Etude Phytochimique et Activité Antioxydante de l'Huile ...

/(épuMi9ue de Côte d1voire Union - Discipline - T ravai/

Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

l'NIVlil-<"'I r r: NANGUIABROGOUA

Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et

Appliquées (UFR-SFA)

Laboratoire de Chimie Bio-Organique et de Substances Naturelles

(LCBOSN)

Année Académique : 2015-2016

MEMOIRE DE MASTER DES SCIENCES FONDAMENTALES ET

APPLIQUEES

Mention : Chimie Option : Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles

Sujet

Etude Phytochimique et Activité Antioxydante de

l'Huile Essentielle de Origanum syriacum L.

(Lamiaceae) acclimaté en Côte d'Ivoire

Présenté par KOUAME Akissi Christelle Euphrasie

Encadré par Dr. OUATARA Zana Adama, Maître Assistant

Soutenu le 6 janvier 2017 devant le jury composé de :

Président du jury : Pr. Békro Yves-Alain, Professeur Titulaire

Directeur scientifique: Pr. MAMYRBEKOVA J. A. épse BEKRO, Professeur Titulaire

Examinateur : Dr. KODJO Charles, Maître de Conférences

TABLE DES MATIERES

DEDICACES iv

REMERCIEMENTS··································································································· V

LISTE DES FIGURES vii

LISTE DES TABLEAUX viii

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ix

INTRODUCTION 1

Chapitre 1 : 2

Revue bibliographique 2

1. ORIGANUM SYRIACUM 3

1.1. Description de la plante 3

1.2. Position systématique 4

1.3. Usages 4

1.4. Travaux antérieurs réalisés sur le genre Origanum 5

li.GENERALITES SUR L'HE 7

11.1. Définition 7

11.2. Composition chimique des HE 8

11.2.1. Composés terpéniques 8

11.2.2. Composés aromatiques 9

11.2.3. Composés d'origines diverses 9

11.3. Biosynthèse des constituants des HE 9

11.4. Notion de chémotype 13

11.5. Procédés d'extraction des HE 13

11.5.1 Méthodes classiques 13

11.5.2 Méthodes innovantes 15

11.6. Méthode d'analyse des HE 17

11.6.1. Chromatographie sur Couche Mince (CCM) 17

11.6.2. Chromatographie en Phase gazeuse (CPG) 17

11.6.3. Couplage CPG-SM 18

11.6.4. Résonance Magnétique Nucléaire du 13C (RMN13C) 18

11.7. Activités antioxydantes des HE 20

Chapitre 11 : 22

Matériel et méthodes 22

1. MATERIEL 23

1.1. Matériel végétal 23

1.2. Matériel technique 23

1.3. Matériel chimique 24

li.METHODES D'ETUDE 24

11.1. Extraction de l'HE 24

11.2. Méthodes d'analyse des HE 25

11.2.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) 25

11.2.2. Dépistage de l'activité antioxydante des HE par CCM 26

11.2.3. Evaluation de l'activité antioxydante des HE par

spectrophotométrie 26

11.2.4. Analyse des HE par CPG 27

11.2.5. Analyse des HE par CPG-SM 28

11.2.6. Analyse des HE par RMN 29

Chapitre Ill: 31

Résultats et discussion 31

1. Rendements en HE 32

2. Différents profils chromatographiques CCM 33

ii

3. Illustration de .la méthode d'analyse par RMN 13C, CPG(lr) et CPG-SM : HE des

TFF de Origanum syricum 34

3.1. Identification par RMN 13C 36

3.2. Identification par CPG(lr) et CPG/SM 38

4. Effet du temps de séchage sur la composition chimique de l'HE de Origanum

syriacum 40

5. Evaluation de l'activité antioxydante des HE .45

5.1. Evaluation qualitative par CCM .45

5.2. Evaluation quantitative par spectrophotométrie .46

CONCLUSION ET PERSPETIVES 50

Références bibliographiques 51

Résumé : 60

Abstract. 61

iii

DEDICACES

A DIEU TOUT PUISSANT,

Maitre omniscient, pour m'avoir permis de mener à bien ce travail.

A ma famille ;

A mon père Mr KOUADIO Kouamé J'ai appris auprès de toi la patience et l'endurance dans le travail.

Ce travail est le tien. Que DIEU te garde plus longtemps auprès De nous.

A ma mère KOUAME Aya Suzanne Tu n'as ménagé aucun effort pour que j'arrive à ce niveau.

Tes prières m'ont sans cesse accompagnée. Maman merci pour ton dévouement et tes sages

Conseils à mon endroit. Reçois l'assurance de mon affection.

iv

REMERCIEMENTS

Tout d'abord je tiens à présenter mes sincères remerciements à ma directrice

scientifique, Mme MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épouse BEKRO,

Professeur Titulaire, Directrice du Pôle Pharmacopée Africaine et Substances

Naturelles, Responsable du Master de Chimie et Physico-chimie des Substances

Naturelles, pour avoir encadré ce mémoire. Recevez à travers ce mémoire ma

respectueuse gratitude pour votre simplicité, grande disponibilité et vos directives

qui m'ont permis de réaliser ce travail.

Mes remerciements vont également à l'endroit du Dr. OUATTARA Zana

Adama, qu'il trouve ici l'expression de ma profonde reconnaissance tant pour son

dévouement exemplaire et son encadrement sans faille que pour ses conseils

avisés et avis judicieux durant la réalisation de ce mémoire.

A M. BEKRO Yves-Alain, Professeur Titulaire, Directeur du Laboratoire de

Chimie Bio-Organique et Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Université Nangui

Abrogoua (UNA). Je vous remercie infiniment pour m'avoir accepté dans votre

laboratoire et pour vos riches enseignements dont j'ai bénéficié au cours de mon

cursus universitaire. Nous avons admiré vos immenses qualités humaines et

pédagogiques ainsi que l'intérêt particulier que vous portez à vos étudiants.

A M. TOMI Félix, Professeur Titulaire à l'Université de Corse pour nous avoir

permis de faire nos analyses dans son laboratoire.

A tous les autres enseignants du LCBOSN pour leur disponibilité, leur

sollicitude et leurs précieux conseils. A tous les doctorants du laboratoire et d'ailleurs particulièrement à GUESSAN

Bi Goblé Landry pour leurs soutiens et leurs entières disponibilités, qu'ils trouvent

ici l'expression de ma profonde gratitude.

A tous les étudiants de Master 2 (Option Chimie et Physico-Chimie de

Substances Naturelles) de l'année académique 2015-2016 pour l'esprit de

solidarité qui a prévalu durant toute l'année, je vous remercie pour tout.

A mon beau-frère Pasteur KANGA Kouakou Daniel et son épouse KOUAME Affoué Rosine, veuillez trouver l'expression de mon profond respect et mes

sincères remerciements pour tout ce que vous avez fait, faites et ferez pour moi.

V

A tous mes frères et sœurs, merci à vous pour vos soutiens et différentes prières.

Que nos liens de sang fassent de nous de véritables complices de la vie.

A tous les autres membres de la Famille, qui de loin ou de près et qui d'une

manière ou d'une autre m'ont soutenu. Soyez rassurés de toute mon affection et

reconnaissance.

vi

LISTE DES FIGURES

Figure 1 :Tiges feuillues de Origanum syriacum [27) .4

Figure 2: Quelques composés majoritaires des espèces du genre Origanum 7

Figure 3: principales voies de biosynthèse des composés volatils naturels 10

Figure 4: Mécanisme de biosynthèse de l'isoprénoïde: voie du mévalonate 11

Figure 5 Bibliothèque de spectres 19

Figure 6 : Tiges feuillues fraîches (A) et sèchées (B) de Origanum syriacum (photo prise par

Kouamé Christelle, 2016) 23

Figure 7: Montage d'hydrodistillation de type Clévenger (photo prise par Goblé Landry, 2013) 25

Figure 8 : Chromatographe en phase gazeuse ( Perkin-Elmer type Clarus 500) (photo prise par

Ouattara A. Zana, 2016) 28

Figure 9: chromatographe Perkin Elmer autosystem XL (photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)

.......................................................................................................................................................................... 29

Figure 10: chromatographe Perkin Elmer autosystem XL(photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)

.......................................................................................................................................................................... 30

Figure 11 : rendement des HE extraites à partir des tiges feuillues fraîches 32

Figure 12: Profils chromatographiques d'HE des tiges feuillues d'Origanium syrianum révélées à

l'UV/254 nm (A) et à la vanilline sulfurique dans le visible (8) 33

Figure 13 : Molécules majoritaires de l'HE des TFF de Origanum syricum 36

Figure 14 Spectre RMN 13C de l'échantillon TFF 37

Figure 15 : Signaux RMN 13C de référence et expérimentaux (en gras) du carvacrol 38

Figure 16: Chromatogramme (sur colonne apolaire) de l'HE de TFF de Origanum syriacum 39

Figure 17 : Spectre de masse en mode impact électronique du carvacrol 39

Figure 18 : différentes fragmentations de la molécule de caracrol 40

Figure 19 : Schéma réactionnel de la conversion du DPPH• ( oxydant) en DPPH-H (réducteur) .45

Figure 20 : Chromatogramme des HE révélées au DPPH• 46

Figure 21 : l'lnhibition du DPPH• en fonction de la concentration des HE et de la vitamine C .47

Figure 22 : Courbes de l'activité anti-oxydante des HE en fonction du pourcentage d'inhibition du

DPPH• par rapport à la vitamine C 48

Figure 23 : CEso des HE et de la vitamine C 49

vii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Résultats de la détection des HE extraites par CCM 34

Tableau 2: Composition chimique de l'HE des tiges feuillues fraîches 35

Tableau 3 : Composition chimique des HE de Origanum syriacum en fonction du

temps de séchage 41

Tableau 4 : Composition chimique des HE de Origanium syriacum récolté dans

différents pays 43

viii

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

AFNOR: Association Française de Normalisation

ASE: Accelerated Solvant Extraction

ATP: Adénosine Triphosphate CCM: Chromatographie sur Couche Mince

CDCb : cloroforme deuteré

CPG: Chromatographie en Phase Gazeuse

DMAPP: Diméthylallyldiphosphate

DPPH: 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle

FID : Free Induction Decay

FPP: Farnésyldiphosphate GGPP: Géranyl-géranyldiphosphate

GPP: Géranyldiphosphate HE: Huile Essentielle

IPP: lsopentenyldiphosphate

Ir: Indices de Rétention

ISO: International Organization for Standardization

MS: Spectrométrie de Masse

ND : non identifié NADPH: Nicotinamide Adénine Dinucléotide phosphate

NF: Norme Française

Rf: Rapport Frontal

RMN: Résonance magnétique nucléaire

TFF: Tiges feuillues fraiches TFS: Tiges feuillues séchées VIT C : vitamine C

ix

INTRODUCTION

Un grand nombre de plantes aromatiques possède des propriétés

biologiques très intéressantes qui trouvent leur application dans divers domaines.

