Estudo de polimorfismos no locus do gene CDX2 em Portugal...
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Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular
Estudo de polimorfismos no locus do gene
CDX2 em Portugal e Moçambique.
Relação com o desenvolvimento da metaplasia
intestinal gástrica
Nuno Miguel Morais Mendes
2008
- 2 -
DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA
AO GRAU DE MESTRE
APRESENTADA À FACULDADE DE
MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO
PORTO
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Artigo 48.º, parágrafo 3:
“A Faculdade não responde pelas doutrinas expendidas na dissertação.”
(Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto – Decreto n.º 19337
29 de Janeiro de 1931)
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar um agradecimento muito especial à minha chefe, Prof. Leonor
David, pela forma como me recebeu no grupo, pelo apoio, pela força, pelo incentivo e
pela confiança que sempre depositou em mim ao longo destes quase 6 anos de trabalho
e convívio diários. É uma honra trabalhar consigo…
À Raquel Almeida, minha orientadora, agradeço a amizade e a forma como me ajudou a
“desligar o complicador” e a organizar este trabalho.
Agradeço à Prof. Leonor Gusmão, minha co-orientadora, pela paciência e tempo
disponibilizados durante o procedimento experimental e pela ajuda na análise e
interpretação de resultados. Não foi fácil entrar no mundo da Genética Populacional!
À Sandra Beleza: obrigado pelas horas que “perdeste” comigo, pela forma como me
entusiasmaste e ajudaste numa altura complicada. Parte deste trabalho é teu!
Agradeço à Luísa Azevedo pela ajuda preciosa na fase da discussão dos resultados, pela
disponibilidade que sempre teve e pela forma como me transmitiu muitos conceitos da
Genética Populacional de modo a fazerem sentido.
Agradeço ao Prof. Sobrinho-Simões, Director do Mestrado em Medicina e Oncologia
Molecular e Director do IPATIMUP, pela oportunidade de realizar este Curso.
Agradeço à Fundação Calouste Gulbenkian pelo financiamento do projecto que permitiu
a realização deste trabalho.
Agradeço à Elisabetezinha pela ajuda e apoio constantes ao longo da execução deste
trabalho e pelas conversas animadas de fim de tarde!
A todo o grupo das mucinas e em particular àqueles que me ajudaram, “aturaram” e
ouviram ao longo deste percurso. Obrigado Ana Maria, Ana Carvalho, Bruno (obrigado
pelas imagens!), Salomé, Lara, Natália e Vânia. Obrigado pelas conversas, pela boa
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disposição que sempre transmitiram e pelas “dicas” informáticas que muito me
ajudaram! Não posso deixar de agradecer a algumas pessoas que embora já não estejam
no Instituto, foram muito importantes no início da minha caminhada pelo mundo da
investigação: obrigado Jace, Patrícia e Sandra!
Aos meus pais e irmão que estão sempre do meu lado e me apoiam em tudo. Obrigado
pela força, confiança, carinho e paciência.
Por fim e não menos importante, agradeço a quem esteve comigo nesta última fase e me
apoiou sempre com muito carinho e compreensão.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian, projecto
n.º FC-68697 – “Estudo de factores biológicos e de estilos de vida que
contribuam para perceber as diferenças entre a incidência de carcinoma
gástrico em dois países com grande prevalência de infecção por
Helicobacter pylori: Moçambique e Portugal”
ÍNDICE
ABREVIATURAS--------------------------------------------------------------------------------9
RESUMO------------------------------------------------------------------------------------------11
ABSTRACT---------------------------------------------------------------------------------------13
CAPÍTULO I – Introdução--------------------------------------------------------------------15
1.1. Carcinogénese gástrica-------------------------------------------------------------15
1.2. Metaplasia intestinal- definição e caracterização-------------------------------17
1.3. Factores de susceptibilidade no desenvolvimento de MI----------------------19
1.4. CDX2 e metaplasia intestinal------------------------------------------------------22
1.5. Situação em África- o “Enigma Africano”--------------------------------------23
CAPÍTULO II – Objectivos-------------------------------------------------------------------25
CAPÍTULO III – Materiais e Métodos------------------------------------------------------27
3.1. Amostragem populacional---------------------------------------------------------27
3.1.1. Selecção das amostras------------------------------------------------------------28
3.1.2. Efectivo amostral-----------------------------------------------------------------29
3.2. Selecção dos “Single Nucleotide Polymorphisms”-----------------------------29
3.2.1. Desenho dos oligonucleótidos para PCR--------------------------------------31
3.3. Amplificação por “PCR Multiplex”----------------------------------------------32
3.3.1. Purificação dos produtos de “PCR multiplex”--------------------------------33
3.4. Desenho dos oligonucleótidos para SBE----------------------------------------34
3.5. Reacção de SnaPshot® multiplex-------------------------------------------------35
3.5.1. Análise das amostras no “ABI PRISM 3100 Genetic Analyser”-----------37
3.6. Análise estatística-------------------------------------------------------------------37
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CAPÍTULO IV – Resultados------------------------------------------------------------------39
4.1. Polimorfismos analisados no locus do gene CDX2----------------------------40
4.2. Minisequenciação por SNaPshot multiplex®------------------------------------40
4.3. Frequências alélicas-----------------------------------------------------------------42
4.4. Caracterização e representação haplotípica--------------------------------------44
4.5. Análise do Equilíbrio de Hardy-Weinberg--------------------------------------49
4.6. Análise de Linkage Disequilibrium-----------------------------------------------50
4.7. Análise de Variância Molecular – AMOVA------------------------------------52
4.7.1. AMOVA total---------------------------------------------------------------------52
4.7.2. AMOVA para cada marcador---------------------------------------------------54
CAPÍTULO V – Discussão---------------------------------------------------------------------57
CAPÍTULO VI – Conclusão-------------------------------------------------------------------70
ANEXO I ------------------------------------------------------------------------------------------71
CAPÍTULO VII - Referências Bibliográficas----------------------------------------------72
Abreviaturas
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ABREVIATURAS
ADN- Ácido desoxirribonucleico
AMOVA- Análise de Variância Molecular
BabA- “Blood-group antigen binding adhesin A”
CagA- “Cytotoxin associated gene A”
CCR- Carcinoma do cólon e recto
DAPI- 4’,6-diamidino-2-fenilindole
FST- Índice de Fixação
H. pylori- Helicobacter pylori
HWE- Equilíbrio de Hardy-Weinberg
IGFBP-3- “Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3”
IL- Interleucina
LD- “Linkage Disequilibrium”
LOH- Perda de Heterozigotia
MI- Metaplasia intestinal
MUC1- Mucina tipo 1
MUC2- Mucina tipo 2
MUC5AC- Mucina tipo 5AC
MUC6- Mucina tipo 6
PCR- “Polymerase Chain Reaction”
SBE- “Single Base Extension”
SNP- “Single Nucleotide Polymorphism”
Tm- Temperatura de “melting”
TNF- “Tumor Necrosis Factor”
Abreviaturas
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VacA- “Vacuolating associated cytotoxin A”
VNTR- “Variable Number of Tandem Repeat”
Resumo
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RESUMO
O carcinoma gástrico constitui a segunda causa de mortalidade associada ao cancro no
mundo. Uma grande parte dos casos de carcinoma gástrico de tipo intestinal é explicada
pela inflamação crónica da mucosa gástrica provocada pela infecção pela H. pylori. Esta
infecção desencadeia uma série de eventos na mucosa gástrica tais como gastrite,
gastrite crónica atrófica e, em alguns casos, metaplasia intestinal (MI). Entre populações
Europeias e Africanas há uma grande diferença na proporção de indivíduos que
desenvolvem metaplasia intestinal no contexto da infecção pela H. pylori. Um dos
factores envolvidos na infecção e desenvolvimento de lesões gástricas associadas reside
nas características genéticas do hospedeiro. Num indivíduo adulto, o gene CDX2 é o
“master gene” envolvido no estabelecimento e manutenção do epitélio intestinal normal
e o seu papel na transdiferenciação da mucosa gástrica em mucosa de tipo intestinal
encontra-se bem definido e caracterizado. Contudo não há estudos que relacionem
polimorfismos no gene CDX2 com o desenvolvimento de MI. Um dos objectivos deste
trabalho consistiu no estudo da distribuição das variantes alélicas de 8 SNPs no locus do
gene CDX2 em duas populações, Portuguesa e Moçambicana, em indivíduos com e sem
MI. Identificamos um SNP (rs9285356) na população Portuguesa que se associa
significativamente (P≤0,05) com a MI e, na população Moçambicana, um SNP
(rs3812862) no promotor do CDX2 potencialmente associado com a MI. Verificamos
haver, para este SNP, um aumento significativo de indivíduos homozigóticos T no
subgrupo MI- em comparação com o subgrupo MI+. O segundo objectivo deste trabalho
foi estudar a distribuição haplotípica dos 8 SNPs nas duas populações, Portuguesa e
Moçambicana, em indivíduos com e sem MI. Identificamos um haplótipo na população
Moçambicana que se associa significativamente com o subgrupo Moçambicano sem
Resumo ______________________________________________________________________________________________
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metaplasia intestinal (haplótipo H23). No último ponto deste trabalho verificamos que
não há indícios de ancestralidade genética europeia no subgrupo Moçambicano MI+ e
que não é este o factor envolvido na maior predisposição destes ao desenvolvimento de
MI, em relação à maioria da população.
Perante estes achados, a realização de estudos funcionais e o aumento do efectivo
amostral do subgrupo Moçambicano com MI são tarefas fundamentais para suportar a
hipótese de que polimorfismos no gene CDX2 poderão ter um efeito “facilitador” ou
“inibidor” do desenvolvimento de MI.
Abstract ______________________________________________________________________________________________
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ABSTRACT
Gastric cancer constitutes the second leading cause of cancer-related death in the world.
The majority of intestinal-type gastric carcinomas are explained by chronic
inflammation upon H. pylori infection. This infection undergoes a cascade of events in
the gastric mucosa like gastritis, chronic atrophic gastritis and, in some cases, intestinal
metaplasia (IM). Among European and African populations there is a substancial
difference in the proportion of individuals that develop intestinal metaplasia after H.
pylori infection. The host genetic background constitutes an important factor involved
in the susceptibility to develop gastric alterations associated with the infection. In
adults, CDX2 is a master gene involved in the establishment and maintenance of the
normal intestinal epithelium. It plays a role in the transdifferentiation of the gastric
mucosa into an intestinal phenotype. However there are no studies focusing on CDX2
polymorphisms and the potential to develop gastric IM. The first aim of this work was
to study the allelic distribution of 8 SNPs in the CDX2 locus in two populations,
Portuguese and Mozambican, in subjects with and without intestinal metaplasia. We
identified a SNP (rs9285356) in the Portuguese population which is associated (P≤0.05)
with IM and a different SNP (rs3812862) in the Mozambican population located in the
promoter region of the CDX2 gene, with suggestion of a negative association with the
IM phenotype. We observed, for this SNP, a significant increase in homozygous
subjects with the T variant in the subgroup without IM. The second aim was to evaluate
the haplotypic distribution of the 8 SNPs in the two populations, Portuguese and
Mozambican, in subjects with and without IM. We identified a haplotype in the
Mozambican population associated (P≤0.05) with the subgroup without IM (H23
haplotype). We also show that there is no evidence of European genetic ancestry in the
Abstract ______________________________________________________________________________________________
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Mozambican subgroup with IM, and that this factor is not involved in the higher
susceptibility to IM in these subjects, when compared with the majority of the
population. Functional studies and increasing the number of Mozambican subjects with
IM are essential to confirm the hypothesis that CDX2 polymorphisms can have a
“facilitating” or “inhibitory” effect in the metaplastic process.
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO
1.1. Carcinogénese gástrica
O carcinoma gástrico constitui a segunda causa de mortalidade associada a cancro no
mundo (1), embora com taxas de incidência muito variáveis nos 5 continentes (Figura
1).
Figura 1:
Mapa ilustrativo da incidência de cancro do estômago no mundo: incidência maior (laranja e
vermelho) em países em vias de desenvolvimento (países Asiáticos e da América do Sul) e
menor (verde claro e verde escuro) na América do Norte, grande parte do continente Africano,
Índia e Austrália. Portugal é o país da Europa com maior incidência de cancro gástrico.
Adaptado de Nature Reviews Cancer 4, 909-917 (November 2004).
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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Existem dois subtipos histológicos principais de adenocarcinoma gástrico, o intestinal e
o difuso. O primeiro desenvolve-se na sequência de uma série de lesões que incluem a
gastrite crónica, a gastrite crónica atrófica, a metaplasia intestinal (MI) e a displasia,
alterações estas que foram descritas como precursoras deste tipo de cancro gástrico por
Pelayo Correa (2) (Figura 2). Uma grande parte dos casos de adenocarcinoma gástrico
de tipo intestinal é explicada pela inflamação crónica da mucosa gástrica provocada pela
infecção pela Helicobacter pylori (H. pylori), uma bactéria Gram-negativa capaz de
colonizar o ambiente ácido característico do estômago humano.
Figura 2:
Cascata de eventos envolvidos na carcinogénese gástrica e subtipos histológicos de carcinoma.
A mucosa gástrica normal é negativa para o CDX2. Após infecção pela Helicobacter pylori as
glândulas gástricas metaplásicas expressam “de novo” CDX2 e a progressão para carcinoma de
tipo intestinal ocorre acompanhada de alterações nos padrões de expressão de vários genes tais
como APC (“adenomatous polyposis coli”), TGF-βRII (“transforming growth factor-β receptor
II”), MLH1 (“MutL homolog 1”). Adaptado de Nature Reviews Cancer 3, 592-600 (Agosto de
2003).
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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São vários os factores capazes de influenciar a possibilidade de, perante a presença de
infecção, haver progressão das lesões associadas à carcinogénese gástrica e, em última
instância, ao desenvolvimento de cancro. Tais factores incluem a susceptibilidade
genética individual do hospedeiro (exemplos: polimorfismos em genes das citoquinas
pró-inflamatórias, genes que codificam estruturas que constituem ligandos para a
bactéria), factores de virulência da estirpe bacteriana (genes associados a citotoxicidade)
e factores ambientais (exemplos: tabaco, dieta). Contudo, apenas uma pequena
proporção (inferior a 1%) dos indivíduos infectados irá desenvolver adenocarcinoma
gástrico (3).
