une agitation
vigoureuse. Cependant, on ne saurait réaliser un examen juste pour le plaisir de le faire, mais
pour contribuer soit au diagnostic des maladies, ou bien au suivi des patients, et même dans le
cadre de la recherche
c. Résultats et exploitation
Le recours à l'électrophorèse peut être justifié par le problème suivant : chez les
membres d'une même famille dont un fils est atteint de drépanocytose, on a extrait
l'hémoglobine des globules rouges et on a soumis les échantillons à l'électrophorèse sur gel
d'agarose afin d'identifier les génotypes pour construire l'arbre généalogique de la famille.
Les sept membres dont l'hémoglobine a été analysée sont les deux parents (pistes 1 et 2),
leurs quatre enfants (pistes 3 à 6) et un petit enfant (piste 7). En outre, deux références sont
constituées par un échantillon d'hémoglobine S (piste 8) et un échantillon d'hémoglobine A
(piste 9).
Le gel ci-contre montre les résultats obtenus.
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Fig. 9 : Exemple d’électrophorèse des hémoglobines A et S (1)
Fig 11: interprétation
VI.2 Application de l'électrophorèse en immunologie : séparation des anticorps sériques
(4)
a. Intérêt clinique
La séparation et l'identification de protéines par électrophorèse de liquides
biologiques est utilisée en immunologie, notamment pour confirmer le diagnostic de certaines
atteintes du système immunitaire, en particulier celles concernant l'immunité humorale.
Principe et méthode de réalisation de l’électrophorèse/Applications de l’électrophorèse Page 15/42
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Des pathologies rares affectant la production des anticorps comme l'agammaglobulinémie
(absence de sécrétion des gammaglobulines) et l'hypo-gammaglobulinémie, (sécrétion
insuffisante des gammaglobulines) peuvent être détectées par électrophorèse des protéines
sériques. En effet, à de rares exceptions près, les atteintes de l'immunité humorale se
traduisent par une diminution de la concentration d'une ou plusieurs classes
d'immunoglobulines dans le sérum, même si les larges variations de concentration observées
parmi la population adulte rendent difficile la détermination de la fourchette des valeurs
normales. C'est pourquoi, en pratique clinique, d'autres tests sont utilisés pour compléter
l'information du médecin comme, par exemple, la mesure des iso-hémagglutinines et de
l'antistreptolysine O ou celle des agglutinines typhoïdiques H et O avant et après
immunisation par le vaccin contre la fièvre typhoïde.
b. Protocole spécifique
Les procédures à suivre pour réaliser les électrophorèses sont indiquées à la page du
protocole général. Les résultats présentés ci-dessous correspondent au dépôt d'échantillons de
plasma ou sérum d'un volume de 5 µL soumis à électrophorèse pendant 60 minutes à 140 V.
Les profils électrophorétique sont tracés avec l'un des deux outils logiciels distribués
librement sur le Web, Digispec et Mesurim. Cependant, on ne saurait réaliser un examen juste
pour le plaisir de le faire, mais pour contribuer soit au diagnostic des maladies, ou bien au
suivi des patients, et même dans le cadre de la recherche
c. Résultats et exploitation cliniques
o Détection d'anomalies immunitaires
Sérum humain normal
Les globulines sériques ont été nommées par Tiselius en 1950 d'après leur vitesse de
migration électrophorétique par rapport à l'albumine qui migre le plus rapidement et présente
la concentration la plus élevée. On distingue ainsi les alpha (1 et 2), bêta (1 et 2) et gamma
globulines dans l'ordre des vitesses de migration décroissantes.
Les anticorps présents dans le sérum migrent à des vitesses différentes selon leur nature. Les
IgA migrent avec les fractions alpha 2 ou bêta 1, les IgM avec la fraction gamma rapide et les
IgG avec la fraction gamma lente.
La figure ci-contre présente le profil électrophorétique du sérum humain normal et son
Principe et méthode de réalisation de l’électrophorèse/Applications de l’électrophorèse Page 16/42
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analyse densitométrique. Il servira de référence pour interpréter les résultats des
électrophorèses des divers patients.
