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André Fioravante Guerra

Métodos de contagem microbiana

Valença, 1ª Edição, 2016. 28p.

Disponível em:

www.microbiologia-de-alimentos.com

étodos de contagem microbiana

Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. www.microbiologia-de-alimentos.com

MÉ TODOS DÉ CONTAGÉM MICROBIANA

Todo método de contagem microbiana deve ser validado e

comprovado como eficaz para esta finalidade.

Alguns métodos já são utilizados há muito tempo e a

eficácia deles já é comprovada. Dente estes, pode-se citar:

contagem em placas, contagem pela técnica de tubos

múltiplos, contagem em câmara de Neubauer etc.

Atualmente, com o avanço tecnológico na área da

computação e técnicas moleculares, há muitos métodos

rápidos de contagem microbiana. Todos estes métodos

devem ter sua eficácia comprovada. Para isso, eles devem

equivaler aos métodos convencionais e serem capazes de

gerar resultados seguros.

Há disponível uma diversidade de métodos rápidos de

detecção microbiana. Estes métodos, na maioria das vezes,

são métodos indiretos, mas fornecem resultados precisos

em um curto intervalo de tempo.

A maioria destes métodos são baseados em kits

comerciais. Aos quais os fabricantes informam o

procedimento de uso. Normalmente, são bastante simples

de usar, muitas vezes, nem precisa de um profissional

especializado em microbiologia de alimentos e um

laboratório de microbiologia.

As desvantagens dos métodos rápidos é o custo,

normalmente análises por testes rápidos são bem mais

custosas que pelos métodos convencionais.

Alguns métodos necessitam de equipamentos auxiliares e

softwares computacionais para realização da leitura. Estes

necessitam ser constantemente calibrados e validados

utilizando métodos de referência.

çã


DILUIÇA O DÉ AMOSTRAS

Os alimentos podem conter diferentes quantidades de microrganismos, podendo oscilar

de zero até bilhões. Os métodos de contagem microbianos devem ser capazes de contar

qualquer nível de contaminação.

Para isso, a estratégia utilizada é diluir a amostra, desta forma, a quantidade de

microrganismo também é diluída. Desta forma, em alguma diluição será possível

realizar a contagem.

Normalmente, as diluições são realizadas com fator de diluição 10. Usualmente, os

procedimentos de análise orientam a diluição de 1mL de alíquota em 9 mL de diluente

apropriado.

Para análise de alimento, a primeira diluição deve ser feita transferindo 25g ou mL do

alimento para 225 mL de diluente. Este procedimento é realizado para obter melhor

amostragem dos alimentos.

Outras diluições podem ser realizadas se determinadas previamente pelo laboratório.

Porém, deve-se manter a proporção de 1:9 para manter o fator de diluição de 10 vezes.

Na Tabela 1 está mostrado algumas diluições utilizadas para contagem de

microrganismos em alimentos.

Tabela 1 – Diluições de amostras de alimentos e bebidas Volume de alíquota (g ou mL) Volume de diluente (mL)

0,1 0,9 1 9

10 90 25 225 50 450

Na Figura 1 está mostrado um sistema de diluição até 10-6 (0,000001g/mL).

Figura 1 – Diluição de amostra.


Entendendo as diluições

Para preparar a diluição 10-1, deve-se transferir 25g ou mL para 225 mL de diluente.

Desta forma, esta é a diluição que contém 0,1g ou mL de amostra em 1 mL de solução.

Por conseguinte, para preparar a diluição 10-2, deve-se transferir 1mL da diluição 10-2

para outro tubo contendo 9 mL de diluente. Ao transferir uma alíquota de 1mL, na

verdade está transferindo 0,1g ou mL de amostra. Esta será diluída mais 10 vezes.

Assim, a diluição 10-2 é a que contém 0,01g ou mL de amostra em 1mL de solução.

Na Tabela 2 está mostrado a quantidade de amostra em cada nível de diluição. Tabela 2 – quantidade de amostra em cada nível de diluição por mililitro.

