Evoluzione molecolare

Beta -lattamasi

Selezione della resistenza agli antibiotici

Charles Darwin, 1859

”On the origin of species by means of natural selection”

1) Forme di vita diverse originano da antenati comuni per discendenza con modificazioni

2) La selezione naturale è il motore dell'evoluzione

18S rRNA tree of life

Divergenza da antenati comuni con modificazioni

Science 2006

Pnas 2006

“Descent with modifications is only one of the evolutionary mechanisms”

Ricostruzione “automatica” dell’albero della vita...

Visione critica dell’albero della vita.

Sintesi moderna della teoria evolutiva

Unione di idee e osservazioni di diverse discipline scientifiche: genetica, genetica di popolazioni, paleontologia, biochimica, matematica, statistica.

Le mutazioni costituiscono la sorgente di variazione. Possono essere sfavorevoli, favorevoli, o neutrali.

●Le variazioni di frequenze di alleli in una popolazione sono determinanti per l'accettazione delle mutazioni. La deriva genetica e la selezione naturale, contribuiscono alla variazione delle frequenze alleliche.

●La ricombinazione genetica ha un ruolo fondamentale per l'evoluzione dei geni.

>1937, Fisher, J. Huxley, Haldane, Simpson, Dobzhansky

“Nulla in biologia ha senso se non alla luce dell'evoluzione”T. Dobzhanski

I fenomeni evolutivi sono spiegati attraverso meccanismi biologici conosciuti:

A c c u r a t e z z a d e l l a p o l i m e r a s i : 9 9 . 9 %

+ c o r r e z i o n e d i b o z z e : 9 9 . 9 9 9 %

+ r i p a r o : 9 9 . 9 9 9 9 9 9 9 %

MUTAZIONI

Mutazioni: alterazioni dell'informazione codificata nel DNA

Sostituzioni: cambiamenti basi

-Transizioni: cambiamenti Purina/Purina o Pirimidina/Pirimidina

-Transversioni: cambiamenti Purina/Pirimidina o viceversa

Inserzioni: aggiunte di nucleotidi

Delezioni: rimozioni di nucleotidi

Mutazioni in sequenze codificanti

● Sostituzioni

♦ sinonime: non modificano l'amino acido♦ di senso: cambiano un amino acido in uno diverso♦ non-senso: cambiano un amino acido in un codone di

stop

● Inserzioni/Delezioni

♦ Con cornice di lettura mantenuta (multipli di tre)

♦ Frameshift

Bias mutazionale (esempio)

G:U

G:T

Duplex

G:C

G:C or A:T

Negli organismi in cui si ha metiliazione delle citosine le mutazioni G:C → A:T sono più probabili delle mutazioni A:T → G:C

riparo

riparo

Duplex

Comparsa e esito delle mutazioni

comparsa della mutazione(caso)

accettazione della mutazione(caso, selezione naturale?)

• mutazione neutrale• mutazione svantaggiosa • mutazione vantaggiosa

MUTAZIONI ACCETTATE: CASO O SELEZIONE?

La maggior parte delle mutazioni osservate sono neutrali

Kimura, M.  Evolutionary rate at the molecular level, Nature (1968)

Teoria neutrale dell'evoluzione molecolare

Kimura, M.  Evolutionary rate at the molecular level, Nature (1968)Kimura, M.  The neutral theory of molecular evolution (1983)

Le mutazioni neutrali (o debolmente svantaggiose) possono essere accettate per effetto del caso

Le mutazioni vantaggiose sono favorite ma possono non essere accettate per effetto del caso

La comparsa delle mutazioni neutrali (o svantaggiose) è molto più probabile della comparsa delle mutazioni vantaggiose

Il caso (oltre alla selezione naturale) ha grande importanza nell'accettazione delle mutazioni.