1.2. Metaplasia intestinal- definição e caracterização
Metaplasia é o nome comum utilizado para caracterizar a substituição de um tecido por
outro. Em tecidos epiteliais as formas mais comuns de metaplasia ocorrem a nível
respiratório, esofágico e gástrico, em resposta a diferentes estímulos (4). No caso da
metaplasia do epitélio respiratório há substituição deste por um de tipo escamoso, muito
comum em indivíduos fumadores. Em indivíduos com refluxo gastro-duodenal é
comum o epitélio escamoso do esófago ser substituído por um epitélio glandular de tipo
intestinal, alteração conhecida como esófago de Barrett. Em indivíduos infectados pela
H. pylori é frequente a substituição do epitélio gástrico por um de tipo intestinal. Em
todos estes casos há estudos que indicam haver uma relação entre o desenvolvimento de
metaplasia e a progressão para carcinoma (4).
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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A metaplasia intestinal pode ser definida como um processo de transdiferenciação
tecidular, que não se sabe com segurança se é reversível e com evidência clara na
progressão para carcinoma numa pequena percentagem de casos (4). De acordo com o
modelo proposto por Pelayo Correa em 1992 a MI gástrica surge após infecção pela H.
pylori (2). Estudos posteriores com modelos animais vieram reforçar este modelo na
medida em que gerbilos da Mongólia infectados com H. pylori desenvolveram lesões de
MI e, após infecções prolongadas, carcinoma gástrico (5, 6, 7).
Após a identificação de novos marcadores de diferenciação gástrica e intestinal,
nomeadamente marcadores para mucinas, a MI passou a ser dividida em 2 subtipos
principais (8, 9): completa (intestinal), caracterizada pela perda de mucinas gástricas
(MUC1, MUC5AC e MUC6) e ganho de mucinas de tipo intestinal (MUC2), e
incompleta (mista gastro-intestinal), caracterizada pela presença quer das mucinas de
tipo gástrico quer da mucina intestinal MUC2 (8) (Figura 3).
Em pacientes com MI o risco de desenvolvimento de cancro gástrico está aumentado,
apesar de só uma pequena proporção de indivíduos infectados pela H. pylori
desenvolver MI (3). Os indivíduos que desenvolvem lesões de MI, em particular
aqueles com MI de tipo incompleto (previamente classificada como MI tipo III) têm o
risco de desenvolvimento de carcinoma gástrico aumentado em 4 vezes. (10, 11).
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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Figura 3:
Imunofluorescência dupla em corte de mucosa gástrica com metaplasia intestinal de tipo
incompleto – Há co-expressão de MUC2 (vermelho) e de MUC5AC (verde). Marcação de ADN
(azul) com DAPI. Adaptado de Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 54: 585-591, 2006.
1.3. Factores de susceptibilidade no desenvolvimento de metaplasia
intestinal
Um dos factores a ter em conta no que respeita ao desenvolvimento de MI num contexto
de infecção pela H. pylori reside nas características genéticas da bactéria,
nomeadamente nos genes CagA (“cytotoxin associated gene A”), VacA (“vacuolating
associated cytotoxin A”) e BabA (“blood-group antigen binding adhesin A”).
Actualmente sabe-se que indivíduos infectados com estirpes cagA+, vacA s1m1 e
BabA2+ têm maior predisposição para desenvolver lesões de MI (12, 13, 14, 15, 16, 17,
Introdução ______________________________________________________________________________________________
- 20 -
18), em contraste com aqueles infectados por estirpes bacterianas negativas para o
produto dos genes BabA2 e CagA e do subtipo Vac s2m2 (18).
A susceptibilidade genética individual também constitui um importante factor na
predisposição e progressão das lesões associadas à infecção. Estudos “in vivo”
demonstraram que a MI induzida pela radiação X é dependente da estirpe de rato
utilizada na experimentação (19, 20).
Estudos em populações humanas baseados em pesquisa de polimorfismos também
apontam para este facto: polimorfismos no gene que codifica para a mucina MUC1,
nomeadamente indivíduos com as chamadas “mucinas pequenas” (“small” VNTRs,
“Variable Number of Tandem Repeats”) têm maior predisposição para desenvolver MI
de tipo incompleto (21, 22). Ainda relativamente à MUC1, um estudo recente
demonstrou que a adesão da H. pylori a linhas celulares humanas de carcinoma gástrico
está inversamente relacionada com o tamanho dos VNTRs do domínio
extracitoplasmático da proteína (23).
Um aumento no risco de desenvolvimento de MI no antro foi também identificado em
indivíduos portadores de polimorfismos no gene IGFBP-3 (“Insulin-like Growth Factor
Binding Protein-3”) associados a baixos níveis séricos de IGFBP-3 (24).
Polimorfismos em genes pró-inflamatórios (interleucinas, IL) também se associam a
risco variável de MI: SNPs (“Single Nucleotide Polymorphisms”) identificados na IL-
1β RN estão associados a aumento de risco de desenvolvimento de MI (25, 26, 27) e
SNPs na IL-1 estão relacionados com o aumento da prevalência de MI (26, 27, 28, 29).
No caso dos polimorfismos da IL-10 há variantes que conferem aumento de risco e
outras que são “protectoras”: o genótipo 819T/T na IL-10 favorece o desenvolvimento
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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de MI e carcinoma gástrico (“non-cardia gastric carcinoma”) (30), o “low activity
allele” do SNP IL10-1082 está associado ao aumento em 60% do risco de
desenvolvimento de MI e displasia (31) e o genótipo IL10-592C/A também está
associado ao desenvolvimento de MI enquanto o alelo G da IL-6-576 tem um efeito
protector (32). O alelo IL-8-251A está associado com o desenvolvimento de lesões
gástricas precursoras (incluindo MI), displasia e carcinoma pois promove um aumento
na produção de interleucina-8 intensificando a reacção inflamatória local (33).
Em indivíduos H. pylori positivos o genótipo -463G/G no gene da mieloperoxidase
(MPO) está associado ao aumento na produção de mieloperoxidase e desenvolvimento
de MI no antro gástrico enquanto o alelo A está associado ao desenvolvimento de MI no
fundo (34). A substituição Thr3991leu no gene TLR-4 (“Toll-Like Receptor-4”) pode
também ser considerada como um factor de risco no desenvolvimento de gastrite e MI
(35). Foram também já descritos polimorfismos funcionais em genes envolvidos na
apoptose: em indivíduos H. pylori positivos, os genótipos do FAS e FASL (membros da
família do TNF (“Tumor Necrosis Factor”) do hospedeiro são determinantes na
patogénese da gastrite crónica atrófica e MI (36).
Existe também uma relação de potenciação na associação de polimorfismos em genes
do hospedeiro com polimorfismos em genes bacterianos: a presença do alelo IL-1B-
511T no hospedeiro com o subtipo vacA m1 bacteriano aumenta significativamente o
risco de desenvolvimento de MI, em comparação com indivíduos infectados com o
subtipo de baixo risco vacA m2 (28, 29).
Introdução ______________________________________________________________________________________________
- 22 -
1.4. CDX2 e metaplasia intestinal – regulação do processo de
transdiferenciação
O CDX2 é um gene pertencente à família “homeobox” e a caracterização do seu papel
como factor de transcrição crucial na diferenciação intestinal data de 1996 (37). Está
localizado no cromossoma 13q12.3 (38) e num indivíduo adulto é normalmente
expresso apenas no epitélio intestinal sendo importante no estabelecimento e na
manutenção da arquitectura intestinal normal (37). Estudos com ratinhos
heterozigóticos CDX2+/- demonstraram a importância do seu papel na medida em que
estes desenvolveram lesões polipóides no intestino, como resultado da perda local de
expressão do CDX2 (39, 40). Mais recentemente, estudos experimentais in vivo
utilizando ratinhos transgénicos com expressão ectópica do CDX2 no estômago levaram
a concluir que, para além do seu papel na diferenciação intestinal, o CDX2 está também
envolvido na transdiferenciação da mucosa gástrica em mucosa de tipo intestinal pois
estes desenvolveram lesões de MI no estômago (41, 42). Para além da expressão do
CDX2 nas lesões de MI gástrica (43) esta foi também descrita em outros órgãos sujeitos
ao processo de transdiferenciação intestinal: esófago (44), fígado (45) e vesícula biliar
(46). Estas observações levam a afirmar que o CDX2 não é apenas responsável pela
diferenciação intestinal normal mas também pela diferenciação intestinal em
localizações aberrantes (4).
Um outro gene que parece ser importante na diferenciação intestinal é o CDX1,
homólogo do CDX2 mas, ao contrário do segundo, o seu papel não está tão bem
definido (47, 48). Contudo sabe-se que há expressão de CDX1 nas lesões de metaplasia
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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intestinal em vários órgãos, incluindo no estômago (43), e que ratinhos transgénicos
para o CDX1 também desenvolvem lesões de metaplasia intestinal gástrica (49).
O CDX2 e/ou o CDX1 actuam como factores de transcrição de diversos genes
envolvidos em processos de diferenciação intestinal tais como sucrase-isomaltase,
proglucagon, receptor da vitamina D, MUC2, entre muitos outros (4).
Neste contexto torna-se evidente o importante papel do CDX2 como um “master gene”
envolvido no processo de transdiferenciação intestinal da mucosa gástrica.
1.5. Situação em África- o “Enigma Africano”
Um estudo publicado em 2005 por Liu et al. (50) revelou, em Portugal, uma taxa de
infecção pela H. pylori de 88,4% (n=221) e uma taxa de desenvolvimento de MI na
ordem dos 34% (n=75). Em Moçambique, um estudo realizado em 2008 revelou uma
taxa de infecção pela H. pylori de 94,5% (n=103) e destes somente 10,1% (n=11)
desenvolveram lesões de MI (51).
Em África, a diferença encontrada entre as taxas de infecção pela H. pylori e o
desenvolvimento de MI e carcinoma gástrico num contexto de infecção é conhecido
como o “Enigma Africano” (52). Este “enigma” traduz uma quebra na cascata de
eventos que ocorre na carcinogénese gástrica, isto é, taxas elevadas de infecção pela H.
Introdução ______________________________________________________________________________________________
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pylori e taxas muito reduzidas de desenvolvimento das lesões gástricas associadas à
infecção, nomeadamente lesões de metaplasia intestinal e de carcinoma gástrico (53).
A primeira descrição deste fenómeno data de 1992 (52). Desde então, alguns estudos
foram executados em diferentes populações Africanas e em 1999 Kidd et al, num estudo
de revisão, verificou que a taxa de infecção pela H. pylori no contexto Africano era de
aproximadamente 72%, variando desde os 25% no Uganda e os 97% no Ghana e uma
taxa de desenvolvimento de MI na ordem dos 14% (54). Mais recentemente um estudo
realizado na Etiópia observou uma sero-prevalência de anticorpos anti-H. pylori na
ordem dos 85,6% (55). Esta relação entre índices elevados de infecção pela H. pylori e
baixas taxas de desenvolvimento de MI e de outras lesões gástricas associadas foi
também encontrada na Gâmbia (56) e na Costa do Marfim (57).
Objectivos
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CAPÍTULO II - OBJECTIVOS
O papel do CDX2 no desenvolvimento de MI no contexto de infecção pela H. pylori
encontra-se bem definido e caracterizado. Contudo, não há estudos que envolvam a
pesquisa de polimorfismos no gene CDX2 e os relacionem com o desenvolvimento de
metaplasia intestinal. Este facto levou-nos a averiguar se 8 SNPs localizados no gene
CDX2 e regiões flanqueantes se associavam ao desenvolvimento de MI, no contexto da
infecção pela H. pylori, em duas populações distintas, uma Portuguesa (através do
estudo de uma amostra constituída por 120 indivíduos) e outra Moçambicana (numa
amostra constituída por 101 indivíduos). Um aspecto que esteve na base deste estudo é a
diferença encontrada entre populações Europeias e Africanas, ambas com grande
prevalência de infecção pela H. pylori mas com grandes diferenças no desenvolvimento
de MI e carcinoma gástrico de tipo intestinal.
Os objectivos foram:
1. Estudar a distribuição das variantes alélicas de 8 SNPs no locus do gene
CDX2, em 2 populações, Portugal e Moçambique, em indivíduos com e sem
metaplasia intestinal;
2. Estudar a distribuição dos haplótipos definidos pelos 8 SNPs estudados no
ponto 1, em 2 populações, Portugal e Moçambique, em indivíduos com e sem
metaplasia intestinal;
Objectivos
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3. Verificar se existe alguma associação entre as distribuições estudadas nos
pontos 1 e 2 e a susceptibilidade ou “protecção” ao desenvolvimento de MI nas
duas populações, consideradas em conjunto ou separadamente.
Materiais e Métodos
_____________________________________________________________________________________
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CAPÍTULO III. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Amostragem populacional
Foram utilizadas, no presente estudo, amostras de ADN genómico de duas populações,
uma população Portuguesa e uma população Moçambicana, obtidas em dois estudos
anteriores. O primeiro estudo, que permitiu a obtenção das amostras da população
Portuguesa, decorreu em 1998 e intitulou-se “Caracterização das lesões gástricas
associadas à infecção por Helicobacter pylori na população dos Estaleiros Navais de
Viana do castelo (ENVC)” e foi financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian
(Projecto n.ºFC-54918). As amostras da população Moçambicana foram obtidas através
de um estudo realizado em 2004 intitulado “ Estudo de factores biológicos e de estilos
de vida que contribuam para perceber as diferenças entre a incidência de carcinoma
gástrico em dois países com grande prevalência de infecção por Helicobacter pylori:
Moçambique e Portugal”, igualmente financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian
(Projecto n.º FC-68697).
Ambos os estudos incluíram, entre outros, colheita de sangue para posterior extracção
de ADN e colheita de fragmentos de mucosa gástrica, obtidos por endoscopia digestiva
alta, para caracterização histológica das lesões gástricas e determinação do estado de
infecção pela H. pylori e caracterização molecular da estirpe bacteriana em relação aos
genes vacA e cagA, por PCR (“Polymerase Chain Reaction”).
Os resultados destes estudos revelaram taxas de infecção por H. pylori muito
semelhantes entre as duas populações e prevalência de MI muito diferente. Em Portugal,
foram estudados 208 indivíduos, sendo detectada a bactéria em 197 casos (94,7%) e
metaplasia intestinal (MI) em 63 (30,3%) (58). Na população Moçambicana em 109
Materiais e Métodos
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indivíduos estudados, 103 (94,5%) são H. pylori positivos e 11 (10,1%) desenvolveram
lesões de MI (51).