Fig. 10 : Piste d'électrophorèse et analyse densitométrique (sérum humain normal)
Sérums pathologiques
Dans le but d'identifier la nature de leur pathologie, on a soumis à l'électrophorèse, le
sérum de deux patients atteints de dysfonctionnements du système immunitaire.
Outre le sérum des deux patients (pistes 2 et 3), on a également soumis à l'électrophorèse
deux échantillons de sérum normal (pistes 1 et 5) ainsi qu'un échantillon d'immunoglobulines
pour servir de référence (piste 4).
Les résultats obtenus et les différents profils densitométriques des pistes sont présentés ci-
dessous.
Principe et méthode de réalisation de l’électrophorèse/Applications de l’électrophorèse Page 17/42
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Fig. 11 : Cinq pistes d'électrophorèse
Fig. 12 : Profils densitométriques
correspondants
L'examen visuel des profils électrophorétique complété par l'analyse densitométrique
permet d'identifier certaines anomalies :
L'individu 2 présente un sérum particulièrement concentré en immunoglobulines mais les
autres protéines sériques présentent une concentration inférieure à la normale.
Inversement, le sérum de l'individu 3 est dépourvu de gamma globulines tandis que les autres
bandes sont normales. Dans le premier cas, il s'agit d'une hyper-gammaglobulinémie tandis
que dans le second, il s'agit d'une agammaglobulinémie.
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Thème 2 : PRINCIPE ET PROCEDURE DE DOSAGE DU GLUCOSE
I. Intérêt clinique de la mesure de la Glycémie
La glycémie et le paramètre fondamental de diagnostic, du pronostic et de la
surveillance du traitement lors de l'étude évolutive du DIABETE, extrêmement banal en
pratique médical courante. La Régulation de la glycémie obéit aux lois suivantes :
- L'autorégulation : les réactions biochimiques sont en presque totalité réversibles.
- Le système hypoglycémiant : assure exclusivement par l’insuline qui est une
hormone secrétée par les cellules B des ilots de Langerhans. L’insuline favorise la
pénétration du glucose dans la cellule hépatique, active la glucokinase et favorise la
glycogenèse par activation du glycogène synthétase.
- Le système hyperglycémiant : assure en grande partie par le glucagon qui est une hormone
secrétée par les cellules alpha des îlots de Langerhans du pancréas endocrine. Le glucagon
favorise aussi la glycogénolyse hépatique. (5)
La concentration en glucose sanguin est maintenue à l’intérieur de limites
relativement étroites dans différentes situations (absorption de nourriture, jeûne ou exercice
intense) par des hormones régulatrices comme l’insuline, le glucagon ou l’épinéphrine. Le
dosage du glucose est un des tests les plus fréquemment réalisés au laboratoire
d’analyses médicales, conjointement avec d‘autres tests de tolérance (épreuve
d’hyperglycémie provoquée, glycémie postprandiale…). (6)
Le désordre du métabolisme des carbohydrates sanguins le plus couramment
rencontré est l’hyperglycémie due au diabète de type 1. Une hyperglycémie supérieure à 3,0
g/L (16,5 mmol/L) peut conduire à une céto-acidose et un coma hyperosmolaire. De même,
Toute hypoglycémie durable, inférieure à 0,30 g/L (1,7 mmol/L), est susceptible
d‘entraîner des lésions encéphaliques graves et irréversibles. (6)
II. Méthode de Dosage :
II.1 Principe se basant sur la méthode enzymatique de Trinder
C’est une méthode enzymatique qui est la plus utilisée car elle est très la plus sensible, très
fiable et spécifique. (7)
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Le glucose est oxydé par la Glucose oxydase en acide gluconique et H2O2 qui
réagit (en présence de Peroxydase) avec le chloro-4-phénol et le 4-Amino-antipyrine pour
former une quinonéimine rouge. L’absorbance du complexe coloré, proportionnelle à la
concentration en glucose dans le spécimen est mesurée à 500 nm.