Nível da diluição Quantidade de amostra por mililitro (g ou mL)

10-1 0,1 10-2 0.01 10-3 0,001 10-4 0,0001 10-5 0,00001

Preparo das diluições

Para diluição das amostras, utiliza-se solução salina a 0,85% ou água peptonada a 0,1%

estéril. Os solutos adicionados à água de tem objetivo de manter a isotonia entre o

citoplasma celular e o diluente. Desta forma, evita-se a osmose entre estes dois meios.

Alguns alimentos necessitam de outros tipos de diluição. Na Tabela 3, está mostrado

alguns tipos de diluições especiais.


MÉ TODOS DIRÉTOS DÉ CONTAGÉM MICROBIANA

CONTAGEM EM PLACAS

A contagem em placas é o método mais comum de contagem de microrganismos

utilizada nos laboratórios de microbiologia.

Baseia-se na capacidade dos microrganismos se reproduzirem quando estão em meio de

cultura apropriado e na temperatura ótima de crescimento. A multiplicação microbiana,

após período de tempo de 24 a 48 horas, atinge bilhões de bactérias. O acúmulo destas

bactérias em um único loco da placa forma uma colônia visível ao olho humano. O

resultado é expresso como UFC (Unidade Formadora de Colônia) por unidade (peso,

volume, área etc).

Para expressar o resultado, é necessário contar as unidades formadoras de colônias. Em

uma placa de Petri, é possível contar até, aproximadamente, 300 UFC. Os manuais de

análises e as legislações específicas para microbiologia de alimentos estipulam limite

máximo e mínimo de contagem. Normalmente, o limite é entre 25 e 250 UFC, porém

alguns outros limites podem ser utilizados para algumas análises como, 15 - 150 ou 30 –

300 UFC/placa.

O limite máximo de contagem é estipulado devido a dificuldade de contagem de placas

contendo muitas UFC e o limite mínimo, devido a significância estatística do ensaio.

Para obter resultado mais significativo, a inoculação de cada diluição é executada em

duplicata. Portanto, o resultado de cada diluição, é a média da contagem das duas placas.

As formas mais comuns de executar a técnica são em profundidade e superfície. Porém,

algumas variações são bastante úteis, como a inoculação em microgota.

TÉCNICA EM PROFUNDIDADE

Alíquota de 1mL de cada diluição é transferida para placa de Petri vazia e estéril.

Posteriormente, o meio de cultura mantido líquido em banho termostático a 50 – 55°C é

adicionado à placa. A homogeneização é realizada com movimentos suaves em forma de

“8” sobre a bancada. Após solidificação, as placas são incubadas na temperatura ótima

de crescimento microbiano.


Na Figura 2 está mostrado a inoculação em profundidade

Cálculo e expressão dos resultados – regra de três

1° Passo – encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, será utilizado limite

mínimo de 25 e máximo de 250 UFC. Portanto, a diluição selecionada deve ser a 10-3.

2° Passo – calcular a média das contagens:

Média =45+41

2 = 43

3° Passo – a diluição 10-3 significa que há 0,001g ou mL de alimento em 1 mL de solução. Portanto, deve-se

fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento.

43 UFC ----------------------- 0,001g ou mL

x UFC ----------------------- 1g ou mL

x = 43000

Resultado = 4,3x104 UFC/g ou mL

Figura 2 – Inoculação em profundidade.


Exemplo 1:

Diluição Contagem (UFC)

10-1 0

10-2 0

10-3 0

Exemplo 2:


10-1 90 100

10-2 6 10

10-3 1 0

Exemplo 3:


10-1 >250 >250

10-2 90 100

10-3 6 10

Exemplo 4:


10-1 >250 >250

10-2 >250 >250

10-3 90 100

Exemplo 5:


10-1 >250 >250

10-2 >250 >250

10-3 >250 >250

Resultado = média x 1

nível de diluição x

1

volume da alíquota

Resultado = 43 x 1

10−3 x

1

1

Resultado = 43000

Cálculo e expressão dos resultados – fórmula

Alternativamente, pode-se utilizar a seguinte fórmula matemática para calcular o resultado.