Predizioni della teoria neutrale

• Regioni “più importanti” mutano meno rapidamente (o sono immutabili)

• residui critici per la struttura• residui critici per la catalisi

• Regioni “meno importanti” mutano più rapidamente

• introni• pseudogeni• terza posizione dei codoni• regioni “periferiche” delle proteine

Accumulo di mutazioni nelle diverse regioni dei geni codificanti per proteine

Genetic drift (deriva genetica)A

llele

freq

uen

cy

Alle

le fr

equ

enc

y

Generations Generations

Small population N = 20

Large populationN = 2000

:= Fissazione o scomparsa di una mutazione attraverso fluttuazioni casuali delle frequenze alleliche

p = 1 / 2N

la probabilità (p) di fissazione è inversamente proporzionale alla dimensione della popolazione (2N in una popolazione diploide)

L'uomo è soggetto a evoluzione neutrale

0 , 0

1 , 0

2 , 0

3 , 0

0 5 0 1 0 0 1 5 0

d e n s i t à d e l l a p o p o l a z i o n e ( a b / k m 2 )

va

ria

zio

ne

ge

ne

tic

a t

ra v

illa

gg

i

m o n t a g n a c o l l i n a p i a n u r a

0 , 0

1 , 0

2 , 0

3 , 0

0 5 0 1 0 0 1 5 0

d e n s i t à d e l l a p o p o l a z i o n e ( a b / k m 2 )

va

ria

zio

ne

ge

ne

tic

a t

ra v

illa

gg

i

m o n t a g n a c o l l i n a p i a n u r a

C a v a l l i - S f o r z a L L . " G e n e t i c d r i f t " i n a n I t a l i a n p o p u l a t i o n . S c i A m . 1 9 6 9 A u g ; 2 2 1 ( 2 ) : 3 0 - 7

Un carattere neutrale (gruppo sanguineo) può essere fissato nella popolazione per deriva genetica. In popolazioni più numerose viene mantenuto un maggiore livello di polimorfismo.

Selezione naturale

: diverso successo riproduttivo dipendente dal valore del genotipo

I mutanti sono più resistenti a una malattia

mutazioneespressa nella progenie

mutazioneespressa nella progenie

mutazionenella linea germinale

I mutanti sono più suscettibili a una malattia

sel. positiva (adattamento)

sel. negativa

Coefficiente di selezione

Misurato come variazione nel tempo dei rapporti di frequenza tra due genotipi in competizione

Ln

Probabilità relative di fissazione di una mutazione neutrale, vantaggiosa, svantaggiosa

Ne = dimensioni “effettive” della popolazione

s = coefficiente di selezione

=0 mutazione neutrale>0 mutazione vantaggiosa<0 mutazione svantaggiosa

Probabilità di fissazione di un allele in base al coefficiente di selezione e alle dimensioni della popolazione

Mutazioni quasi-neutrali

http://evolution-textbook.org/

L'importanza della ricombinazione

A) Singolo gruppo di linkage B) Tre gruppi distinti

vantaggiosa

deb. vantaggiosa

svantaggiosa

neutrale

Effetto del linkage (assenza di ricombinazione) sul destino di alleli alternativi. A) i tre loci sotto selezione sono completamente legati. Si assume che il vantaggio complessivo dell'allele azzurro (vantaggioso) e dell'allele nero (svantaggioso) sia maggiore dell'allele verde (deb. vantaggioso). Le mutazioni vantaggiose, svantaggiose e neutrali sono fissate inseme (effetto hitchhiking). La mutazione vantaggiosa in verde è eliminata. B) i tre loci sono indipendenti. Entrambe le mutazioni vantaggiose sono fissate, la mutazione svantaggiosa è eliminata. Tratta da Lynch, M. The origin of genome architecture.

Bannasch et al. Mutations in the SLC2A9 Gene Cause Hyperuricosuria and Hyperuricemia in the Dog. PLoS Genet. 2008

Kidney Liver

Cys188Phe

Mutazione in GLUT9 causa iperuricemia nel cane DalmataGLUT9 è in linkage con un gene che determina la grandezza delle macchie del manto.

Selezione per linkage di mutazioni patologiche nelle razze canine

Dimensioni del genoma e complessità degli organismi

C-value paradox

Per ragioni storiche il contenuto di DNA nel genoma di un organismo è riferito come C-value, ovvero come constant-value, dall'osservazione che il peso in pg del DNA è costante negli individui di una stessa specie.

