Evaluasi status HER-2/neu pada spesimen kanker payudara dengan uji imunohistokimia (IHC) dan...

5/19/2018 Evaluasi status HER-2/neu pada spesimen kanker payudara dengan uji imunohistokimia (IHC) dan fluorescence in-situ hybridization (FISH) - sli

1/8

Evaluasi status HER-2/neupada spesimen kanker payudara dengan

uji imunohistokimia (IHC) dan fluorescence in-situ hybridization

(FISH)

Kalal Iravathy Goud, Seetha Dayakar, Kolanupaka Vijayalaxmi, Saidam Jangu Babu &Vijay

Anand Reddy P.*

Departments of Molecular Biology & Cytogenetics & *Oncology, Apollo Health City,

Hyderabad, India

Latar belakang dan tujuan: Fluorescence in situ hybridization (FISH) semakin dikenali sebagai tes paling akurat dan

prediktif untuk amplifikasi gen Her-2/neu dan respon terapi pada kanker payudara. Pada studi ini kami

menginvestigasi amplifikasi gen Her-2/neu dengan uji FISH pada spesimen jaringan kanker payudara dan

membandingkan hasilnya dengan analisis imunohistokimia (IHC).

Metode: Sebanyak 90 sampel jaringan kanker payudara digunakan untuk analisis IHC dan FISH. Uji IHC dilakukan

dengan menggunakan antibodi monoklonal tikus pada domain intraselular dari protein Her-2/neu. Setiap slidedinilai

secara blindedoleh dua orang patologis sesuai dengan kriteria yang telah produsen rekomendasikan. Analisis FISH

dilakukan pada potongan jaringan kanker payudarayang telah tertanam dalam parafin. Polisomi untuk sentromer 17

(spec green signal) dibaca sebagai sinyal hijau kurang dari 4 sebagai polisomi sedang dan lebih dari 4 sebagai

polisomi tinggi.

Hasil: 30 dari 90 pasien memilki hasil negatif dengan IHC dan FISH. Dari 28 pasien dengan skor +2 dengan IHC,

20 diantaranya memiliki hasil positif pada FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu, 3 diantaranya memiliki hasil

negatif pada FISH dan 5 pasien sisanya menunjukan hasil yang meragukan (1.8-2.2) pada FISH. Kelima hasil yang

meragukan ini diuji kembali untuk IHC dan FISH pada jaringan yang berbeda, dan kelimanya menunjukkan hasil

positif pada amplifikasi gen Her-2/neu. 25 pasien dengan skor +3 dengan IHC juga memiliki hasil yang positif pada

FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu (>2.2). 7 pasien dengan skor +3 dengan IHC memiliki hasil yang negatif

pada FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu (>2.2), dan menunjukkan polisomi dari kromosom 17 polisomi tinggi

>4.

Interpretasi dan kesimpulan: Hasil dari studi ini mengindikasikan bahwa status HER -2/neu dengan FISH perlu

dilakukan pada semua kasus kanker payudara dengan skor +2 dengan IHC. Kasus dengan skor +3 dengan IHC

dapat diuji dengan FISH untuk menyingkirkan polisomi dari kromosom 17 yang bisa jadi salah diinterpretasikan


2/8

sebagai overekspresi dari HER-2/neu pada analisis IHC. Dibutuhkan pula untuk membangun nilai cut-off pada

amplifikasi gen HER-2/neu dengan FISH dan IHC yang mungkin dapat dibandingkan dan dikalibrasikan lebih jauh

lagi.

Kata kunci: Breast cancer - HER2/neu gene amplification - fluorescence in situ hybridization (FISH) -

immunohistochemistry (IHC)

Kanker payudara menempati posisi kedua sebagai kanker yang paling sering terjadi pada wanita

di India dan puncak insidensinya berada pada usia 40-50 tahun, dengan usia rata-rata 47 tahun.

Sejak laporan pertama dari erb-b2 sebagai faktor prognostik yang buruk pada kanker payudara di

tahun 1987, signifikansi dari onkogen HER-2/neu sebagai faktor prognostik yang tidak cocok

digunakan telah dicatat pada kanker lainnya seperti ovarium, paru, lambung, dan pankreas3-6.

Amplifiasi dari gen erb-b2 atau overekspresi dari protein erb-b2 telah dideteksi dalam 10-30%

kejadian kanker payudara dan bersamaan dengan kelainan dari topoisomerase II (TOP2) yang

juga berhubungan, menunjukkan tidak adanya perubahan setelah pengobatan, dan tidak adanya

perbedaan antara lesi primer dan metastatik.