Assim,


<1 UFC -------------------0,1g X ------------------- 1g

0,1x <1 X <1/0,1

X <10 UFC/g

95 -------------------0,1g X ------------------- 1g

0,1x = 95 X = 95/0,1

X = 950 X = 9,5 x102 UFC/g

95 -------------------0,01g X ------------------- 1g

0,1x = 95 X = 95/0,01

X = 9500 X = 9,5 x103 UFC/g

95 -------------------0,001g X ------------------- 1g

0,1x = 95 X = 95/0,001

X = 95000 X = 9,5 x104 UFC/g

>250 -------------------0,001g X ------------------- 1g

0,1x >250 X >250/0,001

X >250000 X >2,5 x105 UFC/g


TÉCNICA EM SUPERFÍCIE

Alíquota de 0,1mL de cada diluição deve ser transferida para placa de Petri já contendo

meio de cultura sólido. Posteriormente, a alíquota é espalhada sobre o meio com auxílio

de alça espalhadora (bastão tipo hockey ou alça de Drigalsky) até absorção completa da

alíquota pelo meio. Após, as placas são incubadas na temperatura ótima de crescimento

microbiano.

O volume máximo de alíquota que um meio de cultura, quando contido numa placa de

Petri de 9,1cm de diâmetro, consegue absorver é 0,3mL. Normalmente, na inoculação em

superfície, utiliza-se alíquota de 0,1mL. Porém, há casos que necessita inocular 1 mL de

cada diluição, neste caso, pode-se inocular 4 placas com volumes de: 0,3+0,3+0,3+0,1mL

ou 0,25+0,25+0,25+0,25mL.

Na Figura 3 está mostrado a inoculação em superfície

Figura 3 – Inoculação em superfície.




1

volume da alíquota

Resultado = 43 x 1

10−3 x

1

0,1

Resultado = 430000


1° Passo – encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, utilizaremos entre 25

e 250. Portanto, selecionaremos a diluição 10-3.


Média =45+41

2 = 43

3° Passo – a diluição 10-3 significa que há 0,0001g ou mL de alimento em 1 mL de solução. Porém, a alíquota

inoculada foi de 0,1mL, então:

1mL ----------------------- 0,001g ou mL

0,1mL --------------------- y

y = 0,0001g ou mL

4° Passo – fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento.

43 UFC ----------------------- 0,0001g ou mL

x UFC ----------------------- 1g ou mL

x = 430000



Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado.

Assim,



Exemplo 1:


10-1 0

10-2 0

Exemplo 2:


10-1 90 100

10-2 6 10

Exemplo 3:


10-1 >250 >250

10-2 90 100

Exemplo 4 :


10-1 >250 >250

10-2 >250 >250

Exemplo 5 :


10-1 10 16

10-2 0 0

<1 UFC -------------------0,01g X ------------------- 1g

0,01x = <1 X <1/0,01

X <100 UFC/g

0,1 g -------------------1 mL X ------------------- 0,1 mL

X = 0,01 g de alimento inoculado

0,1 g -------------------1 mL X ------------------- 0,1 mL

X =0,01 g de alimento inoculado

95 UFC -------------------0,01g X ------------------- 1g

0,01x = 95 X = 9500

X = 9,5 x 103 UFC/g

0,01 g -------------------1 mL X ------------------- 0,1 mL


95 UFC -------------------0,001g X ------------------- 1g

0,001x = 95 X = 95000

X = 9,5 x 104 UFC/g

0,01 g -------------------1 mL X ------------------- 0,1 mL


>250 UFC -----------------0,001g X ------------------- 1g

0,001x >250 X > 250000

X > 2,5 x 105 UFC/g

0,1 g -------------------1 mL X ------------------- 0,1 mL


13 UFC -----------------0,01g X ------------------- 1g

0,01x = 13 X = 13/0,01

X = 1,3 x 103 UFC/g est.

Obs- est. significa que o resultado foi estimado, visto que a contagem está abaixo do limite mínimo do ensaio.


TÉCNICA EM MICROGOTA

Alíquota de 0,025ml (25µL) de cada diluição deve ser transferida para placa de Petri já

contendo meio de cultura sólido. Posteriormente, a placa é deixada em repouso sobre

uma superfície plana até absorção da alíquota pelo meio. Após, as placas são incubadas

na temperatura ótima de crescimento microbiano.