1 Gbp ≈ 1 pg.

(109) * (660) * (1,66 · 10-24) = 1,02 · 10-12 g

Il C-value del DNA diploide umano (2C) è c.a 6.3 pg nei maschi e 6.4 pg nelle femmine

Il “C-value paradox” (Thomas 1971), deriva dall'osservazione che

1) il contenuto di DNA aploide può avere grandi variazioni anche nello stesso gruppo di organismi (es. nelle angiosperme varia tra 0.1 pg e 125 pg)

2) il contenuto di DNA aploide può non avere una relazione diretta con la “complessità” di un organismo (es alcuni protisti hanno C-values 100 volte superiori a quello dell'uomo).

Thomas, C.A. Jr. (1971) The genetic organization of chromosomes. Annu. Rev. Genet.

Mutation load e Mutation rate

Il mutational load (U) è il tasso di mutazioni deleterie per genoma per generazione.

Nell'uomo si stima U ≈ 2

Il mutation rate () è il numero di mutazioni totali per sito per generazione.

Nell'uomo si calcola = 1,1 · 10-8

Se tutte queste mutazioni fossero deleterie, il mutational load umano sarebbe

U = (1,1 · 10-8 )* (3 ·109 bp) * (2) = 66

Ovvero ciacuno riceve dai propri genitori circa 66 mutazioni, ma solo una piccola percentuale di queste (<5%) sono deleterie.

Analysis of genetic inheritance in a family quartet by whole-genome sequencing. Roach J. C.. et al., Science 2010

A resolution of the mutation load paradox in humans. Lesecque Y, Keightley PD, Eyre-

Walker A. Genetics. 2012

Negli anni '70, per spiegare il paradosso del C-value e l'incompaibilità tra mutation rate and mutation load, venne proposto che vari genomi fossereo costituiti in grande parte da DNA privo di una funzione. Susumu Ohno chiamò questo DNA “Junk DNA”.

Junk: Discarded material, such as glass, paper, or metal, some of which may be reused in some form.

Ohno, S. (1972) So much “junk” DNA in our genome. Brookhaven Symp. Biol. 23, 366–370

The ENCODE Project: ENCyclopedia Of DNA Elements

The human genome encodes the blueprint of life, but the function of the vast majority of its nearly three billion bases is unknown. The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) project has systematically mapped regions of transcription, transcription factor association, chromatin structure and histone modification. These data enabled us to assign biochemical functions for 80% of the genome, in particular outside of the well-studied protein-coding regions.

Encode criticism

The C-value paradox, junk DNA and ENCODE. Eddy SR. Curr Biol. 2012

On the immortality of television sets: "function" in the human genome according to the evolution-free gospel of ENCODE. Graur D, et al. Genome Biol Evol. 2013

Is junk DNA bunk? A critique of ENCODE. Doolittle WF. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013

Neutral evolution of genome complexity

● La selezione naturale domina nelle popolazioni grandi

● La deriva genetica domina nelle popolazioni piccole

● La complessità genomica si origina passivamente per azione della deriva genetica

● La complessità genomica è occasione di innovazioni adattative

OMOLOGIA

Emoglobina alfa uomo - Emoglobina alfa maiale

ATCGGCCACTTTCGCGATCA

Sequenza ancestrale

ATAGGCCACTTTCGCGATCA

ATAGGCCACTTTCGCGATTA

ATAGGGCACTTTCGCGATTA

ATAGGGCACTTT-GCGATTA

ATAGGGCACTTT-GCGATGA

ATCGGCCACTTTCGCGATCG

ATCGGCCACTTTCGTGATCG

ATCGGCCACGTTCGTGATCG

ATCGCCCACGTTCGCGATCG

ATTGCCCACGTTCGCGATCG

Sequenze omologhe

ATCGGCCACGTTCGCGATCG

Evoluzione nel tempo dell'informazione biologica

Omologia = condivisione di un ancestore comune

Evento di separazione

ATCGGCCACTTTCGCGATCA

Organismo ancestore

ATAGGGCACTTT-GCGATGA ATTGCCCACGTTCGCGATCG

Sequenze ortologhe

Separazione dei geni per speciazione

Specie moderna A Specie moderna B

Evento di speciazione

Lo stesso gene in organismi diversi

Separazione per speciazione

OMOLOGIA

Emoglobina alfa uomo - Emoglobina beta maiale

Duplicazione genica

Duplicazione (1% dei geni / milioni di anni)