3.1.1. Selecção das amostras
Para este estudo foram seleccionados apenas indivíduos infectados pela H. pylori. Para
tal foram utilizados os resultados obtidos por caracterização histoquímica tecidular,
após a coloração pela técnica de Giemsa Modificado, e/ou por caracterização molecular
da estirpe bacteriana de H. pylori. Sucintamente, as estirpes bacterianas foram
caracterizadas em relação aos genes vacA e cagA por PCR, seguido de hibridação
reversa (LiPA- Line Probe Assay) com sondas específicas para os diferentes alelos. Para
este fim, foram utilizados fragmentos de biópsias gástricas congeladas ou incluídas em
parafina. A presença dos genes vacA e/ou cagA é indicativo de infecção, condição
major para o desenvolvimento de MI (59). Os indivíduos foram considerados H. pylori
positivos sempre que eram positivos pelo menos por uma das técnicas anteriormente
descritas. No que respeita à presença ou ausência de MI, os indivíduos foram
caracterizados por exame histológico através da técnica de Hematoxilina-Eosina,
método histológico de rotina e pela coloração de “Periodic Acid-Shiff-Alcian Blue, pH
2,5”.
Ambas as condições, presença de infecção pela H. pylori e presença/ausência de MI
foram obtidas por consulta às bases de dados dos dois estudos supracitados.
Materiais e Métodos
_____________________________________________________________________________________
- 29 -
3.1.2. Efectivo amostral
A amostra da população Portuguesa é constituída por 120 indivíduos infectados pela H.
pylori sendo que em 44 casos foi identificada a presença de metaplasia intestinal. No
que respeita à população Moçambicana foram seleccionados 101 indivíduos infectados
pela H. pylori dos quais 9 têm MI.
3.2. Selecção dos “Single Nucleotide Polymorphisms” (SNPs)
Foram pesquisados 8 SNPs no locus do gene CDX2: 4 SNPs intragénicos e 4 SNPs
flanqueantes, 2 a 5’ e 2 a 3’ do gene, num limite de 10Kb. Na escolha dos SNPs teve-se
em conta a informação relativa às taxas de heterozigotia em diferentes populações,
nomeadamente em populações Europeias e Africanas, e a distância genómica entre eles,
tentando, sempre que possível, que a distância entre os SNPs fosse semelhante.
Na tabela 1 encontram-se as informações relativas à identificação e localização dos
SNPs seleccionados e a figura 4 representa esquematicamente a região do cromossoma
13 que contém o gene e regiões flanqueantes.
Materiais e Métodos
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Tabela 1: Localização dos 8 SNPs seleccionados no locus do gene CDX2 e no
cromossoma 13
SNP/Marcador
Localização em
relação ao CDX2
Posição no cromossoma
13*
SNP1 rs9554217 6,8 Kb a 5' 27448121
SNP2 rs3812862 1,8 Kb a 5' 27443126
SNP3 rs1805106 1º Exão 27440961
SNP4 rs3742110 1º Intrão 27437186
SNP5 rs2504211 2º Intrão 27435935
SNP6 rs2481952 3º Exão 27434901
SNP7 rs3003954 3,1 Kb a 3' 27431130
SNP8 rs9285356 9,3 Kb a 3' 27424975
*O gene CDX2 está invertido no cromossoma. Baseado no “Genome Browser Ensembl.org”
(http://ensembl.org), Homo sapiens Março 2008
As caixas a azul representam os exões
Identificação dos SNPs a negrito
*distância genómica entre os exões (em cima) e entre os SNPs (em baixo)
Figura 4: Representação esquemática do gene, regiões flanqueantes a 5’ e 3’,
posição relativa dos SNPs e distâncias genómicas entre eles
SNP 1
5’ 3’
SNP 8
5’
4,9 kb*
SNP 4
1 2 3 4,8Kb* 1,4Kb*
sSNP 7
SNP 6
SNP 2
SNP 3 SNP 5
2,1kb* 3,8kb* 1,3kb* 1Kb*
3,7 Kb*
6,1Kb
Materiais e Métodos
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- 31 -
3.2.1. Desenho das sequências oligonucleotídicas para “Polymerase
Chain Reaction” (PCR)
Foram desenhados 8 pares de sequências oligonucleotídicas (oligos) para amplificar os
fragmentos de ADN que contêm cada um dos polimorfismos escolhidos. Para isso
recorreu-se ao programa “Primer 3”. Na escolha dos oligos teve-se em atenção o
desenho experimental de um PCR “Multiplex”, método que permite a amplificação
simultânea de vários fragmentos de ADN na mesma reacção. Um dos aspectos tidos em
conta foi a escolha de sequências com temperatura de melting (Tm) semelhante. Foi
também utilizado o programa “Primer Dimer” para verificar as taxas de dimerização
entre as sequências oligonucleotídicas seleccionadas. Este passo é de extrema
importância, pois a dimerização entre os pares de oligos que se utilizam em cada
reacção pode afectar e até mesmo comprometer a eficiência do PCR e o “multiplex”
(60). A tabela 2 apresenta as sequências dos 8 pares de oligonucleótidos desenhados, os
tamanhos dos fragmentos de ADN amplificados e as respectivas Tm.
Materiais e Métodos
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- 32 -
Tabela 2: Sequências dos oligonucleótidos utilizados na amplificação dos 8
fragmentos no locus do CDX2
*F, oligonucleótido “forward”; R, oligonucleótido “reverse”
3.3. Amplificação por “PCR Multiplex” e visualização dos fragmentos
Os oligonucleótidos e as condições do PCR foram testadas isoladamente e
posteriormente foram optimizadas as condições para a co-amplificação dos 8
fragmentos numa única reacção (“PCR multiplex”).
As condições de PCR utilizadas foram as descritas no kit “Qiagen Multiplex PCR
System”. Em resumo, para um volume final de 10µl utilizaram-se 5µl de “2x Qiagen
Mix” (mistura de tampão, enzima taq polimerase e dNTPs), 1µl da mistura de oligos,
que corresponde a uma concentração de 0,2 µM de cada um, 3,5µl de água esterilizada e
0,5µl de ADN genómico. A reacção de PCR foi levada a cabo num termociclador da
Par de oligonucleótidos*
Sequência dos oligonucleótidos Amplificado
(pb) Tm (ºC)
1 F CTCTTCCGAAACACCTGAGC 62 rs9554217 R ACCGAGAGCATGTCGCTATT
216 60
2 F GTCTCCCACCTCTTGAGTGC 64 rs3812862 R ATCCCCTGTTTTCTGGTTCC
113 60
3 F CCGCAGAACTTCGTCAGC 58 rs1805106 R GCGTAGCCATTCCAGTCCT
161 60
4 F AGTTGCCTCCACTAGCCTCA 62 rs3742110 R GGATGGTGATGTAGCGACTG
298 62
5 F AAACAGGCCAACTTCACAGC 60 rs2504211 R CTTCAAATGGCAACCTTTGG
115 58
6 F TTCCCATCTGGCTTTTTCTG 58 rs2481952 R CCTTTCCCTTGAGTCCCTCT
192 62
7 F TTTAGGGCCACTCTTTGCAC 60 rs3003954 R AGTGCCTTGCCACTCAAGAT
385 60
8 F GGTTCCAAAGCAGTCCAGAG 62 rs9285356 R TGTTTGTCCAAGCCCTTAGC
278 60
Materiais e Métodos
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- 33 -
“Applied Biosystems” e consistiu numa desnaturação inicial de 15 min a 95ºC, seguida
de 35 ciclos com desnaturação a 94ºC durante 30s, ligação dos oligonucleótidos a 60ºC
durante 1min30s e extensão a 72ºC durante 1min e uma extensão final a 72ºC durante
10 minutos. Após cada amplificação, os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese
em gel de poliacrilamida (T:9%; C:5%). O processo electroforético foi executado sobre
placa horizontal, com arrefecimento a 9ºC, sob uma diferença de potencial de 150V e
utilizando como controlo da corrida o corante azul de bromofenol. Para visualização dos
fragmentos de ADN, os géis foram sujeitos a coloração com nitrato de prata, de acordo
com o método descrito por Budowle et al (1991) (61).
3.3.1. Purificação dos produtos PCR “multiplex”
Os produtos resultantes da amplificação por PCR multiplex foram purificados com a
enzima EXOSAP-IT (“Exonuclease I/Shrimp Alkaline Phosfatase”, “USB
Corporation”) para eliminação de oligos e dNTPs não incorporados. A purificação
enzimática foi executada adicionando 1µl de EXOSAP-IT a 1 µl de produto de PCR
multiplex, imediatamente seguido por incubação em termociclador durante 15 min a
37ºC para actividade enzimática e 15 min a 85ºC para degradação da enzima.
Materiais e Métodos
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- 34 -
3.4. Desenho dos oligonucleótidos para “Single-Base Extension”
Os oligonucleótidos para genotipagem por “Single-Base Extension” (SBE) foram
desenhados na direcção “sense” ou “antisense”, acabando, cada um, na base
imediatamente anterior ao SNP a ser genotipado. Foram igualmente testados quanto à
dimerização entre eles no programa “Primer Dimer”. O tamanho de cada sequência para
SBE foi ajustado de maneira a distribuir os fragmentos por diferentes tamanhos num
intervalo de 15 a 60pb adicionando, quando necessário, uma sequência neutra (cauda),
de acordo com o descrito por Sanchez et al. (62). O tamanho da” cauda” adicionada foi
determinado de forma a não haver sobreposição de alelos marcados com o mesmo
fluorocromo em SNPs diferentes. A tabela 3 apresenta as sequências dos oligos para
SBE, bem como informações relativas aos mesmos.
Materiais e Métodos
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- 35 -
Tabela 3: Oligonucleótidos para “single-base extension” utilizados na genotipagem
dos SNPs por SNaPshot® multiplex.
SNP Sequência do oligonucleótido para SBE Tamanho (pb)
Detecção Direcção na cadeia de ADN
Mutação
1 tctgacaa TGGCTCTGACTCTCCCCTTC
28 G/T Forward G/T
2 tcgtgaaagtctgacaa TACCCCACCACCCCCATTT
36 C/T Forward C/T
3 TGCCGGCCAGGATGGCCC 18 C/G Reverse G/C
4 ccacgtcgtgaaagtctgacaa ATGACTGATGGGCTGCCTTG
42 C/T Forward C/T
5 aa TAGAGCTGAAAATGAGATTTAATT
26 T/G Reverse A/C
6 gaaagtctgacaa CTCTTCCTAGATCTGCAGGCT
34 G/A Forward G/A
7 a GGGAAAGGGTTATTCTATCATAAT
50 T/A Reverse A/T
8 gtgccacgtcgtgaaagtctgacaa ACTAGACTTTGCTATGGGAAAAT
48 G/C Reverse C/G
*As caudas adicionadas estão representadas a azul; a preto representa-se a sequência do oligonucleótido
para SBE complementar à região de “annealing”.
3.5. Genotipagem multiplex por minisequenciação – Reacção de
SNaPshot® multiplex
Numa primeira fase os oligonucleótidos para SBE foram testados isoladamente e
posteriormente em multiplex. A reacção para minisequenciação foi executada utilizando
1 µl da mistura reaccional fornecida no kit “ABI PRISM® SNaPshot® Multiplex”
(“Applied Biosystems”), constituída por ddNTPs marcados com fluorocromos (ddATP-
dR6GTM, ddCTP-dTAMRATM, ddUTP-dROXTM e ddGTP-dR110TM, enzima AmpliTaqR
Materiais e Métodos
_____________________________________________________________________________________
- 36 -
FS TACS/Core e tampão para multiplex), 1,5 µl de produto de PCR multiplex
purificado com EXOSAP-IT, 0,8 µl da mistura de oligonucleótidos para SBE (tabela 4)
e água esterilizada até perfazer um volume de 5 µL.
Tabela 4: Concentração de cada oligonucleótido para SBE utilizada na mistura
por reacção de SNaPshot® multiplex
A reacção de “single-base extension” foi executada num termociclador da “Applied
Biosystems” e consistiu em 25 ciclos a 96ºC durante 10s para desnaturação, 50ºC
durante 5s para ligação do oligonucleótido de SBE e 60ºC durante 30s para extensão.
Após a reacção de extensão os produtos resultantes foram purificados com a enzima
SAP (“Shrimp Alkaline Phosphatase”, “USB Corporation”) de modo a degradar os
ddNTPs fluorescentes não incorporados: aos 5 µl de produto de SBE foi adicionado 1 µl
de SAP seguido de incubação em termociclador à temperatura de 37ºC durante 1hora
para actividade enzimática, e 85ºC durante 15 minutos para degradação da enzima.
Oligonucleótido para SBE
(stock 2,5 µM) Concentração
(µM) 1 0,63 2 0,31 3 0,19 4 0,94 5 0,25 6 0,31 7 0,78 8 0,31
Materiais e Métodos
_____________________________________________________________________________________
- 37 -
3.5.1. Análise das amostras no “ABI PRISM 3100 Genetic Analyser”
As amostras a submeter a electroforese no ABI PRISM 3100 Genetic Analyser
(“Applied Biosystems”) foram preparadas adicionando 0,5 µl de produto de SBE
purificado a 9 µl de formamida “Hi-Di” (“Applied Biosystems”) e 0,5 µl de
GeneScanTM 120 LIZ® Size Standard (“Applied Biosystems”) e corridas, utilizando o
módulo “GS STR POP4 (1mL) E5” com um tempo de corrida de 15 minutos. As
sequências foram obtidas utilizando o programa “GeneScan Analysis 3.7”.
3.6. Análise estatística
As frequências alélicas para cada SNP/marcador foram calculadas utilizando o software
de análise populacional ARLEQUIN 3.01 (63); a comparação das frequências dos
diferentes alelos de cada SNP entre os subgrupos populacionais, Portugal_MI- versus
Portugal_MI+ e Moçambique_MI- versus Moçambique_MI+, foi calculado pelo Teste
Exacto de Fisher através do software JAVASTAT (64) para um intervalo de confiança
de 95% (correspondendo a um nível de significância de 5%). O programa de análise
ARLEQUIN 3.01 foi também utilizado na análise de Linkage disequilibrium (LD),
Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e Análise da Variância Molecular (AMOVA).