A contagem em microgota possui como vantagens a economia de meio de cultura, tempo

e espaço. Porém, é necessário utilizar uma micropipeta calibrada, pois o volume de

inoculação é muito pequeno.

Na Figura 4 está mostrado a inoculação em superfície

Figura 4 – Inoculação em profundidade.




1

volume da alíquota

Resultado = 43 x 1

10−3 x

1

0,025

Resultado = 1720000


1° Passo – encontrar uma diluição entre os limites de contagem do método. Neste caso, deve-se utilizar limite

mínimo de 10 e máximo de 70. Portanto, deve-se selecionar a diluição 10-3.


Média =45+41

2 = 43

3° Passo – diluição 10-3 significa que há 0,001g ou mL de alimento em 1 mL de solução. Porém, a alíquota

inoculada foi de 0,025mL, então:

1mL ----------------------- 0,001g ou mL

0,025mL --------------------- y

y = 0,000025g ou mL

4° Passo – fazer uma regra de três para transformar em UFC por grama ou mililitro de alimento.

43 UFC ----------------------- 0,000025g ou mL

x UFC ----------------------- 1g ou mL

x = 1720000



Pode-se utilizar fórmula matemática para calcular o resultado.

Assim,



Exemplo 1:


10-1 0

10-2 0

Exemplo 2:


10-1 90 100

10-2 6 10

Exemplo 3:


10-1 >250 >250

10-2 90 100

Exemplo 4 :


10-1 >250 >250

10-2 >250 >250

Exemplo 5 :


10-1 1 3

10-2 0 0

<1 UFC ------------------ 0,0025g X ------------------- 1g

0,0025x = <1 X <1/0,0025

X < 400 UFC/g

0,1 g -------------------1 mL X ---------------- 0,025 mL


0,1 g -------------------1 mL X ------------------- 0,025 mL


95 UFC -------------------0,0025g X ---------------------- 1g

0,0025x = 95 X = 95/0,0025

X = 3,8 x 104 UFC/g

0,01 g -------------------1 mL X ------------------- 0,025 mL


95 UFC -------------------0,00025g X ----------------------- 1g

0,00025x = 95 X = 95/0,00025

X = 3,8 x 105 UFC/g

0,01 g -------------------1 mL X ------------------- 0,025 mL


>250 UFC -----------------0,00025g X ------------------- 1g

0,00025x >250 X > 250/0,00025

X > 1,0 x 106 UFC/g

0,1 g -------------------1 mL X ------------------- 0,025 mL


2 UFC ----------------- 0,0025g X ------------------- 1g

0,0025x = 2 X = 2/0,0025

X = 8,0 x 102 UFC/g est.

Obs- est. significa que o resultado foi estimado, visto que a contagem está abaixo do limite mínimo do ensaio.


Cálculo e expressão dos resultados – calculador eletrônico

Pode-se utilizar o calculador eletrônico disponibilizado no site: www.microbiologia-de-alimentos.com

Link para download: http://www.microbiologia-de-alimentos.com/software/

1° Passo – preencher a massa e o volume do diluente utilizado para realizar a primeira diluição;

2° Passo – indicar o limite mínimo e máximo do ensaio;

3° Passo – digitar a contagem de cada placa inoculada;

4° Passo – digitar a alíquota inoculada – profundidade (1mL), superfície (0,1mL) e microgota (0,025mL);

4° Passo – assinalar com um “x” a campo da diluição que se encontra dentro do limite da contagem.

No caso de ausência de crescimento nas placas, é necessário assinalar com um “x” o campo: ausência de

crescimento nas placas.

Da mesma forma, se na última diluição inoculada, a contagem ultrapassar o limite máximo de contagem, é

necessário assinalar com um “x” o campo: incontáveis.

http://www.microbiologia-de-alimentos.com/

http://www.microbiologia-de-alimentos.com/software/


Atualmente, o sistema de normatização ISO, estabelece uma nova forma de calcular o

resultado. O cálculo deve ser realizado como média ponderada de duas diluições. Assim,

há maior significância do resultado, pois duas diluições sucessivas são utilizadas o

cálculo.