II.2 Procédure
Réactions mises en jeu :
Figure 13: Schéma réactionnel par la méthode de Trinder (7)
Réactifs:
Solution Tampon-enzymes (S1) :
Tampon phosphate 150 mmol/L
Glucose oxydase (GOD) > 20 000 UI/L
Peroxydase (POD) > 1000 UI/L
4-Amino-antipyrine (PAP) 0,8 mmol/L
Substance chromogène : Chloro-4-phénol 2 mmol/L (S2)
Solution Etalon : Glucose 1 g/L (5,55 mmol/L)
Prélèvement et préparation du spécimen (8)
Sérum ou plasma :
Séparer rapidement des cellules sanguines pour prévenir la glycolyse. Si le fluorure est
utilisé comme conservateur, une diminution de 0,09 g/L (0,5 mmol/L) est observée dans les
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deux premières heures, la concentration se stabilise ensuite.
Le glucose est stable dans le sérum et le plasma hépariné : •8 h à 25°C.
•72 h à 2-8°C.
Le glucose est stable dans le plasma (fluorure de sodium ou iodoacétate) :
•24 h à température ambiante.
LCR : Analysé immédiatement après collecte pour éviter des résultats
sous évalués. Conserver à -20°C.
Urines : collectées en flacon opaque et conservées à 2-8°C.
Conserver les urines de 24 h avec 5 ml d’acide acétique glacial ou 5 g de
sodium benzoate ou fluorure.
Limite de linéarité : La réaction est linéaire jusqu’à 5 g/L (28 mmol/L). Au-delà,
diluer le spécimen avec une solution NaCl à 9 g/L et refaire le dosage en tenant
compte de la dilution dans le calcul du résultat. La limite de linéarité dépend du
rapport de volume spécimen/réactif.
Mode opératoire (technique manuelle)
Matériel : Equipement de base du laboratoire d’analyses médicales, 2. Sérums de
contrôle normaux et pathologiques.
Le réactif de travail est constitué en mélangeant les solutions S1 et S2.
Ramener les réactifs et spécimens à température ambiante.
CALCUL de la concentration
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Le résultat est déterminé d’après la formule suivante :
Abs (dosage)
Résultat = ……………………… x Concentration de l’Etalon
Abs (Etalon)
Cette méthode de Trinder peut aussi être réalisée à l'aide de bandelettes réactives
(ressemblant à celles utilisées pour les urines) dont l'extrémité, imprégnée de réactifs, reçoit
une goutte de sang. La variation de coloration est appréciée soit visiblement à l'aide d'une
échelle colorée soit par un lecteur portable indépendant et elle permet d'estimer la valeur de la
glycémie. Le prélèvement au bout du doigt permet donc de réaliser facilement cet
«autocontrôle glycémique » si important maintenant pour l'équilibrage de la glycémie des
diabétiques, en particulier ceux porteurs d'une pompe à insuline, implantée ou non.
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THEME 3 : PRINCIPE ET DOSAGE DE L'UREE PAR LA METHODE CINETIQUE
A L'UREASE (9)
I. Intérêt du dosage
L’urée, CO (NH2)2 provient du catabolisme des protéines et des acides aminés par
transamination ou par désamination. Elle est formée dans le foie à partir de l'ammoniac. Elle
passe dans la circulation sanguine. Elle est éliminée essentiellement par le rein. Le taux d'urée
dépend à la fois de la fonction rénale, de la production hépatique, des apports azotés
alimentaires, du catabolisme protidique et de l'état d'hydratation.
II. Principe du dosage enzymatique
La détermination enzymatique de l'urée par méthode cinétique se fait selon les
réactions suivantes:
Urée + H2O——>en presence d’ urease —> 2NH3 + CO2
2NH4+ + 2 alphocétoglutarate +2 NADH—> en presence de GLDH —> 2 Glutamate +
2NAD + 2H2O
GLDH= 2-L-Glutamate déshydrogénase
Cette méthode est plus sensible et plus spécifique que la méthode à la diacétyl-monoxime.
III. Méthode de dosage
a) Echantillons
L'urée sanguine est réalisée chez un sujet à jeun depuis 10 heures environ. Le dosage de
l'urée se fait sur le sérum, le plasma et les urines de 24 heures qui peuvent être congelés à
moins 20°C pendant 3 mois. Il est conseillé d'éviter de traiter les échantillons hémolyses,
contaminés ou ayant subi plus d'une décongélation.
