Evolution of Three Decades of

Separations Research

Daniel W. ArmstrongRobert A. Welch Professor

Department of Chemistry & BiochemistryUniversity of Texas at Arlington

Chromatography: the beginning

J. Am . Chem. Soc. 100 (1978) 4605; D. W. Armstrong, R. Seguin, C. J.  McNeal, R. D. Macfarlane, J. H. Fendler

Est. M.W. ~ 1.5‐10 K

Science, 191 (1976) 920

CALIFORNIUM 252 PLASMA DESORPTION  MASS SPECTROMETRY

In:  J. Am. Chem. Soc. 100 (1978) 4605, we published the 1st highM.W. protein/peptide mass determination (LC‐MS).

The first deliberate use of micellesin chromatography (separations)

D. W. Armstrong & J. H. Fendler, Biochim. Biophys. Acta, 478 (1977) 75.

Advent of the 3‐Phase Model and 

Pseudophase Theoryof 

Separations           

Vs/Ve‐Vm = [v(Kmw‐1)/Ksw] x Cm + 1/Ksw

Over the next 20 years micelle‐based separations grew tremendously giving rise to 

the fields of:• Micellar HPLC• Micellar Capillary Electrophoresis (often miss‐

named micellar electrokinetic chromatography)• Micelle based extractions• Micelle based membranes• And more

This also led to the use deliberate use of surfactants in other areas of analytical importance including atomic absorption & flame emission 

spectroscopy and HPLC‐mass spectrometry.

The 3‐phase model & theoretical  framework  and the peudophase

concept have been used to:• Explain chiral separations in HPLC, GC and CE• Calculate binding constants of molecules to micelles, cyclodextrins, proteins, etc.  

• Calculate binding constants of volatile compounds to any pseudophase by headspace GC

• Explain some extractions and microextractions• Explain molecular dynamics in complex microfluidic laminar flow streams

One of the bigger advances was solid phase micro extraction (SPME) in 1990

C.L. Arthur & J. Pawliszyn, Anal. Chem., 62 (1990) 2145.

The 3‐phase model & theory is used in“head space SPME” and separations 

containing macromolecular or colloidal entities.

Our micelle work led to cyclodextrin research beginning in 1979, which contributed to:

• The 1st commercial reversed phase CSP (in 1983) with thanks to Tom Beesley of Advanced Separation Technologies (Astec)!

• The practice and understanding of enantiomeric separations.

• The elucidation of the molecular chiral recognition mechanisms.

• The 1st published work on small molecule & drug modeling and interaction studies :  (Armstrong, et al., Science, 232, 1986, 1132‐1136).

• The issuing of new FDA guidelines in 1992 concerning the development of stereoisomeric drugs.

• The development of the most broadly utilized macrocycle in the world  (separations, excipients, consumer products, broad variety of scientific studies, etc.).  And one of the few molecules to have its own conference!

SCIENCE, 30 May 1986, Volume 232, pp. 1132‐1135

J. Chromatogr., 513, 181  (1990)

1996‐2006  Journal Cover

Used in various formats:  1987‐2000

Hydroxypropyl‐B‐Cyclodextrinas an

Excipient

At one point during thezenith of this work there were ~50 invitations/year to speak and requests for  ~400 reviews  in one year.

This column (Chiraldex G‐TA)(and a close analogue) have been sent 

on at least two space missions:

1. The ESA’s Rosetta Mission to reach Comet 67P and to detect & quantitate organic molecules.*

2. NASA’s Mars Mission (Curiosity Lab’s analytical unit, a.k.a. Sample Analysis at Mars (SAM).**

*Advances in Space Research 52 (2013) 2080‐2084.** Analytical Chemistry 85 (2013) 8024‐8030.

Structure of DMAA  NH2

(R)

(S)

H2N

(S)

(R)

NH2

(S)

(S)

H2N

(R)

(R)

NH2

If synthetic, it will be racemic and have a distinct diastereomericratio characteristic of the synthetic process.

Enantiomeric composition of the DMAA in synthetic standards and the supplements by enantioselective

GC (Chiraldex GTA)

Synthetic DMAA

Drug Testing and Analysis, 4 (2012) 986‐990.Banned by the FDA in 2012

enantiomers enantiomers

Commercial Supplement

Synthetic Standard

Then in 1994 we discovered that the macrocyclic glycopeptides (antibiotics) were exceptional chiral selectors.

