UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁINSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGARMA DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSUESPECIALIZAÇÃO EM MICROBIOLOGIA

ETIOLOGIA DA BABESIOSE BOVINA NA ILHA DO MARAJÓ, PARÁ

DiscentesKácio Lenon Silva BragaMaurício Oliveira Coelho MarquesThais Nascimento Kimmemgs

OrientadorProf. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves

BELÉM2016

INTRODUÇÃO• Hemoparasitose – Protozoários do filo Protozoa, subfilo Apicomplexa

(GUGLIELMONE, 1995; SEQUEIRA & AMARANTE, 2001; BROWMAN, 2006).

• Em todo mundo, sete espécies são capazes de infectar bovinos (UILENBERG, 2006).

– Babesia bigemina e Babesia bovis

• A transmissão da doença no Brasil é dada pelo carrapato da espécie Boophilus microplus (FARIAS, 2007).

Boophilus microplus Fonte: http://www.uniprot.org/taxonomy/6941

INTRODUÇÃO

- Anemia hemolítica intravascular;- Febre;- Hemoglobinemia;- Hemoglobinúria; - Morte do hospedeiro. (EVERITT et al., 1986).

PRINCIPAIS SINTOMAS

Fonte: http://www.revistaveterinaria.com.br/2012/04/24/

INTRODUÇÃO• Babesiose + Anaplasmose (Anaplasma marginale)– Tristeza Parasitária Bovina (TPB)

• Distribuição em áreas de ocorrência:– Áreas livres;– Áreas de estabilidade enzoótica;– Áreas de instabilidade enzoótica (GONÇALVES, 2000).

INTRODUÇÃO• Babesiose cerebral – B. bovis– Incoordenação motora;– Hiperexcitabilidade;– Cegueira;– Tremores musculares (ANTONIASSI et al., 2009).

• Brasil - babesiose bovina bezerros– Queda da imunidade ao nascer (MADRUGA et al., 1984).

– Infecções assintomátias – reinfecções (GONÇALVEZ, 2000).

Opistótono

Fonte: http://www.pvb.com.br/pdf_artigos

INTRODUÇÃO• Estudos apontam o Brasil como país enzoótico;• Altas taxas de transmissão dos agentes;– Região Sul e Sertão Nordestino;

(GONZALES, 1995; LIMA et al., 1999; SANTOS et al., 2001).

• Região Norte– Clima altamente favorável;– Poucos estudos.

OBJETIVO• Assim, considerando, a carência de estudos, em

especial no Estado do Pará, este trabalho objetivou identificar a etiologia de um surto de síndrome febril neurológica, característico de babesiose, em bovinos de uma fazenda da Ilha do Marajó, Pará.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostragem• 24 animais da raça Nelore; – Maio de 2015.– Fazenda Menino Deus, Ilha do Marajó, Pará.

• Rebanho de aproximadamente 3.100 bovinos– 80% Bos indicus e 20% Bos taurus.– 100 vieram a óbito.

MATERIAIS E MÉTODOS

• 3 mL de sangue; – Auxílio de tubos vacutainer.– Ácido etilenodiaminotetracético - E.D.T.A.

• Laboratório de Tecnologia Biomolecular - LTB/UFPA;

– Sambrook et al. (1989).

Diagnóstico Molecular• Detecção de Babesia;– Nested PCR– ApiF e ApiR (CACCIÒ et al., 2002)

– BabF (MARTIN et al., 2006) e Babesia common (KORDICK et al., 1999)

• Realizadas em volumes de 25 µL;• 10-20 ng DNA genômico; 2,5 mM MgCl2; 125 mM de

cada dNTPs; 10 mM Tris-HCl; 50 mM KCl; 5 µM de cada iniciador (ApiF e ApiR) e 1 U Taq DNA polimerase.

• Segunda reação:– 1µL do produto da primeira reação e 5 µM de

cada iniciador BabF e Babesia common.

• Termociclagem;– 35 ciclos de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 58ºC e 1

minuto a 72ºC, precedida por 5 minutos a 94ºC e seguido de 5 minutos a 72ºC.

– T. de associação dos iniciadores: 65ºC.• Controle positivo;– Babesia vogeli (LTB)

• Controle negativo– água bidestilada estéril

• Produtos visualizados por eletroforese– gel de agarose 1% em Tris-Acetato-EDTA (TAE)– Reagente fluorescente DNA - GelRed™– transiluminador UV

• Amplicons – BabF e Babesia common – 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

• BioEdit (HALL, 1999)

– Alinhar sequências direta e reversa. • National Center for Biotechnology Information

(NCBI).• Sensibilidades dos protocolos de PCR simples

e nested PCR– McNemar– BioEstat 5.3 software (AYRES et al., 2007)

• Todas as amostras de DNA mostraram graus de pureza e integridade satisfatórios para a realização dos testes. Assim, das 24 amostras analisadas, 14 foram consideradas positivas, dada a produção de amplicons de ~350 pares de bases na segunda reação da nested PCR. As sequências obtidas resultaram em dois haplótipos distintos, sendo que duas sequências apresentaram o haplótipo com 322 nucleotídeos, enquanto 12 sequências apresentaram o haplótipo que contém 339 nucleotídeos;

• NCBI: < sequência = B. bovis; > sequência = B. bigemina;

• PCR simples x nested PCR.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Prevalência (%) Método Local Referência

B. bovis B. bigemina

19,04 12,87 RIFI MS Madruga et al. (1983)

82,53 79,09 ELISA MG Patarroyo et al. (1987)

- 87,90 ELISA PE Alves et al. (1987)

- 97,50 ELISA GO Linhares et al. (1992)

88,00 94,00 RIFI SP Barci et al. (1994)

41,01 4,09 Análise de dados RS Almeida et al. (2006)

7,20 0,89 nested PCR AC Embrapa (2007)

9,00 3,09 nested PCR RO Embrapa (2007)

15,00 16,00 PCR PA Silva et al. (2013)

24,87 20,75 ELISA PA Silva et al. (2013)

Tabela 1 – Prevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina no território brasileiro.

De acordo com a população estudada e o método de detecção utilizado, a prevalência de B. bovis e B. bigemina, no Brasil, é amplamente variável. Esses dados sugerem que a prevalência no norte brasileiro seja menor que aquela das regiões mais ao sul

CONCLUSÃO• Apesar do Estado do Pará possuir estabilidade enzoótica,

ainda há a precariedade de estudos na área. Os resultados deste trabalho apontam altas taxas de hospedeiros infectados por Babesia bovis e Babesia bigemina.