Divergenza per mutazioni (0.1% / milioni di anni)

La duplicazione genica è l'evento più frequente nell'evoluzione di nuovi geni e funzioni

Lynch, M. & Conery, J.S. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes. Science, 2000

Demografia delle popolazioni umane

Demografia dei geni duplicati

Distribuzione dell'età di coppie di geni duplicati in sei genomi eucariotici. Dalla distribuzionesi possono ricavare informazioni sui tassi di nascita e morte dei geni duplicati. Da Lynch and Connery, 2003 “The evolutionary demografy of duplicated genes”

Recent duplications

Oldduplications

Baby-boom

Esiti della duplicazione genica

Silenziamento di una copia (pseudogene)

Divergenza funzionale

X

Mantenimento della funzione nelle due copie

(Vita media di un gene duplicato: 3-8 My)

(Es. Proteine ribosomali, tRNA)

(Funzione simile, oppure drasticamente diversa dalla funzione originaria)

Duplicazione per retrotrasposizione

­ in sedi diverse del genoma­ privi di introni­ con coda a polyA­ diversamente regolati

Esiti della duplicazione per retroposizione

Silenziamento di una copia (pseudogene processato)

Acquisizione di una nuova funzione

XMantenimento della funzione nelle due copie

(meno probabile)

Neo-funzionalizzazione e Sub-funzionalizzazione

La sub-funzionalizzazione può riguardare spesso la regolazione dell'espressione del gene nel tempo (es. embrione-adulto) o nello spazio (es. fegato-cervello)

pro-/

ancestral duplication~ 450 My ago

Cluster separation~ 300 My ago

recent duplications

pseudogenes

(Chr 11)

(Chr 16)

Cluster separation~ 300 My ago

Haemoglobin paralogs, different expression, different O2-binding affinity

Sub-funzionalizzazione

H I U a s e - T T R : a n e x t r e m e c a s e o f d i v e r g e n t e v o lu t i o n

D i s t r i b u t i o n : v e r t e b r a t e s

F u n c t i o n : T h y r o x i n e t r a n s p o r t e r“ t r a n s t h y r e t i n ( T T R ) ”

D i s t r i b u t i o n : v e r t e b r a t e s , o t h e r o r g a n i s m s

F u n c t i o n : h y d r o l y s i s o f5 - h y d r o x y i s o u r a t e

Bacteria

Plants

Fungi

Inverteb.

Verteb.

Verteb.

Gene duplication> 500 My ago

Hydroxyisourate hydrolase and transthyretin: extreme functional divergence

Neo-funzionalizzazione

La duplicazione può interessare interi genomi

Duplicazionegenomica

Wolfe, KH, curr. biol

Esiti della duplicazione genomica (WGD) in lievito

Post-WGD

Pre-WGD

Post-WGD

Yeast Gene Order Browser (YGOB)

Yeast Gene Order Browser (YGOB)

Due duplicazioni genomiche nell'evoluzione dei vertebrati(2R hypothesis)

Ohno S (1970). Evolution by Gene Duplication.Dehal, et al (2005). "Two Rounds of Whole Genome Duplication in the Ancestral Vertebrate".

Time

1R

2R

550 Mya

450 Mya

Speciazione per “divergent resolution” di geni duplicati

Una conseguenza importante della WGD è la speciazione per isolamento riproduttivo di subpopolazioni dovuta alla ritenzione differenziale di una copia di un gene duplicato (“divergent resolution” or “reciprocal gene loss”)

X

Subpopolazione 1

X

Subpopolazione 2

F1

Locus A Locus B

Locus A Locus B

X

X X

X

In base alla segregazione mendeliana ¼ della F1 manca completamente del gene.