En effet depuis des milliers d'années, elles servent fidèlement l'homme en

améliorant non seulement sa nourriture et sa beauté, mais occupent aussi une

place digne comme agents thérapeutiques [1]. Mais, afin d'utiliser correctement et

de manière compétente les plantes aromatiques, il est nécessaire de connaître

leurs propriétés, lesquelles dépendent de la présence de substances biologiques

très variées selon leur composition. Ainsi, l'étude de la composition chimique des

plantes demeure une tâche très importante. Par ailleurs, pour les plantes

aromatiques, l'huile essentielle (HE) représente un réservoir de ces composés

bioactifs. C'est pourquoi, l'objectif principal de notre travail est l'étude de l'HE issue

de Origanum syriacum L. acclimatée en Côte d' Ivoire. O. syriacum est une plante

aromatique, originaire du Moyen-Orient, dont l'HE a été beaucoup étudiée [2-19].

Cependant, il n'existe pas d'informations concernant l'HE de O. syriacum cultivée

dans les pays d'Afrique de l'Ouest. C'est à cet effet que nous avons décidé

d'étudier la composition chimique de l'HE de O. syriacum acclimaté en Côte

d'Ivoire et la comparer à celles publiées. Ainsi, nous avons :

- extrait les HE de O. syriacum à partir des tiges feuillues fraîches et

séchées par l'hydrodistillation à l'aide d'un extracteur de type Clévenger; - analysé la composition chimique des HE extraites par CPG (Ir), CPG-SM et

RMN 13C · ,

évalué l'activité antioxydante par spectrophotométrie au moyen du DPPH• ;

- comparé la composition chimique et le pouvoir antioxydant des HE en

fonction du temps de séchage ; - comparé les résultats que nous avons obtenus avec ceux précédemment

publiés sur les HE d'origine méditerranéenne.

1

Chapitre 1 :

Revue bibliographique

1

2

1

1. ORIGANUM SYRIACUM

Les Lamiacées sont une famille de plantes dicotylédones répandues dans le

monde entier. Ils sont pour la plupart des herbes ou des arbustes et comptent

environ 236 genres, lesquels contiennent entre 6 900 et 7 200 espèces [20]; mais

la banque de donnée en compte 7 534 espèces [21]. Le genre Origanum L. comprend 3 groupes, 10 sections, 38 espèces, 6 sous

espèces, 3 variétés et 16 hybrides, caractérisé par une diversité morphologique et

chimique importante [22, 23]. Ce genre est largement présent dans les îles

Canaries et les Açores, dans l'Europe du Nord et jusqu'à l'Est de l'Asie. Mais la

région méditerranéenne représente son aire de distribution la plus importante.

Environ 75% se trouvent dans l'Est méditerranéen et seulement quelques espèces

se produisent dans la partie occidentale de la Méditerranée [24]. Il contient des

plantes aromatiques et médicinales. Le nom origanum vient de 2 mots grecs, "oros"

qui veut dire montagne et "ganos" qui signifie éclat ; donc il signifierait "ornement

des montagnes" [25]. L'espèce Origanum Syriacum est très aromatique et est connu sous le nom

za'atar dans des pays du Maghreb et au Moyen-Orient. Son synonyme est

Majorana syriece [13].

1.1. Description de la plante Origanum syriacum L. (Lamiaceae) est une plante pérenne, atteignant une

hauteur de 0,8 à 1 m, sous-frutescente à la base, à tiges et rameaux dressés,

couverts de poils étalés. Ses feuilles sont pétiolées, souvent garnis de poils très

denses. Le limbe est ové (1-3 cm) ordinairement obtus, parfois subaigu, à marge

entière, ou, rarement, ondulée, pubescente, plus ou moins grisâtre, à nervures très

marquées. La floraison s'observe de juin à décembre suivant les régions. Les épis des

fleurs sont fasciculés avec les ramures axillaires au sommet et les tiges sont

portées par des pédoncules de longueur variable, ovés à cylindriques, dépassant

rarement 1 cm. Les bractées sont distiques, obtuses, fortement imbriquées,

occluant les calices. Le calice (1,5-2mm) est vert, pubescent, profondément

échancré à l'extérieur et à tube tenu [26].

3

Figure 1 :Tiges feuillues de Origanum syriacum [27]

1.2. Position systématique Embranchement :

Sous-embranchement :

Classe:

Sous-classe :

Série:

Super ordre :

Ordre:

Famille:

Sous-famille :

Genre:

Espèce:

Spermaphytes

Angiospermes

Dicotylédones

Gamopétales

Superovariées tétracycliques

Tubiflorales

Lamiales

Lamiaceae

Népétoïdées

Origanum

syriacum

1.3.Usages Origanum syriacum est employée dans le traitement de multiples troubles :

respiratoires (la toux, le rhume, la bronchite, l'asthme, l'angine), gastro-intestinal

(épigastralgie, météorisme), urinaire (infection urinaire) et cardiaque. Aussi, est

elle utilisée pour remédier aux dysménorrhées, céphalées, arthrite rhumatoïde.

Origanum syriacum possède des propriétés antiparasitaire, antiallergique. En

application locale, elle traite certaines affections de peau telles que les dermites 4

séborrhéiques, acnés, intertrigo, verrue, psoriasis, varice ; mais aussi les rages

dentaires et les douleurs musculaires. Dans le domaine culinaire Origanum

syriacum est utilisé comme épice et agent de conservation [28]

1.4. Travaux antérieurs réalisés sur le genre Origanum Le genre Origanum a fait l'objet de nombreuses études chimiques, les

principaux travaux réalisés sur les HE obtenues à partir des principales espèces

rapportent que : - le p-cymène (82,8%), le y-terpinène (6,2%), le p-cymène-8-ol (1,5%) et le

carvacrol (1,2%). sont les composés majoritaires de l'HE d'Origanum saccatum L.

[2] ; - les constituants majoritaires des HE des feuilles de cinq espèces du genre

Origanum de Turquie: O. vu/gare subsp. Hirtum, O. syriacum var. bevanii, O.

majorana, O. minutiflorum et O. onites sont le carvacrol (23,4-80,4%), le thymol

(0,01-39,8%) et le linalol (90,0-91,9%) [3] ; - les composés importants des HE d'Origanum glandu/osum récolté dans le

Nord-Est de Algérie sont le thymol (34,2% et 51, 1 %), le p-cymène (6,6% et 7,5%)

et le y-terpinène (13,4% et 14,5%) [4]; - le fractionnement chromatographique de l'HE d'Origanum d'Espagne a

permis d'identifier 25 monoterpènes, 9 sesquiterpènes, 5 composés aliphatiques, 2

composés phénoliques [5]. En ce qui concerne l'espèce Origanum syriacum sauvage et cultivé dans les

pays du nord d'Afrique et du Proche Orient, elle a été bien étudiée. Les auteurs de

nombreuses études ont rapporté sur les HE extraites de ses feuilles les

informations suivantes:

• La composition chimique de 117 échantillons appartenant à 11 différentes

régions de la Syrie a été étudiée par CPG-MS. La composition était dominée par le

carvacrol et / ou le thymol [6]. Aussi, la thymoquinone, un candidat anticancéreux

prometteur, à été identifié dans les différents échantillons avec les pourcentages

entre 0,04 et 23,7% [7]. • Des travaux successifs de plusieurs équipes de chercheurs ont mis en

évidence une variabilité de la composition chimique des HE en fonction des 5

saisons. Selon ces résultats, la teneur en HE et en monoterpènes phénoliques

diminue pendant la période de floraison tandis que sous de longues photopériodes,

cette teneur augmente, alors que celle du p-cymène diminue [8 - 10].

• L'analyse par CPG et CPG-MS de l'HE des feuilles cultivées en Turquie a

montré que sa composition chimique était dominée par les monoterpènes à

49,02%, monoterpènes oxygénés (36,60%) et sesquiterpènes (12,59%). Les

principaux composants étaient le y-terpinène, le carvacrol, le p-cymène et le 11-

caryophyllène. De plus, les tests de l'activité antioxydante réalisés ont montré que

l'HE de Origanum syriacum comporte des substances antioxydantes [11, 12]

• Les chercheurs du Liban ont montré que les HE des feuilles cultivées sont

riches en carvacrol tandis que celles des feuilles sauvages sont dominées par le

thymol [13]. • l'HE de feuilles récolté au Liban contient 36 composés et sa composition

chimique est dominée par le thymol (24. 7%) et le carvacrol ( 17 .6% ). Aussi, cette

HE a-t-elle manifesté une bonne activité antioxydante [14].

• De nombreux travaux ont été consacrés à l'étude des propriétés

pharmacologiques de l'HE de feuilles de Origanum syriacum. Il en ressort que,

l'extrait des feuilles induit un effet cytotoxique en réduisant la viabilité des cellules

leucémiques [15]. En plus, elle manifeste les activités antimicrobienne [16],

antioxydante [17], antifongique [18] et antiprotozoaire [19].

6

.OH OH

Carvacrol Linalol y-terpinène

OH

Thymol p-cymène 0

thymoquinone

Figure 2: Quelques composés majoritaires des espèces du genre Origanum

li.GENERALITES SUR L'HE

11.1. Définition

Il existe plusieurs définitions de l'HE en fonction de son aspect étudié,

lesquelles sont définies par des botanistes, des physico-chimistes, des industriels,

des parfumeurs ou des pharmacologues [29]. Bruneton a défini l'HE comme «des produits de composition généralement

assez complexe renfermant des principes volatils contenus dans les végétaux et

plus ou moins modifiés au cours de la préparation » [30]. Selon la norme française AFNOR NF T75-006 et ISO, l'HE est un : «produit

obtenu à partir d'une matière première d'origine végétale, après séparation de la

phase aqueuse par des procédés physiques : soit par entraînement à la vapeur

7

d'eau, soit par des procédés mécaniques à partir de l'épicarpe des Citrus, soit par

distillation sèche» [31 ]. Pour Belaiche [32], les HE sont des substances de consistance huileuse

mais sans corps gras, de densité très souvent inférieure à celle de l'eau, plus ou

moins fluides, voire résinoïdes, très odorantes, volatiles, souvent colorées, extraites

à partir d'une matière première végétale botaniquement définie, par des méthodes

de distillation, par enfleurage, par expression, par solvant ou par d'autres

méthodes. Les HE sont constitués des métabolites secondaires produits et utilisés par

les plantes aromatiques pour interagir avec leur environnement. En effet, elles

permettent d'éloigner les maladies, les parasites, mais aussi jouent un rôle

protecteur face aux rayonnements du soleil [33]. Ces substances sont largement

reparties dans le règne végétal, et certaines familles (lamiaceae, rutacées,

myrtacées) en sont très riches [34]. Les HE jouent un rôle important dans la reproduction et la dispersion des

espèces végétales puisqu'elles permettent d'attirer les insectes pollinisateurs [35].