No que respeita à análise de LD foi também utilizado software de análise GOLD (65)
para cálculo dos valores absolutos de D’ como forma de medição da extensão do
desequilíbrio entre os pares de SNPs. Os haplótipos foram inferidos recorrendo ao
programa de análise populacional PHASE v2.1.1 (66). As “Networks” foram calculadas
no programa NETWORK 4.5.0.1 (http://www.fluxus-engineering.com) utilizando a
Materiais e Métodos
_____________________________________________________________________________________
- 38 -
opção “median-joining” (67). O programa de análise estatística WinPepi versão 1.60
utilizou-se na comparação de proporções através da opção “Compare 2, Comparison of
proportions or odds” (68).
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 39 -
CAPÍTULO IV - RESULTADOS
Este trabalho consistiu no estudo de oito polimorfismos (SNPs) localizados no locus do
gene CDX2, em regiões flanqueantes 5’ e 3’ e na região codificante (Figura 4). Foram
estudados dois grupos populacionais, ambos H. pylori positivos, Portugal (120
indivíduos) e Moçambique (101 indivíduos), e dentro destes foram definidos dois
subgrupos, um com metaplasia intestinal (MI+) e outro sem metaplasia intestinal (MI-).
Dos 120 indivíduos que constituem a população Portuguesa, 76 são MI- e 44 são MI+, o
que dá uma prevalência de MI de 37% e dos 101 indivíduos que constituem a amostra
Moçambicana, 92 são MI- e 9 são MI+, o que dá uma prevalência de MI de 9%.
4.1. Polimorfismos analisados no locus do gene CDX2
Em todas as amostras analisadas observaram-se 8 fragmentos com os tamanhos
correspondentes às sequências amplificadas do locus do gene CDX2 (tabela 2).
A figura 5 mostra 11 dos 221 produtos de PCR multiplex obtidos.
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 40 -
Figura 5: Visualização em gel de poliacrilamida, corado por nitrato de prata, dos 8 fragmentos
amplificados por PCR multiplex, em 11 amostras incluídas no estudo, de baixo para cima:
SNP7 (385 pb), SNP4 (298 pb), SNP8 (278 pb), SNP1 (216 pb), SNP6 (192 pb), SNP3 (161
pb), SNP5 (115 pb) e SNP2 (113 pb).
4.2. Minisequenciação por SNaPshot® multiplex
Após a amplificação do ADN foi executada a técnica de SNaPshot® multiplex para
genotipagem dos 8 SNPs seleccionados nos 221 indivíduos do estudo. A figura 6 mostra
3 dos electroferogramas obtidos.
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 41 -
Figura 6: Electroferogramas obtidos após minisequenciação por SNaPshot® multiplex de 3
indivíduos incluídos no estudo. Da esquerda para a direita, alelos detectados (leitura directa): A)
C/C, G/G, G/T, G/A, T/T, C/T, CC, AA; B) C/C, G/T, G/T, G/G, C/T, C/T, G/C, A/T; C) C/C,
G/G, T/T, A/A; C/C, C/C, A/A
ddNTP Fluorocromo Cor
A dR6G Verde
C dTAMRA Preto
G dR110 Azul
T dROX Vermelho
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 42 -
4.3. Frequências alélicas
No sentido de averiguar se polimorfismos localizados no locus do gene CDX2 estão
relacionados, ou estão localizados em regiões associadas, com o aparecimento de MI e
também com a diferente prevalência de MI nas duas populações, Portugal e
Moçambique, foram estudadas as frequências alélicas dos 8 SNPs nos 4 subgrupos
anteriormente descritos (tabelas 5 e 6). As frequências alélicas foram calculadas usando
o programa de análise populacional Arlequin 3.01 (63).
Tabela 5: Portugal - Frequências alélicas dos 8 marcadores nas duas amostras da
população Portuguesa.
MI - MI +
Marcador Alelo N*=152 N*=88 P**
G 81 (53,29) 49 (55,68) SNP1 rs9554217 T 71 (46,71) 39 (44,32)
0,412
C 9 (5,92) 8 (9,09) SNP2 rs3812862 T 143 (94,08) 80 (90,91)
0,251
G 150 (98,68) 86 (97,73) SNP3 rs1805106 C 2 (1,32) 2 (2,27)
0,467
C 102 (67,11) 63 (71,59) SNP4 rs3742110 T 50 (32,89) 25 (28,41)
0,283
A 28 (18,42) 17 (19,32) SNP5 rs2504211 C 124 (81,58) 71 (80,68)
0,496
G 84 (55,26) 43 (48,86) SNP6 rs2481952 A 68 (44,74) 45 (51,14)
0,205
T 115 (75,66) 65 (73,86) SNP7 rs3003954 A 37 (24,34) 23 (26,14)
0,436
G 139 (91,45) 73 (82,95) SNP8 rs9285356 C 13 (8,55) 15 (17,05)
0,04
* Números em parêntesis representam percentagens ** Valor P calculado pelo Teste Exacto de Fisher
N, número de alelos
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 43 -
Na população Portuguesa (Tabela 5) verificou-se existir uma associação significativa
(P=0,04) do alelo C do SNP rs9285356 C>G (SNP8) com a presença de MI. Dos 152
cromossomas analisados da população MI-, 139 (91,45%) são portadores do alelo G e
13 (8,55%) possuem o alelo C. Na população MI+ num total de 88 cromossomas, 73
(82,95%) são portadores do alelo G e 15 (17,05%) possuem a variante C.
Relativamente aos restantes marcadores não foi observada nenhuma associação
significativa quando comparados os dois subgrupos MI- e MI+.
Na população Moçambicana (Tabela 6) não foi observada nenhuma associação
significativa dos diferentes SNPs com o aparecimento de MI. No entanto para o
marcador rs3812862 C>T (SNP2), o subgrupo MI- tem um predomínio do alelo T
contrariamente ao subgrupo MI+ que tem um predomínio do alelo C. Esta diferença,
ainda que não significativa (P=0,06), pode revelar uma tendência de diferenciação dos
dois subgrupos na população Moçambicana.
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 44 -
Tabela 6: Moçambique - Frequências alélicas dos 8 marcadores nas duas amostras
da população Moçambicana.
MI - MI +
Marcador Alelo N* =184 N*=18 P**
G 146 (79,35) 16 (88,89) SNP1 rs9554217 T 38 (20,65) 2 (11,11)
0,27
C 72 (39,13) 11 (61,11) SNP2 rs3812862 T 112 (60,87) 7 (38,89)
0,06
G 183 (99,46) 18 (100) SNP3 rs1805106 C 1 (0,54) 0 (0)
0,91
C 151 (82,07) 16 (88,89) SNP4 rs3742110 T 33 (17,93) 2 (11,11)
0,36
A 100 (54,35) 9 (50) SNP5 rs2504211 C 84 (45,65) 9 (50)
0,46
G 142 (77,17) 11 (61,11) SNP6 rs2481952 A 42 (22,83) 7 (38,89)
0,11
T 76 (41,3) 10 (55,56) SNP7 rs3003954 A 108 (58,7) 8 (44,44)
0,18
G 92 (50) 9 (50) SNP8 rs9285356 C 92 (50) 9 (50)
1
* Números em parêntesis representam percentagens ** Valor P calculado pelo Teste Exacto de Fisher
N, número de alelos
4.4. Caracterização e representação haplotípica
No sentido de averiguar se existe uma associação do conjunto de SNPs estudados com o
aparecimento de MI, definiram-se os haplótipos a partir da genotipagem anteriormente
descrita nas 2 populações e nos 2 subgrupos, recorrendo ao programa de análise
populacional PHASE v2.1.1 (66). A análise global, utilizando todos os indivíduos
Portugueses e Moçambicanos, permitiu a identificação de 26 haplótipos. As tabelas 7 e
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 45 -
8 apresentam os haplótipos que foram identificados nas duas populações, Portuguesa e
Moçambicana, respectivamente.
Tabela 7: Haplótipos observados na população Portuguesa
MI - MI +
Haplótipo* N** N**
H1 TTGCCGTG 4 (2,63) 0
H2 GTGTCGTG 3 (1,97) 3 (3,41)
H3 TTGTCGTG 40 (26,32) 18 (20,45)
H5 TTCTCGTG 1 (0,66) 0
H7 GTGCCATG 47 (30,92) 25 (28,41)
H8 TTGCCATG 18 (11,84) 14 (15,91)
H10 GTCCCATG 1 (0,66) 2 (2,27)
H12 TTGTCATG 0 1 (1,14)
H14 TTGCCGAG 2 (1,32) 2 (2,27)
H16 TTGTCGAG 5 (3,29) 1 (1,14)
H17 GTGCAGAG 16 (10,53) 5 (5,68)
H18 GCGCAGAG 1 (0,66) 0
H20 GTGCCAAG 1 (0,66) 2 (2,27)
H21 TTGTCGTC 1 (0,66) 2 (2,27)
H23 GTGCAGAC 3 (1,97) 4 (4,55)
H24 GCGCAGAC 8 (5,26) 7 (7,95)
H25 TCGCAGAC 0 1 (1,14)
H26 GTGCCAAC 1 (0,66) 1 (1,14)
Total 152 (100,00) 88 (100,00) * Identificação do haplótipo/sequência
** Números em parêntesis representam percentagens
N, número de alelos
Na população Portuguesa foram identificados 18 haplótipos, não se observando
nenhuma diferença estatisticamente significativa (P>0,05) quando comparadas as
frequências haplotípicas individuais nos subgrupos MI- e MI+. Três haplótipos
aparecem exclusivamente no subgrupo MI-, H1, H5 e H18, representando menos de 4%
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 46 -
da diversidade total. Quanto ao subgrupo MI+, os haplótipos exclusivos H12 e H25,
também não ultrapassam os 4% da diversidade haplotípica total. Os haplótipos mais
frequentes são o H3 e o H7 nos dois subgrupos MI- e MI+. O haplótipo H3 aparece em
26,3% das amostras MI- e em 20,5% das amostras MI+, enquanto o haplótipo H7 surge
representado em 30,9% e 28,4% das amostras, respectivamente. Em nenhum dos casos
a diferença de frequência haplotípica entre os 2 subgrupos se revelou significativa
(P>0,05).
Tabela 8: Haplótipos observados na população Moçambicana
MI - MI +
Haplótipo* N** N**
H2 GTGTCGTG 14 (7,61) 1 (5,56)
H3 TTGTCGTG 17 (9,24) 0
H4 GCGTCGTG 1 (0,54) 1 (5,56)
H6 GCGCAGTG 2 (1,09) 0
H7 GTGCCATG 34 (18,48) 4 (22,22)
H8 TTGCCATG 5 (2,72) 2 (11,11)
H9 GCGCCATG 1 (0,54) 1 (5,56)
H10 GTCCCATG 1 (0,54) 0
H11 GTGTCATG 1 (0,54) 0
H13 GTGCCGAG 2 (1,09) 0
H14 TTGCCGAG 7 (3,80) 0
H15 GCGCCGAG 1 (0,54) 0
H17 GTGCAGAG 1 (0,54) 0
H18 GCGCAGAG 3 (1,63) 0
H19 TCGCAGAG 2 (1,09) 0
H22 GCGCAGTC 0 1 (5,56)
H23 GTGCAGAC 30 (16,30) 0 ***
H24 GCGCAGAC 55 (29,89) 8 (44,44)
H25 TCGCAGAC 7 (3,80) 0
Total 184 (100,0) 18 (100,0) * Identificação do haplótipo/sequência ** Números em parêntesis representam percentagens
*** P=0,048, Teste Exacto de Fisher, “WiniPepi, Comparison of proportions or odds”
N, número de alelos
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 47 -
Em relação à população Moçambicana foi possível observar um total de 19 haplótipos.
A comparação entre as frequências haplotípicas individuais nos subgrupos MI- e MI+
revelou uma diferença estatisticamente significativa para o haplótipo H23 (P≤0,05). De
facto, nenhum cromossoma do subgrupo MI+ apresentou esta combinação, enquanto a
mesma é encontrada em cerca de 16% da amostra do subgrupo MI-. Ambos os
subgrupos partilham os mesmos haplótipos mais frequentes, H7 e H24. O haplótipo H7
aparece em 18,48% das amostras MI- e em 22,22% das amostras MI+, enquanto o
haplótipo H24 surge representado em 29,89% e em 44,44% das amostras,
respectivamente. Em nenhum dos casos a diferença de frequência entre os 2 subgrupos
se revelou significativa (P>0,05).
De modo a perceber a forma como as diferentes combinações haplotípicas se
relacionam do ponto de vista filogenético, foi desenhada a representação filogenética
para ambas as populações e para cada subgrupo (MI- e MI+). A representação gráfica é
apresentada na figura 7 (A-D).
A árvore filogenética representativa da população Portuguesa mostrou que os haplótipos
exclusivos de cada um dos subgrupos MI- e MI+ se originam de haplótipos mais
frequentes apenas por um passo mutacional. A árvore filogenética para a população
Moçambicana revelou um elevado grau de reticulação sendo que os haplótipos de
menor frequência se encontram ligados aos mais representativos por poucos passos
mutacionais (mutação ou recombinação). De realçar que o haplótipo H23 (exclusivo do
subgrupo MI-), apenas difere da combinação H24 (possivelmente ancestral e
representada nos dois subgrupos) na posição correspondente ao SNP2, que já tinha
revelado tendência de diferenciação entre os dois subgrupos no cálculo das frequências
alélicas.
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 48 -
A
B
C
D
Figura 7: Representação filogenética da distribuição haplotípica dos 4 subgrupos em estudo. Os
haplótipos inferidos estão representados por círculos, com áreas proporcionais à
representatividade numérica de cada um. M1 a M8 (a vermelho) representam os passos
mutacionais. As “networks” foram calculadas no programa NETWORK 4.5.0.1, utilizando a
opção “median-joining”.
A Portugal_MI- B Portugal_MI+ C Moçambique_MI- D Moçambique_MI+
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 49 -
4.5. Análise do Equilíbrio de Hardy-Weinberg Procedeu-se à análise do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) nas duas populações
em estudo, Portugal e Moçambique.
As tabelas seguintes mostram os resultados obtidos para cada SNP estudado. Na
população Portuguesa todos os marcadores estão em HWE (tabela 9), enquanto a
população Moçambicana apresenta um desvio ao HWE para o marcador rs3812862
(SNP2) (tabela 10), observando-se uma heterozigotia inferior à esperada.