Le plasma est recueilli sur héparinate de lithium. Il faut éviter les anticoagulants
contenant les ions ammoniums et les fluorures. Il faut séparer le plus rapidement possible le
sérum ou le plasma du culot globulaire (dans les 2 heures qui suivent le prélèvement). Les
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urines de 24 heures sont conservées à +4°C pour éviter la pullulation microbienne, il faut les
diluer au 1/100 dans de l'eau distillée avant le dosage.
b) Réactifs
Ce sont des coffrets commercialisés dont il faut suivre le protocole fixé par le fabricant. Ils
contiennent en général les réactifs suivants:
Réactif 1 : ADP 0,66 mmol/1
GLDH >1 OOOU/l
Uréase > 30 OOOU/ l
NADH 0,32 mmol/1
Alphacétoglutarate 9 mmol/1
• Réactif 2: Tampon tris pH 8 75 mmol/1
• Etalon : n = 0/5g/l = (8,325 mmol/1)
Dissoudre le réactif 1 dans le réactif 2 pour obtenir la solution de travail, elle reste stable
pendant 5 jours à 20 - 25°C et 3 semaines à +4°C.
c) Mode opératoire
II faut s'assurer avant emploi que les réactifs et les échantillons sont à la température
ambiante pendant 10 à 20 minutes.
• Longueur d'onde : 340 nm
• Température d'incubation : 37°c
Le Zéro de l'appareil se règle avec de l’eau distillée.
• Domaine de linéarité : jusqu'à 2g/l
• Stabilité de la coloration ; 30 minutes à 20°C-25°C ou 10 minutes à 37°C
Principe et méthode de dosage de l’Urée Page 24
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La méthode est linéaire jusqu'à 2g/l. Si la concentration en urée est supérieure à cette valeur,
il faut recommencer le dosage sur l'échantillon dilué au 1/2 avec une solution de NaCI à 9g/l;
en n'oubliant pas de tenir compte de cette dilution avant de rendre le résultat qui sera
multiplié par 2.
Mélanger et lire les densités optiques (D01) 30 secondes après l'addition de l'échantillon ou
de l'étalon, lire ensuite une seconde fois les densités optiques (D02) exactement 60 secondes
après la première lecture.
Calcul : Urée (g/1) = (D02 - D01) échantillon x n/ (D02 - D01) étalon
n =Concentration de l'étalon urée en g/1.
Tenir compte de la dilution dans le cas des urines (résultat x 100)
Valeurs normales
• Sérum - plasma : 0,15 à 0,45g/l
• Urines de 24 heures 12 à 30 g/24H
Les valeurs normales varient en fonction de l'âge, du régime protidique et de l'état
d'hydratation du sujet.
d) Variations physiopathologiques
Sérum ou plasma
Augmentation : Régime riche en protéines/ Age>60 ans / Fièvre/ Déshydratation/
Insuffisance rénale aiguë/ Insuffisance rénale chronique
Diminution : Age<4 ans/ Insuffisance hépatique sévère (cirrhose)/ Malnutrition proteino-
calorique
Urines de24H
Augmentation : Régime riche en protéines /Fièvre
Diminution : Grossesse/ Régime riche en sucre et pauvre en protéines/ Insuffisance hépatique
sévère/ Néphropathie
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THEME 4 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LA CREATININE
I. INTERET CLINIQUE (10)
La créatinine, petite molécule cyclique, un produit du métabolisme musculaire. Elle
provient de la déshydratation spontanée de l’acide N-methylguanido-acétique ou créatine,
elle-même issue de la transamination du glycolle (l'amidine provient de l’hydrolyse de
l’arginine) dans le tissu rénal et de la trans-methylation classique aux dépens de S-adenosyl
méthionine.
La créatinine plasmatique et urinaire est le reflet fidèle de la masse musculaire globale.