Resultado = ∑ 𝑥

V (n1 + 0,1 n2)d

Resultado = 206

0,1 (2 + 0,1(2))0,1 = 9,4𝑥103 UFC/g ou mL

Cálculo e expressão dos resultados como média ponderada

Utiliza a seguinte fórmula:

Em que:

𝑥 - número de colônias em todas as placas selecionadas; n1 – número de placas selecionadas na primeira diluição; n2 – número de placas selecionadas na segunda diluição; V – é o volume de inóculo em cada placa, em mililitros; d - nível de diluição correspondente à primeira diluição selecionada (a suspensão inicial é uma diluição). Assim,


10-1 90 100

10-2 6 10

Então,

𝑥 = 90 +100 + 6 + 10 => ∑ 𝑥 = 206

V = 1mL (profundidade) / 0,1mL (superfície)

n1 = 2

n2 = 2

d = 10-1 => 0,1

Substituindo, considerando inoculação em superfície


CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER

A grande vantagem deste método de contagem microbiana é o fato de obter resultado já

no momento da execução da técnica. Ou seja, não é necessário incubação por um período

de 24 – 48 horas, como ocorre nos métodos de contagem em placas.

Por isso, é um método bastante útil para contagem de microrganismos em processos de

fermentação.

Para contagem, utiliza-se uma placa denominada câmara de Neubauer. A contagem é

feita com auxílio de um microscópio óptico utilizando a objetiva de 40 ou 100x.

A câmara é calibrada para conter um volume específico de inóculo de 0,0001mL, por

isso, o resultado pode ser expresso por unidade de volume ou peso de amostra.

Para executar a técnica, é necessário diluir a amostras numa proporção de 1:1 com azul

de metileno ou eritrosina. Após homogeneização, transfere-se uma alíquota para a mesa

da câmara de forma a cobrir toda superfície da leitura. O campo de leitura de uma

câmara de Neubauer está mostrado na Figura 5.

Figura 5 – Campo de leitura de uma câmara de Neubauer

Pode-se observar que a placa é dividida em 9 quadrantes, cada um deles contém 25 sub-

quadrantes. Cada quadrante pode ser separado em 3 tipos. As diferentes divisões dos

quadrantes servem para contar microrganismos de diferentes tamanhos.


Cada aresta do campo de leitura da câmara mede 3mm. Portanto, a área total da placa

mede 9mm2. Com a lamínula, o poço de leitura fica com uma profundidade de 0,1mm.

Portanto, o volume total da placa é de 0,9mm3.

Para contagem microbiana, normalmente seleciona-se apenas 1 dos 9 quadrantes, neste

caso, o volume selecionado para leitura é de 0,1mm3 (0,9mm3/9).

No quadrante selecionado para contagem, contar pelo menos 5 sub-quadrantes (os dos

cantos superiores, os dos cantos inferiores e o quadrado central).

Com os valores obtidos na contagem dos 5 sub-quadrantes, determinar o valor do

quadrado médio, que é a média aritmética dos quadrantes contados.

O valor do quadrante médio deve ser multiplicado por 25, que é o número total de sub-

quadrantes contidos no quadrante de contagem.

O valor obtido está em um volume de 0,1mm3. Convenientemente, este valor deve ser

transformado para cm3, pois 1cm3 equivale a 1mL. Em contrapartida, 1cm3 equivale a

1000mm3. Portanto, o número de células obtido na contagem, está em 0,0001mL. Então,

pode-se assumir que para expressar o resultado em células por mL, pode-se multiplicar

o número de células contadas pelo fator de 10000. Assim, o resultado já estará expresso

em células/mL.

Para obter o resultado final, ainda falta multiplicar o número de células/mL pelo fator de

diluição inicial da amostra (amostra + corante).

Há casos em que é necessário diluir a amostra antes de fazer a mistura com o corante.