They rapidly became the method of choice forthe separation of chiral natural and unnatural amino acids, carboxylic acids and a variety of polar drugs and other unusual chiral molecules.

CHIRALITY  8:590‐595  (1996)

Macrocyclic Glycopeptides

With the Petrich group at Iowa State University

“The Separation of Hypericin’s Enantiomers and Their  Photophysics in ChiralEnvironments”  in:  Photochem. Photobiol. 81 (2005)183‐186.

• Synthesized by F.A. Cotton group • Use as molecular wires• Enantioseparation of tri‐metal complexes never 

reported

EMAC = Extended Metal Atom Chains

MM M XX

N N N=

M=Ni, Cr, Co, or CuX=Y=Cl‐

2‐dipyridylamine (dpa)

J.F. Berry, F.A. Cotton et al. J. AM. CHEM. SOC., 2004, 126, 7082-7096

-

D.W. Armstrong, F.A. Cotton, A.G. Petrovic, P.L. Polavarapu, M.M. Warnke Inorg. Chem. 2007, 46, 1535.

Chirality of EMACs

D.W. Armstrong, F.A. Cotton, A.G. Petrovic, P.L. Polavarapu, M.M. Warnke Inorg. Chem. 2007, 46, 1535.

N N N

N

P‐helix (plus or clockwise rotation)

M‐helix (minus or counterclockwise rotation)

End-on view of Ni(dpa)4Cl2

Nickel EMACChirobiotic V

UV detection at 270 nm

Optimized Separation Conditions: 90/10 ACN/MeOH with 0.4% w/v  NH4NO3 and 0.2% w/v NH4TFA Flow rate 0.4 mL/min  CD detection

at 270 nm

12 17 22 27 32

time (mins.)

M.M Warnke, F.A. Cotton, D.W. Armstrong Chirality, 2007, 19, 179.

Specific Rotation ofNickel Complex

bc

=specific rotation=optical rotationb=cell pathlengthc=concentration

c

Peak 1 -5000+192° -0.0156° 3.12 x 10-6 g/cc

Peak 2 +5205+182° +0.0228° 4.38 x 10-6 g/cc

=589 nm, b=1 dm, samples in CH2Cl2

[]=

Cyclofructans (CFs)• Cyclic oligosacchride• Inuline,fructosyltransferase• Beta‐(2‐1) linked D‐fructofuranose

• 6,7,8 fructofuranose units• Crown ether skeleton• UV transparent• Solubility: >1.2g/ml• No health hazardous• The 3‐D structure shown here is incorrect

S. Immel et al. Carbohydrate Research 313 (1998) 91‐105

Native vs. Derivatized CF6

0 10 20 30 40Time (min)

CF63,5‐dimethylphenyl carbamateAcetonitrile/methanol/AA/TEA75/25/0.3/0.2

Native CF6Acetonitrile/methanol/AA/TEA90/10/0.3/0.2

Separation  of  Primary  Amines

min6 10 14 18

CHCH3

NH2

H3COH

NH2

1S,2R/1R,2S

Column: IPCF; 60ACN/40MEOH/0.3AA/0.2TEA

Macrocycles in Separations Today1.  >95% of all GC chiral separations are done on cyclodextrin derivative stationary phases.

2. >90% of all CE chiral separations are done with cyclodextrin‐based chiral selectors. 

3.  CDs are the dominant water‐based NMR chiral shift reagents.

4.  CDs are used for only about 5‐10% of LC chiral separations.

5.  Macrocyclic glycopeptides have superseded crown ethers for the separation of chiral amino acids and many other compounds.  They are the dominant macrocycle used for chiral LC separations.

6.  Cyclofructans are the newest and least developed chiral  macrocycle

CE Separation of Microorganisms

Simultaneous Separation of B. infantis, L. acidophilus, and S. cerevisiae and Determination of Their Viabilities

-1

3

7

11

15

19

23

27

0 10 20 30 40 50 60

Migrat ion t ime (minute)

Red

fluo

resc

ence

inte

nsity

(RFU

)

-1

3

7

11

15

19

23

27

0 10 20 30 40 50 60

Migration t ime (minute)

Gre

en fl

uore

scen

t int

ensit

y (R

FU)