L'élimination de la créatinine est exclusive urinaire, elle subit une filtration glomérulaire et
elle n’est par la suite ni réabsorbée, ni secrétée au niveau du tubule. Sa concentration urinaire
est indépendante de la diurèse et de l’apport protéique alimentaire contrairement à l'urée, et
devient, en mesurant directement la filtration glomérulaire, un des paramètres néphrologiques
les plus appréciés et les plus fidèles. La valeur de la clairance de la créatinine revêt donc une
signification séméiologique fondamentale lors de l'établissement de diagnostic ou de l'étude
de l'évolution d’une insuffisance rénale.
II. PRINCIPE ET METHODE DU DOSAGE : méthode
photométrique colorimétrique selon la réaction de JAFFE.
II.1 Principe
En milieu alcalin, la créatinine donne avec l’acide picrique un complexe jaune orange
dont l’intensité de la coloration mesurée à 492 nm est proportionnelle à la concentration en
créatinine.
Créatinine + acide picrique complexe= créatinine- picrate.
II.2 Méthode de dosage (8)
Prélèvement et préparation du spécimen
Echantillon: Sérum ou plasma hépariné.
Urines : Collecter durant précisément (4, 12 ou 24 h).
Diluer 1+19 dans l’eau déminéralisée avant dosage. •La créatinine est stable
dans le spécimen :
Pendant 24 h à 2-8°C (congeler pour conservation prolongée).
Réactifs :
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Réactifs alcalin (R1)
Phosphate disodique 6,4 mmol/L
Hydroxyde de sodium 150 mmol/L
Réactifs de coloration (R2)
Acide picrique 4,0 mmol/L
Dodécylsulfate de sodium 0,75 mmol/L
Etalon créatinine 177 =mol/L (20 mg/L)
Limite de linéarité
La réaction est linéaire jusqu’à 1327 =mol/L (150 mg/L). Au-delà, diluer le
spécimen (1+4) avec une solution NaCl à 9 g/L et refaire le dosage en tenant compte de la
dilution dans le calcul du résultat. La limite de linéarité dépend du rapport des volumes
spécimen/réactif. (10)
Mode opératoire (technique manuelle) (10)
Porter les réactifs et spécimens à température de mesure. Réaliser tous les essais à
température ambiante et constante.
Le réactif de travail est constitué en mélangeant le réactif alcalin au réactif de
coloration.
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Remarque :
1. Sérum, plasma, ou urines diluées (1 + 19) dans l’eau distillée.
2. L’intervalle de lecture choisi à une incidence sur l’importance des interférences,
certaines intervenant rapidement (acéto-acétate) d’autres lentement (protéines).
3. Pour une meilleure sensibilité, réaliser de préférence le dosage à 37°C.
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Valeurs Normales et Variations Physiologiques :
Créatinine plasmatique :
-Pour l’homme la fourchette de normalité se situe entre 80 et 115 µmol/l, valeurs nettement
plus basse chez la femme entre 50 à 90 µmol/l.
Créatinine urinaire :
Son taux est le reflet de la masse musculaire du sujet, il n’est influence ni par la diurèse, ni
par l’alimentation, pour un sujet donne, son taux est tellement fixe qu’il peut servir de
référence pour estimer la validité d’un recueil complet des urines de 24 heures. Elle est de
1000 à 1500 mg/24H, plus faible chez la femme du fait de la musculature faible. Chez le
nourrisson, tout en graisse et très peu muscle, le taux est minimal.
Signification des variations pathologiques :
La créatinine plasmatique et urinaire avec l’urée plasmatique et urinaire et l
ionogramme plasmatique et urinaire sont les paramètres fondamentaux de la pathologie lors
de l’insuffisance rénale, sont difficiles à interpréter les uns sans les autres.
On admet qu’une créatininémie supérieure à 180 mol correspond à une altération d’eau moins
50% de la fonction rénale. Sa clairance mesure le degré de l’insuffisance rénale et motive de
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ce fait les attitudes thérapeutiques (ajuster les prescriptions diététiques est médicamenteux).
Chez les transplantes, l’abaissement significatif de la clairance de la créatinine est un des
premiers signes du rejet.
Les variations pathologiques concernent exclusivement les atteintes rénales
(pathologie néphrotique) :
-Insuffisance rénale fonctionnelle et organique.
-Glomérulonéphrite aigue ou chronique.
-Syndrome néphrotique.
-Lithiases rénales.