Elles sont stockées dans tous les organes végétaux: fleurs, feuilles, écorces, bois,

racines, rhizomes, fruits ou graines. Elles peuvent être présentes à la fois dans

différents organes, et leur composition peut variée d'un organe à l'autre [28].

11.2. Composition chimique des HE Les HE sont des mélanges complexes et variés, constitués de composés

organiques de structures et de fonction chimique très diverses. Généralement, on

classe ces composés en deux groupes :

~ Les. terpénoïdes ou composés terpéniques, ce sont des molécules

composées d'un nombre variable d'unités d'isoprène [36]; ~ Les composés aromatiques dérivés du phénylpropane [36].

11.2.1. Composés terpéniques Ce sont des hydrocarbonés naturels de structure soit cyclique soit à chaîne

ouverte, formés d'un multiple pair ou impair d'unités de 2-méthylbuta-1,3-diène

(molécule de base) encore appelé l'isoprène (CsHs). La formule brute de ces

hydrocarbures terpéniques est (CsHx)n dont le x est variable en fonction du degré

8

d'insaturation de la molécule et n le nombre d'unités isopréniques allant de 1 à 8

sauf dans les polyterpènes ou n peut atteindre plus de 100 (le caoutchouc) [37].

Seuls les terpènes dont la masse moléculaire est relativement faible (mono - et

sesquiterpènes) sont rencontrés dans les HE leur conférant un caractère volatil et

aromatique [38,39].

11.2.2. Composés aromatiques Ils sont dérivés du phénylpropane (C6-C3), c'est pourquoi leur biogenèse est

totalement différente des terpènes [40]. Ils sont beaucoup moins fréquents dans

l'HE que les terpènes. Les composés en C6-C1 comme la vanilline ou l'anthranilate

de méthyle sont assez fréquents dans les HE. Les coumarines, lactones dérivées

des acides cinnamiques sont également présentes dans certaines HE [30].

11.2.3. Composés d'origines diverses Ce sont des produits résultant de la transformation de molécules non volatiles

entraînables par la vapeur d'eau. Il s'agit de composés issus de la dégradation

d'acides gras, de terpènes. D'autres composés azotés ou soufrés peuvent

subsister mais sont rares. Certaines plantes aromatiques produisent des HE dont

les composés terpéniques renferment l'élément azote. Parmi ces composés on cite

l'indole, qui se trouve dans HE de citron et des fleurs de jasmin [30].

11.3. Biosynthèse des constituants des HE La synthèse et l'accumulation des HE sont généralement associées à la

présence de structures histologiques spécialisées, souvent localisées à la surface

de la plante. Ce sont des poils sécréteurs dans le cas des Lamiaceae.

Plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer l'origine des HE dans la

plante. Actuellement, il est admis que deux voies métaboliques secondaires

conduisent à la formation des principaux constituants des HE (Figure 3). - la voie de l'acide mévalonique qui conduit aux terpènes (Figure 4); - la voie de l'acide shikimique, précurseurs des composés aromatiques [40].

9

COOH

0

OH

0 Acide pyruvique

OH acide shikimique

lCOOH

Acétyl CoA

HOOC

Acide mévalonique

l -monoterpènes (CI o) -sesquiterpènes (C15)

-diterpènes (C2o) -caroténoides (C40)

OH / X

ArC1

(Vanilline) (Acétophénone) (Anétho_le, Coumarine)

-ionones -damascénones

Figure 3: principales voies de biosynthèse des composés volatils naturels

Selon la règle isoprénique biogénétique, chaque groupe de terpènes est issu

de la condensation « tête à queue » d'un nombre variable d'unités isopréniques,

dont la formation se produit par la condensation de Claisen de trois acétyl-CoA

conduisant au 3-hydroxy-3-méthylglutarylCoA qui est ensuite réduit en mévalonate

[41]. La pyrophosphorylation du mévalonate par l'ATP est suivie d'une

décarboxylation et de la déshydratation conduisant à la formation du

pyrophosphate d'isopentényl (IPP), lequel par simple transfert de proton conduit au

pyrophosphate de diméthylallyle (DMAPP) (Figure 4):

10

2

NADPH

3

H3><H HOA __ .Joo9

SCoA

4

NADPH

2ATP 2ADP

\,__) . 5

Mevalonate

ATP ADP

"" /. H,~P

PPO) OÂ~ 0 6

Figure 4 : Mécanisme de biosynthèse de l'isoprénoïde: voie du mévalonate

Les deux intermédiaires en C5 réagissent alors l'un sur l'autre, pour conduire

au pyrophosphate de géranyle (GPP), point de départ de tous les monoterpènes et

monoterpénoïdes :

