ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE · LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS OMS...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE ORGÂNICA E INORGÂNICA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA
ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE
Lippia rigida Schauer (VERBENACEAE)
FORTALEZA-CEARÁ
2012
FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA
ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE
Lippia rigida Schauer (VERBENACEAE)
Dissertação submetida à
Coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Química, da
Universidade Federal do Ceará,
como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em
Química com Área de
Concentração em Química
Orgânica.
Orientador: Prof. Dr. Francisco
Geraldo Barbosa
FORTALEZA-CEARÁ
2012
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OLIVEIRA, F.C.
3
OLIVEIRA, F.C.
A Deus, por me conceder disposição, força, saúde, amor, paz e fé para superar os obstáculos
da vida.
À minha amada esposa Elieuda, que sempre com muito amor e carinho, me incentivou para a
realização deste trabalho, simplesmente muito obrigado.
Aos meus pais Antonio e Maria, que sempre me apoiaram em meus desafios. Por todo
incentivo, carinho, amor, onde estiveram sempre presente me motivando nos momentos mais
difíceis, a eles serei eternamente grato.
4
OLIVEIRA, F.C.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre comigo, me orientando e auxiliando em todos os momentos da
minha vida.
Ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Geraldo Barbosa, pela orientação, dedicação, atenção,
sugestões e muitos conhecimentos que foram transmitidos, que foram fundamentais para a
realização deste trabalho.
Aos colegas do LABFITO (Carol Luz, Diana Kelly, Roberta, Marlon, Keyline e Darlan), pela
amizade.
Ao Prof. Jair Marfezoli, pela ajuda nas determinações estruturais.
Aos colegas e amigos de Pós-graduação: Felipe, Duvilardo, João Vitor, Max, Luciana, Irvila,
Diego, Paula, Bruno, Carol, Daniele, Afonso, entre outros.
À Profa. Dra. Mary Ane pela disponibilidade do equipamento de CLAE e a Antonia pela
ajuda na operação do mesmo.
Ao Prof. Dr. Edilberto pela coleta da planta e disponibilidade dos equipamentos de RMN do
CENAUREMN.
Aos operadores dos equipamentos RMN: Elton, Regivaldo e Prof. Dr. Daniel, pela obtenção
dos espectros de RMN.
Ao André pela obtenção dos espectros de massa.
À Profa. Dra. Jane Eire pela realização dos ensaios de atividade de inibição da enzima
acetilcolineterase.
À Profa. Dra. Givandete pela realização dos ensaios de atividade larvicida.
À Profa. Dra. Telma e doutoranda Cleane pela realização dos ensaios de atividade
antioxidante.
À Profa. Dra. Leticia pela realização dos ensaios de atividade anticâncer.
Aos demais professores do programa de Pós-graduação em química da UFC, que
contribuíram com minha formação.
5
OLIVEIRA, F.C.
Aos funcionários da UFC (Raimunda – “Mundinha”, Aurilana – “Lana”, Sr. Paulo, Célia e
Orlando).
À Doutoranda Renata e ao Mestrando Fábio pela realização dos ensaios de atividade
antibacteriana.
À IC Roberta pela realização da atividade nematicida. Às agências de fomento à pesquisa
(CAPES, CNPq e FUNCAP) pelo apoio financeiro através de recursos para custeio dos
materiais. A FUNCAP e CAPES pela bolsa de mestrado, concedida.
6
OLIVEIRA, F.C.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS......................................
9
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... 11
LISTA DE TABELAS.............................................................................................. 16
LISTA DE FLUXOGRAMAS................................................................................. 19I
RESUMO................................................................................................................... 20
ABSTRACT............................................................................................................... 21
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 22
2. COSIDERAÇÕES BOTANICAS........................................................................ 24
2.1 Considerações botânicas sobre a família Verbenaceae........................................ 24
2.2 Considerações sobre o gênero Lippia.................................................................. 24
2.3 Considerações sobre a espécie Lippia rigida....................................................... 25
3 - LEVANTAMENTO BIBLIOGRAFICO........................................................... 27
3.1 - Levantamentos do potencial biológico do gênero Lippia................................... 27
3.2 Flavonóides: no gênero Lippia dispersão e atividades biológicas....................... 35
3.3 Flavonóides e atividade anticâncer...................................................................... 48
3.4 Flavonóides e inibição da enzima acetilcolinesterase.......................................... 53
3.5 Flavonóides com atividade antioxidantes............................................................. 55
3.6 Flavonóides com atividade antibacteriana............................................................ 61
3.7 Flavonóides com potencial antifúngicos............................................................... 65
3.8 Flavonóides com atividade de citotoxicidade...................................................... 68
3.9 Estruturas química dos flavonóides relatados na literatura com atividade
anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase, antioxidante,
antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.........................................................
71
4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL E CARACTERIZAÇÃO DA
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE L.
rigida...........................................................................................................................
88
7
OLIVEIRA, F.C.
4.1 Determinação estrutural dos metabólitos secundário isolados das folhas de L.
rigida.....................................................................................................................
88
4.1.1 Determinação estrutural de LEF-1.....................................................................
88
4.1.2 Determinação estrutural de LEF-2..................................................................... 97
4.1.3 Determinação estrutural de LEF-3………………………………………….... 104
4.1.4 Determinação estrutural de LEF-4………………………………………….... 111
4.1.5 Determinação estrutural de LEF-5………………………………………….... 119
4.1.7 Determinação estrutural de LDF-1………………………………………........ 126
4.1.8 Determinação estrutural de LDF-2………………………………………........ 133
4.1.9 Determinação estrutural de LDF-3………………………………………........ 139
4.1.10 Determinação estrutural de LEC-1………………………………………...... 145
4.2 Caracterização da composição química do óleo essencial das folhas de L.
rigida...........................................................................................................................
152
5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL……………………………………...... 159
5.1 Material botânico……………………………………………………………...... 159
5.2 Métodos cromatográficos……………………………………………………..... 159
5.2.1 Cromatografia de adsorção………………………………………………........ 159
5.2.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)........................................... 160
5.3 Métodos físicos.................................................................................................... 160
5.3.1 Ponto de fusão.................................................................................................... 160
5.3.2 Rotação óptica [α]D......................................................................................... 160
5.4 Métodos espectrométricos e espectroscópicos...................................................... 161
5.4.1 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)................................ 161
5.4.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV)........................... 161
5.5 Estudo dos constituintes não voláteis de L. rigida................................................ 162
5.5.1 Preparação dos extratos...................................................................................... 162
8
OLIVEIRA, F.C.
5.5.2 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida
(LEF)...........................................................................................................................
162
5.5.3 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida
(LEC)...........................................................................................................................
163
5.5.4 Fracionamento cromatográfico da fração LEFD e isolamento de LEF-1 e
LEF-2..........................................................................................................................
163
5.5.5 Fracionamento cromatográfico da fração LEFA e isolamento de LEF-3,
LEF-4 e LEF-5...........................................................................................................
166
5.5.6 Obtenção do óleo essencial e decocto das folhas de Lippia rigida................... 169
5.5.7 Análise química do óleo essencial por CG-EM e CG-DIC............................... 170
5.5.8 Fracionamento por extração líquido-líquido de LDF........................................ 171
5.5.9 Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-1,
LDF-2 e LDF-3..........................................................................................................
171
5.5.10 Fracionamento Cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-1... 174
6 ATIVIDADES BIOLÓGICAS.............................................................................. 178
6.1 Ensaio de atividade de citotoxicidade in vitro frente à linhagem de células
cancerígenas................................................................................................................
178
6.2 Ensaio de atividade larvicida com o óleo essencial das folhas de L. rigida........ 179
6.3 Ensaio de atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase................................ 180
6.4 Ensaio de atividade toxicidade frente Artemia salina........................................... 181
6.5 Ensaio de atividade antioxidante........................................................................... 182
6.6 Ensaio de atividade nematicida............................................................................. 183
6.7 Ensaio de atividade antibacteriana........................................................................ 183
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................ 185
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 186
9
OLIVEIRA, F.C.
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
OMS Organização Mundial de Saúde
IV Inflavermelho
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN 13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
EM-IE Espectrometria de Massa por Impacto Eletrônico
p.f Ponto de fusão
LEF Extrato Etanolico das Folhas
[α]D Rotação óptica
KBr Brometo de Potássio
J Constante de Acoplamento
δ Deslocamento químico
d Dubleto
dd Duplo dubleto
Hz Hertz
s Singleto
COSY Correlated Spectroscopy
DEPT Distortionless Enhancement by Polazation Transfer
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
BB Broad Band decoupling
1D Unidimensional
2D Bidimensional
m Multipleto
LEFD Fração Diclorometano do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida
LEFA Fração Acetato de Etila do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida
LDFA Fração Acetato de Etila do Decocto das Folhas de Lippia rigida
LECA Fração Acetato de Etila do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida
IK Indice Kolvats
CG-DIC Cromatografia Gasosa acoplado a Detector por Ionização de Chama
CG-MS Cromatografia Gasosa acoplado a Espectrometria de Massa
ALCA Herbário Alexandre Leal Costa
CCD Cromatografia em Camada Delgada
10
OLIVEIRA, F.C.
Rf Índice de Retenção
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CENAUREMN Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear
Θ Ângulo de nutação
LHF Extrato Hexanico das Folhas de Lippia rigida
LHC Extrato Hexanico do Caule de Lippia rigida
LEF Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida
LEC Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida
LEFH Fração Hexano do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida
LEFM Fração Metano do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida
LECH Fração Hexano do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida
LECD Fração Diclorometano do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida
LECM Fração Metano do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida
LDF Decocto das Folhas de Lippia rigida
OEFLR Óleo Essencial das folhas de Lippia rigida
ºC/min Grau Celsius por Minuto
eV ElétronVolt
LDFD Fração Diclorometano do Decocto das Folhas de Lippia rigida
LDFB Fração Butanol do Decocto das Folhas de Lippia rigida
MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo tetrazolina
DMSO Dimetilsulfóxido
AChE Acetilcolinesterase
DTNB Ácido 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzóico)
DPPH 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil
ф Diâmetro
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OLIVEIRA, F.C.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fotos de L. rigida em seu local de coleta. Planta inteira – A; folhas – B;
inflorescência – C................................................................................................................
26
Figura 2 - Estrutura básica de um flavonóides.................................................................... 35
Figura 3 - Flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia............................................. 36
Figura 4 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade anticâncer,
registrado na literatura...........................................................................................................
52
Figura 5 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade inibição da
enzima acetilcolinesterase, registrado na literatura...............................................................
55
Figura 6 – Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade
antioxidante, registrado na literatura.....................................................................................
61
Figura 7 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade
antibacteriana, registrados na literatura................................................................................
65
Figura 8 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade
antifúngica, registrados na literatura.....................................................................................
68
Figura 9 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade
citotoxicidade, registrados na literatura................................................................................
70
Figura 10 - Flavonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.................................................
71
Figura 11 - Isoflavona com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade....................................................
79
Figura 12 - Flavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade....................................................
80
Figura 13 - Chalconas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade........................................................
83
Figura 14 - Biflavonóides com atividade anticâncer, inibição da enzima
acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.....................
84
Figura 15 - Bicatequina com atividade antioxidante............................................................... 85
Figura 16 - Catequinas com atividade antioxidante.................................................................. 85
Figura 17 - Diidrochalcona com atividade antioxidante...................................................... 85
Figura 18 – Isoflavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima
acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.....................
86
Figura 19 - Flavan-3-ol com atividade antifúngica............................................................... 86
12
OLIVEIRA, F.C.
Figura 20 - Flavanonois com atividade citotoxicidade............................................................. 86
Figura 21 - Outras clases de flavonóides com atividade inbição da enzima
acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade....................
87
Figura 22 – Espectro na região de infravermelho de LEF-1 (KBr)..................................... 88
Figura 23 - Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de
LEF-1....................................................................................................................................
90
Figura 24 – Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-1......................................................... 90
Figura 25 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-1............... 91
Figura 26 - Estrutura química de Sakuranetina.................................................................... 91
Figura 27 - Espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 93
Figura 28 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)............ 93
Figura 29 - Espectro de RMN 13
C de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz)................................. 94
Figura 30 - Espectro de RMN 13
C – DEPT 135º de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz).......... 94
Figura 31 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)............... 95
Figura 32 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)..... 95
Figura 33 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).... 96
Figura 34 – Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x
125 MHz)..............................................................................................................................
96
Figura 35 – Espectro na região de infravermelho de LEF-2 (KBr)........................................ 97
Figura 36 – Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de
LEF-2....................................................................................................................................
98
Figura 37 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-2............... 99
Figura 38 - Estrutura química de Pinocembrina.................................................................. 99
Figura 39 - Espectro de RMN 1H de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 101
Figura 40 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz)............ 101
Figura 41 - Espectro de RMN 13
C de LEF-2 (acetona-d6, 125 MHz)................................. 102
Figura 42 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)..... 102
Figura 43 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz)............... 103
Figura 44 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-2 (acetona-d6, 500 x
125 MHz)..............................................................................................................................
103
Figura 45 - Espectro na região do infravermelho de LEF-3................................................ 104
Figura 46 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-3............................... 105
Figura 47 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-3............... 106
13
OLIVEIRA, F.C.
Figura 48 - Estrutura química de Naringenina..................................................................... 106
Figura 49 - Espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 107
Figura 50 - Expansão do espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz)............. 108
Figura 51 - Espectro de RMN 13
C de LEF-3 (acetona-d6, 125 MHz)................................. 108
Figura 52 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz)................ 109
Figura 53 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)..... 109
Figura 54 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).... 110
Figura 55 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x
125 MHz)..............................................................................................................................
110
Figura 56 - Espectro na região de infravermelho de LEF-4................................................ 111
Figura 57 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-4................................ 112
Figura 58 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-4............... 113
Figura 59 - Estrutura química de 7-metoxi-aromadendrina................................................ 113
Figura 60 - Espectro de RMN 1H de LEF-4 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 115
Figura 61 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-4 (acetona-d6, 500 MHz)............ 115
Figura 62 - Espectro de RMN 13
C de LEF-4 (acetona-d6, 125 MHz)................................ 116
Figura 63 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)..... 116
Figura 64 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 500 MHz)...... 117
Figura 65 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).... 108
Figura 66 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-4 (a cetona-d6, 500
x 125 MHz)...........................................................................................................................
108
Figura 67 – Espectro na região de infravermelho de LEF-5 (KBr).................................... 119
Figura 68 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-5......................................................... 121
Figura 69 - Estrutura química de Genkwanina.................................................................... 121
Figura 70 - Espectro de RMN 1H de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)................................. 122
Figura 71 - Espectro de RMN 13
C de LEF-5 (piridina-d6, 500 MHz)................................ 123
Figura 72 - Espectro de RMN 13
C – DEPT 135º de LEF-5 (piridina-d5, 125 MHz).......... 123
Figura 73 – Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)............... 124
Figura 74 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz).... 124
Figura 75 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)... 125
Figura 76 – Espectro na região de infravermelho de LED-1 (KBr)................................... 126
Figura 77 - Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de
LDF-1...................................................................................................................................
128
14
OLIVEIRA, F.C.
Figura 78 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LED-1......................................................... 108
Figura 79 - Estrutura química de Ramnocitrina................................................................... 129
Figura 80 - Espectro de RMN 1H de LED-1 (piridina-d5, 500 MHz)................................. 130
Figura 81 - Espectro de RMN 13
C de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz)................................ 130
Figura 82 - Espectro de RMN 13
C – DEPT 135º de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz).......... 131
Figura 83 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LED-1 (Piridina-d5, 500 MHz)............. 131
Figura 84 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz).... 132
Figura 85 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)... 132
Figura 86 - Espectro na região do infravermelho de LED-2............................................... 133
Figura 87 - Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de
LDF-2...................................................................................................................................
134
Figura 88 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LED-2......................................................... 135
Figura 89 - Estrutura química do Canferol.......................................................................... 135
Figura 90 - Espectro de RMN 1H de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 136
Figura 91 - Espectro de RMN 13
C de LED-2 (acetona-d6, 125 MHz)................................. 137
Figura 92 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz)................ 137
Figura 93 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).... 138
Figura 94 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz). 138
Figura 95 – Espectro na região do infravermelho de LDF-3 (KBr).................................... 139
Figura 96 - Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de
LDF-3...................................................................................................................................
141
Figura 97 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDF-3......................................................... 141
Figura 98 - Estrutura química de Quercetina....................................................................... 141
Figura 99 - Espectro de RMN 1H de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 142
Figura 100 - Espectro de RMN 13
C de LED-3 (acetona-d6, 125 MHz)............................... 143
Figura 101 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz).............. 143
Figura 102 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).. 144
Figura 103 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz). 144
Figura 104 – Espectro na região do infravermelho de LEC-1 (KBr)..................................... 145
Figura 105 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEC-1............................. 146
Figura 106 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEC-1............ 147
Figura 107 - Estrutura química de Taxifolina...................................................................... 148
Figura 108 - Espectro de RMN 1H de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)................................ 149
15
OLIVEIRA, F.C.