-Glomerulosclerose diabétique.
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THEME 5 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE L’ACIDE URIQUE (10)
I. INTERET DU DOSAGE
Chez l’humain, l’acide urique est le principal produit issu du catabolisme des
nucléosides puriques, Adénosine et Guanosine. Dans le sang, l'acide urique est sous forme de
sel soluble (urate) ; lorsque son taux s'élève trop, l'acide urique en excès redevient insoluble
et peut précipiter, en particulier au niveau articulaire. Il peut alors entraîner des crises de
goutte.
II. PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE
II.1 Principe
L’uricase agit sur l’acide urique pour produire de l’allantoïne, du dioxyde de carbone et
du peroxyde d'hydrogène. En présence de peroxydase, le peroxyde d’hydrogène réagit avec un
chromogène (dichloro-hydroxybenzène sulfonate et amino-antipyrine) pour former une
quinonéimine, complexe de couleur rouge. L’absorbance mesurée à 520 nm (490-530), est
proportionnelle à la quantité d’acide urique dans le spécimen.
II.b Méthode Uricase de dosage
L’échantillon
L'uricémie est réalisée chez un sujet à Jeun depuis 10 heures environ. Le prélèvement
est effectué sur le sérum ou le plasma recueilli sur héparinate de lithium et sur les urines de
24 heures, qui peuvent être congelés à moins 20°C pendant 3 mois.
Il est conseillé d'éviter de traiter les échantillons hémolyses, contaminés ou ayant subi
plus d'une décongélation. Il faut séparer le plus rapidement possible le sérum ou le plasma du
culot globulaire (dans les 2 heures qui suivent le prélèvement).
Les urines de 24 heures seront diluées au 1/10 avec de l'eau distillée. Les sérums
peuvent être conservés 1 semaine à +4°C. Les sérums ictériques ou hémolyses donnent des
erreurs par excès.
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Il faut signaler toute prise médicamenteuse (théophilline/ caféine, vitamine C et les
salycilés) qui risque d'interférer avec le dosage.
Ce sont des coffrets commercialisés dont il faut suivre le protocole fixé par le fabricant. Ils
contiennent en général les réactifs suivants :
•Réactif 1 :
Tampon phosphate pH 7,5 : 50 mmol/1
Acide 3-5-dichloro- 2-hydroxybenzène sulfonique : 2 mmol/1
• Réactif 2 :
Amino4 antipyrine 0,23 mmol/1
Peroxydase > 660 U/l
Uricase > 60 U/l
• Etalon : n = 60 mg/1 = (357 µmol/l)
Mode opératoire
II faut s'assurer avant emploi que les réactifs et les échantillons sont à la température
ambiante pendant 10 à 20 minutes.
• Longueur d'onde : 510nm (490à550 nm)
• Température d'incubation 37°C
• Zéro de l'appareil : blanc réactif
• Domaine de linéarité : jusqu'à 250mg/l
• Stabilité de la coloration : 30 minutes à 20°C-25°C ou 10 minutes à 37°C
La méthode est linéaire jusqu'à 250mg/l. Si la concentration en acide urique est
supérieure à cette valeur, il faut recommencer le dosage sur l'échantillon dilué au 1/2 avec
une solution de NaCI à 9g/l; en n'oubliant pas de tenir compte de cette dilution avant de
rendre le résultat qui sera multiplié par 2.
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Dissoudre le réactif 2 dans le réactif 1 pour obtenir la solution de travail dont la stabilité est
de 1 semaine à 20-25°C et de 3 semaines à +4°C.
Calcul : Acide urique (mg/1) = DO échantillon x n / DO étalon
n = Concentration de l'étalon acide urique en mg/1.
Tenir compte de la dilution dans le cas des urines (résultat x 10).
Valeurs normales Elles varient selon l'âge et le sexe.
Mmol/l g/l
Enfant(*) 20-55 [119-327]
Homme 35-72 [208-428]
Femme (**) 26-60 [155-357]
Urines 250-750 mg/24h [1, 48-4, 43 mmol/24 h]
(*) Taux plus élevé chez l’enfant nouveau-né.
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(**) Taux plus faible durant la grossesse.
