Protein Interaction Network Uncovers Melanogenesis Regulatory ...
Ethanol-modulated camouflage response screen in zebrafish uncovers a novel role for cAMP and ERK...
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[email protected] Caio Maximino Laboratório de Neurociências e Comportamento Laboratório de Neuroendocrinologia
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Ethanol-modulated camouflage response screen in zebrafish uncovers a novel role for cAMP and ERK signaling in behavioral sensitivity to ethanol
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Caio MaximinoLaboratório de Neurociências e Comportamento
Laboratório de Neuroendocrinologia
A resposta aguda ao álcool segue uma curva de Yerkes-Dodson
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hiperlocomoção
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção• Animais adultos.
• Distribuição vertical eliciada pela novidade.
• Exposição aguda ou crônica (0.3% v.v.).
• Medidas: Latência, freqüência e duração das transições à porção superior do aquário, movimentos erráticos (“ansiedade”); distância total percorrida e velocidade média (“atividade”)
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A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
hiperlocomoção• Animais adultos.
• Exposição a um modelo de predador.
• Exposição aguda (0.25-1.0% v.v.) ou crônica (0.25% v.v. por 2 semanas).
• Medidas: distância em relação ao modelo (“ansiedade”), distância total percorrida (“atividade”).
A resposta aguda ao álcool implica em ansiólise e
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Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
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Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)• Larvas (6 d.p.f.).
• Locomoção em campo aberto.
• Exposição aguda (1-4% v.v.).
• Medida: atividade locomotora no claro e no escuro.
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
Um efeito similar pode ser observado em larvas (6 d.p.f.)
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A resposta aguda ao álcool é altamente similar em diferentes
espécies
A resposta aguda ao álcool é altamente similar em diferentes
espécies• A Drosophila mutante cheapdate sugere
que a sinalização por AMPc é necessária para suprimir a sensibilidade comportamental ao álcool (Moore et al 1998).
• Camundongos knocked-out dos genes que codificam as isoformas 1 ou 8 da adenilato ciclase apresentam maior sedação em resposta ao álcool (Maas et al. 2005).
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MÉTODOS & RESULTADOSMÉTODOS & RESULTADOS
Ethanol-modulated camouflage response screen in zebrafish uncovers a novel role for cAMP and ERK signaling in behavioral sensitivity to ethanol
SujeitosSujeitos
• Larvas (6 d. p. f.) da cepa AB.
• Larvas fan (background AB x Tübingen).
• DNA genômico extraído de 20 larvas AB e 20 larvas fan, e ampliado com PCR e primers para D. rerio.
Genotipagem da mutação fanGenotipagem da mutação fan
• Painel de 2976 embriões fan.
• Mutação nonsense no primeiro éxon do gene para AC5.
• Hibridização in situ indica que a AC5 é expressa no cérebro de larvas AB normais.
fan induz produção de AMPc em células HEK293
fan induz produção de AMPc em células HEK293
Detecção de fosfo-ERKDetecção de fosfo-ERK
• Anticorpo anti-ERK fosforilada em diluição 1:1000.
• Análise de secções do cérebro de larvas AB normais e mutantes.
• Tratamento com PD98059 (inibidor da MEK), 0 ou 50 μM.
Ensaios para captação e metabolismo do etanol
Ensaios para captação e metabolismo do etanol
• Imersão de 120 larvas (AB ou fan) em etanol 3% v.v.
• Retirada de 40 larvas após 4, 10 ou 16 min.
• Larvas homogeneizadas em 500 μL de Tris-HCl 50 mM; homogenatos centrifugados a 14000 rpm (4° C por 20 min.)
• Kit de ensaio de etanol (Diagnostic Chemicals Ltd.)
Ensaios comportamentaisEnsaios comportamentais
• Resposta pigmentar: Exposição a luz ambiente por ~20 min.; medida de saturação dos melanócitos.
• Atividade locomotora: velocidade instantânea de deslocamento em campo aberto (5 x 4 x 2 cm).