p

~~~~

H

0- p

Pyrophosphate de gérariyte

/ Monoterpènes / Terpènoïdes

11

La condensation suivant le même principe, entre l'IPP et le GPP conduit au

FPP, point de départ de tous les dérivées sesquiterpéniquess:

Ç\_p + ç • Gérany lpyrophosphate / F arnésylpyrophosphate

Sesquiterpènes/ Terpènoïdes

Par condensation d'un FPP avec un IPP, est obtenu le géranyl-géranyl

pyrophosphate (GGPP) point de départ de tous les diterpènes/ terpénoïdes:

+~ 0-P

F arnésylpyrophosphate

•

?,anylpy,ophosphate

Diterpènes / Terpénoïdes

Par contre la formation des tri et tétraterpènes / terpénoïdes s'obtient par

dimérisation réductrice à l'aide de NADPH de deux unités de FPP ou GGPP :

Farn.ésylpyrophosphate

+ P-0

Farnésylpyrophosphate

Triterpèn.es / Terpén.oïdes

SQUALENE 12

11.4. Notion de chémotype

Cette notion désigne une entité chimique distincte au sein d'une même

espèce, ayant la capacité différente de former certains produits chimiques

(métabolites), dont l'apparence est presque indiscernable. Les HE tiennent une

place prépondérante dans ce phénomène.

Ces variations chimiques des métabolites secondaires se produisent en

fonction des influences de leurs écosystèmes (altitude, humidité, ensoleillement,

biotope, etc.) sans transformation substantiellement de leur morphologie et leur

génétique, seul leur phénotype est mouvant. Il est important de noter que des HE à

chémotypes différents, présenteront non seulement des activités différentes mais

aussi des toxicités très variables. Les différents chémotypes sont identifiables par

CPG [42].

11.5. Procédés d'extraction des HE Les HE sont généralement présentes à de très faibles concentrations dans

les plantes à parfum. Avant de pouvoir utiliser ou analyser de telles substances, il

est nécessaire de les extraire de leur matrice. Pour se faire, plusieurs méthodes

d'extraction tels que l'hydrodistillation, l'entraînement à la vapeur, l'hydrodiffusion et

autres ont été mises au point [43].

11.5.1 Méthodes classiques

• Hydrodistillation L'hydrodistillation est un procédé au cours duquel, le matériel végétal est mis

en contact direct avec l'eau bouillante dans une enceinte. Le chauffage permet

l'éclatement des cellules et la libération des molécules volatiles contenues dans la

matière végétale. Les vapeurs hétérogènes sont condensées sur une surface froide

et l'HE se sépare par différence de densité [30, 44].

•Entrainement à la vapeur C'est la méthode la mieux adaptée à l'extraction des composés volatiles des

plantes aromatiques médicinales [45]. Le matériel végétal, dans ce cas, n'est pas

13

en contact avec l'eau. L'eau est bouillie dans un récipient situé en dessous, et à

une certaine distance, du matériel végétal supporté par une grille ou une plaque

perforée. A son passage, la vapeur d'eau saturante entraîne l'HE des plantes vers

un système de refroidissement. La vapeur d'eau saturée en composés volatils se

condense en un mélange hétérogène composé d'HE et d'hydrolat [46,30].

L'hydrolat est la phase aqueuse recueillie contenant des traces de composés

aromatiques, il est aussi appelé l'eau florale.

1

•Hydrodiffusion ou percolation

L'hydrodiffusion est une variante de l'entraînement à la vapeur. Dans ce cas,

le flux de vapeur n'est pas ascendant mais descendant. En effet, le végétal est

disposé dans un parallélépipède métallique grillagé. On soumet donc le végétal à

une pulsion de vapeur d'eau, saturée et humide, mais jamais surchauffée, de haut

en bas. Cette technique exploite ainsi l'action osmotique de la vapeur d'eau. Le

principe de cette méthode réside dans l'utilisation de la pesanteur pour dégager et

condenser le mélange dispersé dans la matière végétale [47]. Les substances

obtenues sont chargées en composants non volatils, on parle alors dans ce cas

d'essences de percolation et non d'HE.

•Expression à froid L'expression à froid est le procédé au cours duquel des tissus végétaux très

riches en HE sont compressés pour en extraire l'essence. Cette méthode

d'extraction est utilisée uniquement pour les zestes d'agrumes. Elle peut se faire à

la main ou après scarifications mécaniques [48, 30].

• Extraction par solvants organiques L'extraction se fait à l'aide de solvants organiques volatils dans des appareils

appelés extracteurs de Soxhlet. La mise en œuvre de cette technique est

indispensable lorsque les composés ne sont pas extractibles par distillation en

raison de leur faible volatilité ou pour les organes végétaux présentant une

concentration en huile essentielle relativement faible. Le principe repose sur le

pouvoir qu'ont certains solvants organiques à dissoudre les composants des HE.

14

Au cours de ce procédé, les végétaux sont épuisés successivement dans un

solvant volatil qui après évaporation donne une pâte très aromatique, la concrète.

La concrète est ensuite diluée dans de l'alcool éthylique puis cette solution est

filtrée et concentrée par distillation sous pression réduite afin d'éliminer l'alcool et

laisser place à l'absolut [49].

11.5.2 Méthodes innovantes Les composés volatils sont connus comme étant thermosensibles et

vulnérables aux réactions chimiques. La perte de certains constituants, la

dégradation de certains composés insaturés par effet thermique ou par hydrolyse,

ainsi que la présence de résidus de solvants organiques plus ou moins toxiques

peuvent être engendrés par certaines techniques d'extraction. Ces désavantages

ont stimulés la mise au point de nouvelles techniques d'extraction des HE plus

écologiques utilisant des solvants moins toxiques et en moins grande quantité en

vue d'optimiser la qualité des HE et d'améliorer leur rendement [50].

1 1 1 1 1 1 1

•Extraction assistée par micro-onde Le principe du procédé d'extraction par micro-onde consiste à extraire

l'essence aromatique à l'aide d'un rayonnement micro-onde d'énergie constante et

d'une séquence de mise sous vide. Sous l'effet conjugué du chauffage sélectif des

micro-ondes et de la pression réduite de façon séquentielle dans l'enceinte de

l'extraction, de l'eau présente dans la plante provoque l'éclatement des glandes

oléifères. Le contenu des cellules est donc plus aisément transféré vers l'extérieur

du tissu biologique, et l'essence est entraînée dans le mélange azéotropique formé

avec la vapeur d'eau propre à la plante traitée. Un essencier de type Clévenger

permet de condenser le distillat et de récupérer l'huile essentielle par simple

décantation en tenant compte la différence de densité. Ce procédé présente les

avantages suivants: rapidité, économie de temps, économie d'énergie, économie

d'eau, extrait sans solvant résiduel, etc. [51, 52]

15

•Extraction assisté par ultrason

La propagation des ondes sonores dans les cellules de la plante soumis aux

ultrasons induit en alternance des cycles de haute pression (compression) et des

cycles de basse pression (à basse pression). Les séries de ces cycles de

compressions et de raréfactions créent une pression acoustique responsable des

microcavitations. Le rendement et la vitesse d'extraction sont les principaux

avantages de cette méthode [53].

•Extraction par fluides supercritique Il s'agit du procédé le plus récent d'extraction à froid des matières premières

végétales. C'est. une méthode où on utilise comme solvant d'extraction un fluide

porté à l'état supercritique par un contrôle adéquat de la température et de la

pression. Les qualités dissolvantes des fluides supercritiques sont plus ou moins

sélectives selon la température, la pression et la nature des solutés. Le fluide le

plus fréquemment utilisé est le dioxyde de carbone. Car, bien qu'il fasse parfois

appelle à des co-solvants pour améliorer sa capacité à solubiliser les molécules

polaires, le C02 possède plusieurs atouts: paramètres critiques (P = 73,8 bars, T =

31, 1 °c), produit naturel, inerte chimiquement, ininflammable, atoxique, facile à

éliminer totalement, aisément disponible, prix modeste et sélectif [54].

•Extraction par eau sub-critique Ce procédé utilise les propriétés de l'eau, qui dans sa phase subcritique voit

ses propriétés de solvant modifiées et peut solubiliser des composés faiblement

polaires. Le procédé d'extraction en eau subcritique permet de travailler

directement sur la matière première humide sans étape de séchage et de proposer

une technique d'extraction sans utilisation de solvant chimique [55].

•Extraction par solvant accéléré (ASE) L'extraction par solvant accéléré connue sous le nom d'ASE (Accelerated

Solvant Extraction) utilise l'effet combiné d'une température élevée et de la

pression avec des solvants classiques pour augmenter l'efficacité du processus

16

d'extraction. li en résulte des temps d'extraction plus rapides et une réduction

significative de l'utilisation de solvants [56].

11.6. Méthode d'analyse des HE

11.6.1. Chromatographie sur Couche Mince (CCM) La CCM est une technique de chromatographie planaire. Elle est

couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse ou de

purification. La CCM repose principalement sur des phénomènes d'adsorption: la

phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long

d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille de matière

plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase

stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de

celle du solvant [57]. Après la migration, le repérage des molécules s'effectue soit

par ultra-violet (UV), soit par un révélateur spécifique ou encore par exposition aux

vapeurs d'iode. La distance de migration des composés est ensuite mesurée et

comparée à celle du front de la phase mobile, ceci permet de définir le rapport

frontal (Rf) caractéristique de chaque composé.

Rf = distance parcourue par un produit distance parcourue par le solvant

11.6.2. Chromatographie en Phase gazeuse (CPG) La CPG est la technique la mieux adaptée à l'analyse des HE. C'est une

technique de séparation limitée aux composés thermostables et suffisamment

volatils. Elle permet à la fois une analyse qualitative et quantitative. C'est une

méthode basée sur la séparation de composés à l'état gazeux suivant leur

coefficient de partage entre une phase stationnaire liquide imprégnée sur un

support solide inerte (colonne de chromatographie) et parcouru par une phase

mobile gazeuse (le gaz vecteur) [58]. Le mélange de constituants est introduit en tête de colonne où il est vaporisé