Tabela 9: Estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg na população Portuguesa.
a Heterozigotia observada b Heterozigotia esperada * Teste Exacto utilizando a “Cadeia Markov”
Tabela 10: Estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg na população Moçambicana.
a Heterozigotia observada bHeterozigotia esperada* Teste Exacto utilizando a “Cadeia Markov”
Marcador Het.Obsa Het.Espb P* rs9554217 0,504 0,500 1,000 rs3812862 0,142 0,140 1,000 rs1805106 0,033 0,041 1,000 rs3742110 0,420 0,439 0,831 rs2504211 0,308 0,313 1,000 rs2481952 0,563 0,500 0,189 rs3003954 0,403 0,385 0,622
rs9285356 0,233 0,214 0,361
Marcador Het.Obsa Het.Espb P* rs9554217 0,337 0,319 0,76 rs3812862 0,347 0,492 0,004 rs1805106 0,010 0,020 1,00 rs3742110 0,287 0,288 1,00 rs2504211 0,446 0,504 0,31 rs2481952 0,406 0,369 0,42 rs3003954 0,436 0,496 0,30
rs9285356 0,465 0,507 0,55
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 50 -
4.6. Análise de Linkage Disequilibrium
Para estudar a ocorrência de associação não aleatória entre os alelos dos diferentes
SNPs procedeu-se à análise de Linkage disequilibrium (LD) nas 2 populações. As
tabelas seguintes apresentam os valores absolutos de D’ (|D’|), valor que mede a
extensão do desequilíbrio, obtidos entre os marcadores genotipados e para os quais
houve relevância estatística (P ≤ 0,05), em Portugal e Moçambique, respectivamente.
Tabela 11: Linkage disequilibrium entre os marcadores genotipados na população
Portuguesa
1 *** 2 - *** 3 - - *** 4 0,667 - - *** 5 0,6 1 - 1 *** 6 0,333 1 - 0,5 1 *** 7 0,333 1 - 0,667 1 0,333 ***
8 - 0,538 - - 0,446 0,4 0,6 ***
Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8
(-) representa ausência de associação estatística.
A amarelo estão indicados os valores de |D’| para os marcadores com LD estatisticamente significativo
(P≤0,05).
A análise da tabela permite verificar que, de uma forma geral, todos os marcadores se
encontram associados, com formação de um bloco de ligação entre os marcadores 4, 5,
6 e 7. O marcador 3 apresenta um nível de heterozigotia extremamente baixo
(heterozigotia=0,033), não sendo informativo na análise de ligação factorial.
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 51 -
Relativamente ao marcador 8 verifica-se que há ligação com os marcadores 5, 6 e 7, que
estão mais próximos, e com o marcador 2, que está mais distante. No entanto, os valores
de D’ não indicam um LD forte ou total. A ligação é perdida com os marcadores 1 e 4,
facto que pode ser explicado pela presença de possíveis regiões de recombinação entre o
SNP2-SNP3, SNP4-SNP5 e SNP1-SNP5.
Tabela 12: Linkage disequilibrium entre os marcadores genotipados na população
Moçambicana
1 *** 2 - *** 3 - nv *** 4 0,05 nv - *** 5 0,05 nv - 1 *** 6 - nv - - 1 *** 7 0,24 nv - 1 0,525 1 ***
8 0,05 nv - 1 1 1 0,525 ***
Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8
nv, não valorizado
(-) representa ausência de associação estatística
A amarelo estão indicados os valores de |D’| para os marcadores com LD com valor P significativo
(P≤0,05).
Na população Moçambicana (tabela 12) verifica-se que, de uma forma geral, todos os
marcadores se encontram associados, sendo esta associação mais nítida entre o bloco
constituído pelos marcadores 4, 5, 6 e 7. O marcador 3, tal como em Portugal, é pouco
polimórfico (Heterozigotia<1%), não podendo ser considerado na análise de ligação
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 52 -
factorial. Relativamente ao marcador 2, os valores de LD não podem ser valorizados
pois, como já foi referido, este SNP não está em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
4.7. Análise da variância molecular (AMOVA)
A análise de variância molecular (AMOVA) foi realizada utilizando o programa de
análise populacional ARLEQUIN 3.01 (63). Os indivíduos foram divididos pelos 4
subgrupos anteriormente descritos, Portugal e Moçambique e dentro destes em MI+ e
MI-. A análise foi executada, numa primeira fase, para o conjunto dos 8 SNPs
genotipados e, posteriormente, de forma isolada para cada marcador. Foram calculados
Índices de Fixação de Wright (valores de FST) como indicadores de diferenciação
genética entre as duas populações.
4.7.1. AMOVA total
Os resultados obtidos (tabela 13) mostram que, para o conjunto dos 8 SNPs estudados
no locus do gene CDX2, a maior fonte de variação é encontrada entre os indivíduos
dentro dos subgrupos e entre populações, Portugal e Moçambique, não se encontrando
diferenças quando se comparam os subgrupos MI- e MI+ dentro de cada população.
Esta análise produziu um valor de FST de 0,18738 (P<0,001). Este valor de P indica uma
diferenciação genética significativa entre as duas populações, Portugal e Moçambique.
No entanto existe uma elevada variação dentro de cada um dos subgrupos (81,26% de
distribuição da variação) mas não entre os subgrupos dentro de cada população (0% de
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 53 -
distribuição da variação). A tabela 14 apresenta os valores de FST associados à
distribuição da variação para os 4 subgrupos em estudo. Para o conjunto dos 8 SNPs
foram obtidos valores de FST significativos ao comparar os subgrupos Portugueses com
os Moçambicanos.
Tabela 13: Índices de Fixação de Wright para as duas populações, Portugal e
Moçambique, e para os subgrupos (MI- e MI+), para os 8 marcadores
*valores percentuais
Tabela 14: Matriz de diferenciação genética entre as subpopulações Portuguesas e
Moçambicanas para os 8 SNP’s
FST* 1 2 3 4
1.Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000(0,56757) -
3.Moçambique_MI- 0,19277(0,00000) 0,16554(0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,22650(0,00000) 0,18291(0,00000) 0,00662(0,30631) -
*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)
AMOVA TOTAL Distribuição da variação*
Entre populações 18,77
Entre subgrupos dentro de cada população
-0,03 (0,00)
Entre indivíduos dentro dos subgrupos
81,26
Total 100
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 54 -
Nesta fase, colocamos a hipótese de haver ancestralidade genética europeia nos
indivíduos Moçambicanos com MI, e que este factor os tornasse mais susceptíveis ao
desenvolvimento de MI no contexto de infecção pela H. pylori. No entanto esta hipótese
não foi confirmada. Os valores de FST, indicativos de distância genética entre
populações, indicam que o subgrupo português MI+ está geneticamente mais distante
do subgrupo Moçambicano MI+ (FST=0,18291) do que do subgrupo Moçambicano MI-
(FST=0,16554), rejeitando qualquer hipótese de ancestralidade. O mesmo se verifica
relativamente ao subgrupo Português MI-.
4.7.2. AMOVA para cada marcador
No sentido de verificar a ocorrência de diferenciação genética de forma isolada,
procedeu-se à análise AMOVA para cada marcador. A tabela 15 apresenta os Índices de
Fixação de Wright obtidos.
Os resultados obtidos mostram a mesma tendência observada quando foi feita a análise
global dos 8 SNPs, isto é, maior variação genética entre as populações, Portugal e
Moçambique, e entre os indivíduos dentro dos subgrupos, do que entre os subgrupos
MI- e MI+ dentro de cada população.
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 55 -
Tabela 15: Índices de Fixação de Wright para as duas populações, Portugal e
Moçambique, e para os subgrupos populacionais (MI- e MI+), para cada marcador
1 2 3 4 5 6 7 8
Marcador rs9554217 rs3812862 rs1805106 rs3742110 rs2504211 rs2481952 rs3003954 rs9285356
Entre populações
14,91 26,7 0,87 4,99 24,32 9,33 19,28 29,71
Entre subgrupos dentro de cada população
-0,79 (0,00)
1,89 -1,04 (0,00)
-0,69 (0,00)
-0,97 (0,00)
0,76 -0,22 (0,00)
0,17
Entre indivíduos dentro dos subgrupos
85,88 71,41 100,17 95,7 76,65 89,91 80,94 70,11
Total 100 100 100 100 100 100 100 100
Os valores representam percentagens de distribuição da variação.
Os valores de distribuição da variação intrapopulacional superiores a 0% estão destacados a azul.
No entanto, 3 SNPs mostraram valores de distribuição percentual indicativos de alguma
variação intrapopulacional: o rs3812862 (1,89%), o rs2481952 (0,76%) e o rs9285356
(0,17%). As tabelas seguintes apresentam os valores de FST obtidos para estes
marcadores, respectivamente, e o anexo I as tabelas com os valores obtidos para os
restantes marcadores.
Tabela 16: Matriz de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais
Portugueses e Moçambicanos para o marcador 2
SNP2 (rs3812862)* 1 2 3 4
1.Portugal_MI- -
2. Portugal_MI+ 0,00000(0,48649) -
3.Moçambique_MI- 0,25717 (0,0000) 0,18699(0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,66403 (0,0000) 0,54230(0,00000) 0.06537(0,18919) -
*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)
Os valores de FST intrapopulacionais superiores a 0,01 estão destacados a azul
Resultados
_____________________________________________________________________________________
- 56 -
Tabela 17: Matriz de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais
Portugueses e Moçambicanos para o marcador 6
SNP6 (rs2481952)* 1 2 3 4
1.Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000(0,95495) -
3.Moçambique_MI- 0,20581 (0,0000) 0,16001(0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,00000(0,79279) 0,00000(0,45045) 0,03830(0,13514) -
*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)
Os valores de FST intrapopulacionais superiores a 0,01 estão destacados a azul
Tabela 18: Matriz de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais
Portugueses e Moçambicanos para o marcador 8
SNP8 (rs9285356)* 1 2 3 4
1. Portugal_MI- -
2. Portugal_MI+ 0,02563(0,00901) -
3.Moçambique_MI- 0,32867 (0,00) 0,19515(0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,45930 (0,00) 0,23068(0,01802) 0.00000(0,99099) -
*valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)
Os valores de FST intrapopulacionais superiores a 0,01 estão destacados a azul
Para os valores de FST indicativos de diferenciação genética intrapopulacional relativos
aos SNPs 2, 6 e 8, só foi encontrada relevância estatística para o SNP8. Este valor de
FST deve-se a uma diferença significativa entre os subgrupos MI- e MI+ em Portugal, já
observada no cálculo das frequências alélicas. Relativamente aos SNPs 2 e 6 as
diferenças são observadas entre os subgrupos MI- e MI+ dentro da população
Moçambicana, no entanto provavelmente devido ao baixo efectivo amostral o valor de
FST não tem relevância estatística. Para todos os SNPs foram obtidos valores de FST
significativos quando se comparam subgrupos Portugueses com subgrupos
Moçambicanos, excepto para o SNP 3.
Discussão _____________________________________________________________________________________
- 57 -
CAPÍTULO V - DISCUSSÃO
Este trabalho consistiu no estudo de 8 SNPs no gene CDX2 e regiões flanqueantes,
previamente descritos nas bases de dados (Ensembl) e escolhidos de forma a estudar
uma região genómica envolvendo o gene CDX2 de, aproximadamente, 30 Kb. O
objectivo foi o de averiguar se alterações genéticas no locus do gene CDX2 se
associavam ao desenvolvimento da MI gástrica, no contexto da infecção pela H. pylori,
em duas populações distintas, uma Portuguesa (constituída por 120 indivíduos) e outra
Moçambicana (constituída por 101 indivíduos). Numa primeira análise foram
comparados os dois subgrupos, com metaplasia e sem metaplasia, dentro de cada
população, Portugal e Moçambique. Posteriormente, comparou-se a distribuição dos
marcadores nas duas populações, no sentido de perceber se existiam alterações que
explicassem a diferença que se observa entre elas relativamente às taxas de
desenvolvimento de MI (e carcinoma gástrico de tipo intestinal), diferença esta que
constitui a base do “Enigma africano”. Neste último ponto estudou-se ainda a
possibilidade de existir ancestralidade europeia no subgrupo Moçambicano com MI.
A nossa abordagem foi baseada numa estratégia “populacional”, também chamada
“blind study of SNP associations”, e envolveu o estudo da região genómica que contém
o gene CDX2. Esta estratégia foi seguida pelo facto de não existirem trabalhos
publicados que mostrem que SNPs específicos do gene CDX2 (localizados na região
codificante ou na região reguladora) estejam relacionados com o desenvolvimento do
fenótipo em análise. Sendo assim, o nosso interesse não foi a pesquisa de polimorfismos
específicos no gene CDX2, mas a identificação de regiões que se pudessem relacionar
com esse fenótipo.
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 58 -
A grande maioria dos estudos que envolvem a pesquisa de polimorfismos e mutações no
CDX2 foram efectuados usando casos de carcinomas do cólon e recto (CCR). O
primeiro estudo, realizado por Yagi et al. (1999) (69), identificou, numa população
Japonesa, 5 SNPs em ADN de células normais e encontrou 3 casos de perda de
heterozigotia (LOH) para duas das variantes encontradas: 2 casos no codão 61 (exão 1)
para a variante CCG→CCC (do tipo “silent mutation”) e 1 caso no codão 293 (exão 3)
para a variante TCT→CCT, Ser→Pro. Contudo, todos os SNPs foram também
identificados em indivíduos saudáveis (69). Posteriormente, um estudo numa população
Britânica, identificou 6 SNPs, 2 dos quais previamente descritos por Yagi et al mas, tal
como no primeiro estudo, não foram encontradas diferenças na distribuição das
variantes alélicas entre os controlos saudáveis e os casos de CCR (70). Em 2005 um
estudo que permitiu a identificação de 9 polimorfismos numa população Israelita, dois
dos quais previamente descritos e 7 identificados “de novo”, concluiu que nenhum deles
se associa ao desenvolvimento de CCR, aparecendo com frequência semelhante em
indivíduos saudáveis (71).
No que respeita à identificação de variantes raras (mutações) no gene CDX2 os
resultados são muito semelhantes: foi encontrada uma mutação somática num caso de
carcinoma do cólon hereditário não-polipóide (HNPCC) (69), duas mutações em CCR,
em que apenas uma (A1408G) foi exclusivamente encontrada num caso tumoral e
ausente em 47 controlos saudáveis (70).
Em resumo, todos os estudos apontam no sentido de que as variações genéticas
identificadas no gene CDX2 têm uma importância mínima na carcinogénese do cólon e
recto pois, na sua grande maioria, foram também identificadas em indivíduos normais.