ATCGGCCACTTTCGCGATCA

gene ancestore

ATAGGGCACTTT-GCGATGA ATTGCCCACGTTCGCGATCG

Sequenze paraloghe

Separazione per duplicazione genica

gene moderno A gene moderno B

Evento di duplicazione

Geni originati per duplicazione in uno stesso genoma

Rapporti evolutivi tra geni

Ortologia: I geni si separano per speciazione. La filogenesi dei geni riflette la storia degli organismi

Paralogia: I geni si separano per duplicazione all’interno di uno stesso organismo. La filogenesi riflette la storia dei geni

Esempio: evoluzione delle globine

Separazionedel gene

Separazione della specie

pro-

uomo

topo

uomo

topo

Diversi rapporti di parentela tra sequenze

In-paralogs e out-paralogs

Outparalogs

Inparalogs

I geni paraloghi possono essere distinti in “inparalogs” (la duplicazione genica è successiva alla speciazione) e “outparalogs” (la duplicazione genica precede la speciazione). L'esempio mostra due geni ipotetici (A e B) derivanti da un antico evento di duplicazione (tratto da Sonnhammer and Koonin, Trends In Genetics, 2002)

Omologia Identità di funzione

Caratteristiche dei geni omologhi

- Proteine derivanti da geni omologhi hanno struttura 3D simile

- Proteine derivanti da geni paraloghi possono avere una funzione uguale o simile

- Proteine derivanti da geni ortologhi hanno probabilmente una funzione uguale o simile

Metodi per la distinzione di tipi diversi omologia

1) Ricostruzione filogenetica. Confronto tra “gene trees” e “species trees”

2) Best reciprocal hit Ricerca di omologia in genomi completi

Best Reciprocal Hit (BRH)

il gene a della specie x ha come miglior mach il gene b della specie y.

Il gene b della specie y ha come miglior match il gene a nella specie x.

a

b

Best hit

Best hit

a' Best hit

a e b : BRHa' e b : non BRH

Gene trees e Species trees

frog

mouse

human

frog

mouse

human

frog

mouse

human

mouse

frog

human

Species tree

Gene tree(complete set) Gene tree

(uncomplete set)

Xenologia: trasferimento orizzontale di geni

Albero delle specie Albero dei geni

trasferimentoorizzontale

Albero dei geni inconciliabile con l'albero delle specie

- intra-specie e inter-specie (frequente nei procarioti)

- endosinbionte → ospite (eucarioti)

Trasferimento orizzontale di geni (HGT): esempio

The mannanase gene HhMAN1 from the coffee berry borer (Hypothenemus hampei)

Adaptive horizontal transfer of a bacterial gene to an invasive insect pest of coffee. Acuna et al. PNAS, 2012

Eukaryotes

Esiti possibili del trasferimento orizzontale

Donor

recipient

Acquisizione di un nuovo gene

Acquisizione di un analogo

Acquisizione di un paralogo

Mantenimento / silenziamento

Mantenimento / silenziamento/ gene displacement

Mantenimento / silenziamento/ gene displacement

“non orthologous gene displacements”: sostituizione di un gene originario ad opera di un gene trasferito orizzontalmente

Mutazioni come orologio molecolare?

Mutazioni ~ Tempo

Orologio molcolare

Ipotesi di una relazione proporzionale tra tempo evolutivo e numero di mutazioni accumulate

L'orologio è stocastico

L'orologio necessita di una calibrazione attraverso un riferimento indipendente (es. Reperti fossili). Una volta conosciuta la velocità dell'orologio, la divergenza tra sequenze può essere usata per stimare il tempo di separazione

Orologio molecolare nell'emoglobina alfa

Calcolo il numerodi mutazioni...

...Trovo il tempo di separazione

Distanza evolutiva

94.2

%Difference    PAM           1              1           5              5          10             11          15             17          20             23          25             30          30             38          35             47          40             56          45             67          50             80          55             94          60            112          65            133          70            159          75            195          80            246          85            328

PAM:  mutazioni puntiformi per 100 siti

Mammalian -globins

Mammalian -globins

Esempio di calcolo basato sull'orologio molecolare

R () = 20 PAM / 2*80 My = 0.12

R () = 20 PAM / 2*80 My = 0.12

R = PAM / 2*T

T = PAM / 2*R

T () = 110 / 2* 0.12 = 458 My

T?