au niveau de l'injecteur. Les différents constituants sont élués à travers la colonne à une vitesse qui dépend de la vitesse linéaire du gaz vecteur, de leur solubilité dans

la phase stationnaire et de leur volatilité [59].Les substances séparées, toujours

sous forme gazeuse, quittent la colonne et traversent l'une après l'autre un

17

détecteur qui signale la proportion de chaque substance sur un enregistreur

intégrateur. L'enregistreur signale une succession de pics, caractérisés chacun par

un temps de rétention et une aire.

Les chromatographies sont généralement effectuées parallèlement sur deux

types de colonne, différents par la nature de leur phase stationnaire. Les colonnes

dites "polaires" sont caractérisées par des phases stationnaires de type

polyéthylèneglycol; Les colonnes dites "apolaires se distinguent par des phases de

type "méthylsilicone".

11.6.3. Couplage CPG-SM La technique de couplage CPG-MS est une technique d'analyse de référence

des HE. Elle permet de confirmer l'identification des composés préalablement

analysés par CPG car La mesure des temps de rétention ne constitue pas une

preuve formelle de la nature des composés. Le principe de cette méthode consiste

à transférer par le gaz vecteur (phase mobile) les composés séparés par

chromatographie en phase gazeuse dans le spectromètre de masse. A ce niveau,

ils vont être fragmentés en ions de masse variables dont la séparation sera en

fonction de leur masse. La comparaison informatique du spectre d'un pic inconnu

avec une ou plusieurs librairies de référence permet son identification à condition

que la similitude des spectres, inconnus et référence, soit suffisante et que les

indices de rétention soient identiques, dans des conditions opératoires

comparables [30,60]

11.6.4. Résonance Magnétique Nucléaire du 13C (RMN13C) Le principe de RMN consiste à observer dans le spectre du mélange les

raies de résonnance appartenant à un composé donné (dont on connaît la série de

déplacement chimique) et ce faisant de l'identifier. L'objectif est donc d'éviter, ou du

moins de réduire, les étapes longues et fastidieuses de purification des

constituants. L'originalité de cette méthode réside dans l'informatisation de la recherche,

grâce à un logiciel d'aide à l'identification développé au laboratoire de Chimie

Biomasse de l'Université de Corse. Celui-ci assure la comparaison des

déplacements chimiques de chacun des carbones du mélange avec ceux des

18

composés de références répertoriés dans des bibliothèques de spectres (Figure

5). L'enregistrement des spectres des composés de références et des mélanges

est réalisé dans des conditions expérimentales identiques (nature du solvant,

concentration, paramètres d'enregistrement des spectres) [61-64].

Afin d'identifier les constituants d'un mélange, il est indispensable de prendre

en compte trois paramètres directement accessibles par le logiciel:

- le nombre de pics observés par rapport au nombre de pics attendus pour

chaque molécule ;

- le nombre de superpositions pouvant se produire lorsque les différents

effets électroniques et/ou stériques font que deux carbones appartenant à deux

molécules différentes ont fortuitement le même déplacement chimique, ou lorsque

les molécules présentes ont une partie de leur squelette et de leur

fonctionnalisation très proche ;

- les variations des déplacements chimiques (66) des carbones dans le

spectre du mélange par rapport aux valeurs de référence.

SPECTRE DU 1\IÉLA:'liGE COMPLEXE BIBLIOTIIÈQUES DE SPECTRES

l ! , ... ' . '

170 80

----

-- ombre de carbones observés

ombre de superpositions

Variation des déplacements chimiques

IDE!'liTIFICATIO~

Figure 5 Bibliothèque de spectres

19

L'identification des composants individuels est basée sur :

i) la comparaison de leurs indices de rétention (Ir) de CPG sur colonnes

polaire et apolaire, déterminés par rapport aux temps de rétention d'une

série de n-alcanes avec interpolation linéaire, avec ceux des composés

de référence

ii) par la concordance spectrale avec les spectres de masses contenus

dans les bibliothèques du laboratoire et les bibliothèques de spectres

commerciales [65, 66]. iii) Sur la comparaison des signaux dans les spectres RMN 13c des HE avec

ceux des spectres de référence compilés dans la bibliothèque spectrale

de laboratoire avec l'aide d'un logiciel développé au laboratoire « Chimie

biomasse ».

Il. 7. Activités antioxydantes des HE Le stress oxydant est communément défini comme un déséquilibre entre les

systèmes oxydants et les capacités antioxydantes d'une cellule, d'un compartiment

cellulaire ou d'un organisme [67], il se produit dans la cellule quand la

concentration des espèces réactives excède les capacités antioxydantes de cette

cellule [68]. Ce stress oxydant est en relation avec l'apparition d'affections telles

que la maladie d'alzheimer [69], l'artériosclérose le vieillissement prématuré de la

peau [70] et le cancer [71]. Une façon de prévenir ce stress oxydatif qui

endommage et détruit les cellules est de rechercher, dans l'alimentation, un apport

supplémentaire de composés antioxydants (vitamine C, a-tocophérol, etc.) [72]. Un antioxydant, est toute molécule endogène ou exogène présente en faible

concentration qui est capable de prévenir, de retarder et de réduire l'ampleur de la

destruction oxydante des biomolécules. Ainsi, les récents et multiples travaux

portés sur les propriétés antioxydantes des HE ont révélés que celles-ci exercent

une excellente activité antioxydante dans les systèmes du DPPH• et de 11-

carotène/acide linoléique et que certaines HE tel que de Thymus vulgaris a un

pouvoir antioxydant élevé en comparaison à des antioxydants synthétiques [73].

D'autre part, l'activité antioxydante très élevée de certains constituants des HE est

non seulement en relation avec leur structure phénolique, mais également 20

attribuable à certains alcools, éthers, cétones et aldéhydes monoterpéniques: le

tinalool, le 1,8-cinéole, le géranial/néral, le citronellal, l'isomenthone, la menthone

et quelques monoterpènes: a-terpinène, y-terpinène et a-terpinolène [74].

21

Chapitre Il :

Matériel et méthodes

22

1. MATERIEL

1.1. Matériel végétal Le matériel végétal est constitué de tiges feuillues de Origanum syriacum.

Ces organes ont été récoltés le 30 juin 2016 à la Riviera M'Pouto (District

d'Abidjan) à 9 h environ. L'identification de ces plantes a été faite par comparaison

avec la description botanique des espèces de O. syriacum du Moyen-Orient

publiées [11-14) [27). Les tiges feuillues récoltées ont été divisées en 3 lots afin d'être utilisées sous forme de tiges feuillues fraîches et sèchées (Figure 6). Une

partie de la récolte a été séchée pendant 21 jours et l'autre 1 mois 14 jours à la

température ambiante dans une salle bien aérée.

1

Figure 6 : Tiges feuillues fraîches (A) et sèchées (8) de Origanum syriacum (photo prise par Kouamé Christelle, 2016)

1.2. Matériel technique Il est constitué d'appareils, de verreries et autres matériaux de laboratoire.

../ L'appareillage est composé de :

- un distillateur de type CLEVENGER

- un spectrophotomètre: WPA S 800 Diode Array

- un Chromatographe en Phase Gazeuse (CPG) Perkin-Elmer type

Clarus 500;

- un Chromatographe en Phase Gazeuse Perkin Elmer autosystem XL

associée à la Spectrométrie de Masse (CPG-SM) ;

- un spectromètre Bruker 400 AVANCE, 9.4 Tesla.

23

../ La verrerie et les autres materiels se composent de :

- des élévateurs ;

- des plaques chauffantes ;

- une balance de précision ;

- des pipettes pasteurs ;

- des micropipettes ;

- de pissettes ;

- des tubes à essais ;

- une éprouvette graduée ;

- des plaques CCM (gel de silice 60 F254 sur support en aluminium,

Merck);

- une lampe ultra-violette (254/366 nm (Min UVIS abnehmbar UV) ;

- des cuves en verre ;

- un portoir

- un séchoir électrique ;

1.3. Matériel chimique Le matériel chimique est constitué des produits suivants :

- acétone;

- éthanol à 96%;

- hexane;

- acétate d'éthyle;

- acide sulfurique;

-vanilline;

- acide ascorbique.

li.METHODES D'ETUDE

11.1. Extraction de l'HE Les HE ont été extraites par hydrodistillation dans un appareil de type

Clevenger (Figure 7) pendant 4 h. Une cocotte-minute de 10 L contenant 2 L d'eau

et du matériel végétal posé sur une grille est chauffé sur une plaque chauffante 24

jusqu'à ébullition du solvant. La vapeur d'eau entraîne les composants volatils vers

la colonne cylindrique et le réfrigérant où la phase gazeuse se condense. Le

mélange d'eau et d'HE obtenu est recueilli dans une burette en passant par

l'essencier. L'HE séparée de l'eau par décantation est prélevée à l'aide d'une

pipette Pasteur dans un tube et séchée sur du sulfate de sodium anhydre (NaSQ4).

Enfin, les HE sont récupérées dans des flacons de verre puis conservées au

réfrigérateur à 4 °C.

Les rendements en HE extraites sont calculés selon la formule suivante :

R(o/o) = massedel

1HE(g) X lOO

masseduvégétal (g)

Réfrigérant

Colonne cylindrique

en verre

Essencier

Cocotte-minute

Plaque chauffante Figure 7 : Montage d'hydrodistillation de type Clévenger

(photo prise par Goblé Landry, 2013)

11.2. Méthodes d'analyse des HE

11.2.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) Les HE sont déposées à l'aide d'un capillaire sous forme de points, distants

de 1 cm les uns des autres et de 0,8 cm des deux bords de la plaque

chromatographique et développées dans le système de solvants hexane/acétate

25

d'éthyle : 20/2 (v/v) dans une cuve de migration jusqu'à la ligne de front de

solvant, situé à 1 cm du bord supérieur de la plaque. Puis la plaque est retirée de

la cuve et séchée. Elle est visualisée au visible puis à l'UV (254 nm) avant d'être

pulvérisée par la vanilline sulfurique (solution de 0,5 g de vanilline et 1 ml d'acide

sulfurique dans 50 ml d'éthanol à 95%). Après pulvérisation, la plaque est séchée

et chauffée à 11 o'c pendant 5 min environ à l'aide d'un sèche-cheveux. Les

différentes colorations apparaissant sous forme de spots sont enregistrées et les

rapports frontaux (Rf) calculés. [75]

11.2.2. Dépistage de l'activité antioxydante des HE par CCM Après séchage, le chromatogramme préparé comme décrit ci-dessus est

pulvérisé avec une solution méthanolique de DPPH• à 1 % (m/v). En présence des

substances antioxydantes, le DPPH• est réduit et passe de la couleur violette à la

couleur jaune. Dans les chromatoplaques, les zones d'activité antiradicalaire

apparaissent en jaune-clair sur le fond violet au bout d'un temps optimal de 30 min