Figura 109 - Espectro de RMN 13
C de LEC-1 (acetona-d6, 125 MHz)............................... 149
Figura 110 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)............. 150
Figura 111 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEC-1 (acetona-d5, 500 x 125 MHz).. 150
Figura 112 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEC-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz). 151
Figura 113 - Cromatograma da análise de OEFLR por CG/EM.......................................... 153
Figura 114 - Espectro de massa do α-pineno....................................................................... 153
Figura 115 - Espectro de massa do limoneno...................................................................... 154
Figura 116 - Espectro de massa do trans-β-ocimeno........................................................... 15
Figura 117 - Espectro de massa do linalol........................................................................... 154
Figura 118 - Espectro de massa do nerol............................................................................. 154
Figura 119 - Espectro de massa do ácido Nerolico.............................................................. 154
Figura 120 - Espectro de massa do acetato nerila................................................................ 154
Figura 121 - Espectro de massa do α-cubebeno................................................................... 154
Figura 122 - Espectro de massa do acetato de geranila....................................................... 155
Figura 123 - Espectro de massa do α-copaeno..................................................................... 155
Figura 124 - Espectro de massa do β-cariofileno................................................................. 155
Figura 125 - Espectro de massa do β-cubebeno................................................................... 155
Figura 126 - Espectro de massa do E-β-farneseno............................................................... 155
Figura 127 - Espectro de massa do α-humuleno.................................................................. 155
Figura 128 - Espectro de massa do alloaromadendreno....................................................... 155
Figura 129 - Espectro de massa do α-amorfeno................................................................... 156
Figura 130 - Espectro de massa do germacreno-D.............................................................. 156
Figura 131 - Espectro de massa do biciclogermacreno....................................................... 156
Figura 132 - Espectro de massa do γ-cadineno.................................................................... 156
Figura 133 - Espectro de massa do δ-cadineno.................................................................... 156
Figura 134 - Espectro de massa do trans-nerolidol............................................................. 156
Figura 135 - Espectro de massa do espatulenol................................................................... 156
Figura 136 - Espectro de massa do óxido de cariofileno..................................................... 167
Figura 137 - Espectro de massa do δ-cadinol...................................................................... 167
Figura 138 - Espectros de massa dos compostos não identificados..................................... 167
Figura 139 – Cromatograma de análise da fração LEFA-(36-54)-(12-27) por CLAE, em
condições de fase reversa (MeOH/H2O 80:20, fluxo 4,5 mL/min e λ = 284 nm).................
168
Figura 140 - Estrutura química do radical livre DPPH........................................................ 182
16
OLIVEIRA, F.C.
Figura 141 - Halo de inibição do crescimento bacteriano de Pseudomonas aeruginosa
pelo método de difusão em disco.................................................................................
184
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade anticâncer.... 27
Tabela 2 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade de inibição
da enzima acetilcolinesterase................................................................................................
28
Tabela 3 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antioxidante. 28
Tabela 4 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade
antibacteriana........................................................................................................................
29
Tabela 5 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antifúngica... 31
Tabela 6 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade
citotoxicidade........................................................................................................................
34
Tabela 7 - Relação dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia......................... 36
Tabela 8 - Relação das estruturas dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia
com suas respectivas espécies..............................................................................................
38
Tabela 9 - Relação das atividades biológicas dos flavonóides isolados de plantas do
gênero Lippia........................................................................................................................
44
Tabela 10 - Flavonóides relatados na literatura com atividade anticâncer.......................... 48
Tabela 11 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de inibição da enzima
acetilcolinesterase..................................................................................................................
53
Tabela 12 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antioxidante....................... 56
Tabela 13 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antibacteriana...................... 62
Tabela 14 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antifúngica........................ 65
Tabela 15 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de citotoxicidade frente as
larvas Artemia salina............................................................................................................
69
Tabela 16 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise
comparativa entre os espectros de RMN 13
C-BB e DEPT 135° de LEF-1..........................
89
Tabela 17 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de
LEF-1, comparados com a literatura (AVENDAÑO, GUERRER, AGUIRRE, 2008 –
17
OLIVEIRA, F.C.
Acetona-d6)........................................................................................................................... 92
Tabela 18 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de
LEF-2, comparados com dados da pinocembrina registrados na literatura (YENJAI et
al., 2009 – CDCl3 + CD3OD)...............................................................................................
100
Tabela 19 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de
LEF-3, comparados com a literatura (ALMEIDA et al., 2005 – acetona-d6).....................
107
Tabela 20 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de
LEF-4, comparados com a literatura (ALMEIDA, et al., 2005 – acetona-d6)....................
114
Tabela 21 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise
comparativa entre os espectros de RMN 13
C-BB e DEPT 135° de LEF-5..........................
120
Tabela 22 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de
LEF-5, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)..................................................
122
Tabela 23 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise
comparativa entre os espectros de RMN 13
C-BB e DEPT 135° de LDF-1.........................
123
Tabela 24 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de
LDF-1, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989).................................................
130
Tabela 25 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de
LDF-2, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989).................................................
136
Tabela 26 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de
LDF-3, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989).................................................
142
Tabela 27 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de
LEC-1, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989).................................................
148
Tabela 28 - Composição química do óleo essencial das folhas de L. rigida Schauer........ 152
Tabela 29 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das
folhas (LEF).........................................................................................................................
163
Tabela 30 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das
folhas (LEC).........................................................................................................................
163
Tabela 31 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD........................ 164
Tabela 32 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)........... 164
Tabela 33 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(30-
36) e isolamento de LEF-1..................................................................................................
165
Tabela 34 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(27-
29) e isolamento de LEF-2..................................................................................................
165
18
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 35 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFA por exclusão
molecular em Sephadex LH-20............................................................................................
167
Tabela 36 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da LEFA-(36-54)............ 167
Tabela 37 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do decocto das folhas
(LDF).................................................................................................................................
171
Tabela 38 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDFA........................ 172
Tabela 39 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LDF-(40-49) e
isolamento de LFD-1...........................................................................................................
172
Tabela 40 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDF-(40-49)-(22-31)
e isolamento de LFD-2 e LFD-3..........................................................................................
173
Tabela 41 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA........................ 175
Tabela 42 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)........... 175
Tabela 43 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-
25).........................................................................................................................................
176
Tabela 44 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-
25)-(31-37)...........................................................................................................................
176
Tabela 45 - Percentual de inibição do crescimento celular de amostras testadas em
concentração única (50 μg/mL) frente à linhagem de células tumorais HCT-8 (cólon)......
179
Tabela 46 – Medida do halo de inibição da enzima acetilcolinesterase.............................. 181
Tabela 47 - Percentual de citotoxicidade frente as larvas de Artemia salina...................... 182
Tabela 48 - Resultado – Atividade antibacteriana pelo teste de difusão em disco Média e
DP dos halos de inibição......................................................................................................
184
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Obtenção do extrato hexânico e etanólico das folhas e do caule de L.
rigida...................................................................................................................................
162
Fluxograma 2 - Fracionamento cromatográfico da fração LEFD, isolamento de LEF-1
e LEF-2...............................................................................................................................
166
Fluxograma 3 – Fracionamento cromatográfico de LEFA e isolamento de LEF-3,
LEF-4 e LEF-5...................................................................................................................
169
Fluxograma 4 - Extração do óleo essencial e obtenção do decocto das folhas de L. 170
19
OLIVEIRA, F.C.
rigida...................................................................................................................................
Fluxograma 5 - Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-
1, LDF-2 e LDF-3...............................................................................................................
174
Fluxograma 6 - Fracionamento cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-
1...........................................................................................................................................
177
20
OLIVEIRA, F.C.
RESUMO
Este trabalho descreve o estudo de investigação química da espécie Lippia rigida Schauer
(Verbenaceae), coletada no município de Muncugê, Bahia. A análise cromatográfica do
extrato etanólico das folhas de L. rigida permitiu o isolamento e caracterização de 3
flavonóides do tipo flavanonas: sakuranetina, pinocembrina e 2 flavanonois: 7-metil-
aromadendrina e taxifolina; 1 flavona: genkwanina; 3 flavonois: ramnocitrina, canferol e
quercetina. Na determinação estrutural dos metabólicos secundários isolados, utilizou-se
técnicas espectroscópicas como Infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de
hidrogênio (RMN 1H) e de carbono-13 (RMN
13C), incluindo técnicas bidimensionais
(COSY, HMBC e HSQC), além de espectrometria de massa (EM) e comparação com os
dados da literatura. Embora todos os compostos isolados sejam conhecidos na literatura, o
isolamento de flavonóides para a espécie L. rigida corrobora com a dispersão
quimiotaxonômica desta classe para o gênero Lippia. Além disso, os compostos 7-metil-
aromadendrina, ramnocitrina, genkwanina e canferol estão sendo relatados pela primeira vez
para o gênero, além do mais os flavonoides 7-metil-aromadendrina e ramnocitrina estão sendo
relatados pela primeira vez para a família Verbenaceae. O óleo essencial das folhas de Lippia
rigida foi obtido por hidrodestilação e analisado em CG-EM e CG-DIC. Os componentes
majoritários do óleo essencial foram α-humuleno (42,3%) e β-cariofileno (13, 0%). O óleo foi
submetido ensaio de atividade larvicida frente a larvas no estágio III do mosquito Aedes
aegypti com e apresentou CL50 de 138, 97 ± 1,2 μg/mL. Ensaio de atividade de citotoxicidade
frente a linhagens de células MDA-MB435, HCT-8 e SF-295, apresentou IC% 83,79, 86,80 e
79,41, respectivamente. A atividade de inibição da enzima acetilcolinesterase revelou com
halo de inibição de 9 mm similar ao controle fisostigmina.
Palavras-chave: Lippia rigida; flavonóides; Verbenaceae.
21
OLIVEIRA, F.C.
ABSTRACT
This paper describes the study of chemical research of the species Lippia rigida Schauer
(Verbenaceae), collected in the municipality of Muncugê, Bahia. Chromatographic analysis of
the ethanol extract from leaves of L. rigid allowed the isolation and characterization of
flavonoid-type flavanones 3 sakuranetin, pinocembrin and naringenin 2 flavanonois 7-methyl
aromadendrin and taxifolin, 1 flavone genkwanin, 3 flavonois ramnocitrin, kaempferol and
quercetin. In the structural determination of secondary metabolites isolated, we used
spectroscopic techniques such as infrared (IR) and hydrogen nuclear magnetic resonance (1H
NMR) and carbon-13 (13
C NMR), including two-dimensional techniques (COSY, HMBC and
HSQC), and mass spectrometry (MS) and comparison with literature data. Although all the
compounds are known in the literature, the isolation of flavonoids for the species L. rigida
chemotaxonomy corroborates dispersal of this class to the genus Lippia. Moreover, the
compound 7-methyl-aromadendrin, ramnocitrina, genkwanina and kaempferol are being
reported for the first time for the genus, besides the more flavonoids 7-methyl-aromadendrin
ramnocitrina and are being reported for the first time for the family Verbenaceae. The
essential oil of Lippia rigida leaves was obtained by hydrodistillation and analyzed in GC-MS
and GC-FID. The major components of the essential oil were α-humulene (42.3%) and β-
caryophyllene (13,0%). The oil was subjected testing larvicidal activity against larvae in stage
III of the mosquito Aedes aegypti and presented with LC50 of 138.97 ± 1.2 mg/mL. Assay of
cytotoxicity activity against cell lines MDA-MB435, HCT-8 and SF-295, IC% showed 83.79,
86.80 and 79.41, respectively. The activity of inhibiting the enzyme acetylcholinesterase
inhibition zone revealed with 9 mm similar to control physostigmine.
Keywords: Lippia rigida; flavonoids; Verbenaceae.
22
OLIVEIRA, F.C.
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é o país com maior biodiversidade do mundo, apresentando cerca de 20%
do número total de espécies do planeta, distribuídas nos diversos biomas (Floresta
Amazônica, Cerrado, Mata Atlântica, Pantanal, Caatinga, Manguezal, etc), sendo que muitas
dessas espécies são endêmicas (KATO, 2001). É estimado que existam cerca de 40 mil
espécies vegetais distribuídas nos diferentes biomas brasileiros (FARNSWORTH, 1991).
Todavia, o levantamento de recursos brasileiros em espécies vegetais ainda é incipiente,
levando-se em conta que outras nações aceleram seus programas de química e farmacologia
de produtos naturais oriundos de plantas, visando à obtenção de patentes para moléculas de
interesse farmacológico derivadas destas.
A organização mundial de saúde (OMS) estima que um em cada cinco habitantes
do planeta, procura assistência médica em terapias não convencionais. A utilização de plantas
como fonte terapêutica para tratamento de diversas doenças é realizada em varias
comunidades do mundo, principalmente na zona rural (RIBEIRO; LEITE; DANTAS-
BARROS, 2005).
No Brasil, observa-se um crescimento na utilização de fitoterápicos
(medicamentos obtidos utilizando-se exclusivamente matéria-prima vegetal) pela população.
Dentre os fatores que poderiam explicar o aumento do uso desta terapêutica, destacam-se os
avanços ocorridos na área científica que permitiram o desenvolvimento de fitoterápicos com
segurança e eficácia reconhecidas, como também uma forte tendência de busca, pela
população, por terapias menos agressivas destinadas ao atendimento primário à saúde
(RIBEIRO; LEITE; DANTAS-BARROS, 2005).
Estudos fitoquímicos têm por finalidade conhecer os constituintes químicos de
espécies de vegetais ou avaliar sua presença. Estes constituintes, que são substâncias
micromoleculares resultantes do metabolismo secundário podem pertencer a diversas classes
de compostos químicos voláteis e não voláteis.
Neste contexto, plantas da família Verbenaceae estão presentes em praticamente
todos os ecossistemas terrestres, sendo uma das cinco mais importantes entre as
23
OLIVEIRA, F.C.
eudicotiledôneas dos campos rupestres (GIULIETTI et al. 1987). Verbenaceae possui 36
gêneros e cerca 1000 espécies com distribuição pan-tropical, principalmente nos neotrópicos.
No Brasil, ocorrem 17 gêneros e aproximadamente 250 espécies, sendo 33 delas
ocorrentes no cerrado. As espécies desta família possuem diversos hábitos, variando de
arbustos, ervas, até, menos frequentemente, árvores e lianas (METCALFE e CHALK, 1950;
SANO e ALMEIDA, 1998; JUDD, 1999; SOUZA e LORENZI, 2005).
A família Verbenaceae também é notabilizada pela diversidade de metabólitos
encontrados, dentre os quais, estão flavonoides, terpenóides, esteróides, iridóides e seus
glicosídeos, quinonas (COSTA, 2001), taninos, saponinas, resinas, alcalóides e naftoquinonas
(PASCUAL et al., 2001).
Dentro da família Verbenaceae destaca-se o gênero Lippia, que possui grande
importância econômica devido aos usos dos óleos essenciais. Além disso, muitas espécies
apresentam diversas atividades farmacológicas (PASCUAL et al., 2001).
Diante da importância do gênero Lippia, este trabalho teve como objetivo
principal realizar o primeiro estudo químico da espécie L. rigida. O trabalho compreendeu o
isolamento, a determinação estrutural dos metabólitos secundários isolados utilizando técnicas
espectrométricas de RMN de 1H e
13C (1D e 2D), IV, EM, além da determinação de p.f. e
[α]D, a caracterização do óleo essencial e a investigação química e atividades biológicas.
Para facilitar a busca de informações, o trabalho está dividido em seis capítulos:
Capítulo 1: Introdução, Capítulo 2: Cosiderações botânicas, Capítulo 3: Levantamento
bibliográfico, Capítulo 4: Determinação estrutural e caracterização da composição
química do óleo essencial das folhas de L. rigida, Capítulo 5: Procedimento experimental,
Capítulo 6: Atividades biológicas, Capítulo 7: Considerações finais e Referências
Bibliográfica.
24
OLIVEIRA, F.C.
2 COSIDERAÇÕES BOTÂNICAS
2.1 Considerações botânicas sobre a família Verbenaceae
Plantas da família Verbenaceae estão presentes em praticamente todos os
ecossistemas terrestres, sendo uma das cinco mais importantes entre as eudicotiledôneas dos
campos rupestres (GIULIETTI et al., 1987). A família Verbenaceae possui 36 gêneros e cerca
1000 espécies com distribuição pan-tropical, principalmente nos neotrópicos. No Brasil,
ocorrem 17 gêneros e cerca de 250 espécies, sendo 33 delas ocorrentes no cerrado. As
espécies desta família possuem diversos hábitos, variando de arbustos, ervas, até, menos
frequentemente, árvores e lianas (METCALFE e CHALK, 1950; SANO e ALMEIDA, 1998;
JUDD, 1999; SOUZA e LORENZI, 2005).
As espécies de Verbenaceae têm seu potencial econômico amplamente explorado,
tanto como ornamentais (LORENZI e SOUZA, 2001), quanto como terapêuticas, neste último
caso devido à presença de óleos essenciais. Muitos estudos atestam atividades analgésicas,
antiespasmódicas, calmantes, sedativas, citostáticas, antimicrobianas, antitumorais,
hepatoprotetoras, antiinflamatórias e laxativas de algumas de suas espécies (STEFANINI et
al. 2002). Além dessas, análises bioquímicas recentes atestam as propriedades de Lantana
camara L. como repelente de mosquitos do gênero Aedes e de Stachytarpheta cayennensis
(Rich) Vahl. como leishmanicida (DUA et al., 2003; MOREIRA et al., 2007).
As principais classes de substâncias encontradas na família são flavonóides,
terpenóides, esteróides, iridóides e seus glicosídeos, quinonas (COSTA, 2001), taninos,
saponinas, resinas, alcalóides e naftoquinonas (PASCUAL et al., 2001).
2.2 Considerações sobre o gênero Lippia
O gênero Lippia reúne aproximadamente 254 táxons, incluindo espécies e
variedades, a maioria localizadas no Brasil, Paraguai e Argentina, havendo poucas espécies
endêmicas na África. No Brasil, os principais centros de diversidade específica desse gênero
estão localizados na Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais e na Chapada Diamantina na
Bahia (SALIMENA, 2002).
O gênero Lippia possui grande importância econômica devido aos diferentes usos
dos óleos essenciais, sendo muitas espécies medicinais (SALIMENA, 2002). Muitas espécies
deste gênero são utilizadas em programas fitoterápicos e de complementação alimentar no
25
OLIVEIRA, F.C.