Isso ocorre quando o número de células é muito alto. Neste caso, o resultado final deve

ser multiplicado pelo fator de diluição:

Fator de diluição = 1

nível de diluição


Quad médio = 210

5 = 42

Quad total = 42 × 25 = 1050

Quad total = 1050 × 10000 = 10500000

Quad total = 10500000 × 2 = 21000000

Cálculo e expressão dos resultados

1° Passo – encontrar o tipo de quadrante mais adequado para a contagem. Selecionar e contar as células

contidas em, pelo menos, 5 sub-quadrantes

Quad 1 = 50 células Quad 2 = 20 células Quad 3 = 40 células Quad 4 = 90 células Quad 5 = 10 células Total = 210 células

2° Passo – calcular o quadrado médio

3° Passo – calcular o quadrado total

4° Passo – transformar para células/mL

5° Passo – corrigir o fator de diluição inicial da amostra

Resultado = 2,1x107 células/mL

Cálculo usando o calculador eletrônico

Disponível no site: www.microbiologia-de-alimentos.com Download link: http://www.microbiologia-de-alimentos.com/software/ Item – Calculador contagem em câmara de Neubauer. Valença, 1ªEd., 2016.exe

1° Passo – preencher o número de sub-quadrantes selecionados para contagem;

2° Passo –anotar a contagem obtida em cada sub-quadrante;

3° Passo –indicar os volumes de amostra e corante utilizado;

4° Passo – assinalar com um “x” a diluição selecionada para a contagem

5° Passo –o resultado será calculado automaticamente.



MÉ TODOS INDIRÉTOS DÉ CONTAGÉM MICROBIANA

TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS

É um método estatístico de contagem microbiana. A unidade de expressão do resultado é “número mais provável de unidade formadora de colônia por grama ou mililitro” (NMP/g ou mL).

Há tabelas específicas para análise microbiológica de água que expressa o resultado como NMP/100 mL.

A tabela de número mais provável para alimentos, estabelece a inoculação de 3 níveis de diluição em 3 tubos. Por isso, são denominadas tabelas de número mais provável por grama ou mL, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001g ou mL.

Neste caso, deve-se inocular 3 tubos de cada diluição com 1mL cada.

Para detecção dos tubos positivos, é necessário um meio de diferenciação. Isto pode ser conseguido com adição de um tubo de Duhran invertido no interior de meio, como ocorre na análise de coliformes pela técnica de tubos múltiplos.

Na Figura 6 está mostrado a técnica de tubos múltiplos.

Figura 6 – inoculação pela técnica de tubos múltiplos


A técnica de tubos múltiplos é bastante útil para detecção de poucas quantidades de

microrganismos. Esta técnica permite detecção de até 0,3NMP/g ou mL de alimentos.

Este nível de detecção não é possível quando se utiliza o método de contagem em placas.

Para expressar o resultado, é necessário o auxílio de uma tabela de número mais

provável. Na Figura 7 está mostrado uma tabela de número mais provável para

alimentos.

Figura 7 – Tabela de Número mais Provável.


Executando a análise conforme a Figura 7, os limites mínimo e máximo de detecção do

ensaio é <3,0 e >1100NMP/g ou mL, respectivamente. Há como diminuir e aumentar o

limite de detecção do teste.

Para diminuir, é necessário inocular 1mL de diretamente do alimento (alimentos

líquidos) ou 10mL da diluição 10-1 (alimentos sólidos). Neste último caso, é necessário

preparar a primeira série de tubos com dupla concentração e contendo exatamente

10mL. Este procedimento tem como objetivo evitar a diluição da amostra, visto que os

10mL de meio em dupla concentração, será diluído com 10mL de líquido da primeira

diluição. Desta forma, a concentração final será a concentração recomendada pelo

fabricante.

Para aumentar o nível de detecção do teste, basta acrescentar mais tubos de diluição e

diluir mais a amostra.

Na Figura 8 e 9 estão mostrados como proceder para diminuir e aumentar o nível de

detecção do ensaio, respectivamente.

Figura 8 – Técnica de tubos múltiplos com limite de detecção reduzido.


Figura 9 – Técnica de tubos múltiplos com limite de detecção aumentado.

Cálculo e expressão dos resultados - TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL

1 – Anotar o número de tubos positivos em cada diluição; 2 – A quantidade de tubos positivos deve ser arranjados em uma única linha da maior para a menor diluição: Exemplo:

10-1 10-2 10-3

2 1 0

Neste caso, a combinação de tubos a ser considerada é: 2 1 0 3 – Encontrar a combinação na Tabela de NMP. Exemplo: Número Mais Provável por grama ou mL, para séries de 3 tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiança 95%.