[76,77].

11.2.3. Evaluation de l'activité antioxydante des HE par spectrophotométrie L'activité antioxydante in vitro a été évaluée à l'aide d'un spectrophotomètre

par la mesure du pouvoir de piégeage du radical DPPH• (1, 1-Diphenyl-2-

picrylhydrazyle) selon la méthode décrite par Blois [78]. Le DPPH• est solubilisé dans l'éthanol absolu pour obtenir une solution de concentration 0,03 mg/ml.

Différentes gammes de concentrations de l'HE sont préparées dans l'éthanol

absolu (0,56 mg/ml, 0,28 mg/ml, 0, 14 mg/ml, 0,07 mg/ml, 0,035 mg/ml et

0,0175 mg/ml). Dans des tubes secs et stériles, sont introduits 2,5 ml d'extraits

préparés et 1 ml de solution éthanolique de DPPH•. Après une période

d'incubation de 30 min à la température du laboratoire et l'abri de la lumière,

l'absorbance est lue à 517 nm contre un blanc formé de 2,5 ml d'éthanol pur et 1

ml de solution de DPPH•. Le témoin positif de référence est la vitamine C préparé

dans les mêmes conditions que les extraits d'étude. Le pourcentage d'inhibition (1)

du radical DPPH· est calculé suivant la formule [79] :

26

l = (Ab - Ae) /Ab* 100 I : pourcentage d'inhibition (% );

Ab : absorbance du DPPH•;

Ae : absorbance de l'échantillon

Les concentrations efficaces à 50% (CE50) ont été déterminées avec le

logiciel Graph pad prism [80].

11.2.4. Analyse des HE par CPG L'analyse des HE extraites a été réalisée au moyen d'un chromatographe en

phase gazeuse (Perkin-Elmer type Clarus 500), équipé d'un injecteur diviseur, de

deux colonnes de silice apolaire et polaire de 50 x 0,22 mm de diamètre interne, de

0,25 µm d'épaisseur du film, garnies respectivement de polydiméthylsiloxane

(C2H50Si)n et de polyéthylène glycol, et de deux détecteurs à ionisation de flamme

(Figure 8). Les conditions opératoires sont les suivantes : le gaz vecteur est

l'hydrogène ; la pression en tête de colonne est de 20 psi ; la température de

l'injecteur et des détecteurs est de 250°C. La programmation de température est de

60° jusqu'à 220°C à raison de 2°C/min, avec un palier de 20 min à 220°C ;

l'injection à été faite par mode diviseur avec un rapport 1/60. La quantité

d'échantillon injectée est de 0,5 µI issue d'une solution contenant 50 µL de l'HE

dans 350 µL de CDCb. Les substances volatiles ont été identifiées grâce à la

comparaison de leurs indices de rétention (Ir) sur colonnes polaire et apolaire,

calculés à partir des temps de rétention des composes séparés et des n-alcanes

linéaires. [59]

27

Figure 8 : Chromatographe en phase gazeuse ( Perkin-Elmer type Clarus 500) (photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)

11.2.5. Analyse des HE par CPG-SM Les analyses ont été effectuées à l'aide d'un chromatographe Perkin Elmer

autosystem XL (Figure 9), doté d'un injecteur automatique et d'une colonne

apolaire (Rtx-1) (diamètre interne : 60 m x 0,22 mm; épaisseur du film : 0,25 µm),

couplé à un détecteur de masse Perkin Elmer Turbo Mass. Le gaz vecteur est

l'hydrogène (1 ml) et il exerce une pression en tête de colonne de 25 psi. La

température de l'injecteur est de 250°C et celle du détecteur 280°C. La

programmation de la température est de 60°suivie d'une augmentation jusqu'à230

°C à raison de 2°C/min, avec un palier de 45 min à 230°C. L'injection se fait par

mode split avec un rapport de division de 1/50. La quantité d'échantillon injectée

est de 0,2 µI. Les spectres de masse sont obtenus au moyen d'un détecteur à filtre

quadripolaire et l'ionisation est faite par impact électronique par un faisceau

électronique de 70 eV.

28

Figure 9 : chromatographe Perkin Elmer autosystem XL (photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)

11.2.6. Analyse des HE par RMN Les spectres de RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker 400

AVANCE, 9,4 Tesla, opérant à 400, 132 MHz pour le 1 H et à 100,623 MHz pour le 13C (Figure 10). Les spectres ont été enregistrés avec une sonde de 5 mm. Le

solvant est le CDCb additionné de tétraméthylsilane (TMS). Les déplacements

chimiques sont donnés en ppm (o) par rapport au TMS pris comme référence

interne.

Les spectres du 13C ont été enregistrés avec les paramètres suivants : angle

d'impulsion 45°; temps d'acquisition = 2,7 s correspondant à une acquisition de 128

K avec une largeur spectrale (SW) de 24000 Hz (environ 240 ppm) ; délai de

relaxation 01 = 0, 1 s ; résolution digitale de 0, 183 Hz/pt. Pour l'enregistrement des

spectres, une masse de 40 mg d'huile essentielle et de 8 mg de fraction de

chromatographie est dissoute dans 0,5 ml de CDCb. Le nombre d'accumulation

est de 3000 pour chaque enregistrement. Les données du signal (FID) sont

multipliées avant la transformée de Fourrier par une fonction exponentielle (LB =

1,0 Hz).

29

Figure 10 : chromatographe Perkin Elmer autosystem XL(photo prise par Ouattara A.Zana,2016)

30

Chapitre 111 :

Résultats et discussion

31

1. Rendements en HE

L'huile essentielle de Origanum syriacum est un liquide très fluide, jaune

pâle, possédant une odeur forte.

Les rendements en HE extraites à partir des tiges feuillues de Origanum

syriacum sont représentés dans la figure 11

rendements 3,00

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00 TFF TFS/21j TFS/lm 14j

• rendements

Figure 11 : rendement des HE extraites à partir des tiges feuillues fraîches

(TFF); séchées 21 jours (TFS/21j) et 1 mois 14 jours (TFS/lm 14j)

Au regard des histogrammes, nous constatons que le rendement en HE des

tiges feuillues fraîches (0,49%) est moins élevé que ceux des tiges feuillues

séchées pendant 21 jours (2,24%) et 1 mois 14 jours (2,73%). La durée de

séchage a été choisie de façon aléatoire. Toutefois, les rendements obtenus sont

en accord avec ceux publiés par plusieurs chercheurs sur les espèces

méditerranéennes. En effet, des feuilles fraîches récoltées à Amman et au Liban

ont fourni les HE avec les rendements respectivement de 0,85% [81] et de 0,5%

[82]. En ce qui concerne les rendements en HE des feuilles séchées, nous

constatons qu'ils sont comparables à ceux rapportés dans la littérature sur l'espèce

cultivée dans le sud de la Turquie (2,8%) [83].

32

2. Différents profils chromatographiques CCM

Les résultats de la détection des constituants des HE au moyen de la CCM

sont présentés dans la figure 12 et consignés dans le tableau 1. 1 mw1..,,&wJ<J,twh 0

Rf=0,95

Rf=0,78

Rf=0,65

Rf=0,62

Rf=0,35

Rf=0,11

Fl F2 F3 F4 FS F6 Fl F2 F3 F4 FS F6

Figure 12 : Profils chromatographiques d'HE des tiges feuillues d'Origanium

svrianum révélées à l'UV/254 nm (A) et à la vanilline sulfuriaue dans le visible (8)

Développant: hexane/acétate d'éthyle 20/2 (v/v)

1 En général, les constituants chimiques des HE appartiennent à la famille des

terpènes, dont les structures chimiques renferment des systèmes conjugués à au

moins 4 doubles liaisons, apparaissent à l'UV/254 nm sous forme de zones

sombres sur fond fluorescent vert clair dans la chromatoplaque [83). De ce point de vue, les HE de Origanum syriacum renferment des constituants terpéniques, car

leur profil chromatographique après la visualisation à l'UV/254 nm a montré environ

5 spots sombres (Figure 12A). En outre, la vanilline sulfurique étant un révélateur

des constituants des HE, a été employée pour les identifier dans nos échantillons.

En effet, la vanilline sulfurique les révèle en bleu, vert, rouge et marron, selon ce

qui est rapporté dans la littérature [84).

33

Tableau 1 : Résultats de la détection des HE extraites par CCM

Rf Couleur Composés

possibles

0,11 0 Bleu 0,35 Bleu 0,62 Rougeâtre 0,65 Bleu 0,72 Bleu 0;78 Violet

0,95 Marron

Terpène ---- Terpène Terpène Terpène Terpène Terpène ND

Développant : hexane/acétate d'éthyle 20/2 (v/v) ; Révélateur : vanilline sulfurique

Vu les résultats obtenus, nous pouvons dire que la composition chimique de

tous les échantillons analysés est semblable. Les échantillons ont des profils

chromatographiques similaires. Précisément, la composition chimique des HE des

TFF et séchées TFS de Origanum syriacum présente une similarité à la fois en

nombre de spots et de colorations bleue et violette rougeâtre et marron. Ces spots

bleus (Rf=O, 11; 0,35; 0,65; 0,72) et violet (Rf=0,78) sont des terpènes. Aussi, les

profils chromatographiques ne présentent-ils pas de variation en fonction du temps

de distillation. En somme, nous concluons que l'obtention des HE à partir du

matériel sec est plus intéressante vu que le rendement en HE dans ce cas est trois

fois plus élevé que dans le cas des TFF (Figure 11 ).

3. Illustration de la méthode d'analyse par RMN 13C, CPG{lr) et CPG-SM : HE

des TFF de Origanum syricum

La combinaison des méthodes d'analyses CPG (Ir), CPG-SM et RMN 13C

appliquée à l'HE de TFF de Origanum syriacum a permis d'identifier 30 composés

représentant 99,4% de la composition totale (Tableau Il). Cette HE est caractérisée

par une très forte proportion de monoterpènes (Figure13) parmi lesquels, le

carvacrol 28 (67,8%) (Figure13) est le composé majoritaire. A côté de ce

composé, le y-terpinène 18 (13,0%) (Figure13) est présent avec une teneur

appréciable tandis que le p-cymène 13 est identifié avec une proportion non

négligeable (4,3%) (Figure13). Les autres composés sont présents à des teneurs

34

inférieures à 2,3% (myrcène 9). Parmi ceux-ci, le ~-bisabolène 30 (1, 1 %) et le ~

caryophyllène 29 (0,3%) sont les seuls sesquiterpènes.

Tableau Il : Composition chimique de l'HE des tiges feuillues fraîches

No Composés Ira lrp TFF Mode d'identification

1 a-thujène 925 1015 1,8 Ir, SM, RMN 13C

2 a-pinéne 933 1013 0,7 Ir, SM, RMN 13C

3 camphène 946 1062 0, 1 Ir, SM

4 oct-1-èn-3-ol 963 1444 0,6 Ir, SM, RMN 13C

5 octan-3-one 966 1252 0, 1 Ir, SM

6 sabinène 967 1120 0,2 Ir, SM

7 p-pinène 973 1109 0,2 Ir, SM

8 octan-3-ol 981 1388 0,6 Ir, SM, RMN 13C

9 myrcène 983 1158 2,4 Ir, SM, RMN 13C

10 a-phellandrène 999 1162 0,3 Ir, SM

11 l1-3-carène 1007 1145 0, 1 Ir, SM

12 a-terpinène 1011 1177 2,2 Ir, SM, RMN 13C

13 p-cymène 1014 1268 4,3 Ir, SM, RMN 13C

14 limonène 1023 1198 0,3 Ir, SM

15 P-phelland rene 1023 1208 0,3 Ir, SM

16 (Z)-P-ocimène 1027 1229 0,1 Ir, SM

17 (E)- P-ocimène 1038 1246 0, 1 Ir, SM

18 y-terpinène 1051 1242 13,0 Ir, SM, RMN 13C

19 trans-hydrate de sabinene 1055 1460 0,3 Ir, SM

20 terpinolene 1080 1279 0, 1 Ir, SM

21 linalol 1085 1542 0,4 Ir, SM

22 bornéol 1151 1694 0,2 Ir, SM

23 terpinèn-4-ol 1163 1597 0,8 Ir, SM, RMN 13C

24 a-terpinéol 1174 1691 0,3 Ir, SM