Brasil, sendo L. alba (Mill.) N. E. Brown e L. sidoides Cham. as espécies mais conhecidas e
estudadas sob o ponto de vista químico e agronômico (PASCUAL et al., 2001; LEAL et al.,
2003; DUARTE et al., 2005).
Este gênero pode ser caracterizado por apresentar plantas arbustivas ou
subarbustivas, com folhas decussadas, geralmente com indumento glandular, florescências
parciais capituliformes ou espiciformes, congestas, axilares, brácteas membranáceas ou
cartáceas, verdes ou coloridas, amarelas, róseas ou vináceas, ultrapassando ou não o
comprimento das flores; flores sésseis, cálice comprimido, induplicado, membranáceo,
inconspícuo, persistente no fruto; corola hipocraterimorfa, alva, rósea, magenta, lilás ou
amarelas, tubo reto ou curvo, lábio superior ou adaxial, lábio inferior ou abaxial único, 2
lobos laterais; 4 estames; ovário monocarpelar, bilocular, 2 ovulado, estigma lateral e fruto
dividido na maturidade em dois mericarpos (TRONCOSO, 1974).
Algumas propriedades medicinais atribuídas às espécies do gênero Lippia estão
relacionadas à produção de óleos essenciais pelos tricomas secretores. Em Lippia, a
morfologia, distribuição e frequência dos tricomas secretores e não secretores podem ser
usados como caracteres taxonômicos discriminativos em nível específico (BONZANI et al.,
1997; SALIMENA, 2002).
Algumas espécies do gênero Lippia como a L. alba, apresentam a composição
química de seu óleo essencial com variações quantitativas e qualitativas, levando à
classificação de diferentes quimiotipos.
2.3 Considerações sobre a espécie Lippia rigida
A espécie L. rigida Schauer (Figura 1, p. 26) é um arbusto encontrado no bioma
Caatinga do estado da Bahia. Alcança cerca de 1 m de altura, muito ramificada, de folhas
pequenas (1 a 2 cm) e aromáticas com cheiro forte. As folhas e caule de L. rigida foram
coletados em junho de 2010 em Mucugê, no Estado da Bahia. Uma exsicata representando a
coleta foi depositada no Herbário Alexandre Leal Costa do Departamento de Botânica da
Universidade Federal da Bahia, sob os números 1240-1245, e a indentificação botânica foi
feita pela Professora Ms. Maria Lenise Silva Guedes, do referido Departamento.
26
OLIVEIRA, F.C.
Figura 1 – Fotos de L. rigida em seu local de coleta. Planta inteira – A; folhas – B;
inflorescência – C (Fotografo: Prof. Dr. Edilberto R. Silveira, 2010)
A
B
C
27
OLIVEIRA, F.C.
3 - LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
3.1 - O potencial biológico do gênero Lippia
O potencial biológico de plantas do gênero Lippia pode ser observado através de
levantamentos bibliográfico registrados na literatura, como no review de plantas do gênero
Lippia, realizado Pascual e colaboradores (2001), onde pode ser encontrado um grande
número de espécies com a sua composição química, aspectos farmacológicos e usos
tradicionais.
Diferentes atividades farmacológicas e biológicas são apontadas para plantas do
gênero Lippia, dentre as quais, se destacam: anticâncer, inibição da enzima
acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade. Desta forma,
realizou-se um levantamento no período de 2000 – 2011 nas bases de dados Scifinder scholar
e Science direct destas atividades para completar e atualizar informações do gênero Lippia.
Os dados encontram-se apresentados nas tabelas 1 – 6.
Tabela 1 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade anticâncer
Espécie Linhagem de
Células
Parte usada Amostra Referências
L. dulcis Trev.
L. canescens Kunth
B16F10; MK-1;
HeLa
Partes
aéreas
Extrato
ABE et al., 2002
L. sidoides Cham HL60;
CEM
Cerne Extrato COSTA et al., 2001
L. alba;
L. citriodora;
L. dulci;
L. micromera;
L. origanoides
Vero;
THP-1
Partes
aéreas
Óleo
essencial
ESCOBAR et al.,
2010
L. gracilis H.B.K;
L. thymoides Mart et
Schau;
L. microphylla Cham.;
L. sidoides Cham.
Walker 256;
Ehrlich
Folhas
extrato
PESSOA et al., 2006
L. citriodora;
L. dulcis;
L. origanoides;
L. citriodora
Vero
Folhas e
flores
Óleo
essencial
CORREA-ROYER
et al., 2010
28
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 2 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade de inibição da
enzima acetilcolinesterase
Espécie Parte usada Amostra Referências
L. alba;
L. sidoides;
Folhas;
Talos;
Caule sem cascas;
Cascas;
Folhas
Extrato
MORAIS et al.,
2007
L. sidoides Folhas Extrato LIBERATO et al.,
2011
Tabela 3 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antioxidante
Espécie Parte usada Amostra Referências
L. cf microphylla Cham. Folhas e caule Extrato DAVID et al., 2007
L. origanoides;
L. alba (Quimiotipo carvona);
L alba (Quimiotipo limonena);
L. alba (Quimiotipo
biciclosesquifellandreno.
Folhas
Óleo
essencial
OLIVERO-VERBEL
et al., 2009
L. javanica;
L. wilmsii;
L. rehmannii;
L. scaberrima
Folhas
Extrato
SHIKANGA et al.,
2010
L. pseudo-thea;
L. hermannioides;
L. alba;
L. rubella;
L. sidoide
Folhas
Extrato
FABRI et al., 2011
L. graveolens Partes aeréas Extrato MARTÍNEZ-ROCHA
et al., 2008
L. alba ---- Óleo
essencial
PUERTAS-MEJÍA et
al., 2002
L. gracilis Schauer Folhas Óleo
essencial
MENDES et al., 2010
L. multiflora Folhas Óleo
essencial
AGNANIET et al.,
2005
L. nodiflora Partes aeréas Extrato SHUKLA et al., 2009
L. sidoides ----- Extrato LIBERATO et al.,
2011
L. grandis Folhas Óleo
essencial
DAMASCENO et al.,
2011
L. aff. gracillis Folhas e talos Óleo
essencial
LIMA, 2007
29
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 4 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antibacteriana
Espécie Bactérias Parte usada Amostra Referências
L. alba
B. subtilis;
B. megaterium;
S. aureus;
S.lutea;
S. dysentriae;
V. mimicus;
V.parahemolyticus;
S. paratyphy
Folhas e flores
Extrato
COSTA et al., 2009
L. aff. gracillis
S. paratyphi;
S. marcescens;
M. morganii;
P. mirabilis;
K. pneumoniae;
E. coli;
S. aureus
Folhas
Óleo
essencial
PESSOA et al., 2005
L. javanica;
L. wilmsii;
L. rehmannii;
L. scaberrima
S. aureus;
E. faecalis;
E. coli;
P. aeruginosa
Folhas
Extrato
SHIKANGA et al.,
2010
L. alba
L. alba f.
intermedia
S. aureus MRSA;
S. aureus;
L. casei;
S. mutans
Partes aéreas
Óleo
essencial
OLIVEIRA et al.,
2006
L. origanoides
S. aureus MRSA;
S. aureus;
L. casei;
S. mutans
Partes aéreas
Óleo
essencial
OLIVEIRA et al.,
2007
L. chevalieri
E. coli;
S. aureus;
E. hirae
Partes aéreas
Óleo
essencial
MEVY et al., 2007
L. graveolens S. lútea;
V. cholerae
Partes aéreas Extrato HERNÁNDEZ, 2009
L. multiflora
S. aureus NCTC
6571;
B. subtilis NCTC
8236;
E. coli NCTC
10418;
P. aeruginosa
ATCC 10145;
S. aureus;
S. species;
S. epidermidis;
Enteroinvasive
E. coli;
Enterohaemorrhagic
Folhas
Óleo
essencial
OLADIMEJI et al.,
2004
30
OLIVEIRA, F.C.
E. coli;
K. pneumoniae
L. rubella B. cereus Folhas Extrato FABRI et al., 2011
L. chevalieri;
L. multiflora
B. cereus;
E. faecalis;
E. coli;
L. innocua;
P. mirabilis;
S. entérica;
S. dysenteria;
S. aureus;
S. camorum
Folhas
Óleo
essencial
BASSOLE et al.,
2003
L. javanica S. aureus;
E. coli
Planta inteira Óleo
esencial
MANENZHE et al.,
2004
L. javanica
S. aureus;
S. epidermidis;
E. coli;
E. cloacae;
K. pneumoniae;
P. aeruginosa
Folhas
Óleo
esencial
NGASSAPA et al.,
2003
L. multiflora
S. aureus;
E. coli;
P. aeruginosa;
S. typhii;
B. subtilis
Folhas
Extrato
KUNLE et al., 2003
L. nodiflora
S. epidermidis;
S. aureus;
P. vulgaris;
S. paratyphi A;
E. coli;
S. paratyphi B
Panta inteira
Extrato
DURAIRAJ et al.,
2007
L. sidoides
S. mutans;
S. sanguis;
S. salivarius;
S. mitis
Folhas
Óleo
essencial
BOTELHO et al.,
2007
L. turbinata E. coli;
P. aeruginosa;
Shigella sp;
S. aureus;
Partes aéreas
Extrato
HERNÁNDEZ et al.,
2000
L. javanica
K. pneumonia;
C. neoformans;
B. cereus
Partes aéreas
Óleo
essencial
VILJOEN et al., 2005
L. integrifolia
S. aureus MS ATCC
29213;
S. aureus RM
ATCC 43300;
E. coli ATCC
25922;
E. coli LM1.
Partes aéreas
Óleo
esencial
LIMA et al., 2011
31
OLIVEIRA, F.C.
E. coli LM2;
P. aeruginosa
ATCC 27853;
Y. enterocolitica PI;
S. enteritidis MI;
Salmonella sp MI
L. sidoides
K. pneumoniae;
Proteus sp;
E. coli;
S. pyogenes;
Flores
Extrato
MOREIRA et al.,
2011
L. turbinata
S. aureus;
B. cereus;
E. faecalis;
P. mirabilis
Partes aéreas
Óleo
essencial
DEMO et al., 2005
L. aff. gracillis
Salmonella sp;
S. paratyphi;
S. marcescens;
M. morganii;
P. mirabilis;
K. pneumoniae;
E. coli;
S. aureus;
P. aeruginosa
Folhas
Óleo
essencial
LIMA, 2007
Tabela 5 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antifúngica
Espécie Fungos Parte
usada
Amostra Referências
L. alba
S. cerevaceae;
A. flavus;
A. niger;
C. albicans
Folhas e
flores
Extrato
COSTA et al., 2009
L. alba;
L. alba f.
intermedia
C. albicans;
Serotype B
C. albicans;
C. parapsilosis;
C. guilliermondii
Partes
aéreas
Óleo
essencial
OLIVEIRA et al.,
2006
L. origanoides
C. albicans;
Serotype B
C. albicans;
C. parapsilosis;
C. guilliermondii
C. neoformans;
T. rubrum
Partes
aéreas
Óleo
essencial
OLIVEIRA et al.,
2007
L. chevalieri C. Albicans;
S. cerevisiae
Partes
aéreas
Óleo
essencial
MEVY et al., 2007
L. multiflora
C. pseudotropicalis;
C. albicans;
Folhas
Óleo
OLADIMEJI et al.,
32
OLIVEIRA, F.C.
T. rubrum;
A. flavus
essencial 2004
L. alba
C. albicans
Folhas
Óleo
esencial;
Extrato
DUARTE et al.,
2005
L. alba C. krusei Folhas Extrato HOLETZ et al., 2002
L. pseudo-
thea;
L. sidoide
C. albicans Folhas Extrato FABRI et al., 2011
L. multiflora C. albicans Folhas Extrato KUNLE et al., 2003
L. nodiflora C. albicans;
C. neoformans
Planta
inteira
Extrato DURAIRAJ et al.,
2007
L. rehmannii
L. theobromae;
B.cinerea;
R. solani;
F. oxysporum;
C. gloeosporioides;
A. alternata;
P. digitatum;
A. citri
Planta
inteira
Óleo
essencial
LINDE et al., 2010
L. scaberrima P. digitatum Planta
inteira
Óleo
essencial
PLOOY et al., 2009
L. scaberrima C. gloeosporioides;
L. theobromae
Partes
aéreas
Óleo
essencial
REGNIER et al.,
2010
L. sidoides C. albicans Folhas Óleo
essencial
BOTELHO et al.,
2007
L. alba A. flavus Folhas Óleo
essencial
SINGH et al., 2011
L. graveolens C. albicans;
C. dubliniensis
Planta Óleo
essencial
POZZATTI et al.,
2009
L. alba
A. alternata;
A. flavus;
A. fumigatus;
A. glaucus;
A. niger;
A. shydowi
A. terreus;
C. cladosporioides;
C. lunata;
F. graminearum;
F. nivale;
F. oxysporum;
Fusarium sp.;
P. italicum;
R. solani;
R. stolonifer;
Trichoderma spp.
Folhas
Óleo
essencial
SHUKLA et al.,
2009
L. berlandieri A. niger;
Penicillium spp.
---- Óleo
essencial
SOSA et al., 2010
L. citriodora M. perniciosa Planta Óleo REGNIER e
33
OLIVEIRA, F.C.
inteira essencial COMBRINCK,
2010.
L. citriodora;
L. dulcis;
L. origanoides;
L. citriodora
C. krusei;
A. fumigatus
Folhas e
flores
Óleo
essencial
CORREA-ROYER
et al., 2010
L. geminate;
L. alba
R. solani;
B. oryzae
Folhas Óleo
esencial;
Extrato
BHUYAN et al.,
2010
L. integrifolia
M. gypseum;
T. rubrum;
T. mentagrophytes;
T. rubrum C 110;
T. rubrum C 135;
T. rubrum C 136;
T. rubrum C 137;
T. rubrum C 139;
T. rubrum C 140;
T. mentagrophytes C
108;
T. mentagrophytes C
364;
T. mentagrophytes C
539;
T. mentagrophytes C
738;
T. mentagrophytes C
943;
T. mentagrophytes C
726;
Partes
aéreas
Óleo
esencial
LIMA et al., 2011
L. rehmannii
L. theobromae;
C. gloeosporioides;
L. theobromae;
C. gloeosporioides;
A. alternata;
P. digitatum;
A. citri;
R. solani;
F. oxysporum
Partes
aéreas
Óleo
esencial
LINDE et al., 2010
L. rugosa
A. flavus;
A. Níger;
A. parasiticus;
Aspergillus spp;
F. moniliforme;
Fusarium spp1
Fusarium spp2
P. roqueferti
Penicilium spp
Folhas
Óleo
esencial
AOUDOU et al.,
2010
34
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 6 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade de citotoxicidade
Espécie Parte usada Amostras Referências
L. alba Folhas e flores Extrato ARA et al., 2009
L. cf. microphylla Cham. Partes aéreas Extrato DAVID et al., 2007
L. multiflora Moldenke Partes aéreas Extrato AJAIYEOBA et al.,
2006
Lippia origanoides;
Lippia alba (Quimiotipo
carvona);
Lippia alba (Quimiotipo
limoneno); Lippia alba
(Quimiotipo
biciclosesquifellandreno)
Folhas
Óleo
essencial
OLIVERO-VERBEL
et al., 2009
L. pseudo-thea;
L. hermannioides;
L. alba;
L. rubella;
L. sidoide
Folhas
Extrato
FABRI et al., 2011
L. gracilis Folhas Óleo
essencial
TELES et al., 2010
L. grandis Folhas Óleo
essencial
DAMASCENO et al.,
2011
De acordo com as tabelas de 1-6, 11 espécies apresentaram atividade anticâncer, 2
espécies apresentaram atividade de inibição da enzima acetilcolonesterase, 19 espécies
apresentaram atividade antioxidante, 18 espécies apresentaram atividade antibacteriana, 18
espécies apresentaram atividade antifúgica e 12 espécies apresentaram atividade de
citotoxicidade.
35
OLIVEIRA, F.C.
3.2 Flavonóides no gênero Lippia: dispersão e atividades biológicas
Os flavonóides são substâncias com uma constituição química que compreende os
derivados flavônicos (flavus – amarelos), os derivados antociânicos (anthos – flor e kyanus –
azul), as catequias/catecóis e outros constituintes relacionados (TESTE e TRENTINI, 1997).
São derivados da condensação de uma molécula de ácido cinâmico com três grupos malonil-
CoA2 (MARTINEZ-FLORES, 2002) e representam um dos grupos fenólicos mais
importantes e diversificados entre os produtos de origem natural, sendo amplamente
distribuído no reino vegetal e encontrado em diversas formas estruturais (SIMÕES et al.
2007).
Aos flavonoides e outros polifenóis são atribuídos diversas funções, tais como,
proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível, além de proteção
contra insetos, fungos, vírus e bactérias, atração de animais com finalidade de polinização,
antioxidantes, controle da ação de hormônios vegetais, agentes alelopáticos e inibidores de
enzimas (HARBONE, 1989; HARBONE e WILLIAMS, 2000).
A estrutura básica dos flavonoides (Figura 2) consiste em dois anéis fenil (A e B)
ligados através de um anel pirânico (C) (MARTINEZ-FLORES, 2002). Essa estrutura (C6-
C3-C6) permite que os mesmos sofram diversos tipos de reações como hidroxilação,
metoxilação, glicolisação com mono e oligossacarídeos e acetilação. Estas reações podem
ocorrer em várias posições da estrutura (SHAHIDI, 1996) e estão relacionados com esquemas
de proteção frente a processos oxidativos (BORS et al., 1996; ODABASOGLU et al., 2004).