Número de Tubos Positivos

NMP/g ou mL Intervalo de Confiança (95%)

10-1 10-2 10-3 Inferior Superior

0 0 0 <3,0 - - 9,5

2 1 0 15 3,7 42

3 3 3 >1100 420 - -

4 – Observar se a diluição utilizada para obter a combinação coincide com a diluição da Tabela NMP. 5 – Se coincidir, o NMP expresso na quarta coluna da Tabela NMP já é o resultado. Caso contrário, o resultado da quarta coluna deve ser multiplicado pela razão (divisão) entre a diluição mais concentrada inoculada e a primeira diluição da Tabela NMP.


Cálculo e expressão dos resultados - TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL ELETRÔNICA

Disponível no site: www.microbiologia-de-alimentos.com Download link: http://www.microbiologia-de-alimentos.com/software/ Item – Tabela NMP-g ou mL. Série de 3 tubos. Inóculo 0,1; 0,01 e 0,001 g. Valença, 1ª Ed. 2015.exe Tabela NMP-100 mL - Série de 10 tubos - Inóculo de 10 mL.Valença, 1ª Ed. 2015.exe Tabela NMP-100 mL - Série de 5 tubos - Inóculo de 10; 1; 0,1 mL.Valença, 1ª Ed. 2015.exe Tabela NMP-100 mL - Série de 5 tubos - Inóculo de 10 mL.Valença, 1ª Ed. 2015.exe

Neste caso, deve-se digitar a combinação de tubos positivos após teste de confirmação em caldo verde

brilhante ou Escherichia coli, e o resultado é gerado automaticamente. Também é necessário fazer a correção

se a diluição mais concentrada utilizada para gerar o resultado não coincidir com a primeira diluição da Tabela

NMP.

Exemplo:




MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

É um método indireto de contagem microbiana baseado na propriedade de turvação do

meio de cultura quando há crescimento microbiano.

O nível de turvação do meio de cultura é medido em um espectrofotômetro e expresso

como absorvância ou transmitância.

Para medida do crescimento microbiano, é necessário utilizar um tubo contendo o

mesmo meio de cultura de crescimento, porém sem inóculo. Este tubo será utilizado

para zerar o equipamento e descontar a quantidade de luz que o meio sem crescimento

microbiano absorve. Desta forma, a diferença de luz absorvida entre o tubo com

crescimento e sem crescimento, é a quantidade de crescimento microbiano.

A expressão do resultado pode ser em unidade de absorvância ou transmitância, porém

pode-se expressar o resultado como UFC/g ou mL através da confecção de uma curva de

calibração.

Neste caso, é necessário obter uma quantidade considerável de amostra (normalmente

por centrifugação e eliminação do sobrenadante), seguido de diluição em vários níveis

de forma a contemplar toda faixa de extensão da leitura do espectrofotômetro

(absorvância 0,2 – 0,8). O monocromador do equipamento deve estar ajustado para 620

λ.

Construção da curva de calibração

1° Passo – ativação do inóculo

2° Passo – centrifugação, lavagem do pellet com tampão fosfato pH 7,2 e centrifugação. Este

procedimento deve ser repetido duas vezes e tem como objetivo eliminar interferentes na leitura no

espectrofotômetro;

3° Passo – adicionar quantidade suficiente de tampão ao pellet de modo a conferir absorbância de 0,800 à 600λ; 4° Passo – a partir do tubo ajustado no 3° passo, preparar mais quatro diluições transferindo os respectivos volumes de alíquota e tampão: 1:1; 1:5; 1:9; 1:99; 5° Passo – ler e anotar a absorvância de todos os tubos no espectrofotômetro ajustado para 600 λ; 6° Passo – fazer a contagem de UFC/g ou mL por alguma técnica de contagem (profundidade, superfície ou microgota); 7° Passo – plotar um gráfico de dispersão absorvância x UFC/g ou mL. Solicitar regressão linear para avaliar a melhor equação representativa dos dados experimentais. Avaliar o valor de “R” e “R2”.