25 carvone 1218 1730 0, 1 Ir, SM

26 carvacrol methyl oxide 1226 1588 0,2 Ir, SM

27 thymol 1270 2175 0,3 Ir, SM

28 carvacrol 1283 2205 67,8 Ir, SM, RMN 13C

29 P-caryophyllène 1418 1588 0,4 Ir, SM

30 P-bisabolène 1501 1717 1,1 Ir, SM, RMN 13C

Monoterpènes hydrocarbonés 26,4

Monoterpènes oxygénés 71,5

Sesquiterpènes 1,5

Total: 99,4

L'ordre d'élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire, excepté pour les composés suivis d'un

astérisque (colonne polaire). Ira et lrp : indices de rétention mesurés respectivement sur colonne apolaire (BP-1) et

polaire (BP-20).

35

OH

carvacrol y-terpinène p-cimène

myrcène

a-terpinène

Figure 13 : Molécules majoritaires de l'HE des TFF de Origanum syricum

Dans les paragraphes suivants nous présentons l'interprétation des résultats

de RMN 13C sur l'exemple du carvacrol, étant le composé majoritaire dans l'HE

d'étude.

3.1. Identification par RMN 13C Les composés présents dans l'HE des TFF ont été identifiés par

comparaison des déplacements chimiques de leurs atomes de carbone avec ceux

des composés de référence présents dans une bibliothèque de spectres à l'aide

d'un logiciel (Figure 15). Les composés ainsi identifiés par RMN 13C sont repérés

dans le chromatogramme de la CPG par leurs indices de rétention (IR) afin d'être

quantifiés. A titre d'exemple, nous indiquons dans le spectre RMN 13C du mélange

tous les 10 siqnaux du carvacrol (Figure 14).

36

7

1 2

3~ -----1-0H

1 Il 4~ ---6

5

1 8

9 --- -----1 0

C9+C10

C3 C4CG

Cl""

~ es

C8

C2

C7

210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ·10 rl(ppm)

Figure 14: Spectre RMN 13C de l'échantillon TFF

Les signaux des 6 carbones sp2 du noyau benzénique apparaissent à 153,65

ppm (C1); 148,40 ppm (CS); 130,83 ppm (C3); 121,00 ppm (C2); 118,72 ppm (C4) et 113,05 ppm (C6). Les deux carbones méthyliques de la chaîne latérale

résonnent à 23,99 ppm (superposition d'où l'intensité élevée du signal) tandis que

le carbone méthynique (CS) se trouve à 33,68 ppm. Le déplacement chimique du

carbone du méthyle (C7) est repéré à 15,36 ppm. Les variations entre les valeurs

théoriques et celles obtenues expérimentalement sont inférieures ou égales à 0,09

ppm (Figure 15).

37

15,30 15,36

OH 153,60 153,65

118,81~ .!,1113,10 118,72 ~ 113,05

148,44 148,40

23,97./" .}.},O / ......._ 23,97 23,99 33,68 23,99

Figure 15: Signaux RMN 13C de référence et expérimentaux (en gras) du carvacrol

3.2. Identification par CPG(lr) et CPG/SM La figure 16 représente le chromatogramme de l'HE des TFF de Origanium

syriacum. Chaque pic dans ce chromatogramme représente un composé ou des

composés en cas de co-élution. Ces composés passent ensuite dans le détecteur

de masse et les spectres de masse (en mode impact électronique) ainsi enregistrés

sont comparés avec ceux des composés de référence contenus dans les

bibliothèques de spectres. L'identification des molécules proposées par la

spectrométrie de masse est confirmée par une bonne concordance entre les Ir

(apolaire et polaire) expérimentaux obtenus à partir de la CPG et ceux contenus

dans la banque de données. Les numéros des composés identifiés sur les pics

sont les mêmes que ceux du tableau Il. A titre d'exemple, nous présentons

l'identification du carvacrol 28.

38

28

18

Ir

Figure 16: Chromatogramme (sur colonne apolaire) de l'HE de TFF de Origanum syriacum

La structure du carvacrol a été proposée par la spectroscopie de masse

(Figure 17) et son identification a été confirmée par une bonne correspondance

entre les Ir expérimentaux (lra/lrp 1283/2205) et ceux présents dans la banque de

données (lra/lrp 1278/2219).

135

91

121 127 133

150

m 30 ~ 50 w (wileyregistry8e) PHENOL, 2-METHYL-6-(1-METHYLETHYL)-

90 100 110 120 130 140 150 iso m/z

Figure 17 : Spectre de masse en mode impact électronique du carvacrol

39

Les fragmentations principales du carvacrol en CPG-MS observées sont: m/z 150

[Mr+; m/z 135 [M-15] '\ m/z 107 [M-43] ·+; m/z 91 [M-43-16] ·+. L'obtention de ces

fragmentations a été possible à partir de la structure du carvacrol par la rupture des

liaisons présentée ci-dessous (Figure 18) :

HO

* HO

f m/z 135 [M-15r+ Perte du fragment méthyle.

* m/z 91 [M-43-16r+ perte de fragment OH et isopropyle

m/z 107 [M-43]'+ Elimination d'un fragment [C3H1]

m/z 77 [M-43-29]'+ perte des fragments [C3H1] ·+et [CHO]'+ avec ouverture du cycle

Figure 18 : différentes fragmentations de la molécule de caracrol

4. Effet du temps de séchage sur la composition chimique de l'HE de

Origanum syriacum

Les compositions chimiques des HE provenant de TFF, TFS 21j et TFS 1 m

14j de Origanum syriacum sont reportés dans le tableau Ill.

40

Tableau Ill: Composition chimique des HE de Origanum syriacum en fonction du temps de séchage

Composés Ira lrp TFF TFS 21 j TFS 1m 14j

1 a-thujène 925 1015 1,8 1,04 1,9

2 a-pinéne 933 1013 0,7 0,6 0,9

3 camphène 946 1062 0,1 0,1 0,1

4 oct-1-en-3-ol 963 1444 0,6 0,7 0,9

5 octan-3-one 966 1252 0,1 0,1 0,1

6 sabinène 967 1120 0,2 0, 1 0,1

7 p-pinène 973 1109 0,2 0,2 0,2

8 octan-3-ol 981 1388 0,6 0,6 0,8

9 myrcène 983 1158 2,4 2,2 2,9

10 a-phellandrène 999 1162 0,3 0,3 0,4

11 li-3-carèn~ 1007 1145 0, 1 0,1 0,1

12 a-terpinène 1011 1177 2,2 2,1 2,8

13 p-cymène 1014 1268 4,3 4,8 6,8

14 P-phellandrène* 1023 1208 0,3 0,2 0,3

15 limonène* 1023 1198 0,3 0,2 0,3

16 (Z)-P-ocimène 1027 1229 0,1 0, 1 0,1

17 (E)- P-ocimène 1038 1246 0, 1 0, 1 0,1

18 y-terpinène 1051 1242 13,0 11,3 14,5

19 trans-hydrate de sabinène 1055 1460 0,3 0,8 1,1

20 Terpinolène 1080 1279 0, 1 0,1 0,1

21 cis-hydrate de sabinène 1084 1544 0,5

22 Linalol 1085 1542 0,4 0,4

23 bornéol 1151 1694 0,2 0,2 0,2

24 terpinèn-4-ol 1163 1597 0,8 0,4 0,6

25 a-terpinéol 1174 1691 0,3 0,2 0,2

26 Carvone 1218 1730 0, 1 0,1 0,1

27 carvacrol méthyloxyde 1226 1588 0,2 - 0,2

28 Thymol 1270 2175 0,3 0,4 0,3

29 Carvacrol 1283 2205 67,8 69,8 61,5

30 P-caryophyllène 1418 1588 0,4 0,5 0,3

31 P-bisabolène 1501 1717 1, 1 0,4 0,5

Monoterpènes hydrogénés 26,4 24,3 33,2

Monoterpènes oxygénés 71,5 72,9 64,9

Sesquiterpènes 1,5 0,9 0,8

Total: 99,4 98,1 98,9

L'ordre d'élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire, excepté pour les composés suivis d'un astérisque (colonne polaire). Ira et lrp: indices de rétention mesurés respectivement sur colonne apolaire (BP-1) et polaire (BP-20).

41

Durant la période de séchage, nous n'avons pas observé de variation notable

de la composition chimique au niveau qualitatif. Cependant, au niveau quantitatif

nous avons noté de légères variations au niveau des différentes classes de

composés : monoterpènes oxygénés (64,9%- 72,9%); sesquiterpènes (0,8%- 1,5%)

et monoterpènes hydrogénés (24,3%-33,2%). Le séchage à donc une influence

relativement faible sur la composition chimique de l'HE de Origanum syriacum.

Le tableau IV récapitule la comparaison des compositions chimiques des HE

de Origanum syriacum de Côte d'Ivoire et celles des autres régions du monde.

42

Tableau IV : Composition chimique des HE de Origanium syriacum récolté dans différents pays

Composés identifiés Jordanie [80] Turquie [83] Côte d'Ivoire

[81] Sauvage Cultivée TFF TFS 21 j TFS 1m14j [3] [13]

a-thujène 0,47 - 1,7 1,638 0,607 1,78 1,04 1,89

a-pinéne 0,38 1,22 1,6 0,871 0,317 0,67 0,63 0,87

camphéne 0,21 - o. 1 0,148 0,057 o. 11 0,10 0,13

oct-1-en-3-ol 0,36 - - 1,553 1,521 0,63 0,70 0,86

octan-3-one - - 1,3 - - 0,09 0,09 0,10

sabinène 0,35 - 0,3 - - 0,24 0,07 0,07

13-pinène 0,60 - 0,2 o. 112 0,087 0,18 0,17 0,22

octan-3-ol 0,33 - 0,3 3,139 2,368 0,56 0,62 0,79

myrcène - 1,38 1,9 3,918 2,164 2,37 2,18 2,89

1,8 - cineol 0,27 - - - - - - -

a-phellandrène - - - 0,732 0,034 0,27 0,28 0,38

li-3-carène 0,36 - 0,3 0,146 0,095 0,09 0,12 0,13

a-terpinène 0,37 2,94 2,5 5,327 2,140 2,24 2,12 2,85

p-cymène 30,22 15,69 8,7 10,17 5,53 4,32 4,83 6,79

13-phellandrene 0,35 - - 1,019 0,36 0,26 0,25 0,32

limonène - - 0,4 - - 0,27 0,19 0,33

(Z)-!3-ocimène - - - 0,373 - 0,05 0,06 0,06

(E)- 13-ocimène - - - - 0,112 0,13 o. 11 0,14

y-terpinène 4,27 27,79 12,6 15,67 9,039 13 11,31 14,50

trans-hydrate de sabinene - - 0,3 1,361 2,453 0,32 0,81 1,06

terpinolene 0,35 - 0,3 0,293 o. 181 0,12 0,10 o. 15 cis-hydrate de sabinène 3,22 - 0,2 - - - - 0,52

43

linalol 0,41 0,89 2,0 0,101 0,213 0,35 0,43 - P-thujone 0,38 - - - - - bornéol 0,31 - 0,3 0,085 0,206 0,15 0,18 0,15

terpinèn-4-ol 0,34 0,74 - 0,61 0,774 0,81 0,41 0,62

a-terpinéol - 0,01 0,7 - - 0,33 0,23 0,21

carvone 0,36 - 0,3 - - 0,10 o. 11 0,10

carvacrol méthyloxyde 0,23 4,57 0,9 0,092 0,055 0,18 - 0,21

thymol 0,43 2,12 24,7 43,28 2,93 0,32 0,38 0,32

carvacrol 44,10 26,97 17,6 4,26 58,88 67,76 69,81 61,47

P-caryophyllène 2,5 12,59 - 3,422 3,202 0,36 0,48 0,28

P-bisabolène 1501 - 1,5 - - 1, 11 0,43 0,47

a-humulène 0,43 - - 0,516 0,433 - - - bornylacétate 0,34 - - - - - - - camphor 0,77 - - - - - - - 2-lsopropyl-1-méthoxy-4-méthylbenzene - - 7,9 - - - - - a-copaène - - - - - - - - erémophilène - - 0,3 - - - - - cadinène - - 0,1 - - - - - a-cadinène - - 0,1 - - - - -

caryophyllène oxyde - - 0,2 - - - - -

spathulénol - - 0,3 0,179 0,353 - - - - - 0,1 0,073 0,124 - - -

Total: 96,78 98,21 90,6 99,14 98,03 98,82

44

1

Les HE de cette plante sont toujours dominées soit par le thymol soit par le

carvacrol accompagné parfois du p-cymène ou du y-terpinène. La composition à

dominance carvacrol de l'HE de la plante de Côte d'Ivoire est proche de celle de

Jordanie et du Liban. Les HE de ces deux pays présentent une composition

chimique relativement proche de celle de l'espèce acclimatée en Côte d'Ivoire au

niveau qualitatif mais pas au niveau quantitatif. Cela pourrait s'expliquer par la

différence des climats. En effet, dans le sud la Côte d'Ivoire où a été acclimaté

l'espèce Origanum syriacum que nous avons étudié, le climat est équatorial, donc

très humide avec une température relativement constante, entre 29 et 32°C. Ce

climat est très différent de celui de Jordanie et de celui du Liban où les plantations

de Origanum syriacum sont réalisées au printemps ou en début d'automne.

5. Evaluation de l'activité antioxydante des HE

5.1. Evaluation qualitative par CCM Le pouvoir réducteur et la capacité de piégeage des radicaux d'une

substance peuvent être un indicateur de son activité antioxydante. Le 2,2-diphényl-

1-picrylhydrazyle (DPPH•) est un radical libre stable qui accepte un radical

hydrogène pour devenir une molécule diamagnétique stable (Figure 19). Donc, le