Beberapa teknik yang saat ini tersedia untuk menghitung HER2/neu yaitu, IHC pada jaringan

yang tertanam dalam parafin untuk deteksi protein HER-2/neu, analisis Southern blot, teknik

reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), teknik chromogenic in situ

hybridization (CISH), dan teknik fluorescence in situ hybridization (FISH). Uji HER2/neu

digunakan sebagai penanda prognostik untuk menentukan agresifitas dari kanker payudara.

Kadar serum HER2/neu terkadang dinilai untuk menentukan baseline dan jika meningkat,

digunakan untuk memonitor pengobatan kanker. Bagaimanapun juga, metode ini tidak

digunakan secara luas karena kadar dari HER2/neu hanya meningkat jika terdapat tumor yang

luas pada stadium lanjut, sehingga pada stadium awal, HER2/neu dapat tidak ditemukan;negatif.

FISH digunakan secara meluas untuk diagnosis serta memonitor respon dari terapi, seperti terapi

hormon dan kemoterapi. Pada studi ini kami menginvestigasi amplifikasi gen Her-2/neu dengan

uji FISH pada spesimen jaringan kanker payudara dan membandingkan hasilnya dengan analisis

imunohistokimia (IHC).


3/8

Material dan Metode

Pada studi retrospektif ini, jaringan dari ca mammaeyang telah tertanam dalam parafin dari 90

pasien wanita konsekutif yang telah dioperasi di Departemen Onkologi pada bulan Juli 2008

April 2009 dan dirujuk ke Departemen Biologi Molekular dan Sitogenetik, Apollo Health City,

Hyderabad, India, untuk analisis FISH diikutsertakan pada studi ini. Usia rata-rata dari pasien

berada antara 30-50 tahun (47.94 13.7). Diagnosis histopatologi dari kanker payudara

ditentukan berdasarkan evaluasi standard light-mikroskopis dari potongan yang telah diwarnai

dengan Hetoylin dan Eosin pada setiap kasus dan didiagnosis sebagai karsinoma duktal invasif

grade I, II, dan III. Status reseptor estrogen dan progesteron (ER, PR) juga dicatat.

Analisis IHC: IHC protein dari Her-2/neu dilakukan pada potongan jaringan yang ditanam dalam

parafin dengan ketebalan 3 to 4 m yang terletak pada slides yang telah dilapisi poly-L-Lysine.

Setelah deparaffinizationdan blocking dari endogenous peroxidase, immunostainingHER-2/neu

dilakukan dengan onkoprotein kelinci, anti-human c-erbB-2, sebagai antibodi primer (Dako,

Copenhagen, Denmark) pada dilusi 1:100. Pengikatan dari antibodi primer dicek dengan Dako

Quick-Staining, Labelled StreptavidinBiotin System (LSAB; Dako, USA), diikuti dengan

penambahan diaminobenzidine (DAB) sebagai kromogen. Setiap slide dinilai secara blinded oleh

dua orang patologis sesuai dengan kriteria yang telah produsen rekomendasikan.Immunostaining

dibaca secara semikuantitatif dan dibagi dalam beberapa grade, yaitu: 0, 1+, 2+, dan 3+

Intensitas skor dari 0 atau 1+ dianggap sebagai ekspresi negatif dan 3+ dianggap sebagai

ekspresi positif dari HER-2/neu. Skor 2+ dianggap meragukan, yang kemudian direkomendasika

untuk dilakukan analisis FISH lebih lanjut.

Analisis fluorescence in situ hybridization (FISH): analisis FISH dilakukan menggunakan

peralatan pemeriksaan PathVysion HER-2 (Vysis, USA). Terdapat 2 pemeriksaan fluorescent-

labelled:LSI (locus-specific identifier) HER-2 spesifik untuk lokus gen HER-2 (17q11) dan CEP

(chromosome enumeration probe) 17 spesifik untuk sekuens DNA satellite pada regio

sentromer dari kromosom 17. Potongan parafin dengan ketebalan 3-4 mm dipotong

menggunakan mokrotom dan diapungkan dalam air free-protein pada suhu 400C. Potongan-


4/8

potongan tersebut dipasang pada slides yang dilapisi poly-L-Lysine dan dikeringkan. Slides

tersebut disimpan semalaman di dalam oven pada 560C. Slides tersebut kemudian di-

deparaffinized dalamxylenepada suhu ruangan selama 20 menit dan didehidrasikan dalam 100%

ethanol selama 15 menit pada suhu ruangan dan dikeringkan dengan udara. Lalu slides tersebut

diberikanpretreatment solution (sodium thiocyanite) danprotease solutionselama 15 menit, dan

didehidrasi dengan alkohol 70, 80 dan 100% selama 5 menit dan dikeringkan dengan udara.