Figura 2 – Esqueleto básico de um flavonoide
O
O
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
B
CA
O interesse econômico pelos flavonoides é decorrente de suas diferentes
propriedades e também de sua importância farmacológica, dentre as quais se destacam a
atividade antitumoral, anti-inflamatória, antioxidante, antiviral, entre outras (TRUEBA e
SANCHES, 2001; SIMÕES et al., 2007).
36
OLIVEIRA, F.C.
Mais de 9.000 flavonoides foram relatados a partir de plantas superiores e micro-
organismos (FERRER et al. 2008), representando uma das maiores classes de produtos
naturais. Em geral, são encontrados nas frações mais polares, como acetato de etila
(agliconas) e butanólica (flavonoides glicosilados). Alguns compostos menos polares, como a
luteolina, são extraídos com clorofórmio ou diclorometano (NIERO, 2000). Segundo o
levantamento bibliográfico realizado para o gênero Lippia, os flavonóides são representados
por 51 estruturas diferentes (Tabelas 7 e 8), sendo 62,74% flavonas; 21,57% flavanonas;
3,63% biflavonóides e 11,89% chalconas, como indicado na Figura 3.
Figura 3 - Flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia
Tabela 7 - Relação dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia
Nº Nome dos flavonóides Referências
01 Desmetoxicentaureidina ABE et al., 2002
02 Eupafolina ABE et al., 2002
03 6-hidroxiluteolina ABE et al., 2002
04
Quercetina
COSTA et al., 2001
LIN et al., 2007
LIMA, 2007
05 Luteolina COSTA et al., 2001
LIN et al., 2007
06 Glucoluteolina COSTA et al., 2001
07 Taxifolina COSTA et al., 2001
LIN et al., 2007
08 Luteolina-7-diglicuronideo HENNEBELLE et
62,74%
21,57%
3,63%
11,89%
0
10
20
30
40
50
60
70
1 Flavononas Flavonas Biflavonóides Chalconas
37
OLIVEIRA, F.C.
al., 2008.
09 5,5”-diidroxi-6,4’,6”,3’”,4’”-pentametoxi-[C7–O–C7”]-
biflavona
BARBOSA et al.,
2005
10 4’,4’”,5,5”-tetrahidroxi-6,6”,3’”-trimetoxi-[C7–O–C7”]-
biflavona
BARBOSA et al.,
2005
11 5,3’-diidroxi-6,7,4’,5’-tetrametoxiflavona ONO et al., 2005
ONO et al., 2006
12 Crisina ONO et al., 2005
13 Salvigenina ONO et al., 2005
KANKO et al.,
2004
14 Eupatorina ONO et al., 2005
15 5-hidroxi-6,7,3’,4’-tetrametoxiflavona ONO et al., 2005
16 Galangina LIN et al., 2007
17 Metilgalangina LIN et al., 2007
18 Apigenina ONO et al., 2008
LIN et al., 2007
19 Apigenina 7-O-glucosideo LIN et al., 2007
20 Escutellareina LIN et al., 2007
21 Escutellareina 7-O-hexosideo LIN et al., 2007
22 6-Metilescutellareina LIN et al., 2007
23 6,7-Dimetilescutellareina LIN et al., 2007
24 Luteolina 7-O-glicosídeo LIN et al., 2007
25 6-Hidroxiluteolina LIN et al., 2007
26 6-Hidroxiluteolina 7-O-hexosideo LIN et al., 2007
27 6-Hidroxiluteolina 7-O-ramnosideo LIN et al., 2007
28 Pinocembrina LIN et al., 2007
29 Naringenina LIN et al., 2007
30 Sakuranetina LIN et al., 2007
31
Eriodictiol
LIN et al., 2007
ALMEIDA et al.,
2010
32 Eriodictiol 7-O-glicosideo LIN et al., 2007
33 Pentahidroxiflavanona-A LIN et al., 2007
34 Pentahidroxiflavanona-A 7-O- hexosideo LIN et al., 2007
35 Pentahidroxiflavanona-B LIN et al., 2007
36 Pentahidroxiflavanona-B 7-O-hexosideo-1 LIN et al., 2007
37 Pentahidroxiflavanona-B 7-O-hexosideo-2 LIN et al., 2007
38 Floretina LIN et al., 2007
39 Floridzina LIN et al., 2007
40 3-Hidroxifloretina LIN et al., 2007
41 3-Hidroxifloretina 6-O-hexosideo LIN et al., 2007
42 2’-O-β-D-glicopiranosil-3,4,4’,6’-tetra-hidroxi-di-hidrochalcona ALMEIDA et al.,
38
OLIVEIRA, F.C.
2010
43 2’-O-β-D-glicopiranosil-4,4’,6’-tri-hidroxi-di-hidrochalcona ALMEIDA et al.,
2010
44 4’,5,7-tri-hidroxi-6-metoxiflavona ALMEIDA et al.,
2010
LIMA 2007
45 Hispidulina ONO et al., 2008
46 Jaceosidina ONO et al., 2008
47 Cirsilineol ONO et al., 2008
48 Eupatorina ONO et al., 2008
49 Hispidulina 7-O-β-D-glucosideo ONO et al., 2008
50 Jaceosidina 7-β-glucosideo ONO et al., 2008
51 3-metil-quercetina LIMA 2007
Tabela 8 - Relação das estruturas dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia com
suas respectivas espécies
O
O
OH
OMe
OHO H
O H
MeO (01 )
L. dulcis Trev.
L. canescens Kunth.
O
O
OH
OHO H
O H
MeO (02 )
L. dulcis Trev.
L. canescens Kunth.
O
O
OH
OHO H
O H
(03 )
L. dulcis Trev.
L. canescens Kunth.
O
O
OH
OH
O H
O H
O H
(04 )
L. sidoides Cham.
39
OLIVEIRA, F.C.
O
O
OH
O H
O H
OH
(05 )
L. sidoides Cham.
(06 )
O
O H
OH
OH
O H
O
OH
O H
O H
O
O
L. sidoides Cham.
O
OO H
O H
OH
O H
O H
(07 )
L. sidoides Cham.
O
OO H
O H
OH
O H
(08 )
L. alba
(09 )
O
O
MeO
OMe
O
O
OMe
O H
OMe
MeO
O H
O
L. alba
(10 )
O
O
OH
OMe
O
O
OMe
O H
O H
MeO
O H
O
L. alba
O
O
OH
O H
OMe
MeO
MeO(11 )
L. dulcis
O
OO H
O H
MeO
MeO(12 )
L. dulcis
40
OLIVEIRA, F.C.
O
OO H
OMe
MeO
MeO
OMe
O H
(14 )
L. dulcis
O
OO H
OMe
MeO
MeO
OMe
(15 )
L. dulcis
O
OO H
O H
O H
(16 )
L. graveolens
O
O
OMe
OH
(17 )
L. graveolens
O
O
OH
O H
O H
(18 )
L. graveolens
(19)
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
O H
O
O
L. graveolens
O
O
OH
O H
O H
OH(20 )
L. graveolens
(21 )
O
O H
OH
OH
OHO
O
O
O H
O H
OH
L. graveolens
41
OLIVEIRA, F.C.
(22 )
O
O
OH
O H
O H
MeO
L. graveolens
(2 3 )
O
O
MeO
O H
MeO
L. graveolens
(24 )
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
O H
O
O
O H
L. graveolens
(25 )
O
O
OH
O H
O H
OH
O H
L. graveolens
(26 )
O
O H
OH
OH
OHO
O
O
O H
O H
OH
O H
L. graveolens
(2 7 )
O
O H
CH3
OH
OHO
O
O
O H
O H
OH
O H
L. graveolens
O
OO H
OH
OH
(28)
L. graveolens
O
OO H
OH
OH
O H
(29 )
L. graveolens
42
OLIVEIRA, F.C.
O
OO H
MeO
OH
O H
(30 )
L. graveolens
O
OO H
OH
O H
O H
(31 )
L. graveolens
(32 )
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
O H
O
O
OH
O H
L. graveolens
O
OO H
OH
OH
O H
O H
(33 )
L. graveolens
(34 )
O
O H
CH3
OH
OHO
O
O
O H
O H
OH
O H
L. graveolens
O
OO H
OH
OH O H
(35)
L. graveolens
(36 )
O
O H
CH3
OH
OHO
O
O
O H
O H
OH
L. graveolens
(37 )
O
O H
CH3
OH
OHO
O
O
O H
O H
OH
L. graveolens
O H
O
OH
O H
(38 )
L. graveolens
(3 9 )
O
O H
OH
OH
O H
O H
O
OH
O H
O
L. graveolens
43
OLIVEIRA, F.C.
(40 )
O H
O
OH
O H
O H
O H
L. graveolens
(41 )
O
O H
CH3
OH
OH
O H
O
OH
O H
O
O H
L. graveolens
(42 )
O
O H
OH
OH
O H
O H
O
OH
O
O H
L. sidoides
(4 3 )
O
O H
OH
OH
O H
O H
O
OH
O
O H
L. sidoides
(44 )
O
O
OH
O H
MeO
O H
L. sidoides
(4 5 )
O
O
OH
O H
O H
L. triphylla
(46 )
O
O
OH
O H
O H
OMe
MeO
L. triphylla
(47 )
O
O
MeO
O H
O H
MeO
L. triphylla
44
OLIVEIRA, F.C.
(48 )
O
O
MeO
O H
O H
MeO
OMe
L. triphylla
(49)
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
O H
O
O
MeO
L. triphylla
(50)
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
O H
O
O
MeO
L. triphylla
(51 )
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
O H
O
O
OH
OMe
L. aff. gracillis
Para os flavonoides isolados do gênero Lippia realizou-se um levantamento
bibliográfico das atividades biológicas apresentadas por estes. Dentre os flavonoides
relatados, 15 apresentaram diversas atividades biológicas, confirmando o potencial biológico
dos flavonoides isolados deste gênero, conforme mostra a Tabela 9.
Tabela 9 - Relação das atividades biológicas dos flavonoides isolados de plantas do gênero
Lippia
Nº Nome dos flavonoides Atividade biológica Referências
02 Eupafolina Anticâncer ABE et al., 2002
HERRERIAS, 2009
Anticâncer
WILLIAMS, 2004
CALTAGIRONE et al., 2000
TAKAHASHI et al., 1998
MANTHEY et al., 2002
SAEWAN et al., 2011
PICK et al., 2011
HE e Liu, 2006
PLOCHMANN et al., 2007
GRYNBERG, 2009
45
OLIVEIRA, F.C.
04
Quercetina
Inibição da enzima
acetilcolinesterase
JUNG e PARK, 2007
KHAN et al., 2009
Antioxidante
BRIGHENTE et al., 2007
FURUSAWA et al., 2005
FROEHLICHER et al., 2009
SÖHRETOLU et al., 2009
SILVA et al., 2008
VINSON et al., 1995
BURDA e OLESZEK, 2001
GALOTTA et al., 2008
Antibacteriana IWAGAWA et al., 1990
TALEB-CONTINI et al., 2003
Antifúngica TALEB-CONTINI et al., 2003
5
Luteolina
Anticâncer
TAKAHASHI, et al., 1998
MANTHEY et al., 2002
PLOCHMANN et al., 2007
HERRERIAS, 2009
BRIGHENTE et al., 2007
Antioxidante
MIEAN e MOHAMED, 2001
BRIGHENTE et al., 2007
SI et al., 2011
SILVA et al., 2008
BRIGHENTE et al., 2007
Antibacteriana XU e LEE, 2001
Antifúngica
XUE-GU et al., 2010
SATHIAMOORTHY et al., 2007
07
Taxifolina
Antioxidante
BRIGHENTE et al., 2007
VINSON et al., 1995
BURDA e OLESZEK, 2001
46
OLIVEIRA, F.C.
12
Crisina
Anticâncer
PICK et al., 2011
BASABE et al., 2010
USIA et al., 2002
PLOCHMANN et al., 2007
Antioxidante
BRIGHENTE et al., 2007
VINSON et al., 1995
BURDA e OLESZEK 2001
Antibacteriana ALI et al., 1998
Antifúngica YANG et al., 2011
16
Galangina
Anticâncer USIA et al., 2002
Antioxidante BURDA e OLESZEK, 2001
Antibacteriana MARCUCCI, 1996
Antifúngica YANG et al., 2011
18
Apigenina
Anticâncer
CALTAGIRONE et al., 2000
TAKAHASHI et al., 1998
USIA et al., 2002
MANTHEY et al., 2002
PICK et al., 2011
PLOCHMANN et al., 2007
HERRERIAS, 2009
Inibição da enzima
acetilcolinesterase
FALÉ et al., 2011
Antioxidante
MIEAN e MOHAMED, 2001
BRIGHENTE et al., 2007
BABAEI et al., 2008
SI et al., 2011
SHARIFIFAR et al., 2009
VINSON et al., 1995
BURDA e OLESZEK, 2001
BRIGHENTE et al., 2007
Antibacteriana BASILE et al., 1999
Antifúngica LOPES et al., 2004
20 Escutellareina Anticâncer PLOCHMANN et al., 2007
47
OLIVEIRA, F.C.
24
7-O-β-D-glicosideo
Luteolina
Antioxidante TASKOVA et al., 2003
Toxicidade TASKOVA et al., 2003
28
Pinocembrina
Anticâncer
SIMIRGIOTIS et al., 2008
USIA et al., 2002
Antioxidante SIMIRGIOTIS et al., 2008
Antibacteriana BREMMER e MEYER, 1998
Antifúngica YANG et al., 2011
29
Naringenina
Anticâncer
SCHULTZ 2003
MANTHEY et al., 2002
PLOCHMANN et al., 2007
Antioxidante
BRIGHENTE et al., 2007
BABAEI et al., 2008
DELAZAR et al., 2008
VINSON et al., 1995
BURDA e OLESZEK, 2001
Antibacteriana MALTERUND et al., 1985
31
Eriodictiol
Anticâncer PLOCHMANN et al., 2007
Antifúngica XUE-GU et al., 2010
38
Floretina
Anticâncer
TAKAHASHI et al., 1998
PLOCHMANN et al., 2007
45
Hispidulina
Anticâncer PLOCHMANN et al., 2007
Toxicidade MOREIRA et al., 2003
51 3-metoxi quercetina Inibição da enzima
acetilcolinesterase
JUNG e PARK, 2007
Considerando-se a importância dos flavonóides como metabólitos bioativos,
realizou-se um levantamento bibliográfico das atividades anticâncer, inibição da enzima
acetilcolinesterase, antioxidantes, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade, destes
compostos no período de 1985-2011, nas bases de dados Scifinder scholar e Science direct.
Segundo o levantamento realizadado foram identificados 428 flavonóides diferentes, os quais
foram agrupados nas Tabelas 10 a 15 e nas Figuras 4 a 9.
48
OLIVEIRA, F.C.
3.3 Flavonóides e atividade anticâncer
Vários flavonoides têm demonstrado suprir a carcinogênese em modelos animais
(Tabela 10). Há na literatura relatos de que os flavonoides exercem um efeito benéfico em
vários mecanismos que envolvem a patogenia do câncer. Estudos investigativos têm
demonstrado que os possíveis mecanismos de inibição da carcinogênese por polifenois
estejam relacionados com o aumento da expressão de superóxido dismutase (MANSON,
2003), inibição da cicloxigenase e lipoxigenase (HONG, 2001; SAKATA, 2003), indução de
apoptose e repressão do ciclo celular, como demonstrado em células carcinogênicas humanas
in vitro (MANSON, 2003).
Os flavonoides vêm sendo extensivamente pesquisados como protetores das
células contra danos de raios-X, bloqueando a progressão do ciclo celular e a síntese de
prostaglandinas e inibindo mutações em experimentos animais (REDDY, 2003). Quercetina,
luteolina e genistiteína têm mostrado capacidade de inibir o dano oxidativo de DNA induzido
por irradiação ultravioleta (WEISS, 2003). Além disso, a quercetina expressa efeitos
antiproliferativos e induz a morte celular de células tumorais predominante por mecanismos
apoptóticos em diversas linhagens de células cancerosas (WILLIAMS, 2004). A naringenina é
que é uma flavanona que causa citotoxicidade e apoptose via inibição do crescimento tumoral
em linhagens de células humanas leucêmicas (SCHULTZ, 2003).
Dos flavonoides pesquisados com atividade anticâncer, 58,76% pertencem à
classe das flavonas; 1,03% pertencem à classe das isoflavonas; 27,83% pertencem à classe das
flavanonas; 10,31% pertencem à classe das chalconas e 2,06% pertencem à classe dos
biflavonoides, conforme a Figura 4, p. 52.
Tabela 10 - Flavonoides relatados na literatura com atividade anticâncer.
Nome dos flavonoides Linhagem de
Células
Referências
Quercetina (4) -- WILLIAMS, 2004
Naringenina (29) -- SCHULTZ, 2003
Nobiletina (52) HT-1080 SATO et al., 2002
Quercetina (4)
Apigenina (18)
B16-BL6 CALTAGIRONE
et al., 2000
Genisteina (53)
Apigenina (18)
Luteolina (5)
Quercetina (4)
Floretina (38)
HL-60
TAKAHASHI et
al., 1998
49
OLIVEIRA, F.C.