Cálculo de UFC/g ou mL de uma amostra

1° Passo – tomar uma amostra e mensurar a absorvância no mesmo comprimento de onda selecionado

para construção da curva de calibração;

2° Passo – se a absorvância estiver no intervalo entre 0,2 e 0,8, este valor já pode ser utilizado para

cálculo de UFC/mL. Caso contrário, deve-se diluir ou concentrar a amostra até conseguir absorvância

nesta faixa de linearidade;

3° Passo –o valor da absorvância é o “y” da equação. O valor de “x” é a quantidade de UFC/g ou mL;

4° Passo – se tiver sido necessário diluir a amostra. O valor de “x” (UFC/g ou mL) ainda deve ser

multiplicado pelo fator de diluição.

Exemplo – curva de calibração de Saccharomyces cerevisiae

Leitura das diluições

Diluições Absorvância (600λ)

leitura ajustada 0.800

1:1 0.635

1:5 0.422

1:9 0.321

1:99 0.186

Contagem das células em câmara de Neubauer

Absorvância 600λ

células/mL Log células/mL

0.800 1200000 6.1

0.635 1000000 6.0

0.422 500000 5.7

0.321 190000 5.3

0.186 120000 5.1

Plotagem do gráfico

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ab

sorv

ânci

a 6

00λ

Log células/mL


𝑦 = 0.5386𝑥 − 2.5578 0.532 = 0.5386𝑥 − 2.5578 0.532 + 2.5578 = 0.5386𝑥 𝑥 = 5.74 log 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿

𝑥 = 5.4𝑥105 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿

𝑦 = 0.5386𝑥 − 2.5578 𝑦 = 0.5386(5.40) − 2.5578

𝑦 = 0.349

𝑦 = 0.5386𝑥 − 2.5578 0.632 = 0.5386𝑥 − 2.5578 0.632 + 2.5578 = 0.5386𝑥 𝑥 = 5.92 log 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿

𝑥 = 3.3𝑥106 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿

Inserir linha de tendência e exibir equação

Problema 1 – descobrir a quantidade de células/mL de um crescimento overnight de Saccharomyces cerevisiae Absorvância da amostra => 0.532 (suposição) Este valor é o “y” da função. Para descobrir a quantidade de células/mL basta substituir na equação

Resolvendo log de 5.74

Problema 2 – ajustar um inóculo de Saccharomyces cerevisiae para conter exatamente 2,5x105 células/mL Este é o valor “x” da equação, substituindo: Log de 2,5x105 é de 5.40, portanto:

Ajustar a absorvância (600λ) do inóculo para 0.349

Problema 3 – descobrir a quantidade de células/mL de um crescimento overnight de Saccharomyces cerevisiae Absorvância da amostra => 1.567 (suposição) Diluir a amostra até a faixa de leitura Diluindo a amostra na proporção de 1:3 Absorvância da amostra => 0.632

Resolvendo log de 5.74

𝑥 = 8.4𝑥105 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 x 4 (fator de diluição)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ab

sorv

ânci

a 6

00λ

Log células/mL


BIBLIOGRAFIA

TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 10.ed. Porto Alegre: Artmed, c2012. xxviii, 934 p., il., color. ISBN 9788536326061 (enc.).

PELCZAR, Michael Joseph; CHAN, E. C. S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2.ed. São Paulo: Pearson Education: Makron Books, 1997. 2v., il. (algumas color.), tabs. Inclui apêndice, glossário e índice. ISBN v.1 9788534601962 (Broch.).

BAM - BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL On Line . U.S. Food and Drug Administration. Departmente os Health and Human Services, 2001.

NEDER, Rahme Nelly. Microbiologia : manual de laboratório. São Paulo: Nobel, 2004. [138], il. Bibliografia : p. [138]. ISBN 8521307152 (Broch.).

MADIGAN, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de Brock. 10. ed. São Paulo: Prentice Hall, 2004. 608 p., il. Inclui bibliografia e índice. ISBN 9788587918512

KRIEG, N. R. & HOLT, J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed. Vol 1,2,3,4 - Willians & Wilkins Inc. N. York. 1984.

DOWNES, F.P. & ITO, K. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Washington, D.C.: American Public Health Association (APHA), 2001.120p.

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