80My

(20 PAM) (20 PAM)(110 PAM)

Proteine diverse, velocità di evoluzione diverse

Alcuni organismi evolvono più rapidamente di altri

Characterization of evolutionary rates and constraints in three Mammalian genomesCooper et al Genome Res 2002

Gli uomini evolvono (forse) più rapidamente delle donne...

Strong male-driven evolution of DNA sequences in humans and apesMAKOVA AND LI, Nature 2002

Molte proteine non si comportano come orologi molecolari

Evolutionary rate: PAM x 100 My

Cause delle deviazioni dall'orologio molecolare

1. Tasso di mutazione: Caratteristiche specie-specifiche negli enzimi di replicazione e riparo del DNA influiscono sulla velocità di mutazione

2. Tempo di generazione: Tempi di generazione differenti determinano una diversa velocità di fissazione delle mutazioni

3. Selezione naturale: Gli organismi possono essere soggetti in modo differente alla selezione naturale. Variazioni ambientali possono avere significato differente per i diversi organismi.

4. Funzione del gene: Cambiamenti funzionali di un gene nel corso dell'evoluzione possono determinare variazioni nella velocità di mutazione

Ayala, F. Bioessays 1999 Jan;21(1):71-5

Analisi dei cambiamenti evolutivi in relazione alla funzione

- Tipo e sede delle mutazioni

- Velocità di accumulo delle mutazioni

Determinazione delle pressione selettiva:

- Selezione purificatrice

- Neutralità

- Selezione positiva (adattamento)

Adaptive evolution of the TTR active site after gene duplication

H IU a se T T R

C o n s e r v e d w i t h i n g r o u p s , b u t d i ff e r e n t b e t w e e n g r o u p s

HIUase

TTR

H IU a se T T R

Accelerated evolution

All conserved mutations

map at the active site

Evoluzione accelerata: insulina negli istricomorfi

Istricomorfi

Esamero di insulina di mammifero.Gli istricomorfi presentano la forma monomerica

Sostituzioni sinonime/non sinonime

Mutazioni possibili: 549 (3 x 3 x 61) 392 non sinonime134 sinonime

 ~25% siti sinonimi

Test Ka/Ks

KN numero di sostituzioni / totale siti

KA numero di sostituzioni aminoacidiche / totale siti non sinonimi

KS numero di sostituzioni sinonime / totale siti sinonimi

KA/KS < 1 selezione purificatrice

KA/KS ~ 1 neutralità (pseudogeni)

KA/KS >1 selezione positiva (adattamento)

KA KS KA/KS

Istone 3 0 6.38 0Istone 4 0 6.12 0Actina alpha 0.01 3.68 0.002Insulina 0.13 4.02 0.010Mioglobina 0.56 4.44 0.126Urochinasi 1.28 3.92 0.326Ig K 1.87 5.90 0.316

Adattamento evolutivo nel lisozimaMessier et al. Nature, 1997

Pseudogenizzazione della miosina 16 e cambiamenti anatomici nell'evoluzione umana

Inattivazione della miosina 16 (MYH16) negli ominidi per mutazione di frameshift nell'esone 18

Data stimata inattivazione di MYH16: 2.4 Myr

STEDMAN et al, NATURE 2004

dN:

sost. non sinonime; ds: sost. sinonime

Calcolo del tempo di inattivazione del gene CHOU et al. PNAS 2002; STEDMAN et al, NATURE 2004

dN mutaz. non sinonime; d

s: mutaz sinonime

w1 = d

N1/d

s (pseudogene);

w = dN/d

s (altre specie)

dN1

mutaz. non sinonime nello pseudogene

[NB: dN

equivalente a Ka; ds equivalente a Ks]

T 1=Tw1−w

1−w

X

t1

t-t1

X