potentiel réducteur des HE testées a été mis en évidence par un dépistage

préliminaire sur plaque CCM à l'aide du DPPH•, utilisé comme révélateur (Figure

20).

r- N02 J. ~N-N-0 + RH ~

02NVN02 donneur de H DPPH (Ox) violet

N02J:;;i _ R + ON·N-0

02N N02 DPPH-H (red) jaune

Figure 19 : Schéma réactionnel de la conversion du DPPH• (oxydant) en DPPH H (réducteur)

45

Rf=0,78

Rf=0,72

Rf=0,5

Rf=0,4

Fl F2 F3 F4 FS F6

Figure 20 : Chromatogramme des HE révélées au DPPH•

Développant : hexane/ acétate d'éthyle, 20:2 (v/v)

F1: TFF (3h); F2: TFF (4èmeh); F3: TFS 21J (3h); F4: TFS 1M 14J (30min); F5: TFS 1M 14J (3h);

F6: TFS 1M 14J (4ème h)

Les zones d'activités antiradicalaires apparaissent jaune-blanc sur fond

violet, témoin de la réduction du DPPH• par les constituants des HE testées. Au

regard des profils chromatographiques des HE (figure 15), nous pouvons dire que

tous les échantillons marquent une bonne propriété antiradicalaire probablement

due à la présence du composé révélé majoritaire en rouge par la vanilline

sulfurique, et des 3 autres composés de Rf=O, 78 ;Rf=O, 7 et Rf=0,5 (figure 15). Par

ailleurs, les HE des TFS (F3 et F4) contiennent une substance antioxydante

(Rf=0,4) de plus. Il est à révéler que sa séparation s'est fait dans les 30 premières

minutes d'extraction (F4). En effet, les HE de Origanum syriacum renferment des

composés antioxydants dont le potentiel peut être évalué quantitativement.

5.2. Evaluation quantitative par spectrophotométrie Les différents pourcentages d'inhibition du DPPH• par les HE des TFF et

TFS sont présentés dans la Figure 21. La capacité antioxydante des HE vis-à-vis du radical DPPH• est déterminée

par une diminution de l'absorbance induite par des substances antiradicalaires

présentes dans les échantillons de l'HE. Cette diminution se traduit par une chute

46

de l'absorbance du DPPH• dans un intervalle des concentrations de l'HE (Figure

21).

%1 • Fl:TFF (3h)

• F2:TFF {4ème h)

• F3:TFS 21J {3h)

• F4:TFS lM 14J (30min)

• F5: TFS lM 14J (3h)

• F6:TFS lM 14J (4ème h)

C aVITC

0,56 0,28 0,14 0,07 0,035 0,0175

Figure 21 : !'Inhibition du DPPH• en fonction de la concentration des HE et de la vitamine C

Ces résultats montrent qu'aux petites concentrations, les HE extraites ont

présenté une activité antioxydante relativement faible par rapport à la vitamine C.

Cependant, à 0, 14 mg/ml l'HE extraite à partir des TFF a manifesté une bonne

activité avec un pourcentage d'inhibition de 61,35% lequel s'accroît jusqu'à 81,25%

pour la concentration de 0,56 mg/ml. Par ailleurs, à cette concentration, tous les

échantillons des HE ont montré des pourcentages d'inhibition significatifs, par

exemple 89, 78% pour les TFS, ce qui est plus ou moins proche de celle de la

vitamine C (96,07%). Un pourcentage d'inhibition similaire (82, 1 %) de l'HE de

Origanum syriacum du Liban a été obtenu par des chercheurs libanais [81]. Pour une meilleure appréciation, il est préférable que l'activité antioxydante

soit exprimée en concentration efficace (CEso) laquelle est définie comme étant la

concentration d'un substrat qui cause la perte de 50% de l'activité de DPPH•. Donc,

la CEso traduit l'efficacité d'un extrait. Plus cette concentration est faible, plus

l'extrait est efficace. Les CEso des HE testées ont été déterminées graphiquement

(Figure 22) au moyen du logiciel Graph Pad prism.

47

. FI

150 • F2 . F3 = .g . F4 - 100 :s :ë • F5 = • ~- ::c ( • F6 "O i:.. ~ ,:.. 50 :Q • Vitamine C - = ~ u

0 ,.. = e _5J

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 ,:.. -log (concentration)

Figure 22 : Courbes de l'activité anti-oxydante des HE en fonction du pourcentage d'inhibition du DPPH• par rapport à la vitamine C

F1: TFF (3h); F2: TFF (4èmeh);F3: TFS 21J (3h); F4: TFS 1M 14J (30min); FS: TFS 1M 14J (3h); F6: TFS 1M 14J (4ème h)

Les résultats relatifs aux CEso sont présentés dans la Figure 23. Nous

constatons que les valeurs des CEso des HE sont plus élevées que celle de la

vitamine C (0,0194 mg/ml) ; ce qui traduit une efficacité relativement inférieur à

celle de la vitamine C. Cependant, les organes frais (F2) manifestent un effet

antioxydant (0,0776 mg/ml) plus important que les organes secs.

48

CESO

0,12

0,1

0,08

0,06

0,04

0,02

0 Vit C Fl F2 F3

•VitC

• Fl

• F2

• F3

• F4

• FS

• F6 F4 FS F6

Figure 23 : CEso des HE et de la vitamine C

Toutefois, une activité antioxydante similaire à nos résultats a déjà été

rapportée dans la littérature. En effet, l'effet de piégeage du DPPH• par l'HE de

Origanum syriacum a été évaluée par des chercheurs Libanais, qui ont démontré

une activité significative (CEso de 1,7 µg / ml) par rapport à la vitamine C (CEso=

1,0 µg/ml) [81] de l'espèce libanaise.

49

CONCLUSION ET PERSPETIVES

Le principal but du présent travail a été l'étude de l'HE issue de Origanum

syriacum acclimatée en Côte d' Ivoire. A notre connaissance, aucune étude n'a

encore été réalisée sur l'HE de cette espèce. C'est pourquoi, nous nous sommes

intéressés à cette HE afin de connaître sa composition chimique et de la comparer

avec celle cultivée au Moyen-Orient rapportée dans la littérature. En vue d'étudier

cette composition chimique en fonction du temps de séchage, les tiges feuillues

fraîches et séchées de cette espèce ont été utilisées.

Ainsi, les HE ont été obtenues par l'hydrodistillation à l'aide d'un

hydrodistillateur de type Clévenger avec les rendements de 2,73 % pour les tiges

feuillues séchées et de 0,49 % pour les tiges feuillues fraîches. Ces valeurs sont

comparables à celles des HE extraites des espèces méditerranéennes.

L'analyse par CPG, CPG-MS et RMN 13C montrent que la composition

chimique de l'HE étudiée est similaire à celles déjà publiées par d'autres

chercheurs. Aussi, le séchage des feuilles n'influence que très faiblement cette

composition. Les composés majoritaires sont le carvacrol (61,5 - 61,8%) et le y

terpinène (11,3 -14,5%). Ces résultats indiquent que Origanum syriacum aclimatée

en Côte d'Ivoire appartient au chémotype carvacrol.

Le piégeage du radical DPPH• par l'HE aux petites concentrations a été

relativement plus faible que celui par la vitamine C. Néanmoins, à 0, 14 mg/ml l'HE

extraite à partir des tiges feuillues fraîches a manifesté une bonne activité avec un

pourcentage d'inhibition de 61,35%, lequel croit jusqu'à 81,25% à 0,56 mg/ml.

Cette activité peut être attribuée principalement à la forte teneur en carvacrol

(composé phénolique). Par conséquent, nous pouvons suggérer que cette HE peut

être utilisée comme un bon antioxydant.

En perspective, il serait intéressant de réaliser des tests biologiques sur l'HE

de Origanum syriacum afin de mettre en évidence les éventuelles propriétés

pharmacologiques mentionnées dans la littérature pour les espèces

méditerranéennes.

50

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59

Résumé

La présente étude s'inscrit dans le cadre de valorisation des HE de Origanum

syriacum, une plante aromatique du Moyen-Orient acclimatée en Côte d'Ivoire. Les

HE des tiges feuillues fraîches et séchées ont été obtenues par hydrodistillation à

l'aide d'un extracteur de type Clévenger. L'extraction a donné de différents

rendements en HE en fonction du temps de séchage. Les tiges feuillues sèchées

ont produit plus d'HE (0,49%) que les tiges feuillues fraîches (2,73%). La

composition chimique des HE a été analysée par CPG, CPG-SM et RMN 13C, qui

ont permis de montrer qu'elles contiennent 24,3-33,2% de monoterpènes

hydrogénés, 64,9-72,9% de monoterpènes oxygénés et 0,8-1,5% de

sesquiterpènes. Les composants principaux sont les suivants: carvacrol (61,5 -

69,8%), y-terpinène (11,3- 14,5%), p-cymène (4,3 - 6,8%) et myrcène (2,2 -2,9%).

Le test de réduction du radical 2,2-diphenyl -1-picrilhydrazyle a été employé

pour mesurer le pouvoir antioxydant des HE, en comparaison à la vitamine C prise

comme référence. En général, les HE extraites de Origanum syriacum ont signé

une activité antioxydante significative, mais relativement inférieure à la propriété

antioxydante de la vitamine C. L'HE de Origanum syriacum peut être considérée

comme un antioxydant naturel à fort potentiel.

Mots clés : Origanum syriacum, HE, Activité antioxydante, Composition chimique,

Carvacrol

60

Abstract

The present study is part of the valorization of the essential oils of Origanum

syriacum, an aromatic plant of the Middle East acclimatized in Côte d'Ivoire. The

essential oils of the fresh and dried leaf stems were obtained by hydrodistillation

using a Clevenger extractor. The extraction gave different yields of essential oil

according to the time of drying. Dry leafy stems produced more essential oil

(0.49%) than fresh leafy stems (2.73%). The chemical composition of the essential

oils was analyzed by GC, GC-MS and 13C-NMR, which showed that they contained

24.3-33.2% hydrogenated monoterpenes, 64.9-72.9% oxygenates monoterpenes

and 0.8-1 .4% sesquiterpenes. The main components are carvacrol (61.5 - 69.8%),

y-terpinene (11.3-14.5%), p-cymene (4.3-6.8%) and myrcene (2.18 -2.89%).

The reduction test of the 2,2-diphenyl-1-picrilhydrazyl radical was used to

measure the antioxidant power of essential oils, in comparison with the vitamin C

taken as reference. ln general, essential oils extracted from Origanum syriacum

have a significant antioxidant activity, but relatively less than the antioxidant

properties of vitamin C. The essential oil of Origanum syriacum can be considered

a natural antioxidant with high potential.

Key words: Origanum syriacum, HE, Antioxidant activity, Chemical composition, Carvacrol

61

;{?~ ~ @û, d ''Juoûze ~ - 1)~ - ?'tM<U!,

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l'iAl'iGUIABROGOUA

Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UF-.R-Si;A)

Laboratoire de Chimie Bio-Organique et.de Substances Naturelles (LCBOSN)

Année Académique 2015-2016

ATTESTATION DE CQ.RRECTIO.N

Je soussigné, Mr BEKRO Yves-Alain, Professeur Titulaire à l'Université Nangui

Abrogoua, Président du jury de soutenance de mémoire de MASTER de Mlle

KOUAME,-Akissi Christelle Euphrasie, atteste que l'impétrant a pris en compte

toutes tes observations faites dans le cadre de la correction de son mémoire.

En foi de quoi, je lul délivre la présente attestation pour servir et valoir ce que de

droit.

Fait à Abidjan le ~o'1/<-=t:

Etude Phytochimique et Activité Antioxydante de l'Huile ...

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