Em 2008, um estudo com casos de carcinomas gástricos provenientes de uma população
Coreana, levou à identificação de 2 SNPs (codões 293 e 260) dos 5 previamente
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 59 -
descritos por Yagi et al (1999), LOH para 2 marcadores de microssatélites em 25% dos
casos de carcinoma e duas mutações somáticas de tipo “missense”. Em 3 dos casos com
LOH e nos casos com mutação somática foi encontrada perda de expressão de CDX2
por imunohistoquímica. No entanto, os autores concluíram que, tal como para a
carcinogénese do cólon e recto, a inactivação do gene CDX2 por mutações é pouco
frequente (72).
Um aspecto relevante também discutido nestes trabalhos, todos com abordagens
metodológicas muito semelhantes, é que a identificação de diferentes SNPs em
diferentes populações pode dever-se à variação da etnicidade e que o perfil genético
diverso encontrado entre populações de regiões geográficas distintas pode ser
importante para avaliar a importância real do CDX2 (71, 72). Esta possibilidade tem
especial importância no âmbito do nosso trabalho.
Existem diferenças na distribuição das variantes alélicas dos 8 SNPs entre os
subgrupos MI- e MI+, em cada uma das populações estudadas?
O cálculo das frequências alélicas mostrou haver, na população Portuguesa, uma
associação significativa (P≤0,05) do SNP8 e, na população Moçambicana, uma
associação que pode ser interpretada como tendencialmente significativa (P=0,06) do
SNP2, com o desenvolvimento de MI. Não foi encontrado significado estatístico para
mais nenhum marcador estudado, em ambas as populações.
A associação significativa entre o alelo C do SNP8 e o desenvolvimento de MI na
população Portuguesa, apesar do número de cromossomas analisados no subgrupo
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 60 -
Português MI- ser maior (N=152) do que o do subgrupo MI+ (N=88), sugere que o alelo
C (ancestral) está mais representado no subgrupo menor MI+ (17,05%) do que no
subgrupo maior MI- (8,55%). Esta observação sugere uma possível relevância deste
alelo, ou outro na região que o circunda com o qual esteja em linkage disequilibrium,
para a susceptibilidade ao desenvolvimento de MI. Este marcador está associado aos
marcadores 5, 6 e 7 (que lhe estão mais próximos) e ao marcador 2 (que se encontra
mais distante), mas com valores de associação iguais ou inferiores a 0,6. Este facto pode
justificar não se ter verificado nenhuma variação na distribuição das frequências alélicas
nos marcadores com os quais está em LD. Por outro lado, este SNP está localizado a
cerca de 7 Kb a 3’ do gene, fora da região promotora e de regiões prováveis de
regulação, o que nos leva a considerar a hipótese de que esta associação seja
circunstancial. Contudo, mais estudos seriam necessários para sustentar estas
suposições.
Na população Moçambicana, embora não tenha sido encontrada nenhuma associação
significativa na distribuição dos SNPs com o aparecimento de MI, verificou-se que,
para o SNP2, há uma inversão na distribuição das frequências das variantes alélicas
entre os dois subgrupos. O alelo C (derivado) está representado em 39,13% das
amostras MI- e em 61,11% das amostras MI+ e é o único marcador que não está em
HWE nas duas populações. Este SNP está localizado na região promotora do gene
CDX2, a 1,8 Kb do primeiro exão (Figura 4) e numa região cromossómica cuja taxa de
recombinação mostra valores médios esperados (1CM/MB). Tendo em conta estes
aspectos, consideramos que este marcador ou mais concretamente, o alelo C, ou outro
na região que o circunda e que esteja em forte LD com ele, poderá estar envolvido no
aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de MI. Para se poder confirmar esta
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 61 -
hipótese teremos de aumentar o efectivo amostral do subgrupo Moçambicano MI+,
factor limitante para o poder da análise estatística. No momento da realização deste
estudo não foi possível obter mais amostras devidamente caracterizadas quanto à
presença/ausência de infecção e MI (também devido ao baixo número de indivíduos que
desenvolvem MI em Moçambique). Uma outra abordagem será a realização de estudos
funcionais. A clonagem das duas variantes alélicas do promotor com o gene da
Luciferase seria importante para verificar se há diferenças de expressão. Em todo o
caso, e com os dados de que dispomos, a relevância deste resultado ainda não está
demonstrada, podendo ser resultado do baixo efectivo amostral. Por outro lado, pode
não ser este SNP a ter efeito directo sobre o CDX2 mas estar em LD com outro
marcador na mesma região, sendo esse o portador do efeito “directo” no gene, na
população moçambicana. Se assim for, o SNP2 funcionaria como um indicador dessa
associação.
Um último aspecto prende-se com o facto dos SNPs potencialmente relevantes que
foram identificados não serem os mesmos nas 2 populações. Se as duas populações
fossem geneticamente semelhantes para o conjunto dos 8 marcadores estudados, não
seria possível interpretar estes resultados como possíveis indicadores de alguma
associação, pois estaríamos à espera que os marcadores indicativos de alguma relação
com o fenótipo em estudo fossem os mesmos nas 2 populações. O Teste Exacto de
Diferenciação Populacional baseado nas frequências haplotípicas indicou-nos no
entanto que a probabilidade de as conseguirmos diferenciar é significativa (P<10-7),
tornando possível interpretar as variações encontradas como potencialmente indicadoras
de alguma associação. Este facto vem ao encontro de resultados publicados por outros
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 62 -
grupos que encontram associação de um ou mais SNPs com alguma patologia
dependendo da origem da população em estudo (71, 72).
São cada vez mais os estudos de associação de SNPs, localizados quer em regiões
reguladoras quer em regiões codificantes, com diversas patologias. Muitos dos SNPs
localizados nas regiões promotoras afectam a ligação a factores de transcrição. Alguns
revelam-se importantes dependendo da origem geográfica da população estudada. Por
exemplo, os SNPs -1031 e -863 no promotor do TNF-α demonstraram ser importantes
na susceptibilidade do hospedeiro para a inflamação gástrica e risco de desenvolvimento
de úlcera péptica, após infecção pela H. pylori (73). Numa população Chinesa, o SNP
C46359T no promotor do gene que codifica a metiltransferase de ADN 3B (DNMT3B)
não pode ser utilizado como marcador de estratificação de grupos com maior
susceptibilidade de desenvolvimento de metástases linfáticas de adenocarcinoma
gástrico do cárdia, ao contrário do que foi publicado em populações Caucasianas (74).
O SNP -181A/G no promotor do gene da metaloproteinase-7 (MMP-7) pode ser
utilizado como indicador de risco aumentado de carcinoma esofágico de células
escamosas, adenocarcinoma gástrico do cárdia e carcinoma pulmonar de não pequenas
células (75). Da mesma forma, numa população Chinesa, o alelo -251T do promotor do
gene da IL-8, encontra-se associado ao aumento do risco de carcinoma gástrico de tipo
difuso, ao contrário da variante -251A (76). Os indivíduos portadores do genótipo G/G
do SNP 309 do promotor do gene MDM2, regulador negativo da proteína p53, têm
susceptibilidade aumentada para o desenvolvimento de carcinoma gástrico e pior
prognóstico, quando comparados com os indivíduos portadores do alelo T (G/T+T/T)
(77). O SNP -260 C<T do promotor do gene CD14, principalmente os indivíduos
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 63 -
portadores do alelo T, têm maior risco de desenvolvimento de carcinoma gástrico
relacionado com infecção pela H. pylori (“H. pylori – related gastric carcinoma”) (78).
Com este pano de fundo, a diferença encontrada na distribuição das variantes alélicas do
SNP2 na população Moçambicana, ganha relevância.
Como já foi referido anteriormente, o SNP2 (rs3812862) não está em HWE na
população Moçambicana. As frequências genotípicas para este marcador comparadas
com as frequências depositadas no “International Hapmap Project”
(http://www.hapmap.org) para uma população Nigeriana (YRI, “Youruba in Ibadan”)
(tabela 19) são diferentes. Na população Moçambicana observa-se um aumento
estatisticamente significativo (P≤0,05) de indivíduos homozigóticos CC e uma
diminuição estatisticamente significativa (P≤0,05) na taxa de indivíduos heterozigóticos
CT, em relação à referida população Nigeriana. Por comparação, verificamos que os
valores obtidos na população Portuguesa em estudo são semelhantes aos depositados na
mesma base de dados para uma população Europeia. Este facto já nos indica uma
diferença na distribuição deste marcador na população Moçambicana.
Tabela 19: Frequências alélicas e genotípicas para o marcador rs3812862 obtidas
neste estudo e descritas para populações europeias e africanas
Alelos Genótipos rs3812862 C T CC CT TT
Total Total Portugal 0,071 0,929 1 0 0,141 0,859 1
HapMap-CEU* 0,067 0,933 1 0 0,133 0,867 1
Moçambique 0,411 0,589 1 0,238 0,347 0,416 1 HapMap-YRI* 0,35 0,65 1 0,1 0,5 0,4 1
* Baseado no “Genome Browser Ensembl.org” (http://ensembl.org), Homo sapiens Março 2008 ( CSHL-HAPMAP: HapMap-CEU-
Europa; CSHL-HAPMAP: HapYRI, África).
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 64 -
O que temos discutido até aqui relaciona-se com a associação deste SNP como
indicador de associação com o desenvolvimento de MI e com o desvio ao HWE
encontrado. Como tal, fomos verificar o HWE em cada subgrupo Moçambicano, MI- e
MI+, isoladamente, e verificamos que é o subgrupo MI- que não obedece à Lei de
Hardy-Weinberg.
Tabela 20: Frequências alélicas e genotípicas nos dois subgrupos Moçambicanos
Alelos Genótipos
rs3812862 C T CC CT TT Total Total Moçambique_MI- 0,391 0,609 1 0,228 0,326 0,446 1 Moçambique_MI+ 0,611 0,389 1 0,333 0,556 0,111 1
Estudando as frequências genotípicas (tabela 20) dos dois subgrupos Moçambicanos
verificamos haver, no subgrupo MI- face ao subgrupo MI+, diminuição dos indivíduos
homozigóticos CC, aumento significativo de homozigóticos TT (P≤0,05) e diminuição
de indivíduos heterozigóticos. Estes resultados levam-nos a considerar a hipótese de que
o alelo T, e mais concretamente o genótipo TT, poderão ter um efeito “protector” para o
desenvolvimento de MI e ser específico da população Moçambicana, já que em Portugal
e na população europeia estudada no “International Hapmap Project” este é o alelo mais
prevalente em ambos os subgrupos. Este resultado vem ao encontro de um estudo
publicado em 2006 que mostra que há regiões genómicas que se associam com
determinada patologia dependendo da origem da população (79).
Outros aspectos são importantes na interpretação de desvios ao HWE. Uma das razões
geralmente apontadas para que um marcador não obedeça à Lei de Hardy-Weinberg
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 65 -
reside na ocorrência de erros técnicos que se traduzam nos resultados de genotipagem.
(80, 81). Não é o caso do nosso estudo em que não houve qualquer dúvida relativa à
genotipagem para este marcador. Este aspecto é reforçado pelo facto de na amostra
Portuguesa não haver qualquer evidência de “desvio ao equilíbrio” para o mesmo
marcador. Uma outra forma de sustentar a veracidade dos resultados da genotipagem e
evitar associações erradamente positivas seria a inclusão no estudo de uma verdadeira
população controlo em HWE (grupo de indivíduos “normais”, isto é, nunca infectados
e, portanto, sem metaplasia intestinal). Contudo, foi-nos vedada esta hipótese de
trabalho devido às limitações amostrais nesta população africana. Um outro aspecto
apontado como causa de desvios ao HWE é a ocorrência de endogamia, fenómeno
comum em populações africanas, que se traduz na diminuição na taxa de heterozigotia
(82). Contudo, se fosse esta a justificação para o desvio encontrado, seria de esperar que
outros marcadores estudados não obedecessem a esta lei. Sendo assim, dado haver
estudos que indicam que uma violação ao HWE pode ser devida a uma associação real
(83, 84), indicando uma possível selecção de um alelo em relação a outro, este resultado
sugere a importância deste marcador na população Moçambicana, sendo que o reforço
amostral, factor limitante neste tipo de estudos, bem como estudos mais detalhados,
seriam da máxima importância para melhor perceber o verdadeiro significado destas
observações.
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 66 -
Existe algum haplótipo que se associe ao desenvolvimento de metaplasia intestinal
dentro de cada população?
A caracterização haplotípica das duas populações produziu 26 haplótipos. Na população
Portuguesa, apesar da diferença encontrada na distribuição das variantes alélicas do
SNP8, não se verificou nenhuma diferença significativa na distribuição haplotípica entre
os dois subgrupos, indicando que os dois subgrupos Portugueses, MI- e MI+, são
geneticamente muito semelhantes para o conjunto dos 8 marcadores genotipados. Este
facto vem reforçar a associação, interpretada como circunstancial, do alelo C do SNP8
com a MI, já discutida anteriormente.
Relativamente à população Moçambicana foi observada, para o haplótipo H23, uma
variação na distribuição entre os dois subgrupos MI- e MI+ que foi significativa
(P≤0,05). Este haplótipo é um dos mais representados no subgrupo Moçambicano MI-
(16,3%) e não tem qualquer representação no subgrupo MI+ (Figura 7C e 7D). De
realçar que o haplótipo H23 apenas difere da combinação H24 na posição
correspondente ao SNP2, sugerindo a possível associação do alelo T na protecção ao
desenvolvimento de MI. O facto do alelo T estar presente na população com MI
(haplótipos H2, H7 e H8) não invalida a hipótese anterior uma vez que o mesmo se
encontra associado a diferentes “backgrounds” genéticos. Mais ainda, como mostra a
tabela 20, existe uma diferença estatisticamente significativa na proporção de indivíduos
homozigóticos TT entre o subgrupo MI- (44,6%) e o subgrupo MI+ (11,1%).
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 67 -
Os resultados obtidos anteriormente foram confirmados duma outra forma aplicando o
teste AMOVA através do qual são calculados os valores de FST (índice de Fixação)
como indicadores de diferenciação genética entre populações. No entanto, para o
conjunto dos 8 marcadores estudados, não foi encontrada nenhuma variação entre os
subgrupos dentro de cada população. A totalidade da distribuição da variação (tabela
13) foi encontrada ao comparar as duas populações entre si, Portugal e Moçambique,
com 18,77% de distribuição da variação e sobretudo ao comparar os indivíduos dentro
dos subgrupos com 81,26% de distribuição da variação. Entre Portugal e Moçambique o
valor obtido de distribuição da variação está dentro do intervalo de valores esperados
quando se comparam populações de diferentes continentes (15 a 20% de variação). O
“Teste Exacto de Diferenciação Populacional” baseado nas frequências haplotípicas
também apontou neste sentido. Por este facto, com base nestes marcadores, não é
possível identificar diferenças que expliquem a variação encontrada entre as duas
populações relativamente ao desenvolvimento de MI.