Channel A

Channel B

B. infantis L. acidophilus S. cerevisiae

-1

3

7

11

15

19

23

27

0 10 20 30 40 50 60

Migrat ion t ime (minute)

Red

fluo

resc

ence

inte

nsity

(RFU

)

-1

3

7

11

15

19

23

27

0 10 20 30 40 50 60

Migration t ime (minute)

Gre

en fl

uore

scen

t int

ensit

y (R

FU)

Channel A

Channel B

B. infantis L. acidophilus S. cerevisiae

Live (green fluorescence curve)

Dead (red fluorescence curve)

Developed into a Rapid Test for Microbial Contamination

Published in the U.S. Pharmacopeia,  2012

Ionic Liquids in Separations and

Mass SpectrometryAnal. Chem. 74 (1999) 3873;   J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 14247.J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 593;   Anal. Chem. 81 (2009) 160.

GC  commercialization with thanks to Supelco and esp. Len Sidisky.

IL 82

IL 59

N N(CH2)12 N N

2NTf2-

P(CH2)12

P

2NTf2-

IL 94

IL 126

N N

2TfO2-

O O O N N

N

HNHN

NH

O

O

O

C5H10

C5H10

C5H10

P

P

P

3TfO2-

IL Blend

Examples of More Analytically Useful ILsSynthesized in Our Work

Why  the  Renaissance  in  GC?

1) Miniaturization2) Advent and Commercialization of Effective, 

Efficient Comprehensive GCxGC3) Advent of the 1st New Class of  Stationary 

Phase in 40 Years:  Ionic Liquids4) Availability of Statistical  Methods  to Efficiently 

Obtain and Treat Data5) Growing  Necessity  to Analyze Complex  

Samples  (Metabolomics, Nutritional, Petro, Environmental, Etc.

Figure 6.  GC x GC separation of diesel fuel on the (a) IL x HP‐5 column combination, (b) the DB‐Wax x HP‐5 column combination, and (c) the HP‐50+ x HP‐5 column combination.  Both the IL x HP‐5 and DB‐Wax x HP‐5 configurations generated distinct chromatographic regions for the saturated hydrocarbons, monoaromatics, and diaromatics.  The HP‐50+ x HP‐5 configuration had nearly complete separation of the saturated hydrocarbons from the aromatics, but no clear separation of the aromatics into monoaromatic and diaromatic regions.

Anal. Bioanal. Chem. 390 (2008) 323‐332.

Water detection by GC1. Water cannot degrade the stationary phase.

2. Water must produce a reasonably sharp, efficient peak.

3. Water must be well separated from all solvents (matricies) and an internal standard.

4.  Analysis times should be short.

5.  Results must be highly accurate and reproducible.

6.  Effective for any concentration from 99%.

A)

C)

B)

acetoneI.S.

acetoneI.S.

H2O

H2O

H2OacetoneI.S.

t‐butanol

DMF

impurity

impurity

Chromatograms A and C are isothermal separations.  Chromatogram B is for the same sample as in A, however a temperature gradient was used to decrease the analysis time and further “sharpen” the water peak.  This enhanced the sensitivity and precision of the method. 

Chromatogram A: 1ml injection, 50°C, analysis time: 9 min, Internal Standard: acetone (0.4%) 

Chromatogram B: 1 ml injection;50°C (hold 2min), ramp 10dpm to 80°C; analysis time: 6min, Internal Standard: acetone (0.4%).  

Chromatogram C: 0.2 ml injection; 110°C, analysis time: 8min, Internal Standard: acetone (0.2%).

t‐butanolChromatograms illustrating the separation of water from

organic solvents

LC‐GC North America, Vol. 30, April, 2012, pp. 142‐158.

Rapid Analysis of Ethanol and Water in Commercial Products Using Ionic Liquid Capillary Gas Chromatography with 

Thermal Conductivity Detection and/or Barrier Discharge Ionization Detection

J. Agric. Food Sci. 62 (2014) 1832‐183848

Quantitation of Water in Solids (i.e., APIs)

• Weight loss by drying– Detects mass of all volatile solvents – Nonselective

• Karl Fischer– Labor intensive and not a high throughput method– Needs careful control of solvents– Need to control ambient moisture– Side‐reactions can affect results

Headspace Gas Chromatography (HSGC)

• A common method in pharmaceutical products to analyze residual solvents

• Increases sensitivity compared to direct injection

• Nonvolatile portions that can damage the column are not injected, cleaner injections