Peralatan pemeriksaan didenaturasikan pada suhu 800C selama 5 menit dan diaplikasikan di atas

slide dan cover slipped, dan diletakkan pada ember yang telah dilembabkan untuk inkubasi

semalaman. Setelah pencucian post-hybridization, diberikan 0,4% 2XSCC (sodium saline

citrate) 40 pada suhu 37oC. Setelah menghilangkan cover slips, slides tersebut diceluplan di

dalam buffer post- hybridization selama 18 detik, kemudian dikeringkan dalam keadaan gelap

dan diaplikasikan pula 10 l DAPI dan cover slip diletakkan secara perlahan. Slides tersebut

diskrining di bawah mikroskop fluoresensi (Olympus, USA) dengan filter yang sesuai (DAPI,

FITC, TRITC dualdan triple band pass filters). Sinyal yang didapat dihitung dalam setidaknya

200 sel untuk gen HER-2/neumaupun sinyal sentromer kromosom 17 di bawah imersi minyak

pada 1000x magnifikasi dengan menggunakan filter rekomendasi. Hasil diekspresikan jika rasio

dari sinyal HER-2/neu (orange) ke sentromer 17 dan bacaannnya terbaca sebagai berikut: rasio

yang diperkirakan 1-1.8 mengindikasikan tidak adanya amplifikasi gen (negatif), rasio >2.2

mengindikasikan adanya amplifikasi gen HER-2/neu (positif), dan rasio antara 1.8-2.2 dianggapmeragukan. Polisomi 17 juga direkam dalam sel dengan 4 spec sinyal hijau sebagai polisomi

moderat; sedang dan lebih dari 4specsinyal hijau sebagai polisomi tinggi.

Results

Of the 90 patients, 30 with a score of 0/1+ (negative) by IHC were FISH negative for HER-2/neu

gene amplification (ratio between 0.6-1.6) (Fig. 1 A, B, Fig. 2 A, B). Of the 28 patients with the

score of 2+ by IHC (Fig. 2 C), 20 were FISH positive for HER-2/neu gene amplification (>2.2),

three were FISH negative and five patients showed equivocal (1.8-2.2) results by FISH (Fig. 1C).

These five cases were retested for IHC and FISH on different paraffin embedded tissue blocks,

where all five patients were found eligible for trastuzumab-based therapy. Twenty five patients

with the score of 3+ by IHC (Fig. 2 D) were FISH positive for HER-2/neu gene amplification


5/8

with the ratio of >3.9 (>2.2) (Fig. 1 D). Seven cases with the score of 3+ by IHC were FISH

negative for HER-2/neu gene amplification (>2.2). These cases showed polysomy of

chromosome number 17 (spec green signals > 4) which could have been the reason for IHC 3+

(Fig. 3). The association of HER-2/neu status in these 90 patients with histological grade of

tumour and estrogen and progesterone receptor status is shown in the Table.

Hasil

Dari 90 pasien, 30 diantaranya yang memiliki hasil skor 0/1+ (negatif) dengan hasil IHC ang

juga negatif untuk amplifikasi gen HER-2/neu (rasio antara 0.6-1.6) (Fig. 1 A, B, Fig. 2 A, B).

Dari 28 pasien dengan skor +2 dengan IHC (Fig. 2 C), 20 diantaranya memiliki hasil positif pada

FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu (>2.2), 3 diantaranya memiliki hasil negatif pada FISH

dan 5 pasien sisanya menunjukan hasil yang meragukan (1.8-2.2) pada FISH (Fig. 1C). Kelima

hasil yang meragukan ini diuji kembali untuk IHC dan FISH pada jaringan yang berbeda, dimana

kelima pasien layak untuk menerima terapi trastuzumab-based. 25 pasien dengan skor +3 dengan

IHC (Fig. 2D) juga memiliki hasil yang positif pada FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu

dengan rasio >3.9 (>2.2) (Fig. 1D). 7 pasien dengan skor +3 dengan IHC memiliki hasil yang

negatif pada FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu (>2.2). Kasus ini dapat menunjukkan

polisomi dari kromosom 17 (sinyal hijau >4 spec) yang bisa menjadi alasan untuk hasil IHC 3+

(Fig. 3). Hubungan antara status HER-2/neu pada kesembilan puluh pasien ini dengan grade

histologis dari tumor dan status dari reseptor estrogen serta progesteron ditunjukkan pada tabel.