Agehoustina (54)
Lucidina-dimetil éter (55)
Artemetina (56)
Gnafaliina (57)
LLC-MK2;
C6
SÁNCHEZ et al.,
2001
3,5,6,7,8,3’,4’-heptametoxiflavona (58)
Tangeretina (59)
Nobiletina (52)
Sinensetina (60)
Escutellareina-tetra-O-metil (61)
Nobiletina-5-desmetil (62)
Escutellareina-tetra-metiliso (63)
Sinensetina-5-desmetil (64)
Quercetina 3,5,7,3’,4’- pentametil éter (65)
Quercetina 3,7,3’,4’- tetrametil éter (66)
Limocitrina 3,5,7,4’-tetrametil éter (67)
Quercetina 5,7,3’,4’-tetrametil éter (68)
Limocitrina 3,7,4’-trimetil éter (69)
Quercetina 5,7,3’,4’-tetrametil éter-3-acetato (70)
Limocitrina 3,7,4’-trimetil éter-5-acetato (71)
Quercetina3,7,3’,4’-tetrametil éter-5-acetato (72)
5,8-diidroxi-3,7,3’,4’-tetrametoxiflavona (73)
Ramnetina (74)
Canferol (75)
Crisoeriol (76)
Apigenina (18)
Luteolina (5)
Quercetina (4)
Hesperetina (77)
Naringenina (29)
DMS-114;
HT-29;
ER+; ER-;
MCF-7;
MDA-MB-435;
DU-145;
SK-MEL5
MANTHEY et al.,
2002
Bonaniona A (78)
Bonanniol A (79)
Bonanniol B (80)
Bonanniol C (81)
Bonanniol E (82)
KB;
KB-VIN;
A549;
DU145
ROSSELLI et al.,
2011
Diidroquercetina-7,4’-dimetil éter (83)
Blumeatina (84)
Quercetina (4)
Luteolina-7-metil éter (85)
KB; NCI-H187
SAEWAN et al.,
2011
6-Metoxiflavanona (86)
Pinostrombina (87)
Dimetil pinocembrina (88)
Estrobopinina (89)
Estrobopinina-7-metil éter (90)
Dimetilcriptostrobina (91)
6-Metoxiflavona (92)
Apigenina (18)
Crisina (9)
Crisina-dimetil éter (93)
Canferol (75)
MDCK BCRP
MCF-7 MX
PICK et al., 2011
50
OLIVEIRA, F.C.
Quercetina (4)
Morina (94)
Penduletina (95)
Ayanina (96)
Retusina (97)
Tangeretina (59)
Sinensetina (60)
Nobiletina (52)
3,5,6,7,8,3’,4’-Heptametoxi-flavona (98)
5-Hidroxi-6-metil-7-metoxi-flavona (99)
Estrobocrisina-dimetil éter (100)
Genisteina (53)
Neocalicopterona (101)
Neocalicopterona 4-metil éter (102)
Califlorenon B (103)
4-Hidroxiderrincina (104)
Isobachalcona (105)
Xantoangelol (106)
Xantoangelol F (107)
Xantoangelol H (108)
2”-deoxixantoangelol H (109)
Lespeol (110)
6’-diidro-7”-hidroxilespeol (111)
Isobavachina (112)
Prostratol F (113)
7-O-metil prostratol F (114)
4’-O-geranil naringenina (115)
HL60;
CRL1579;
A549; AZ521
AKIHISA et al.,
2011
Rutina (116) GL-15 SANTOS et al.,
2011
7,7” dimetil lanaraflavona (117)
Agatisflavona (118)
7”-metil agatisflavona (118)
HT-29;
NCl-H460;
RXF-393;
MCF-7;
OVCAR-3
PRADHAN et al.,
2009
Crisina (12)
6,8-Di-C-7-O-trigeranilcrisina (120)
6-C-7-O-Digeranilcrisina (121)
6-C-Geranilcrisina (122)
8-C-Geranilcrisina (123)
3-O-8-C-Digeranilcanferol (124)
Isomacarangina (125)
4’-hidroxi-3,7-dimetoxiflavona (126)
3,7,4’-trimetoxiflavona (127)
HeLa;
A549;
HT-29;
HL-60
BASABE et al.,
2010
2’,4’-diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona (128)
Estercurensina (129)
Cardamonina (130)
(S)-Pinocembrina (28)
SW-480
SIMIRGIOTIS et
al., 2008
2’,4’-diidroxi-6’-metoxi-3’,5’-dimetilchalcona (131)
SMMC-7721;
8898;
SPC-A-1;
YE et al., 2004
51
OLIVEIRA, F.C.
HeLa;
95-D;
GBC-SD
Canferol 3-O-(4”-O-acetilil-α-L ramnopiranosideo
(132) Canferol 3-O-(2”,3”,4”-tri-O-acetil-α-L-
ramnopiranosideo (133)
MCF-7 SMITH et al., 2006
Flavona (134) HT-29 WENZEL et al.,
2000
3-O-[(S)-2-metilbutiroil]pinobanksina (135)
Crisina (12)
Galangina (16)
Apigenina (18)
Pinocembrina (28)
B16-BL6;
HT-1080;
A549;
HeLa
Colon 26-L5
USIA et al., 2002
Canferol 5-O-β-D-glicopiranosideo (136)
(+)-Catequina (137)
(+)-Gallocatequina (138)
HepG2;
Caco-2;
MCF-7
DONG et al., 2007
Quercetina (4) MCF-7 HE e LIU, 2006
Quercetina (4)
Isorhamnetina (139)
Miricetina (140)
Eriodictiol (31)
Apigenina (18)
Floretina (38)
Morina (94)
Canferol (75)
Naringenina (29)
Hesperetina (74)
Escutellareina (20)
Baicaleina (141)
Baicaleina-7-glucuronideo (142)
Crisina (12)
Catequina (137)
Hispidulina (45)
7-metoxi-baicaleina (143)
Luteolina (5)
Cirsimaritina (144)
7-metoxi-apigenina (145)
Xantohumol (146)
Naringenina chalcona (147)
Leucemia
PLOCHMANN et
al., 2007
Desmetoxicentaureidina (148)
Eupafolina (2)
6-hidroxiluteolina (149)
B16F10; MK-1;
HeLa
ABE et al., 2002
Reinoutrina (150)
Hiperina (151)
Miricitrina (152)
Quercitrina (153)
Guaijaverina (154)
SW-480
SIMIRGIOTIS et
al., 2008
5-Hidroxi-7-metoxiflavona (155) MCF-7; KHAMIS et al.,
52
OLIVEIRA, F.C.
5-Hidroxi-6,7-dimetoxiflavona(156)
2,5-Diidroxi-7-metoxiflavanona (157)
2,5-Diidroxi-6,7-dimetoxiflavanona (158)
MCF-7 ADR;
MDAMB435;
MT-1
2004
Flavona (134)
Eupafolina (2)
Apigenina (18)
Luteolina (5)
B16-F10
HERRERIAS,
2009
Amentoflavona (159)
7''-Ometilagatisflavona (160)
Quercetina (4)
Ehrlich;
S180
GRYNBERG,
2009
3-O-metoximinimiflorina (161)
A549;
K562;
WiDR
RUIZ, 1998
Minimiflorina (162)
3-metoximinimiflorina (163)
Mundulinol (164)
Buceracidina A (165)
Buceracidina B (166)
KB;
KB-VIN;
A549;
1A9;
HCT-8;
MCF-7;
PC-3;
U87-MG;
SK-MEL-2;
HAYASHI et al.,
2003
Figura 4 – Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade anticâncer,
registrado na literatura
53
OLIVEIRA, F.C.
3.4 Flavonóides e inibição da enzima acetilcolinesterase
Estudos com animais mostraram que os déficits de memória, cognição e
aprendizado durante o processo de envelhecimento está relacionado ao acúmulo de radicais
livres. Esses sinais assemelham-se àqueles observados na DA (Doença de Alzheimer).
Pesquisas demonstram ainda que o tratamento à base de antioxidantes corrigem problemas
relativos à memória, ao aprendizado e à cognição, provocados por envelhecimento ou
moléstias e seu uso pode ser útil no tratamento da DA (SOCCI et al., 1995; PEERING et al.,
1997; MONTINE et al., 2002).
Flavonoides com mono-O-7-C-glicosídeo apresentam inibição da enzima
acetilcolinesterase (RAUTER et al., 2005). A presença de um açúcar (7-O-glicosídeo), um
substituinte 4-OMe, o comprimento da cadeia de glicosídeo e as ligações interglicosídicas da
cadeia de açúcar também são importantes e/ou necessários para a atividade (FAN et al.,
2008).
A presença de um grupo hidroxila livre em C-7 no anel A é importante para a
atividade. A hidratação do grupo prenila em C-3 diminui significativamente a potência de
inibição (KIM et al., 2011). Nas flavonas, um grupo hidroxila em C-5 em vez de um
grupo metóxi em C-5 e a presença de um grupo metóxi em C-3 reduziu a potência inibitória.
Entretanto, um grupo metoxi adicional em C-4’ melhora a atividade inibitória (SAWASDEE,
et al., 2009).
Dos 54 flavonóides que apresentavam inibição da enzima acetilcolinesterase
(Tabela 11), 46,67% pertencem à classe das flavonas; 20,00% pertecem a classe das
isoflavonas; 13,33% pertencem à classe das flavanonas e 10,31% perencem a classe das
chalconas, conforme a Figura 5, p.55.
Tabela 11 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de inibição da enzima
acetilcolinesterase.
Nome dos flavonóides Referências
8-metoxiquercetina 3,7-O-a-L-ramonopiranoseo (167)
8-metoxikanferol 3,7-di-O-raminosídeo (168)
MORAIS et al.,
2007
Genisteína (53) EXNER et al.,
2001
Genisteina-8-C-glicosídeo (169)
Genisteina-7-O-glicosídeo (170)
Genisteina-5-O-metil (171)
54
OLIVEIRA, F.C.
Genisteina-7-O-glicosídeo-5-O-metil (172)
Apigenina-7-O-glicosídeo (173)
Luteolina-7-O-glucosideo (174)
Apigenina-7-O-(2-O-glucosilglicosídeo (175)
Hesperidina (176)
Luteolina 7,3-di-O-glicosídeo (177)
RAUTER et al.,
2009
Luteolina-7-O-glicuronídeo (178)
Apigenina 7-O-glicuronideo (179)
Acacetina-7-O-glicuronideo (180)
Luteolina glucuronideo (181)
Apigenina (18)
FALÉ et al., 2011
5’-geranil-4’-metoxi-5,7,2’-triidroxiflavona (183)
5’-geranil-5,7,2’,4’-tetrahidroxiflavona (184)
Kkuwanon U (185)
Kuwanon E (186)
Kuwanon C (187)
Morusina (188)
Morusinol (189)
Ciclomorusina (190)
NeocIclomorusina (191)
KIM et al., 2011
Tilirosideo (192)
Quercetina-3-Metoxi (51)
Quercitrina (153)
Quercetina (4)
JUNG e PARK,
2007
Quercetina (4)
Macluraxantona (193)
KHAN et al.,
2009
2-(3-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxicroman-4-ona (194)
2-(3-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxicroman-4-ona (195)
3-(4-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (196)
3-(4-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona
(197)
3-(3-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (198)
3-(3-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona
(199)
2-(4-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (200)
2-(4-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona
(201)
2-(3-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona(202)
2-(3-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona
(203)
(E)-3-(4-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-1-(2-hidroxi-4,5-
dimetoxifenil)prop-2-en-1-ona (204)
(E)-3-(4-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-1-(2-hidroxi-4,5-
SHEN et al., 2009
55
OLIVEIRA, F.C.
dimetoxifenil) prop-2-en-1-ona (205)
5,7,4’-trimethoxiflavona (206)
5,7-dimetoxiflavona (207)
3,5,7,4’-tetrametoxiflavona (208)
3,5,7,3’,4’-pentametoxiflavona (209)
5-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavona (210)
5,3’-diidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavone (211)
SAWASDEE et
al., 2009
Canferol-8-lavandulil (212)
Kushenol C (213)
Kuraridina (214)
Kurarinona-2’-metoxi (215)
Isoxanthohumol (216)
Maackiaina (217)
JUNG et al., 2010
Figura 5 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade inibição da
enzima acetilcolinesterase, registrado na literatura
3.5 Flavonóides com atividade antioxidante
Vários estudos classificam a ação dos flavonóides como agentes antioxidantes,
cujo, o mecanismo de ação têm por base a modulação de sinal das vias intracelulares
importantes para a função celular. A baixa toxicidade e a elevada acessibilidade favorecem os
flavonóides como compostos biologicamente ativos para prevenir e tratar danos causados pelo
stress (GOMES et al., 2008).
As propriedades antioxidantes dos flavonóides são devido a vários mecanismos
diferentes, tais como, eliminação de radicais livres, quelação de íons metálicos como ferro e
56
OLIVEIRA, F.C.
cobre, e inibição de enzimas responsáveis pela geração de radicais livres. Dependendo da
estrutura, os flavonóides são capazes de limpar praticamente todos os ROS (radicais livres)
conhecidos, incluindo o superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidroxila, oxigênio
singlete, alcóxi, aroxi e peroxil radicais, assim como alquila, arila e nitrogênio-
radicais. Assim, os flavonóides podem proteger os biossistemas contra o ataque dos radicais
livres que podem estar envolvidos em vários tipos de câncer e doenças coronárias
(VAN ACKER et al., 1996; BENAVENTE-GARCIA et al., 1997).
Quanto maior o número de grupos hidroxila no anel B, maior o potencial anti-
radical dos flavonóides. No entanto, a ligação dupla entre C2-C3 aparentemente não contribui
para a capacidade de doação de hidrogênio dos flavonóides na ausência de uma estrutura
polihidroxilada no anel B. Estes grupos hidroxila ajudam a estabilizar o radical ariloxil após a
doação de hidrogênio no processo de eliminação dos radicais livres (CAO et al., 1997).
As substituições orto-hidroxila, seja no anel B ou no anel A, são as
características mais importantes para a atividade anti-radical de flavonóides,
(YOKOZAWA et al., 1998).
Dos 199 flavonóides que apresentam atividade antioxidante (Tabela 12), 62,79%
pertencem à classe das flavonas; 4,65% pertecem à classe das isoflavonas; 33,95% pertencem
à classe das flavanonas; 18,60% perencem à classe das chalconas; 2,56% pertencem à classe
das bicatequinas; 15,38% pertencem à classe das catequinas; 5,13% pertencem à classe das
diidrochalconas; 2,25% pertencem à classe dos biflavonóides; 3,37% pertencem à classe das
isoflavanonas e 6,74% pertencem à outras classes de flavonóides, conforme a Figura 6, p. 61.
Tabela 12 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antioxidante
Nome dos flavonóides Referências
Rutina (116)
Chalconaringenina (147)
Canferol-3-O-rutinosídeo (218)
LE GALL et al., 2003
Quercetina glicosilada (219)
Luteolina (5)
Apigenina (18)
CROZIER et al., 1997
MIEAN e
MOHAMED, 2001
Aromadendrina (219)
Naringenina (29)
Taxifolina (7)
Luteolina (5)
Apigenina (18)
Quercetina (4)
BRIGHENTE et al.,
2007
57
OLIVEIRA, F.C.
Canferol-3-O-a-L-ramnopiranosil-(1,2)-b-D-glucopiranosil cafeico
(220)
Canferol (75)
Crisina (12)
Luteolina (5)
3,7-diidroxiflavona (221)
Baicaleina (141)
3,4’-diidroxiflavona (222)
2’,3-diidroxiflavona (223)
Canferol (75)
Canferol 4’-O-metileter (224)
Quercetina (4)
Miricetina (140)
Morina (94)
Fisetina (225)
3,3’,4’-triidrixiflavona (226)
3-metoxi-3’,4’-diidroxiflavona (227)
Quercetina-3-O-glucosideo (228)
Quercetina-4’-O-glucosideo (229)
3,2’,6’-triidroxiflavona (230)
FURUSAWA et al.,
2005
Miricetina 3-O-(3”-O-acetil)-a-L-ramnosideo (231)
Miricetina 3-O-a-L-ramnosideo (232)
Miricetina 3-O-b-D-glucosideo (234)
Quercetina 3-O-(3”-O-acetil)-a-L-ramnosideo (235)
Quercetina 3-O-a-L-ramnosideo (236)
Quercetina 3-O-b-D-glucosideo (237)
Helicrisina B (238)
Isosalipurposideo (239)
AGNIHOTRI et al.,
2008
Quercetina 3-O-ramnosideo (240)
Luteolina 7-O-ramnosideo (241)
Isoramnetina 3-O-rutinosideo (242)
Canferol 3-O-ramnosideo (243)
Apigenina (18)
Naringenina (29)
BABAEI et al., 2008
Luteolina (5)
Apigenina (18)
SI et al., 2011
Neobavaisoflavona (244)
8-prenildaidzeina (245)
Isobavachalcona (246)
Bavachinina (247)
Corilifol A (248)
XIAO et al., 2010
isoramnetina 3-Orungiosideo Bavachinina (249)
3’-O-metilorobol Bavachinina (250)
AHMAD et al., 2010
Isoorientina (251) DU et al., 2010
58
OLIVEIRA, F.C.
Isovitexina 6″-O-E-p-coumarate (252)
Quercetina (4)
Quercetina 3-O-β –glucopiranosideo (253)
Quercetina 3-O-β –galactopiranosideo (254)
Quercetina 3-O-(2”-O-galloil)-β-glucopiranosideo (255)
Quercetina 3-O-(2”-O-galloil)-β –galactopiranosideo (256)
Quercetina 3-O-(6”-O-galloil)-β-glucopiranosideo (257)
Quercetina 3-O-(6”-O-galloil)-β-galactopiranosideo (258)
Quercetina-3-O−α-arabinofuranosideo (259)
Quercetina-3-O-α-ramnopiranosil-(1→6)-β-glucopiranosideo (260)
SÖHRETOLU et al.,
2009
Procianidina (267)
Quercetina (4)
Rutina (116)
Epicatequina (268)
Hiperosideo (269)
FROEHLICHER et al.,
2009
Rutina (116)
Crisoeriol 7-O-rutinosideo (270)
Canferol 3-Oglucosideo (271)
Crisoeriol 7-O-glucosideo (272)
Naringenina (29)
DELAZAR et al., 2008
Rutina (116)
Apigenina (18)
Apigenina 3’,6-dimetoxi (273)
Apigenina 4’,7 dimetoxi (274)
SHARIFIFAR et al.,
2009
Canferol 5-O-â-D-glucopiranosideo (275)
(+)-Catequina (276)
(+)-Gallocatequina (277)
(-)-Epicatequina (268)
3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavanona-3-O-β-D-glucopiranosideo
(278)
3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavona-3-O-β-D-glucopiranosideo (279)
DONG et al., 2007
Quercetina (4)
Hiperosideo (269)
Rutina (116)
Isoquercitrina (280)
Quercitrina (153)
Canferol (75)
Luteolina (5)
SILVA et al., 2008
Apigenina 6-neohesperidose (281)
Canferol 3-robinobiosideo (282)
Canferol 3-O-a-L-ramnopranosil-(1 6)-β-D-galactopiranosideo
(283)
Rutina (116)
ABRAHAM et al.,
2008
2’,4’-diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona (284)
59
OLIVEIRA, F.C.