Haverá indícios de ancestralidade genética europeia nos indivíduos Moçambicanos
com MI?
Um outro aspecto desta análise relaciona-se com a possibilidade de podermos estudar se
havia ancestralidade genética europeia nos indivíduos pertencentes ao subgrupo
Moçambicano MI+, numa tentativa de “desvendar” um pouco o mistério subjacente ao
“Enigma Africano”. Verificamos que não existe ancestralidade genética europeia no
pequeno subgrupo Moçambicano MI+ e que não é este o factor envolvido na maior
predisposição destes indivíduos para o desenvolvimento de MI. De facto, a distância
genética encontrada entre o subgrupo Português MI+ e o subgrupo Moçambicano MI+ é
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 68 -
superior (FST=0,18291) à encontrada entre o subgrupo Português MI+ e o subgrupo
Moçambicano MI- (FST=0,16554), o que rejeita qualquer hipótese de ancestralidade.
Embora não se tenha observado nenhuma associação do conjunto dos 8 marcadores
genotipados e o desenvolvimento de MI entre as duas populações estudadas,
verificamos a ocorrência de diferenciação genética para cada marcador, para confirmar
os resultados obtidos no cálculo das frequências alélicas.
Os resultados mostraram a mesma tendência observada aquando da análise global, isto
é, maior distribuição da variação entre as duas populações, Portugal e Moçambique, e
entre indivíduos dentro dos subgrupos (tabela 15), do que entre os subgrupos MI- e MI+
dentro de cada população. No entanto verificamos que 3 marcadores mostraram alguma
percentagem de distribuição da variação intrapopulacional, um entre os subgrupos MI- e
MI+ em Portugal (SNP8) (tabela 16) e dois entre os subgrupos MI- e MI+ em
Moçambique (SNP2 e SNP6) (Tabelas 17 e 18). Estes resultados, excepto para o SNP6
(rs2481952), estão de acordo com o que foi observado inicialmente no cálculo das
frequências alélicas e discutido para o SNP8 e SNP2, respectivamente na população
Portuguesa e Moçambicana. Relativamente ao SNP6, que não tinha demonstrado
indícios de variação alélica, mesmo que tendencial, entre os dois subgrupos
Moçambicanos, verificamos que o alelo A no subgrupo MI+ está representado em
38,89% das amostras face aos 22,83% nas amostras do subgrupo MI-. No entanto, para
este tipo de variação, o baixo efectivo amostral do subgrupo Moçambicano MI+, não
permitiu que o teste estatístico utilizado detectasse esta diferença na variação da
distribuição alélica. No entanto, dado que a análise estatística AMOVA é mais sensível
a efectivos amostrais baixos, nenhum dos valores P associado aos valores de FST
Discussão
_____________________________________________________________________________________
- 69 -
indicativos de algum grau de diferenciação ou distância genética entre os subgrupos
Moçambicanos é significativo.
Conclusão _____________________________________________________________________________________
- 70 -
CAPÍTULO VI - CONCLUSÃO
O estudo de 8 SNPs na região genómica que contém o gene CDX2, realizado com o
objectivo de identificar alterações na distribuição das variantes alélicas que se associem
com o desenvolvimento de metaplasia intestinal gástrica no contexto da infecção pela
H. pylori, permitiu identificar na população Portuguesa um SNP (rs9285356) que se
associa significativamente com o desenvolvimento de MI. Na população Moçambicana
identificamos um SNP no promotor do CDX2 (rs3812862, C>T) potencialmente
associado com MI, e verificamos haver, para este SNP, um aumento significativo
(P≤0,05) de indivíduos homozigóticos para o alelo T no subgrupo MI- em comparação
com o subgrupo MI+. Também observamos uma associação significativa (P≤0,05) do
haplótipo H23 com o subgrupo MI-. Tudo isto nos leva a afirmar que, na população
Moçambicana, o alelo T deste SNP e mais concretamente o genótipo TT podem ter um
efeito protector em relação ao desenvolvimento de MI.
Verificamos também que não há indícios de ancestralidade genética europeia no
subgrupo Moçambicano MI+ e que não é este o factor envolvido na maior predisposição
destes ao desenvolvimento de MI, em relação à maioria da população.
A realização de estudos funcionais e o aumento do efectivo amostral do subgrupo
Moçambicano com metaplasia intestinal são tarefas que se mostram fundamentais para
confirmar estes resultados e, concretamente, para suportar a hipótese de que
polimorfismos no gene CDX2 seriam “facilitadores” ou “inibidores” do
desenvolvimento de MI.
Anexo
_____________________________________________________________________________________
- 71 -
ANEXO - Matrizes de diferenciação genética entre os subgrupos populacionais
Portugueses e Moçambicanos para os marcadores 1, 3, 4, 5 e 7, respectivamente
SNP1- rs9554217a 1 2 3 4
1. Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,99099) -
3.Moçambique_MI- 0,13852 (0,0000) 0,14055 (0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,19203 (0,00901) 0,19382 (0,00901) 0.00000 (0,34234) -
SNP3-rs1805106a 1 2 3 4
1. Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,66667) -
3.Moçambique_MI- 0,00000 (0,62162) 0,00526 (0,25225) -
4.Moçambique_MI+ 0,00000 (0,99099) 0,00000 (0,99099) 0.00000 (0,99099) -
SNP4-rs3742110a 1 2 3 4
1. Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,52252) -
3.Moçambique_MI- 0,05116 (0,0000) 0,02394 (0,02703) -
4.Moçambique_MI+ 0,07390(0,09910) 0,04363 (0,15315) 0.00000 (0,53153) -
SNP5-rs2504211a 1 2 3 4
1. Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000(0,99099) -
3.Moçambique_MI- 0,23588 (0,0000) 0,21299 (0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,21587 (0,01802) 0,19046 (0,00000) 0.00000 (0,82883) -
SNP7-rs3003954a 1 2 3 4
1. Portugal_MI- -
2.Portugal_MI+ 0,00000 (0,95495) -
3.Moçambique_MI- 0,20581 (0,0000) 0,18297 (0,00000) -
4.Moçambique_MI+ 0,06485 (0,09910) 0,04568(0,21622) 0.01079 (0,30631) -
a valor de FST, números em parêntesis representam valores P (Teste exacto utilizando a “Cadeia Markov”)
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 72 -
CAPÍTULO VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Parkin DM, Bray FI, Devesa SS (2001) Cancer burden in the year 2000. The global
picture. European Journal of Cancer, 37: S4-S66.
2. Correa P (1992) Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial
process- First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and
Prevention. Cancer Research, 52: 6735-6740.
3. Uemura N, Okamoto S, Yamamoto S, Matsumura N, Yamaguchi S, Yamakido M,
Taniyama K, Sasaki N, Schlemper RJ (2001) Helicobacter pylori infection and the
development of gastric cancer. New England Journal of Medicine, 345: 784-789.
4- Mesquita P, Almeida R, Lunet N, Reis CA, Santos Silva LF, Serpa J, Van Seuningen
I, Barros H, David L (2006) Metaplasia- A Transdifferentiation process that facilitates
cancer development.The model of gastric intestinal metaplasia. Critical Reviews in
Oncology, 12: 3-26.
5. Honda S, Fujioka T, Tokieda M, Satoh R, Nishizono A, Nasu M (1998) Development
of Helicobacter pylori-induced gastric carcinoma in Mongolian gerbils. Cancer
Research, 58: 4255-4259.
6. Watanabe T, Tada M, Nagai H, Sasaki S, Nakao M (1998) Helicobacter pylori
infection induces gastric cancer in Mongolian gerbils. Gastroenterology, 115: 642-648.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 73 -
7. Zheng Q, Chen XY, Shi Y, Xiao SD (2004) Development of gastric adenocarcinoma
in Mongolian gerbils after long-term infection with Helicobacter pylori. Journal of
Gastroenterology and Hepatology, 19: 1192-1198.
8. Reis CA, David L, Correa P, Carneiro F, de Bolos C, Garcia E, Mandel U, Clausen
H, Sobrinho-Simões M (1999) Intestinal metaplasia of human stomach displays distinct
patterns of mucin (MUC1, MUC2, MUC5AC and MUC6) expression. Cancer Research,
59: 1003-1007.
9. Tatematsu M, Tsukamoto T, Inada K (2003) Stem cells and gastric cancer: role of
gastric and intestinal mixed intestinal metaplasia. Cancer Science, 94: 135-141.
10. Filipe MI, Jass JR (1986) Intestinal metaplasia subtypes and cancer risk. IN: Filipe
MI, Jass JR, editors. Gastric carcinoma. London: Churchill Livingstone, p 87-115.
11. Filipe MI, Muñoz N, Matko I, Pompe-Kirn V, Jutersek A, Teuchmann S, Benz M,
Projon T (1999) Intestinal metaplasia types and the risk of gastric cancer: a cohort study
in Slovenia. Internacional Journal of Cancer, 57: 324-329.
12. Warburton VJ, Everett S; Mapstone NP, Axon AT, Hawkey P, Dixon MF (1998)
Clinical and histological associations of cagA and vacA genotypes in Helicobacter
pylori gastritis. Journal of Clinical Pathology, 51: 55-61.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 74 -
13. Nogueira C, Figueiredo C, Carneiro F, Gomes AT, Barreira R, Figueira P, Salgado
C, Belo L, Peixoto A, et al.(2001) Helicobacter pylori genotypes may determine gastric
histopathology. American Journal of Pathology, 158: 647-654.
14. Prinz C, Schoniger M, Rad R, Becker I, Keiditsch E, Wagenpfeil S, Classen M,
Rosch T, Schepp W, et al. (2001) Key importance of the Helicobacter pylori adherence
factor blood group antigen binding adhesion during chronic inflammation. Cancer
Research, 61: 1903-1909.
15. Yamaoka Y, Kikuchi S, el-Zimaity HM, Gutierres O, Osato MS, Graham DY
(2002) Importance of Helicobacter pylori oipA in clinical presentation, gastric
inflammation and mucosal interleukin 8 production. Gastroenterology, 123: 414-424.
16. Yu J, Leung WK, Go MY, Chan MC, To KF, Ng EK, Chan FK, Ling TK, Chung
SC, et al. (2002) Relationship between Helicobacter pylori babA2 status with gastric
epithelial cell turnover and premalignant gastric lesions. Gut, 51: 480-484.
17. Gallo N, Zambon CF, Navaglia F, Basso D, Guariso G, Grazia Piva M, Greco E,
Mazza S, Fogar P, et al. (2003) Helicobacter pylori infection in children and adults: a
single pathogen but a different pathology. Helicobacter, 8: 21-28.
18. Zambon CF, Navaglia F, Basso D, Rugge M, Plebani M (2003) Helicobacter pylori
babA2, cagA and s1m1 vacA genes work synergistically in causing intestinal
metaplasia. Journal of Clinical Pathology, 56: 287-291.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 75 -
19. Watanabe H, Naito M, Kawashima K, Ito A (1985) Intestinal metaplasia induced by
x-irradiation in different strains of rats. Journal of Gastroenterology, 35: 841-847.
20. Watanabe H, Fujimoto N, Masaoka Y, Ohtaki M, Ito A (1997) Strain differences in
the induction of intestinal metaplasia by x-irradiation in rats. Journal of
Gastroenterology, 32: 295-299.
21. Silva F, Carvalho F, Peixoto A, Seixas M, Almeida R, Carneiro F, Mesquita P,
Figueiredo C, Nogueira C, et al. (2001) MUC1 gene polymorphism in the gastric
carcinogenesis pathway. European Journal of Human Genetics, 9: 548-552.
22. Silva F, Carvalho F, Peixoto A, Teixeira A, Almeida R, Reis C, Bravo LE, Realpe
L, Correa P, et al. (2003) MUC1 polymorphism confers increased risk for intestinal
metaplasia in a Colombian population with chronic gastritis. European Journal of
Human Genetics, 11: 380-384.
23. Costa NR, Mendes N, Marcos NT, Reis CA, Caffrey T, Hollingsworth MA, Santos-
Silva F (2008) Relevance of MUC1 mucin variable number of tandem repeats
polymorphism in H pylori adhesion to gastric epithelial cells. World Journal of
Gastroenterology, 14: 1411-1414.
24. Zhang ZW, Newcomb PV, Moorghen M, Gupta J, Feakins R, Savage P, Hollowood
A, Alderson D, Holly JM (2004) Insulin-like growth factor binding protein-3:
relationship to the development of gastric pre-malignancy and gastric adenocarcinoma
(United Kingdom). Cancer Causes Control, 15: 211-218.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 76 -
25. Zambon CF, Basso D, Navaglia F, Germano G, Gallo N, Millazo M, Greco E, Fogar
P, Mazza S, et al. (2002) Helicobacter pylori virulence genes and host IL1-RN and IL1-
1B genes interplay in favouring the development of peptic ulcer and intestinal
metaplasia. Cytokine, 18: 242-251.
26. Chen A, Li CN, Hsu PI, Lai KH, Tseng HH, Hsu PN, Lo CC, Lin CK, Hwang IR, et
al. (2004) Risks of interleukin-1 genetic polymorphisms and Helicobacter pylori
infection in the development of gastric cancer. Alimentary Pharmacology &
Therapeutics, 20: 203-211.
27. Rad R, Prinz C, Neu B, Neuhofer M, Zeitner M, Voland P, Becker I, Schepp W,
Gerhard M (2003) Synergistic effect of Helicobacter pylori virulence factors and
interleukin-1 genetic polymorphisms for the development of severe histological changes
in the gastric mucosa. Journal of Infectious Diseases, 188: 272-281.
28. Figueiredo C, Machado JC, Pharoah P, Seruca R, Sousa S, Carvalho R, Capelinha
AF, Quint W, Caldas C, et al (2002) Helicobacter pylori and interleukin-1 genotyping:
an opportunity to identify high-risk individuals for gastric carcinoma. Journal of the
National Cancer Institute, 94: 1680-1687.