Il est recommandé à chaque laboratoire de définir ses propres valeurs de référence pour la
population concernée.
Variations physiopathologiques
-Sérum ou plasma :
Augmentation : Goutte/ hémopathies / chimiothérapie/ Insuffisance rénale.
Diminution : déficit congénital en xanthine oxydase
- Urines
Augmentation : Goutte/ leucémies/ Médicaments uricosuriques
Diminution: Médicaments hypo-uricémiants (allopurinol)
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THEME 6 : TECHNIQUES IMMUNOMETRIQUES DU DOSAGE DE LA
MYOGLOBINE
I. Généralités et Intérêt clinique du dosage de la myoglobine (11)
Des marqueurs biologiques permettent de faire un diagnostic d’une ischémie du
myocarde, d’évaluer le pronostique, d’évaluer l’efficacité du traitement, et le risque de
récidive. Le marqueur idéal devrait être cardio-spécifique, sensible, et dont le dosage serait
rapide et simple. Mais aucun marqueur regroupe toutes ces caractéristiques, on va utiliser
plusieurs tests. Les marqueurs utilisés de nos jours sont la myoglobine, la troponine et
l’isoenzyme CK-MB. Il y a apparition des marqueurs dans la circulation en fonction de leur
masse moléculaire, leur localisation et leur concentration cellulaire.
-Avantages du dosage de la myoglobine :
Les reins éliminent rapidement de la circulation cette protéine de 17,8 kDa, rétablissant
des concentrations circulantes normales dans les 16 à 36 heures. Puisque la clairance de cette
protéine est rapide, les concentrations de myoglobine peuvent indiquer de façon fiable la
récidive d'infarctus.
De plus, les dosages de myoglobine permettent d'exclure le diagnostic d'infarctus aigu
du myocarde: deux dosages consécutifs bas, le premier lors de l'admission du patient et le
second 1 à 2 heures plus tard, permettent dans presque tous les cas de conclure à l'absence
d'infarctus aigu du myocarde.
Les dosages de myoglobine détectent également précocement une reperfusion après
traitement thrombolytique
-Inconvénients: C'est un marqueur non cardio-spécifique et augmente aussi en cas
d’atteintes musculaires, péricardites, troubles du rythme, et insuffisance rénale.
Son dosage peut être effectué actuellement en urgence d'une façon fiable et précise par
immunoturbidimétrie. La méthode de référence est une méthode radio-immunologique mais
moins rapide, elle ne peut pas être effectuée en urgence. En chirurgie cardiovasculaire, il n'est
pas possible d'utiliser le dosage de la myoglobine car sa valeur augmente par le simple fait de
l'intervention. (7)
Méthodes immunometriques du dosage de la myoglobine Page 35 sur 42
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II. Méthodes du dosage
1. Immunoprécipitation
L'immunoprécipitation est la formation de complexes immuns avec des antigènes
moléculaires. En maintenant constante la concentration de l'anticorps, l'antigène est dilué par
diffusion, jusqu'à la formation d'un précipite lorsque la région d’équivalence est atteinte. (12)
On l'utilise donc pour isoler et concentrer une protéine précise parmi des milliers
d'autres. L'immunoprécipitation impose que l'anticorps se trouve en milieu solide à certaines
étapes du traitement. Elle peut être soit directe ou bien indirecte. (2)
2. Immuno-turbidimetrie et immuno-néphélométrie
a. Immuno-turbidimetrie
La turbidimétrie est la mesure du degré de turbidité d'une suspension. Elle est
déterminée grâce à un système optique, en général un spectrophotomètre classique, qui
mesure la diminution, due à l'absorbance, de l'intensité d'un rayon lumineux (de longueur
d'onde 500nm) traversant la suspension. (2)
En pratique, l'échantillon contenant l'antigène (protéine de myoglobine) est mis en
contact avec un excès d'anticorps spécifiques et déposé dans une cuve d'analyse. La
formation de complexes immuns solubles change l'absorbance de la solution qui peut être
mesurée par photométrie/spectrophotométrie. Lors de la détermination du point final, la
variation de l'absorption dans une période donnée correspond à la concentration de l'antigène
(12).