Estercurensina (285)
Cardamonina (286)
(S)-pinocembrina (28)
SIMIRGIOTIS et al.,
2008
Abacopterina E (287)
Abacopterina F (288)
Abacopterina G (289)
Abacopterina H (290)
Abacopterina I (291)
Trifillina B (292)
Eruberina A (293)
Astragalina (294)
Contigoside B (295)
ZHAO et al., 2007
Genisteina (54)
Apigenina (18)
Baicaleina (141)
Crisina (12)
Flavona (134)
Hesperitina (77)
Hesperetina rutinosideo (296)
Neohesperidina (297)
Naringenina (29)
Quercetina (4)
Taxifolina (7)
Miricetina (140)
Rutina (116)
Morina (94)
Canferol (75)
Epigallocatechina 3-gallato (298)
Epicatechina 3-gallato (299)
Epigallocatechina (300)
Catechina (137)
VINSON et al., 1995
Canferol (75)
Galangina (16)
Quercetina (4)
Morina (94)
Robinetina (301)
Fisetina (225)
Canferide (302)
3-hidroxiflavona (303)
Laricitrina (304)
Laricitrina 3’-O-glucosideo (305)
Miricetina (140)
Hesperetina (77)
3,5,7,3’,4’,5’-hexametoxiflavona (306)
60
OLIVEIRA, F.C.
3,5,7,3’,4’-pentametoxiflavona (307)
Laricitrina 3,3’-O-diglucosideo (308)
Flavona (134)
5-hidroxiflavona (312)
Quercetina 3-O-glucosideo-7-O-rhamnosideo (309)
Laricitrina 3,7,3’-O-triglucosideo (310)
Rutina (116)
Taxifolina (7)
Naringenina (29)
GB-1a (biflavanona) (319)
Canferol 3,7-O-diramnosideo (311)
Formononetina (321)
Biochanina A (322)
Crisina (12)
Flavanona (316)
Fustina (318)
Genisteina (53)
Luteolina 7-O-glucosideo (24)
8-metoxiflavona (313)
Apigenina 8-C-glucosideo (314)
GB-1 (biflavanona) (320)
Daidzeina (323)
Naringina (317)
Apigenina 7-O-glucosideo (315)
Apigenina (18)
BURDA e OLESZEK,
2001
Aromadendrina (219)
Naringenina (29)
Taxifolina (7)
Luteolina (5)
Apigenina (18)
Quercetina (4)
Canferol (75)
Canferol-3-O-α-L-ram(1 2)-β-D-glc (324)
BRIGHENTE et al.,
2007
Luteolina-7-diglucuronideo (325) HENNEBELLE et al.,
2008
Luteolina 7-O-β-d-glucosideo (24)
Quercimeritrina (326)
Quercitrina (153)
TASKOVA et al., 2003
(+)-Catequina (137)
(-)-Epicatequina (268)
(+)-Astilbina (327)
Rutina (116)
Quercetina (4)
GALOTTA et al., 2008
Naringenina (29) ALMEIDA et al., 2010
61
OLIVEIRA, F.C.
Figura 6 – Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade antioxidante,
registrado na literatura.
3.6 Flavonóides com atividade antibacteriana
Os flavonóides são conhecidos por serem sintetizados por plantas em reposta a
infecções microbianas, justificando assim sua ação antimicrobiana frente a vários
microorganismos. Esta atividade se dá provavelmente devido a habilidade de complexação
com a parede bacteriana (COWAN, 1999).
Uma série de flavonas, flavonóis, flavanonas, e isoflavonas, bem como algumas
de seus derivados metoxilados, isoprenilados e acilados mostraram atividade antibacteriana.
De acordo com a Tabela 13, p. 62, os flavonóides são eficazes no combate as bactérias, sendo
que foram encontrados 63 flavonóides ativos.
Isoflavononas contendo grupos prenila tem melhor atividade contra bactérias
Gram-positivas como Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis. Esta atividade é observada
quando os grupos prenila estão localizados em posições C-6 ou C-8 no anel A e C-3' ou C-
5' no anel B (BOJASE et al., 2002).
A maior atividade antimicrobiana contra Proteus vulgaris e Staphylococcus
aureus, para alguns flavonóides esta relacionada à presença de grupos hidroxilas nos
carbonos 3', 4', 5' no anel B e no C-3. Epigalocatequina e diidrorobinetina exibiram fraca
atividade antimicrobiana, indicando que a ligação dupla entre C-2 e C-3, não é importante
para atividade antibacteriana (MORI et al.,1987).
62
OLIVEIRA, F.C.
Flavonas metiladas exibem atividade antibacteriana principalmente
contra bactérias Gram-positivas. Os flavonóides que apresentam grupos hidroxila nos
carbonos C-5 e C-7 e com três substituições no anel B são ativos. Por exemplo, a atividade
de 5,7,4'-triidroxi-3',5'-dimetoxiflavona contra bactérias Gram-positivas S. aureus era muito
maior do que a de 7,4'-diidroxi-3', 5'-dimetoxiflavona (ZHENG et al., 1996).
Flavonóides que apresentam grupos hidroxilas no anel B aumentam sua atividade
antimicrobiana, quando comparados com as flavonas que não possuem grupos hidroxila no
anel B. Este fato pode levantar a hipótese de que o mecanismo de ação seja em alvos na
membrana plasmática. Compostos lipofílicos podem interromper a estrutura da membrana
microbiana e a maior hidroxilação do composto pode levar a maior atividade antimicrobiana
por aumento de toxicidade aos microrganismos (COWAN, 1999).
Dos flavonóides levantados com atividade anticâncer 61,90% pertencem à classe
das flavonas; 23,81% pertencem à classe das flavanonas; 2,38% perencem à classe das
chalconas, 2,38% pertencem à classe dos biflavonóides e 9,52% pertencem à outras classes de
flvonóides, conforme a figura 7, p. 65.
Tabela 13 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antibacteriana.
Nome dos flavonóides Bactérias Referências
Crisina (12) Ps. Aeruginosa ALI et al., 1998
Apigenina (18)
Vitexina (328)
Saponarina (329)
Lucenina 2-O-glicosídeo (330)
P. vulgaris
P.mirabilis
Ps. aeruginosa
E.coli
K. pneumoniae
E. cloacae
BASILE et al., 1999
OKSUS et al., 1984
5,7-diidroxi-4’,6,8-trimetoxiflavona (331)
5,6-diidroxi-4’,7,8-trimetoxiflavona (332)
B. subtilis
(MTCC121)
S. aureus
(MTCC96)
E. coli (MTCC68)
S.typhimurium
(MTCC98)
BRAHMACHARI et
al., 2011
5-Hidroxi-4’,3,7-trimetoxiflavona (333)
3,5,7-trihydroxy-4’-metoxiflavona (334)
E.coli
(ATCC25922)
S. blanc
LEFAHAL et al., 2010
Quercetina-3-O-rhamnoside (336)
Quercetina-O-glicosídeos
(3-O-glicosídeo (328),
Sl. maltophilia
63
OLIVEIRA, F.C.
3-O-galactosideo (335),
3'-O-galactosideo (336),
3-O-rutinosideo (337),
3-O-galactoglucosideo (338),
7-O-glicosídeo (339)
E. cloacae WAAGE e HEDIN,
1985
Canferol-3-O-(3"-Z-p-coumaroil)- (6"-O-E-
feruloil)-β-glicopiranosídeo (340)
B cereus
S. aureus
S. epidermidis
LIU et al., 1999
Quercetina (4)
Quercetina 3-arabino-piranoside-2"-galato
(342)
E. coli
IWAGAWA et al.,
1990
Tiliroside (343)
S. aureus
S. epidermidis
E. coli
Ps. aeruginosa
K. pneumoniae
MITROKOSTA et al.,
1993
Naringenina (29)
E coli
S.Staphylococcus
E faecalis
MALTERUND et al.,
1985
Pinocembrina (28)
Pinocembrina chalcona (147)
S. aureus
S. mutans
BREMMER e MEYER,
1998
PARK et al., 1998
5,7,4'-tri-6-metil-8-isoprenilflavonona (344)
5,7,4'-triidroxi 8-metil-6-isoprenilflavonone
(345)
S. aureus WACHTER et al., 1999
5,3'-dihidroxi-4'-metoxi-6'', 6'' -
dimetilcromeno (7,8,2 ",3") –flavanona (346)
5,7,4 '-tri-6,8-di-(3-metilbutil 2-enilo)-
flavanona (347)
Gram-positivas
Gram-negativas
RAHMAN e GRAY,
2002
Miricetina (140)
Emorina (94)
Quercetagetina (348)
Datiscetina (349)
Robinetina (301)
P. vulgaris
S. aureus
MORI et al., 1987
5,7,4'-tri-3',5'- dimetoxiflavona (350)
7,4'-dihidroxi 3', 5'-dimetoxiflavona (351)
S. aureus
E. coli
ZHENG et al., 1996
Galangina (16) Stenotrophomonas
maltophilia
MARCUCCI, 1996
Luteolina (5)
Mirecettina (140)
S. aureus
resistentes a
meticilina
(MRSA)
XU e LEE, 2001
5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-β-D- E. coli;
64
OLIVEIRA, F.C.
glicopiranosídeo (352)
5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-[2”-O-(5’”-O-
trans-cinnamoil)-β-D-apiofuranosil]-b-D-
glicopiranosídeo (353)
5,7,30-triidroxi-flavanona- 4’-O-β-D-
glicopiranosídeo (354)
Naringenina-7-O-β-D-glicopiranosídeo (355)
Rutina (116)
Nicotiflorina (356)
P. aeruginosa;
P.mirabilis;
K. pneumoniae;
A. baumannii;
S. aureus;
E. faecalis;
B. subtilis.
ORHAN et al., 2010
tricina-4’-O-β-L-arabinosídeo (357) S. aureus;
E. coli
PARVEEN et al., 2010
Canferol-3-O-α-L-(2a′,3a′-E-di-p coumaroil)-
ramnosídeo 7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-
glucopiranosil-(1→3)-[α-L-ramnopiranosil-
(1→2)]-β-D-glicopiranosídeo (358)
S. aureus;
B. subtilis;
E.coli;
P. aeruginose
RAO et al., 2007
Kuwanon C (359)
Mulberrofurano G (360)
Albanol B (361)
Soforaflavanona G (362)
Sanggenon D (363)
Papyriflavonol A (364)
5-metilsoforaflavanona B (365)
E. coli;
S. typhimurim;
S. epidermis;
S. aureus
SOHN et al., 2004
Quercetina (4)
5,6,4’-triidroxi-7-metoxiflavona (366)
5,6,3’,4’-tetrahidroxi-7-metoxiflavona (367)
5,7,3’,4'-tetrahidroxi-3-metoxiflavonol (368)
5,7,3’,4'-tetrahidroxiflavona (369)
S. aureus (ATCC
6538);
S. aureus (ATCC
29213);
S. epidermidis
(6ep);
S. sobrinus (87.3);
E. faecalis (ATCC
10541)
TALEB-CONTINI et
al., 2003
4’”-O-metilagatisflavona (370) S. aureus NDONGO et al., 2010
Isoliquiritigenina (371) B. subtilis MACHADO, 2000
Lanceolatina B (372)
Derriobtusona A (373)
S. aureus
SORIANO, 1999
65
OLIVEIRA, F.C.
Figura 7 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade antibacteriana,
registrados na literatura.
3.7 Flavonóides com potencial antifúngicos
Devido à capacidade generalizada de flavonóides para inibir germinação de
esporos de patógenos de plantas, eles têm sido propostos para uso contra patógenos
fúngicos do homem (HARBORNE e WILLIAMS, 2000). Segundo o levantamento
bibliográfico realizado, 57 flavonóides paresentaram atividade antifúngica (Tabela 14).
A presença de substituintes doadores de elétrons no anel B, tende a enfraquecer a
atividade antifúngica, enquanto que a presença de substituintes retiradores de elétrons
aumentam esta atividade (LÓPEZ et al., 2001).
Dos 57 flavonóides pesquisados com atividade antifúngica, 35,89% pertencem à
classe das flavonas; 1,03% pertecem a classe das isoflavonas; 33,33% pertencem à classe das
flavanonas; 5,13% perencem a classe dos flavanonois; 2,56% pertencem à classe dos
biflavonóides; 2,56% pertecem à classe das isoflavanonas; 15,38% pertecem à classe das
isoflavonas e 5,13% pertebcem à outras classes de flavonóides, conforme a Figura 8, p. 68.
Tabela 14 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antifúngica.
Nome dos flavonóides Fungos Referências
3,5,7,3’,4’-pentahidroxi flavona-3-O-β-D-xilopiranosil-7-
O-α-arabinopiranosil-(1→3)-O-α-L-ramnopiranosideo
(374)
4’-hidroxi-5,7dimetoxi flavona-4’-O-β-xilopiranosil-(1-
F. oxisporum;
A. Níger;
P. digitatum
SATNAMI e
YADAVA,
66
OLIVEIRA, F.C.
3)-O-β-D-glucopiranosil-(1→4)-O-α-L-ramnopiranosideo
(375)
5,2’-diidroxi-6,7dimetoxi isoflavona (376)
3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxi flavona (377)
2011
Pinobanksina (378)
Pinocembrina (28)
Crisina (12)
Galangina (16)
P. italicum
YANG et al.,
2011
Eriodictiol (31)
Homoeriodictiol (379)
Diidroquercetina (380)
Luteolina (5)
F.
graminearum;
S. zeicola
XUE-GU et
al., 2010
(-)-epicatequina3-O-β-glicopiranosídeo (381)
5-hidroxi-3-(4-hidroxilfenil)pirano[3,2-g]cromeno-4(8H)-
ona (382)
6-( p-hidroxibenzil)-taxifolina-7-O-β-D-glicosídeo (383)
Quercetina-3-O-α-glicopiranos-l-(1→2)-β-D-
glicopiranosídeo (384)
(–)-epicatequina-(2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-2H-
cromeno-3,5,7-triol (385)
A. alternata;
A. fumigates;
A. niger;
M.
phaseolina;
P. citrii
KANWAL et
al., 2010
3,5-diidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona (386) C. albicans SÜZGEÇ-
SELÇUK e
BIRTEKSÖZ,
2011
5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-β-D-glicopiranosídeo (387)
5,7,3’-triidroxi-flavanona- 4’-O-β-D-glicopiranosídeo
(388)
Naringenina-7-O-β-D-glicopiranosídeo (389)
5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-[2”-O-(5’”-O-trans-
cinnamoil)-β-D-apiofuranosil]-b-D-glucopiranosideo
(390)
Rutina (116)
Nicotiflorina (356)
C. albicans
C. krusei
ORHAN et
al., 2010
Tricina-4’-O-β-L-arabinosideo (357) S.
typhimurium;
C. albicans
PARVEEN et
al., 2010
5, 7-diidroxi-3, 6,4’-trimetoxiflavona-7-O-α-L-
xilopiranosil-(1--3)-O-α-L-arabinopiranosil-(1→4)-O-β-
D-galactopiranosideo (391)
F.oxysporum;
P. digitatum;
A. niger;
T. viride
YADAVA e
TIWARI,
2007
3′-(3R-acetoxi-5,5-dimetilciclopent-1-eno)-4′-O-
metilescutellareina 7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-
glucopiranosil-(1→3)-[α-L-ramnopiranosil-(1→2)]-β-
67
OLIVEIRA, F.C.
D-glucopiranosideo (392)
Canferol-3-O-β-D-glucopiransoil-(1→4)-α-L-
ramnopiranosil-(1→6)-β-D-galactopiranosideo 7-O-(6′′′′-
O-acetil-β-D-glucopiranosil-(1→3)-[α-L-
ramnopiranosil-(1→2)]-β-D-glucopiranosideo (393)
Canferol-3-O-β-D-glicopiranosil(1→2)-β-D-(6a′-O-
caffeoil)-glicopiranosídeo 7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-
glicopiranosil-(1→3)-[α-L-ramnopiranosil-(1→2)]-β-
D-glicopiranosídeo (394)
Canferol-3-O-α-L-(2a′,3a′-E-di-p-coumaroil)-ramnosídeo
7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-glicopiranosil-(1→3)-[α-L-
ramnopiranosil-(1→2)]-β-D-glicopiranosídeo (358)
A. Níger;
A. Ochraceus;
A. versicolor;
As flavus;
P.ochrochloro
n;
P.
funiculosum;
T. viride;
C.cladosporioi
des A.
alternate
RAO et al.,
2007
5’-hidroxi-3’,4’,3,6,7-pentametoxiflavona (395)
4’,5,7-triidroxi-3’-O-β-D-glucuronico ácido-6”-metil
(396)
Luteolina (5)
iso-orientina (397)
ester,
T. mentagroph
ytes;
C. neoformans
SATHIAMOO
RTHY et al.,
2007
Canferol (75)
(±)-Catequina (137)
C. rugosa RUIZ et al.,
2006
Orientina (398)
M. canis;
M.gypseum;
T.
mentagrophyte
s; T. rubrum;
E. flocosum;
C. neoformans
CAMPOS et
al., 2005
Amentoflavona (399) C. albicans JUNG et al.,
2007
Hildegardiol (400)
2-Hidroximaackiaina (401)
Farrerol (402)
C. albicans;
C. glabrata;
C. krusei
MERAGELM
AN et al.,
2005
Papiriflavonol A (364)
Kuraridina (403)
Soforaflavanona D (404)
Sophoraisoflavanona A (405)
C. albicans,
S. cerevisiae
SOHN et al.,
2004
4’-metoxicanferol-7-(acetiloxi)-3,5-O-α-L-ramnosideo
(406) Apigenina (18)
C. cladosporioi
LOPES et al.,
68
OLIVEIRA, F.C.