29. Leung WK, Chan MCW, To KF, Man EPS, Ng EKW, Chu ESH, Lau JYW, Lin S,
Sung JJY (2006) H. pylori genotypes and cytokine gene polymorphisms influence the
development of gastric intestinal metaplasia in a Chinese population. American Journal
of Gastroenterology, 101: 714-721.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 77 -
30. Rad R, Dossumbekova A, Neu B, Lang R, Bauer S, Saur D, Gerhard M, Prinz C
(2004) Cytokine gene polymorphisms influence cytokine expression, gastric
inflammation and host specific colonisation during Helicobacter pylori infection. Gut,
53: 1082-1089.
31. Kato I, Canzian F, Franceschi S, Plummer M, van Doorn LJ, Lu Y, Gioia-Patricola
L, Vivas J, Lopez G, Severson RK, et al. (2006) Genetic polymorphisms in anti-
inflammatory signalling and the prevalence of gastric precancerous lesions in
Venezuela. Cancer Causes Control, 17: 1183-1191.
32. Kim N, Park YS, Cho S, Lee HS, Choe G, Kim IW, Won YD, Park JH, Kim JS, et
al. (2008) Prevalence and risk factors of atrophic gastritis and intestinal metaplasia in a
Korean population without significant gastroduodenal disease. Helicobacter, 13: 245-
255.
33. Ye BD, Kim SG, Park JH, Kim JS, Jung HC, Song IS (2008) The interleukin-8-251
A allele is associated with increased risk of noncardia gastric adenocarcinoma in
Helicobacter pylori-infected Koreans. Journal of Clinical Gastroenterolgy (under
publication).
34. Steenport M, Eom H, Schneller J, Gupta R, Mustafa Y, Villanueva R, Straus EW,
Raffaniello RD (2007) Association of polymorphisms in myeloperoxidase and catalase
genes with precancerous changes in the gastric mucosa of patients at inner-city hospitals
in New York. Oncology Reports, 18: 235-240
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 78 -
35. Achyut BR, Ghoshal UC, Moorchung N, Mittal B (2007) Association of toll-like
receptor-4 (Asp299Gly and Thr3991Leu) gene polymorphisms with gastritis and
precancerous lesions. Human Immunology, 68: 901-907.
36. Hsu PI, Lu PJ, Ger LP, Lo GH, Tsay FW, Chen TA, Yang HB, Chen HC, Lin WS,
Lai KH (2008) Polymorphisms of death pathway genes FAS and FASL and risk of
premalignant gastric lesions. Anticancer Research, 28: 97-103.
37. Suh E, Traber PG (1996) An intestine-specific homeobox gene regulates
proliferation and differentiation. Molecular Cell Biology, 16: 619-625.
38. German MS, Wang J, Fernald AA, Espinosa III R, Le Beau MM, Bell GI (1994)
Localization of the genes encoding two transcription factors, LMX1 and CDX3,
regulating insulin gene expression to human chromosomes 1 and 13. Genomics, 24:
403-404.
39. Beck F, Chawengsaksophac K, Waring P, Playford RJ, Furness JB (1999)
Reprogramming of intestinal differentiation and intercalary regeneration in Cdx2
mutant mice. Procedings of the National Academy of Sciences of United States of
America, 96: 7318-7323.
40. Tamai Y, Nakajima R, Ishikawa T, Takaku K, Seldin MF, Taketo MM (1999)
Colonic hamartoma development by anomalous duplication in Cdx2 knokout mice.
Cancer Research, 59: 2965-2970.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 79 -
41.Silberg D, Sullivan J, Kang E, Swain GP, Moffet J, Sund NJ, Sackett SD, Kaestner
KH (2002) CDX2 ectopic expression induces gastric intestinal metaplasia in transgenic
mice. Gastroenterology, 122: 689-696.
42. Mutoh H, Hakamata Y, Sato K, Eda A, Yanaka I, Honda S, Osawa H, Kaneko Y,
Sugano K (2002) Conversion of gastric mucosa to intestinal metaplasia in Cdx2-
expressing transgenic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications,
294: 470-479.
43. Almeida R, Silva E, Santos-Silva F, Silberg DG, Wang J, de Bolos C, David L
(2003) Expression of intestine-specific transcription factors, CDX1 and CDX2, in
intestinal metaplasia and gastric carcinomas. Journal of Pathology, 199: 36-40.
44. Moons LM, Bax DA, Kuipers EJ, Van Dekken H, Haringsma J, Van Vliet AH,
Siersema PD, Kusters JG (2004) The homeodomain protein CDX2 is an early marker of
Barrett’s oesophagus. Journal of Clinical Pathology, 57: 1063-1068.
45. Ishikawa A, Sasaki M, Ohira S, Ohta T, Oda K, Nimura Y, Chen MF, Jan YY, Yeh
TS, et al. (2004) Aberrant expression of CDX2 is closely related to the intestinal
metaplasia and MUC2 expression in intraductal papillary neoplasm of the liver in
hepatolithiasis. Laboratory Investigation, 84: 629-638.
46. Osawa H, Kita H, Satoh K, Ohnishi H, Kaneko Y, Mutoh H, Tamada K, Ido K,
Sugano K (2004) Aberrant expression of CDX2 in the metaplastic epithelium and
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 80 -
inflammatory mucosa of the gallbladder. American Journal of Surgical Pathology, 28:
1253-1254.
47. Soubeyran P, Andre F, Lissitzky JC, Mallo GV, Moucadel V, Roccabianca M,
Rechreche H, Marvaldi J, Dikic I, et al (1999) Cdx1 promotes differentiation in a rat
intestinal epithelial cell line. Gastroenterology, 117: 1326-1338.
48. Lynch J, Suh ER, Silberg DG, Rulyak S, Blanchard N, Traber PG (2000) The
caudal-related homeodomain protein Cdx1 inhibits proliferation of intestinal epithelial
cells by down-regulation of D-type cyclins. The Journal of Biological Chemistry, 275:
4499-4506.
49. Mutoh H, Sakurai S, Satoh K, Osawa H, Hakamata Y, Takeuchi T, Sugano K
(2004) Cdx1 induced intestinal metaplasia in the transgenic mouse stomach:
comparative study with Cdx2 transgenic mice. Gut, 53: 1416-1423.
50. Liu Y, Ponsioen CI, Xiao SD, Tytgat GN, Ten Kate FG (2005) Geographic
pathology of Helicobacter pylori gastritis. Helicobacter, 10: 107-113.
51. Carrilho C, Modcoicar P, Cunha L, Ismail M, Guisseve A, Lorenzoni C, Fernandes
F, Peleteiro B, Almeida R, Figueiredo C, David L, Lunet N (2008) Prevalence of
Helicobacter pylori infection, chronic gastritis and intestinal metaplasia in Mozambican
dyspeptic patients (under publication).
52. Holcombe C (1992) Helicobacter pylori: the African enigma. Gut, 33: 429-431.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 81 -
53. Lunet N, Barros H (2003) Helicobacter pylori infection and gastric cancer: facing
the enigmas. International Journal of Cancer, 106: 953-960.
54. Kidd M, Louw JA, Marks IN (1999) Heicobacter pylori in Africa: observations of
an “enigma within an enigma” Journal of Gastroenterology and Hepatology, 14: 852-
858.
55. Mogges F, Kassu A, Mengistu G, Adugna S, Andualem B, Nishikawa T, Ota F
(2006) Seroprevalence of Helicobacter pylori in dyspeptic patients and its relationship
with HIV infection, ABO blood groups and lifestyle in a university hospital Northwest
Ethiopia. World Journal of Gastroenterology, 12: 1957-1961.
56. Campbell DI, Warren BF, Thomas JE, Figura N, Telford JN, Sullivan PB (2001)
The African enigma: low prevalence of gastric atrophy, high prevalence of chronic
inflammation in West African adults and children. Helicobacter, 6: 263-267.
57. Attia KA, N’dri Yoman T, Diomande MI, Mahassadi A, Sogodogo I, Bathaix YF,
Kissi H, Sermé K, Sawadogo A, et al. (2001) Clinical, endoscopic and histologic
aspects of chronic Helicobacter pylori gastritis in Cote d’Ivoire: study of 102 patients.
Bulletin de la Société de Pathologie Exotique, 94: 5-7.
58. Rastreio/Estudo Piloto de Patologia Gástrica associada à infecção por Helicobacter
pylori na população constituída por trabalhadores dos Estaleiros Navais de Viana do
Castelo. Resultados Intercalares, Outubro de 1998. Ministério da Saúde. Edição da
Administração Regional de Saúde do Norte.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 82 -
59. Xia HH, Kalantar JS, Talley NJ, Wyatt JM, Adams S, Cheung K, Mitchell HM
(2000) Antral-type mucosa in the gastric incisura, body, and fundus (antralization): a
link between Helicobacter pylori infection and intestinal metaplasia? American Journal
of Gastroenterology, 95: 114-121.
60. Lins TCL, Nogueira LR, Lima RM, Gentil P, Oliveira RJ, Pereira RW (2007) A
multiplex single-base extension protocol for genotyping Cdx2, FokI, BsmI, ApaI and
TaqI polymorphisms of the vitamin D receptor gene. Genetics and Molecular Research,
6: 316-324.
61. Budowle B, Chakraborty R, Giusti AM, Eisenberg AJ, Allen RC (1991) Analysis of
the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American
Journal of Human Genetics, 48: 137-144.
62. Sanchez JJ, Borsting C, Morling N (2005) Typing of Y chromosome SNPs with
multiplex PCR methods. Methods in Molecular Biology, 297: 209-228.
63. Schneider S, Roessli D, Excoffier L (2005) Arlequin version. 3.01: A software for
population genetic data analysis Evolutionary Bioinformatics Online 1:47-50.
64. “Two way Contigency Table analysis”, Bernard Rosner, Fundamentals of
Biostatistics, 6th Ed., 2006.
65. Abecasis GR, Cookson OC (2000): GOLD – Graphical overview of Linage
Disequilibrium. Bioinformatics Applications Note, 16:182-183.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 83 -
66. Stephens M, Smith NJ, Donnelly P (2001): A new statistical method for haplotype
reconstruction from population data. American Journal of Human Genetics , 68: 978-
989.
67. Bandelt HJ, Forster P, Röhl A (1999) Median-joining networks for inferring
intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution, 16: 37-48.
68. Abramson JH (2004) WinPepi (Pepi-for-Windows): Computer program for
epidemiologists. Epidemiologic Perspectives & Innovation, 1:6.
69. Yagi OK, Yuasa Y (1999) Genomic structure and alterations of homeobox gene
CDX2 in colorectal carcinomas. British Journal of Cancer, 79: 440-444.
70. Sivagnanasundaram S, Islam I, Drummond F, Walters JRF, Edwards YH (2001)
The homeobox gene CDX2 in colorectal carcinoma: a genetic analysis. British Journal
of Cancer, 84: 218-225.
71. Rosek LS, Lipkin SM, Fearon ER, Hanash Samir, Giordano TJ, Greenson JK, Kuick
R, Misek DE, Taylor JMG, Douglas JÁ, Rennert G, Gruber SB (2005) CDX2
polymorphisms, RNA expression, and risk of colorectal cancer. Cancer Research, 65:
5488-92.
72. Song JH, Kim CJ, Cho YG, Chae HS, Cao Z, Nam SW, Lee JY, Park WS (2008)
Genetic alterations of the Cdx2 gene in gastric cancer. APMIS 116: 74-80.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 84 -
73. Lu CC, Sheu BS, Chen TW, Yang HB, Hung KH, Kao AW, Chuang CH, Wu, JJ
(2005) Host TNF-α -1031 and -863 promoter single nucleotide polymorphisms
determine the risk of benign ulceration after Helicobacter pylori infection. American
Journal of Gastroenterology, 100: 1274-1282.
74. Wang YM, Wang R, Wen DG, Li Y, Guo W, Wang N, Wei LZ, He YT, Chen ZF,
Zhang XF, Zhang JH (2005) Single nucleotide polymorphism in DNA
methyltransferase 3B promoter and its aasociation with gastric cardiac adenocarcinoma
in North China. World Journal of Gastroenterology, 11: 3623-3627
75. Zhang J, Jin X, Fang S, Wang R, Li Y, Wang N, Guo W, Wang Y, Wen D, Wei L,
Dong Z, Kuang G (2005) The functional polymorphism in the matrix metalloproteinase-
7 promoter increases susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma, gastric
cardiac adenocarcinoma and non-small cell lung carcinoma. Carcinogenesis, 26: 1748-
1753.
76. Lee WP, Tai DI, Lan KH, Li AFY, Hsu HC, Lin EJ, Lin YP, Sheu ML, Li CP,
Chang FY, Chao Y, Yen SH, Lee SD (2005) The -251T allele of the interleukin-8
promoter is associated with increased risk of gastric carcinoma featuring diffuse-type
histopathology in Chinese population. Human Cancer Biology, 11: 6431-6441.
77. Ohmiya N, Taguchi A, Mabuchi N, Itoh A, Hirooka A, Niwa Y, Goto H (2006)
MDM2 promoter polymorphism is associated with both an increased susceptibility to
gastric carcinoma and poor prognosis. Journal of Clinical Oncology, 24: 4434-4440.
Referências bibliográficas
_____________________________________________________________________________________
- 85 -
78. Zhao D, Sun T, Zhang X, Guo Y, Yu D, Yang M, Tan W, Wang G, Lin D (2007)
Role of CD14 promoter polymorphism in Helicobacter pylori infection-related gastric
carcinoma (2007) Human Cancer Biology, 13: 2362-2368.
79. Voight BF, Kudaravalli Sridhar, Wen X, Pritchard JK (2006) A map of recent
positive selection in the human genome. PLOS Biology 4: 446-458.
80. Gomes I, Collins A, Lonjou C, Thomas NS, Wilkinson J, Watson M, Morton N
(1999) Hardy-Weinberg quality control. Annals of Human Genetics, 63: 535-538.
81. Hosking L, Lumsden S, Lewis K, Yeo A, McCarthy L, Bansal A, Riley J, Purvis I,
Xu CF (2004) Detection of genotyping errors by Hardy-Weinberg equilibrium test.
European Journal of Human Genetics, 12: 395-399.
82. Chalbi N, Zakaria D (1998) Modèles de familie, endogamie et consanguinité
apparente en Tunisie. Essais de mesure (French). Famille Population, 1:39-59.
83. Lee WC (2003) Searching for disease-susceptibility loci by testing Hardy-Weinberg
disequilibrium in a gene bank of affected individuals. American Journal of
Epidemiology, 158: 397-400.
84. Czika W, Weir BS (2004) Properties of the multiallelic trend test. Biometrics, 60:
69-74.