Diskusi

Gen HER-2/neu berlokasi di lengan panjang pada kromosom 17 (17q12-21.32). Gen ini

mengkodekan onkoprotein p185, reseptor dari tyrosine kinaseyang dapat dihubungkan dengan

jalan transduksi sinyal multipel. Overekspresi dari gen ini ditemukan pada berbagai keganasan,

terutama pada payudara, ovarium, lambung, pankreas, prostat, kolorektal, traktus genitalia pada

wanita dan paru-paru. HER-2/neu, yang juga dikenal sebagai onkoprotein erbB-2 mengalami

overekspresi pada 25-30% kanker payudara. Overekspresi HER-2/neu pada pasien dengan

kanker payudara dan nodus limfe positif berkaitan dengan prognosis yang buruk dengan


6/8

berkurangnya interval bebas penyakit dan memendeknya jangka waktu untuk bertahan, dan

hubungan yang serupa mungkin terjadi pada kasus nodus negatif.Tingkat ekspresi dari gen HER-

2/neutampak sebagai prediktor yang signifikan untuk respon dari beberapa agen terapeutik. Trastuzumab

(Herceptin), suatu antibodi humanized monoclonal antiHER-2/neu, disahkan oleh US Food and Drug

Administration sebagai agen terapeutik adjuvan untuk pasien kanker payudara metastasis dengan

overekspresi protein HER-2/neu.Sebagai hasilnya, evaluasi dari status HER-2/neu menjadi penting dalam

menentukan kelayakan pasien untuk menerima pengobatan trastuzumab.

Pada laboratorium klinis, status HER-2/neu biasanya diperiksa menggunakan spesimen yang telah

difiksasi oleh formalin dan tertanam di dalam parafin menggunakan IHC ataupun FISH. Wang et al

mencapai tingkat penerimaan tertinggi, sebesar 98% dengan dua uji FISH, Inform (Ventana Medical

Systems, Tucson, AZ) dan PathVysion (Vysis). Semua kasus dengan IHC negatif dan hampir semua IHC

positif rendah (1+) tidak menunjukkan adanya gen amplifikasi, sedangkan hampir semua kasus IHCpositif tinggi (3+) menunjukkan amplifikasi gen. Bagaimanapun juga, kasus IHC positif sedang (2+)

menunjukkan kejanggalan yang signifikan dengan uji FISH, misalnya, beberapa menunjukkan amplifikasi

gen HER-2/neu dan yang lainnya tidak. Hasil janggal lainnya juga terlihat pada pasien kami; 30 pasien

dengan skor 0/1+ pada IHC memiliki hasil FISH negatif untuk amplifikasi gen HER-2/neu (rasio antara

0.6-1.6). Dari 28 pasien dengan skor +2 dengan IHC, 20 diantaranya memiliki hasil positif pada

FISH untuk amplifikasi gen Her-2/neu, 3 diantaranya memiliki hasil negatif pada FISH dan 5

pasien sisanya menunjukan hasil yang meragukan (1.8-2.2) pada FISH. Status Her-2/neu yang

paling sesuai untuk pasien seperti ini berada pada zona abu-abu (sekarang diartikan sebagai rasio

FISH 1.8-2.2) dan tetap tidak jelas. Untuk menyebutkan hal ini, guidelines dariAmerican Society

of Clinical Oncology/ College of American Pathologists (ASCO/CAP) telah menambahkan katergori

equivocal;meragukan untuk hasil FISH, sama halnya dengan analisis IHC, dengan harapan hal ini dapat

mendorong studi lebih lanjut untuk menetapkan keuntungan potensial yang lebih baik dari terapi HER2

langsung untuk pasien dengan hasil FISH yang meragukan. Pada studi kami, kelima hasil yang

meragukan ini diuji kembali untuk IHC dan FISH pada jaringan yang berbeda, dimana kelima

pasien ini menunjukkan hasil 2+ untuk amplifikasi gen dan layak untuk menerima terapi

trastuzumab-based. Alasannya bisa jadi karena heterogenitas tumor secara alamiah yang menghasilkan

berbagai variasi. Jadi, kasus yang meragukan pada FISH dapat diuji kembali dengan blok jaringan yang

berbeda pada pasien yang sama.