Figura 8 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade antifúngica,
registrados na literatura
3.8 Flavonóides com atividade de citotoxicidade
O ensaio de atividade de citotoxicidade sobre Artemia salina tem sido inserido
dentro da rotina de trabalho de muitos laboratórios de química de produtos naturais, no intuito
de selecionar e monitorar o estudo fitoquímico de extratos de plantas na procura de
substâncias bioativas (HAMBURGER, HOSTETTMANN, 1991).
Quercetrina (153)
7-O-metoxiquercetrina (407)
des 2004
Biochanina A 7-O-β-D-xilopiranosil-(1--6)-β-D-
glicopiranosídeo (408)
Biochanina A 7-O-β-D-apiofuranosil-(1--6)-β-D-
glicopiranosíde (409)
Biochanina A 7-O-β-D- glicopiranosídeo (410)
Biochanina A 7-O-β-D-apiofuranosil-(1--5)-β-D-
apiofuranosil-(1--6)-β-D-glicopiranosídeo (411)
C. krusei
C. glabrata
C. albicans
C. parapsilosis
C. neoformans
GARCEZ et
al., 2010
Quercetina (4)
C. albicans
(ATCC 1023);
C. albicans;
C. tropicalis
TALEB-
CONTINI et
al., 2003
Cudraflavanona B (412)
Wighteona (413)
C. neoformans;
A. Fumigates;
A. nidulans;
C. glabrata
FUKAI et al.,
2003
69
OLIVEIRA, F.C.
Diversos trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com
atividades como antifúngica, viruscida e antimicrobiana (MACRAE, HUDSON, TOWERS,
1988) parasiticida (SAHPAZ et al., 1994), tripanossomicida (ZANI et al., 1995), alelopática,
entre outras.
Dos 21 flavonóides pesquisados com atividade de citotoxicidade (Tabela 15),
46,67% pertencem à classe das flavonas; 13,33% pertecem a classe das flavanonois; 20,00%
pertencem à classe das flavanonas e 6,67% pertencem à classe dos biflavonóides e 13,33%
pertecem à ouras classes de flavonóides, conforme a Figura 9, p. 70.
Tabela 15 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de citotoxicidade frente as
larvas de Artemia salina.
Nome dos flavonoides Referências
Biochanina A (322) GARCEZ et al., 2010
Luteolina 7-O-glucosideo (24) TASKOVA et al., 2003
Miricetina 3-O-(2”-O-galloil)-α-ramnopiranosideo 7- metil
éter (414)
Miricetina 3-O-(3”-O-galloil)-α-ramnopiranosideo 7-metil
éter (415)
Miricetina 3-O-(3”-O-galloil)-α-ramnopiranosideo (416)
Miricitrina (153)
LEE et al., 2000
2,5-Diidroxi-7-metoxiflavanona (417)
2,5-Diidroxi-6,7-dimetoxiflavanona (418)
5-Hidroxi-7-metoxiflavona (419)
5-Hidroxi-6,7-dimetoxiflavona (420)
KHAMIS et al., 2004
CIclochampedol (421) ACHMAD et al., 1996
Afzelina A (422)
Afzelina B (423)
Afzelina C (424)
AWANTU et al., 2011
4’”-O-Metilagatisflavona (425) NDONGO et al., 2010
Hispidulina (45) MOREIRA et al., 2003
3-O-metílico de minimiflorina (161)
3-hidroxi-minimiflorina (162)
RUIZ, 1998
(E)-7-O-Metil pongamol (426)
Lanceolatina B (427)
Derriobtusona A (428)
SORIANO, 1999
70
OLIVEIRA, F.C.
Figura 9 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade de
citotoxicidade, registrados na literatura.
71
OLIVEIRA, F.C.
3.9 Estruturas químicas dos flavonóides relatados na literatura com atividade
anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana,
antifúngica e citotoxicidade.
Figura 10 - Flavonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
O
O
R 7
R 8
R 5
R 6
R 9
R 4
R 1
R 2
R 3
Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
52 OMe OMe OMe OMe H H OMe OMe H
54 OMe OMe OMe OMe H OM
e
OMe OMe OMe
55 OMe OMe OMe OMe H H H H H
57 OMe OH H OH OMe H H H H
58 OMe OMe OMe OMe OMe H OMe OMe H
59 OMe OMe OMe OMe H H H OMe H
60 H OMe OMe OMe H H OMe OMe H
61 H OMe OMe OMe H H H OMe H
62 OMe OMe OMe H H H OMe OMe H
63 OMe OMe H OMe H H H OMe H
64 H OMe OMe OH H H OMe OMe H
65 H OMe H OMe OMe H OMe OMe H
66 H OMe H OH OMe H OMe OMe H
67 OMe OMe H OMe OMe H OMe OMe H
68 H OMe H OMe OH H OMe OMe H
69 OMe OMe H OH OMe H OMe OMe H
70 H OMe H OMe Acetila H OMe OMe H
71 OMe OMe H Acetila OMe H OMe OMe H
72 H OMe H Acetila OMe H OMe OMe H
73 OH OMe H OH OMe H OMe OMe H
74 H OMe H OH OH H OH OH H
75 H OH H OH OH H OH H H
76 H OH H OH H H H H H
72
OLIVEIRA, F.C.
92 H H OMe H H H H H H
93 H OMe H OMe H H H H H
94 H OH H OH OH OH H OH H
95 H OH OMe OMe OMe H H OH H
96 H OMe H OH OMe H OH OMe H
97 OMe OH H OMe H H OMe OMe H
98 OMe OMe OMe OMe OMe H OMe OMe H
99 H OMe Me OH H H H H H
100 H OMe Me OMe H H H H H
116 H OH H OH A H OH OH H
120 Ger Ger Ger OH H H H OH H
121 H Ger Ger OH H H H OH H
122 H H Ger OH H H H H H
123 Ger H H OH H H H H H
124 Ger H H OH OGer H H OH H
125 H H H OH Ger H H OH H
134 H H H H H H H H H
136 H OH H OGlc OH H H OH H
139 H OH H OH OH H OH OH H
140 H OH H OH OH H OH OH OH
141 H OH OH OH H H H H H
142 H OGlc OH H H H H H H
143 H OMe OH OH H H H H H
144 H OMe OMe OH H H H OH H
145 H OMe H OH H H H OH H
148 H OH H OH OH H OMe OMe H
149 H OH OH OH H H OH OH H
150 H OH H OH Xil H OH OH H
151 H OH H OH OGlc H OH OH H
152 H OH H OH ORha H OH OH H
153 H OH H OH ORha H OH OH H
154 H OH H OH OArab H OH OH H
155 H OMe H OH H H H H H
156 H OMe OMe OH H H H H H
167 OMe ORha H OH OH H OH OH H
168 OMe ORha H OH OH H H OH H
173 H OGlc H OH H H H OH H
174 H OGlc H OH H H OH OH H
175 H OGlc-2-
OGlc
H OH H H H OH H
73
OLIVEIRA, F.C.
176 H OGlc H OH H H OGlc OH H
178 H OGlcr H OH H H OH OH H
179 H OGlcr H OH H H H OH H
180 H OGlcr H OH H H H OMe H
181 H ORha(1-
6)Glc
H OH H H H OMe H
182 H OGlc H OH H H H OMe H
183 H OH H OH H OH H OMe
184 H OH H OH H OH H OH
191
OH H OH
OH H OH H
192 H OH H OH O
H
H
OH
O H
O H
O
O
OH
H H OH H
206 H OMe H OMe H H OMe H H
207 H OMe H OMe H H H H H
208 H OMe H OMe OMe H H OMe H
209 H OMe H OMe H H H OMe H
210 H OMe H OH H H H OMe H
211 H OMe H OH OMe H OH OMe H
212
OH H OH OH H H OH H
213 OH H OH OH OH H OH H
220 H OH H OH Rha-Glc H H H H
221 H H H H OH H H H H
222 H H H H OH H H OH H
223 H H H H OH OH H H H
224 H OH H OH OH H H OMe H
225 H OH H H OH H OH OH H
226 H H H H OH H OH OH H
227 H H H H OMe H OH OH H
228 H OH H OH OGlc H OH OH H
229 H OH H OH OH H OH OGlc H
230 H H OH H OH OH H H H
231 H OH H OH ORha-(3”-OAc) H OH OH OH
74
OLIVEIRA, F.C.
232 H OH H OH ORha H OH OH OH
234 H OH H OH OGlc H OH OH OH
235 H OH H OH ORha-(3”-OAc) H OH OH H
236 H OH H OH Rha H OH OH H
237 H OH H OH OGlc H OH OH H
240 H OH H OH ORha H OH OH H
241 H ORha H OH H H OH OH H
242 H OH H OH ORut H OMe OH H
243 H OH H OH ORha H H OH H
247 H OH
H H H H OH H
249 H OH H OH OGlc-3-Rha H OMe OH H
251 H OH Glc OH H H OH OH H
252 H OH Glc-
O
O
OH OH H H OH OH H
253 H OH H OH OGlcp H OH OH H
254 H OH H OH OGalp H OH OH H
255 H OH H OH (2”Ga)OGlcp H OH OH H
256 H OH H OH (2”Ga)OGalp H OH OH H
257 H OH H OH (6”Ga)OGlcp H OH OH H
258 H OH H OH (6”Ga)OGalp H OH OH H
259 H OH H OH OArab H OH OH H
260 H OH H OH ORha(1-6)Glcp H OH OH H
269 H OH H OH OGalcts H OH OH H
280 H OH H OH OGlcp H OH OH H
281 H OH H OH ORha(1-6)Galact. H H OH OH
282 H OH H OH ORha(1-2)Galact. H H OH OH
75
OLIVEIRA, F.C.
283 H OH H OH ORha-6-Galact. H H OH OH
301 H OH H H OH H OH OH OH
302 H OH H OH OH H H OMe H
303 H H H H OH H H H H
304 H OH H OH OH H OH OH OMe
305 H OH H OH OH H OGlc OH OMe
306 H OH H OH OH H H OMe H
307 H OMe H OMe OMe H OMe OMe OMe
308 H OH H OH OGlc H OGlc OH OMe
309 H ORha H OH OGlc H OH OH H
310 H OGlc H OH OGlc H OGlc OH OMe
311 H ORha H OH ORha H H OH H
312 H H H OH H H H H H
313 H OMe H H H H H H H
314 OGlc OH H OH H H H OH H
315 H OGlc H OH H H H OH H
324 H OH H OH ORha(1-2)Glc H H OH H
325 H OdiGlc H OH H H OH OH H
326 H OGlc H OH OH H OH OH H
328 Glc OH H OH H H H OH H
329 H OGlc Glc OH H H H OH H
330 Glc OH Glc OH H H OH OH H
331 OMe OH OMe OH H H H OMe H
332 OMe OMe OH OH H H H OMe H
333 H OMe H OH OMe H H OMe H
76
OLIVEIRA, F.C.
334 H OH H OH OH H H OMe H
335 H OH H OH OGalt H H OH H
336 H OH H OH OH H H OGalt H
337 H OH H OH ORha H H OH H
338 H OH H OH OGaltGlc H H OH H
339 H OGlc H OH OH H H OH H
340 H OH H OH OGlcp(3”,6”-
OH
C H 3
O
H
H )
H H OH H
341 H OH H OH OGlcp(3”-A,6”-
OH
CH 3
O
H
H
)
H H OH H
342 H OH H OH OArabps H OH OH H
343 H OH H OH O
O H
O H
O H
O
O
OH
H H OH H
356 H OH H OH ORut H H OH H
357 H OH H OH H H OMe OH OMe
359 H OH H OH
OH H OH H
364 H OH O
O H
O H
O H
O
O
OH
OH OH H OH OH O
O H
O H
O H
O
O
OH
366 H OMe OH OH H H H OH H
367 H OMe OH OH H H OH OH H
368 H OMe H OH OMe H OH OH H
369 H OMe H OH H H OH OH H
375 H OMe H OMe H H H OXilp(1-
3)Glc(1-4)Rha
H
377 H OH H OH OH H OH OH OH
77
OLIVEIRA, F.C.
A =
OOH
OH
O H
O
O H
O O H
OH
O G er=O O H
O H
O H
OH
O
Xil=
O -G li=
O
O H
OH O H
O H
O
O -R am =
O
O H
OH O H
OO
O H
OH O H
O
O -A rab=
187 R =
188 R =
O
O
O H
O H
O
O H
R
O H
1 9 6 : n=1
1 9 7 : n=0
1 9 8 : n=1
1 9 9 : n=0
( )n
( )n
N
O
O
MeO
MeO
O
O
O
MeO
MeO
O
N
384 H OH H OH OGlcp(1-4)Glcps H OH OH H
386 OMe OMe Me OH OH H H H H
291 H OXil(1-3)
Ara(1-
4)Galt
OMe OH H H H OH H
395 H OMe OMe OH OMe H OMe OMe H
396 H OH H OH H H OGlcpr
Ac.-6”-
Metil
OH H
397 H OH Glc OH H H OH OH H
398 Glc OH H OH H H OH OH H
406 H CH3CO2 H ORha ORha H H OMe H
407 H OMe H OH ORha H OH OH H
375 H OMe H OMe H H H OXilp(1-
3)Glc(1-
4)Rha
H
419 H OMe H OH H H H H H
420 H OMe OMe OH H H H H H
78
OLIVEIRA, F.C.
OO H
OH
O H
OH
OO H
O H
O
OO H
O H
O
O H
OOH
OH
O H
O
O H
OHOH
O
O
O
O
OH
O H
O
O H
O
O
O H
OO
358
O
O
O
372
R 1 R 2 R 3
414 M e G G
415 M e H G
416 H G GG =
O
O
O
OH
O H O
O H
O H
421
O
OR 2 OR 3
O H
C H 3
OR 1
O H O
O
O H
O H
O H
OOH
OH
O H
O
O H
OHOH
O
O
O
OH
O H
O
O
OO
OH
O H O
OMe
O
O
292
OOH
OH
O H
O O H
OH
O H
OH
O
O HO H
O
CH3
O O H
O H
O H
O
O
O H
OHOH
O
O
O
OH
O H
O
O
OO
OH
O H O
O H
O
393
O O H
OH
O H
OH
OOH
OH
O HO O
O H
O
O H
OHOH
O
O
O
OH
O H
O
O
OO
OH
O H O
O H
O
OHOO
OH
O H
394
79
OLIVEIRA, F.C.
Figura 11 - Isoflavona com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
O
O
R 2
R 1
R 3
R 5
R 4R 6
Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6
53 H OH H OH H OH
169 OH OH H OH H OH
170 H OGlc H OH H OH
171 H OGlc H OMe H OH
244 H OH H H
OH
245
OH H H H OH
248 H OH H H
OH
250 H OH H OH OMe OH
408 H OXil(1-6)Glc H H H OMe
409 H OApi(1-6)Glc H H H OMe
410 H OGlc H H H OMe
411 H OApi(1-5)Api(1-6)Glc H H H OMe
415 H OH H H H OH
O
O
MeO
MeO
O N
( ) n
2 0 0 : n=1
2 0 1 : n=0
N
O
O
MeO
MeO
O
( )n
2 0 2 : n =1
2 0 3 : n =0O O
O H O
O H
3 8 2
80
OLIVEIRA, F.C.
Figura 12 - Flavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
O
O
R 7
R 8
R 4
R 3
R 2
R 5
R 9
R 1 R 6
Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11
77 H OH H OH H H H OH OMe H H
78 H OH Ger OH H H H H OH H H
79 H OH Ger OH OH H H H OH H H
80 H OH Ger OMe OH H H H OH H H
83 H OMe H OH OH H H OH OMe H H
84 H OH H OH H H H OH H OH H
86 H H OMe H H H H H H H H
87 H OH H OMe H H H H H H H
88 H OMe H OMe H H H H H H H
89 H OH Me OH H H H H H H H
90 H OMe Me OH H H H H H H H
91 Me OMe H OMe H H H H H H H
112
OH OH OH H H H H H H H
113 OH H H H H H H OH H H
114 OMe H H H H H H OH H H
115 H OH H H H H H H
H H
157 H OMe H OH H Me H H H H H
158 H OMe OMe OH H Me H H H H H
177 H OGlc(1-
2)Rha
H OH H H H OH OMe H H
177 H OGlc(1-
2)Rha
H OH H H H OH OMe H H
185 H OH H OH H H OH H OMe
H
186 H OH H OH H H OH H OH
H
81
OLIVEIRA, F.C.