• EconomicalHeat

Headspace volatile compounds

Dissolved sample& nonvolatile compounds

NN

NN

NN

P

F

FFCF2

F3C

CF2

CF3

CF2F3C

P

F

FFCF2

F3C

CF2

CF3

CF2F3C

P

F

FFCF2

F3C

CF2

CF3CF2F3C

1‐hexyl‐3‐methylimidazolium trifluorotris(pentylfluoroethyl) phosphate (HMIM FAP) 

1‐butyl‐3‐methylimidazolium trifluorotris(pentylfluoroethyl) phosphate (BMIM FAP) 

1‐ethyl‐3‐methylimidazolium trifluorotris(pentylfluoroethyl) phosphate (EMIM FAP) 

FAP ILs: the anion is all important

Trifluorotris(pentylfluoroethyl) Phosphate (FAP) Anion

Chemistry  Today 2004, 22, 42‐43.

• Low content of residual water • Low water uptake • Hydrolytic stability• High thermal stability• Low viscosity 

SamplePercent Water

HSGC Loss on DryingAscorbic acid 2.7 a

Bupivacaine 3.8 b

Carnitine 1.9 a

Cholecalciferol 3.6 b

Ephedrine 2.1 a

Ethnylestradiol 3.7 c

Homocysteine 3.4 2.9

Ibuprofen 0.2 b

Ketamine hydrochloride 1.1 1.1

Lysozyme 7.5 b

Oxypene 0.7 0.8

Paclobutrazol 1.0 b

Penicillamine 1.6 a

Promethazine 3.9 3.8

Propranolol 2.7 2.2

Rifampicin 2.9 2.7

Scopolamine 2.1 a

Sodium tartrate dibasic dihydrate 15.9 15.6

A New Approach for Ultra-Sensitive Anion Analysis a.k.a.:

P I E S IFor

Paired Ion Electrospray Ionization

Detection of Anions

• Three different ways to detect ions1) Anion SIM2) Cationic complex SIM3) Use MS/MS (SRM)

‐ Trap m/z of complex‐ Excite this m/z to break complex‐Monitor m/z of deprotonated cation (m/z 289)

1+

ClO4-

1+

%

100

0

%

100

0

%

100

0

%

100

010.10

12.54

5.06

14.46

14.45

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

%

100

00

Time (min)

%

100

0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

%

100

00

Time (min)

%

100

0

15.52

13.80

%

100

0

%

100

0

9.53

2.97

TIC

clopyralid, m/z: 514.3

2,4-DB, m/z: 571.4

2,4-D, m/z: 543.3

dicamba, m/z: 543.3

2,4,5-T, m/z: 577.3

dichlorprop, m/z: 557.3

fenoprop, m/z: 591.3

Quinclorac, m/z: 564.3

MCA, m/z: 517.313.82

mecoprop, m/z: 537.4

Chromatographic separation and detection of nineteen acidic pesticides in positive ion mode LC‐ESI‐MS. 

[1] C.C. Leandro, D.A. Bishop, R.J. Fussell, F.D. Smith, B.J. Keely, J. Agric. Food Chem. 54 (2006) 645.[2] J.-Y. Hu, T. Aizawa, Y. Magara, Water Res. 33 (1998) 417.[3] K.-W. Yang, R. Eisert, H. Lord, J. Pawliszyn, Applications of Solid Phase Microextraction, Royal Society of Chemistry, United Kingdom, 1999.[4] J.T. Yu, K.J. Bisceglia, E.J. Bouwer, A.L. Roberts, M. Coelhan, Anal. Bioanal. Chem. 403 (2012) 583.[5] A. Cappiello, G. Famiglini, F. Bruner, Anal. Chem. 66 (1994) 1416.[6] R.B. Geerdink, A. Kooistra-Sijpersma, J. Tiesnitsch, P.G.M. Kienhuis, U.A.T. Brinkman, J. Chromatogr. A 863 (1999) 147.[7] T.C.R. Santos, J.C. Rocha, D. Barcelo, J. Chromatogr. A 879 (2000) 3.

Improvement

1700×

4200×

830×

1700×

830×

250×

330×

‡ The LOD range reported is based on LODs of 19 pes cides obtained using dica on C5(bpyr)2 in the SRM positive ion mode.

1978, Bowdoin College