Pada studi kami, pasien dengan kanker payudara yang lebih muda dilaporkan memiliki frekuensi

amplifikasi genHER-2yang lebih tinggi. Panjwani et al menunjukkan korelasi yang positif dari grade III


7/8

dengan amplifikasi HER-2/neu yang sesuai dengan literatur yang ada. Hubungan yang terbalik tercatat di

antara status reseptor hormon dan amplifikasi gen HER-2/neupada studi ini. Alasannya bisa jadi karena

adanya pemberian sinyal yang kompleks antara ER dan jalur sinyal growth factor lainnya di dalam sel

kanker payudara. Pada studi kami, 18% kasus menunjukkan ekspresi kedua ER dan amplifikasi HER2.

AmplifikasiHER2pada tumor ini dilaporkan berhubungan dengan resistensi terhadap terapi tamoxifen.

Dipostulasikan bahwa pada tumor ini, fungsi tamoxifen sebagai estrogen-agonits untuk meningkatkan

pertumbuhan sel kanker payudara yang menunjukkan kadar HER2 yang tinggi dan co-activator reseptor

estrogen menghasilkan resistensi de novoterhadap tamoxifen.

7 kasus dengan skor 3+ pada IHC menunjukkan hasil negatif pada FISH untuk amplifikasi gen (>2.2).

Studi-studi sebelumnya juga menunjukkan hal yang sama. Meskipun terdapat hubungan yang baik antara

amplifikasi gen dan overekspresi protein HER-2, banyak studi yang juga menunjukkan bahwa 3-15%

kanker payudara terdapat overekspresi protein HER-2 tanpa amplifikasi gen dan amplifikasi gen Her-2

tanpa overekspresi protein. Berbagai macam teori telah diajukan untuk menjelaskan kesenjangan ini.

Peningkatan ekspresi reseptor pada kanker payudara tanpa perubahan genetik telah dilaporkan pada 10%

kasus, dimungkinkan karena aktivasi transkripsional atau post transkripsional. Penjelasan lain mengenai

overekspresi tanpa amplifikasi termasuk sensitifitas tinggi dari uji IHC, single copydari gen HER-2 pada

transkripsi mRNA, atau amplifikasi gen di bawah tingkat yang terdeteksi oleh uji FISH. Keberadaan dari

polisomi kromosom 17 tidak sering terjadi pada kanker payudara dan telah disarankan untuk

diperhitungkan pada overekspresi tanpa amplifikasi. Kami menemukan bahwa rata-rata hasil copy dari

kromosom 17 jika dibandingkan dengan HER-2/neu, secara signifikan lebih tinggi pada FISH , dan hal

ini bisa menjadi salah interpretasi sebagai overekspresi dari HER2/neu pada analisis IHC. Hal ini dapat

dijadikan alasan untuk memeriksa apakah tumor dengan IHC 3+/FISH negatif dengan polisomi 17 secara

biologis berbeda dengan FISH negatif lainnya dan lebih mirip dengan tumor konvensional dengan

amplifikasi HER2/neu, khususnya dalam respon terhadap terapi Herceptin-based.Oleh karena itu, semua

kasus kanker payudara dengan skor IHC 2+ perlu diuji dengan FISH.

Diskusi mengenai metode terbaik dalam menentukan status HER2/neu pada sampel ini masih berlanut,

dengan metode FISH yang popularitasnya meningkat sehubungan dengan bukti terbaru, yaitu jika

dibandingkan dengan IHC, FISH lebih akurat dalam memprediksi respon terapi trastuzumab-based.

Investigasi dari amplifikasi HER2/neu bersamaan dengan perubahan genetik yang sering terjadi dapat

menjadi bernilai dalam menentukan faktor prognostik. Kasus yang meragukan perlu diinterpretasikan

dengan perhatian lebih dan pasien perlu dimonitor dalam follow up. Studi ini menunjukkan bahwa

pendekatan kombinasi menggunakan metodologi IHC dan FISH dapat mengoptimalkan tes HER2/neu


8/8

pada kanker payudara. Dibutuhkan pula untuk membangun nilai cut-offpada amplifikasi gen HER-

2/neu dengan FISH dan IHC yang mungkin dapat dibandingkan dan dikalibrasikan lebih jauh

lagi. Hal ini secara potensial dapat meningkatkan akurasi dan tes HER-2/neu yang lebih bermaknsa

di masa depan.

Evaluasi status HER-2/neu pada spesimen kanker payudara dengan uji imunohistokimia (IHC) dan...

Documents

Transcript of Evaluasi status HER-2/neu pada spesimen kanker payudara dengan uji imunohistokimia (IHC) dan...