La turbidimétrie est utilisée en complément à la néphélométrie, qui se base plutôt sur la
diminution de l'intensité par diffusion de la lumière.
Méthodes immunometriques du dosage de la myoglobine Page 36 sur 42
Fig 13 :
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Fig 14 : techniques de précipitation en phase liquide (12)
b. immuno-néphélométrie : Cas particulier de la néphélémétrie (2)
La néphélométrie est une des techniques de mesure de la teneur en particules, en
suspensions, ou de la turbidité d'un milieu (respectivement gazeux ou liquide).
Elle fait partie de la photométrie des milieux troubles.
En effet, le principe est que les complexes immuns dispersent les rayons lumineux
passant par la cuve. En d’autres termes, la néphélométrie consiste à mesurer la lumière
diffusée à 90° d'angle par rapport à la lumière incidente. Ainsi, les rayons dispersés sont
focalisés par un système optique vers un photo-détecteur, et la concentration de l'antigène est
déterminée selon une courbe de calibrage. (12)
L'instrument utilisé pour faire les mesures est le néphélomètre. Il est généralement
constitué d'une source de lumière blanche ou de lumière infrarouge ou bien laser. Cependant,
il importe de préciser la nuance qui existe entre la néphélométrie et la néphélémétrie.
La néphélémétrie a le même principe que la néphélométrie, sauf qu’elle est utilisée
pour mesurer les concentrations de protéines sériques par immuno précipitation : le sérum
dilué est mis en présence d'un anti-sérum spécifique et le complexe antigène-anticorps
antiprotéine précipite sous forme de fines particules permettant une analyse néphélémétrique.
(2)
Méthodes immunometriques du dosage de la myoglobine Page 37 sur 42
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Cette technique consiste à mesurer l'intensité d'un rayonnement laser diffusé à travers
un échantillon pour le relier à une concentration. En d’autres
c. Méthode du dosage via l’Immuno-turbidimetrie et immuno-néphélométrie
On met en contact le prélèvement avec des particules revêtues d’Ac-antimyoglobine,
d’où la formation du complexe immun myoglobine-anti myoglobine. Pour
l’immunoturbidimétrie, on mesure l’absorption d’un faisceau lumineux par les complexes
immuns, et pour l’immunonéphélométrie on mesure l’intensité de la lumière diffusée par les
complexes immuns.
Ces techniques sont rapides, adaptées à l’urgence, avec un domaine de mesure étendu
(de 50 à 600 µg/l), mais il existe des interférences notamment avec les prélèvements
hyperlipémies et avec les facteurs rhumatoïdes.
Echantillon : 10 µl de sérum ou de plasma hépariné. Conditions de conservation : 10 jours à
+2°C/+8°C ou 2 mois à -20°C.
Interprétation du Résultat :
Au cours de l’IDM: élévation entre 2 et 3h, pic entre 8 et 21h, retour à la normale entre 24 et
36h
Seuil décisionnel :
- si < 50 µg/l à la 3ème heure: exclusion d’IDM (98%)
- si > 90 µg/l : probabilité d’IDM
- si >130 µg/l : prédit l’IDM avec une bonne sensibilité
Méthodes immunometriques du dosage de la myoglobine Page 38 sur 42
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CONCLUSION GENERALE
Somme toute, il nous revenait de présenter le principe et méthode de réalisation de
l’électrophorèse, le principe de méthode de dosage du glucose, la technique et principe de
dosage de la créatinine, de l’urée, de l’acide urique, et enfin, le principe et méthode
immunométriques dans le dosage de la myoglobine. Nous avons successivement présenté
l’intérêt clinique, le principe, le mode opératoire, les échantillons, les réactifs, les valeurs de
référence de ces techniques biochimiques. Il s’avère que ces techniques sont toutes
nécessaires pour un bon diagnostic et suivi des populations atteintes des diverses
pathologies. Il est donc important que nous les connaissions et les appliquions (en plus ce
celles présentées par l’enseignant, Dr Assob) durant nos pratiques hospitalières, afin d’être
mieux outille en ce qui concerne la Biochimie Clinique.
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BIBLIOGRAPHIE
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