219 H OH H OH OH H H H OH H H
238 H OH H OGlc H H H H OH H H
279 H OH H OH OGalct H H OH OH OH H
296 H ORut H OH H H H OH OMe H H
316 H H H H H H H H H H H
317 H Oneo H OH H H H H H H H
318 H OH H H OH H H OH OH H H
344 Isoprop. OH Me OH H H H H OH H H
345 Me OH Isoprop. OH H H H H OH H H
347
OH
OH H H H H OH H H
352 H OMe H OH H H H H OGlcp H H
353 H OMe H OH H H H H Apf.Glcp H H
354 H OMe H OH H H H OH OGlcp H H
355 H OH H OH H H H H OH H H
362
OH H OH H H OH H OH H H
374 H OArab(1
-6)Rha H OH OXilop H OH OH H H H
378 H OH H OH OH H H H H H H
379 H OH H OH H H OH OMe H H H
380 H OH H OH OH H OH OH H H H
383 H OGlc O H
OH OH H OH OH H H H
387 H OMe H OMe H H H OGlc H H H
388 H OH H OH H H OH OGlc H H H
389 H OGlc H OH H H H OH H H H
402 Me OH Me OH H H H OH H H H
82
OLIVEIRA, F.C.
403 O
OH H OH H OH H OH H H H
404 H OH
OH H OH H OH H H OH
413 H OH
OH H OH H OH H H H
417 H OMe H OH H OH H H H H H
418 H OMe OMe OH H OH H H H H H
O
O H
O H
OO H
O
O H
8 2
OO
O
O H
O H
OH
OH
8 1
OO
OO H
R 2
R 1
R 3
Nº R1 R2 R3
161 H OMe
162 OH OH
163 H OH
164 OH H
165 H OH H
147 OMe OH H
83
OLIVEIRA, F.C.
193 n= 1
194 n= 0
( )n
O
O
MeO
MeO
O
N
195
N
O
O
MeO
MeO
O
O
O H
O
OMe
O
O H
346
O
OHO H
O
O
O H
O O H
O H
O
OOMe
MeO
O
O
390
( )n
Figura 13 - Chalconas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
R 5
R 6
OR 4
R 2
R 1
R 3
Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6
104 Me OH
H H OH
105 H OH
H H OH
106 Me OH H H OH
107 H OH
H H OH
146 H OH
OMe H OH
147 H OH H OGlc H OH
239 Me OH Me OH OH OH
246
OH H H OH OH
284 H OH Me OH OMe H
285 H OH H OH OMe H
286 H OH H OGlc OMe H
371 H OH H H OH OH
84
OLIVEIRA, F.C.
O
MeO
O H
O
R
108 R = O H
109 R = H
OO H
O H
O
110
OO H
O H
O
111
204 n= 1
205 n= 0
O H
O
MeO
MeO
O
N
( )n
Figura 14 - Biflavonóides com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
O
OO H
OH
O H
O
OR
OH
O
O H
159 R = H
160 R = M e
O
O
O H
O H
OH
O
O
R 3
O H
OH
R 2
R 1
R 1 R 2 R 3
319 H H O H
320 O H H O H
OOH
O H O
O H
O
O
OH O H
OMe
370
O
O
O H O
OH
O H
OH O H
O
O H
399
O
O H
OO H
OH
OH
O H
O
OMe
425
85
OLIVEIRA, F.C.
Figura 15 - Bicatequina com atividade antioxidante.
OOH
O H
O H
O H
O HOOH
O H
O H
O H
O H267
Figura 16 - Catequinas com atividade antioxidante.
OOH
O H
O H
R 1
O H
R 2
Figura 17 - Diidrochalcona com atividade antioxidante.
O H
O H
OMe
OO H
RutinO
297
Nº R1 R2
268 OH H
276 OH H
277
O H
O H
O H
O
O
H
298
O H
O H
O H
O
O
OH
300 OH H
86
OLIVEIRA, F.C.
Figura 18 – Isoflavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
OR 1
R 2 O
R 3
R1 R
2 R
3
321 O H H O M e
322 O H O H O M e
323 O H H O H
OOH
O H O
O H
O H
405
Figura 19 - Flavan-3-ol com atividade antifúngica.
O
O H
O H
R
O H
OH
R
381 O G lcp
385 O H
Figura 20 - Flavanonois com atividade citotoxicidade.
OO
O H O
O H
O H
4 2 2
OO
O H O
O
O H
4 2 3
OO
O H O
O
O
4 2 4
87
OLIVEIRA, F.C.
Figura 21 - Outras clases de flavonóides com atividade inbição da enzima acetilcolinesterase,
antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.
O
O
O H
O H
O
O
O H
O
O
O H
O H
O
O
189
OO
OMe
O
373
190
OO H
O H
OH
O
OR 3
OO
R 2
R 1 O
R1 R
2 R
3
287 H H H
288 H H H
289 H O M e H
290 H O M e M e
291 G lc H M e
292 H H M e
OO H
O H
OH
O
OR 2
O HO
R 1
GlcO
R1 R
2
293 C H2O H H
294 M e M e
295 C H2O H M e
O OO
O H
O H
O H
OH
O H
H H
H
360
O OO
O H
O H
O H
OH
O H
361
O
O H
O
O H
O
OH
O H
O
O H
O H
O H
OH
363O
O
O
MeO
OH
H
OH
400
OO
O H
OMe427
O OMe
O
OMe
428
O
O
OO
OH
OH
H
H
401
88
OLIVEIRA, F.C.
4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL E CARACTERIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO
QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE L. rigida.
4.1 Determinação estrutural dos metabólitos secundário isolados das folhas de L. rigida
4.1.1 Determinação estrutural de LEF-1
O tratamento cromatográfico da fração LEFD (Item 5.5.4, p. 163) obtida pelo
fracinamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido
amorfo amarelo com ponto de fusão entre 122–124 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,31 (c = 1,0
MeOH), que foi denominado de LEF-1.
O espectro na região do infravermelho de LEF-1 (Figura 22) mostrou duas bandas
em 3523 e 3148 cm-1
, correspondentes à deformações axiais de ligação O-H, caracterizando a
presença de hidroxila; observou-se também absorções em 2915 e 2849 cm-1
características de
deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1644 cm-1
que foi relacionada à
deformação axial C=O de carbonila conjugada; as bandas em 1605 e 1558 cm-1
foram
atribuidas às vibrações de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e uma banda
em 1214 cm-1
foi associada às vibrações de deformações axiais de ligações C-O.
Figura 22 – Espectro na região do infravermelho de LEF-1 (KBr)
3523
3523
2915
2849
3523
1605 1644
1558 1214
1380 3148
89
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] (Figura 27 e 28, p. 93) apresentou
quatro sinais na faixa δ 6,35 – 4,99, os quais foram associados a hidrogênios ligados a anel
aromático. Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 7,39 (2H, d, J = 8,4 Hz) e
6,90 (2H, d, J = 8,4 Hz), relativos a hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais,
referentes a hidrogênios ligados a anel aromático, assinalados em δ 6,04 (1H, d, J = 2,0 Hz) e
6,03 (1H, d, J = 2,0 Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta posicionados. Além disso,
foi observado um sinal em δ 3,84 (3H, s) compatível com os hidrogênios de grupo metoxila,
um sinal em δ 5,46 (1H, dd, J = 12,8 e 3,0 Hz) referente a hidrogênios metínico oxigenado e
dois sinais em δ 3,20 (1H, dd, J = 12,8 e 17,1 Hz) e 2,75 (1H, dd, J = 3,0 e 17,1 Hz) referentes
a dois hidrogênios diasterotópicos. Mais dois sinais foram observados em δ 11,10 (1H, s) e
7,74 (1H, s) referentes a duas hidroxilas, sendo a primeira quelada, (Tabela 17, p. 92).
No espectro de RMN 13
C [125 MHz, (CD3)2CO], (Figura 29, p. 94) foram
observadas quatoze linhas espectrais, das quais duas (δ 128,1 e 115,3) foram relacionadas a
dois carbonos cada, após análise do espectro de 1H,
13C-HSQC (Figura 32, p. 95). Comparação
do espectro de RMN 13
C totalmente desacoplado, com RMN 13
C-DEPT 135º, (Figura 30, p.
94), permitiu identificar a presença de um carbono metílico (δ 57,2), um metilênico (δ 44,4) e
sete carbonos monoidrogenados (δ 128,1-79,2), dos quais, um deles (δ 79,2) foi associado a
carbono metínico oxigenado. Os setes sinais restantes foram identificados como carbonos não
hidrogenados, sendo um, característico de carbono carbonílico (δ 198,6), (Tabela 16).
Tabela 16 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise
comparativa entre os espectros de RMN 13
C-BB e DEPT 135° de LEF-1
C CH CH2 CH3 Fórmula molecular
196,8 (C=O) 128,1 (2X) 43,6 55,4 (C-O)c
168,0 (C-O)a 79,2 (C-O)
c
164,1 (C-O)b 115,3 (2X)
163,3 (C-O)c 94,6
157,9 (C-O)a 93,7
129,7
102,9
7 C 7 CH 1 CH2 1 CH3 C16H14O5
a – carbono sp
2 ligado a hidroxila;
b – carbono sp
2 ligado a grupo metoxila;
c – carbono ligado
oxigênio de éter.
90
OLIVEIRA, F.C.
Após análise do espectro de correlação heteronuclear 1H,
13C-HSQC, foi
possível identificar que os sinais em δ 115,3 e 128,1 são referentes a dois átomos de carbonos
cada, totalizando 16 carbonos na estrutura de LEF-1. Estes dados juntamente como o espectro
de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 23) forneceu o pico correspondente
ao íon molecular m/z 286,0 daltons, que possibilitou sugerir a fórmula molecalar do composto
(C16H14O5). Apos análise de todos os dados até aqui descritos possibilitou sugerir um
esqueleto flavonônico para LEF-1.
Figura 23 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-1
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 31, p. 95), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 7,39) com os hidrogênios
H-3’ e H-5’ (δ 6,90). Além disso, observou-se acoplamento do hidrogênio H-2 (δ 5,46) com o
hidrogênio diasterotópicos H-3a (δ 3,20), assim como, o acoplamento entre os dois
hidrogênios diasterotópicos H-3a (δ 3,20) e H-3b (δ 2,75), como representado na Figura 24.
Figura 24 – Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de LEF-
1
O
O
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H
2
34
5
6
78
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
91
OLIVEIRA, F.C.
Análise do diagrama de contorno do espectro de HMBC (Figura 33 e 34, p. 96)
permitiu identificar os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,04 (H-8), δ 6,03 (H-6) e δ 3,84
(metoxila) com o carbono em δ 169,8 (C-7) determinando a posição da metoxila no carbono 7
do esqueleto flavonoídico. Mostrou também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,90 (H-
3’ e H-5’) e δ 7,39 (H-2’ e H-6’) com o carbono em δ 157,9 (C-4’) permitido-se determinar a
posição da hidroxila no anel B. Verificou-se também acoplamentos do hidrogênio em δ 6,04
(H-8) com o carbono δ 163,3 (C-9), do hidrogênio δ 6,03 (H-6) com o carbono δ 164,1 (C-5),
determinando a posição da hidroxila no anel A. Os acoplamentos do hidrogênio δ 5,46 (H-2)
com o carbono δ 43,6 (C-3) e acoplamento dos hidrogênios δ 3,20 e 2,75 com o carbono
196,8 (C-4), também foram observados. Figura 25.
Figura 25 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-1
O
O
O H
OH
H 3 CO
H
HH
H
H
H
H
H
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
A partir dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na
literatura (JERZ, WAIBEL, ACHENBACH, 2005) pôde-se confimar para LEF-1 a estrutura
de um flavonóide do tipo flavanona, registrado na literatura como sakuranetina (Figura 26).
Figura 26 - Estrutura química de sakuranetina (LEF-1)
O
O H
OH
MeO
O
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '2
3
4
Embora a substância sakuranetina (LEF-1) já se encontre descrita na literatura
para o gênero Lippia (ONO, 2006), este é o primeiro relato para a espécie L. rigida.
92
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 17 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEF-
1, comparados com a literatura (JERZ, WAIBEL, ACHENBACH, 2005 – CDCl3)
HSQC HMBC Sakuranetina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 79,2 5,46 (1H, dd, J = 12,8 e 3,0
Hz)
Ha-3; Hb-3 H-2’;H-
6’
78,9
3 43,6 3,20 (1Ha, dd, J = 12,8 e 17,1
Hz)
2,75 (1Hb, dd, J = 3,0 e 17,1
Hz)
H-2 43,2
4 196,8 Ha-3; Hb-3 196,0
5 164,1 12,13 (1H, s) H-6 162,9
6 94,6 6,03 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-8 94,2
7 168,0 168,0
8 93,7 6,04 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-6 95,1
9 163,3 164,1
10 102,9 H-6 103,1
1’ 129,7 H-2; Ha-3;
Hb-3; H-2’;
H-6’
H-3’; H-
5’
130,7
2’ 128,1 7,39 (2H,d, J = 8,4 Hz) 128,0
3’ 115,3 6,90 (2H,d, J = 8,4 Hz) H-2’ H-5’ 115,7
4’ 157,9 H-2’; H-6’ H-3’; H-
5’
156,1
5’ 115,3 6,90 (2H,d, J = 8,4 Hz) H-6’ H-3’ 115,7
6’ 128,1 7,39 (2H,d, J = 8,4 Hz) 128,0
OCH3 55,4 3,84 (3H, s) 55,7
93
OLIVEIRA, F.C.
OH-5
OCH3
3a
3b
Figura 27 - Espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 28 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)
2’;6’ 3’;5’ 6;8
2
94
OLIVEIRA, F.C.
Figura 29 - Espectro de RMN 13
C de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz)
Figura 30 - Espectro de RMN 13
C – DEPT 135º de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz)
3’ ; 5’
6
10
8 2 3
2’ ; 6’
1’
9
5
7
4 4’
OCH3
6 8 2
3
OCH3 3’;5’
2’;6’
95
OLIVEIRA, F.C.
3Ha 3Hb 3C 3C
Figura 31 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 32 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
2H 2C
6H 6C
8H 8C
3’H 3’C
5’H 5’C
2’H 2’C
6’H 6’C
2’;6
’
3’;5
’ 6;8
2
2
3a 3b
3a
3b
6;8
3’;5
’
2’;6
’
96
OLIVEIRA, F.C.
3;4
25;26
O
OO H
O
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H O H
CH 32
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
5 '
6 '
O
OOH
O
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H O H
CH 3
6
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
O
OO H
O
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H O H
CH 3
19
17
2218
20
21
23
24
26
25
Figura 33 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
Figura 34 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125
MHz)
1
2
8
5
6
7 9;10
11;12
13;14
15;16
18;19
17
20;21
22
23;24 13;14 3; 4
97
OLIVEIRA, F.C.
4.1.2 Determinação estrutural de LEF-2
O tratamento cromatográfico da fração LEFD (Item 5.5.4, p. 163) obtida pelo
fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido
amorfo amarelo com ponto de fusão entre 192-194 oC e rotação óptica [α]D = - 0, 64 (c = 0,5 ,
MeOH), que foi denominado de LEF-2.
Assim como em LEF-1, no espectro na região do infravermelho de LEF-2
(Figura 35), observou-se duas bandas em 3421 e 3097 cm-1
, correspondentes à deformações
axiais de ligação O-H, caracterizando a presença de hidroxila; absorção em 2925 cm-1
característico de deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1627 cm-1
foi relacionada
a deformação axial C=O de carbonila conjugada; as bandas em 1602 e 1589 cm-1
foram às
vibrações de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1297 a 1093
cm-1
foram associadas às vibrações de deformações axiais de ligações C-O.
Figura 35 – Espectro na região do infravermelho de LEF-2 (KBr)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
30
40
50
60
70
T%
cm-1
1214 3421
3097
2925
1627 1602
1589
1297
1093
98
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEF-2 (Figura 39 e 40, p. 101)
mostrou dois sinais referentes à hidrogenios pertencentes a anel aromático, um dos quais em δ
5,92 (2H, dd, 2,0 Hz), caracteristico de hidrogenios meta posicionados e o outro em δ 7,35
(5H, m) sugerindo a presença de um anel aromático monosubstituido. Além disso, observou-
se um sinal em δ 5,35 (1H, dd, J = 3 e 13,0 Hz) referente a um hidrogênio metínico
oxigenado; dois sinais em δ 3,00 (1H, dd, J = 3 e 17,0 Hz) e 2,73 (1H, dd, J = 3,0 e 17,0 Hz)
referentes a dois hidrogênios diasterotópicos. Figura 36.
No espectro de RMN 13
C [125 MHz, (CD3)2CO] (Figura 41, p. 102) de LEF-2
observou-se doze sinais, sendo um destes em δ 198,2 (C-4) referente a carbono carbonilíco,
10 sinais referentes a carbonos de anel aromáticos e um sinal em δ 80,9 (C-2) referente a
carbono com hibridização sp3
oxigenado, na Tabela 18, p. 100.
Após análise do espectro de 1H,
13C HSQC (Figura 42, p. 102), foi possível
identificar que o sinal em δ 126,1 refere-se a dois carbonos e o sinal em δ 128,8 refere-se a
três carbonos, totalizando 15 carbonos na estrutura de LEF-2. O espectro de HSQC permitiu
associar inequivocamente os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos,
conforme descrito na Tabela 18, p. 100. Após análise de todos os dados até aqui descritos foi
possibilitou sugerir também para LEF-2 um esqueleto flavonônico.
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 43, p. 103), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios H-2 (δ 5,35) com o hidrogênio diasterotópicos H-3a (δ 3,00),
assim como, o acoplamento entre os dois hidrogênios diasterotópicos H-3a (δ 3,00) e H-3b (δ
2,73), como representado na Figura 36.
Figura 36 – Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de LEF-2
O
O
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
O espectro de HMBC (Figura 44, p. 103), mostrou os acoplamentos dos
hidrogênios δ 5,92 (H-6 e H-8) com o carbono em δ 166,8 (C-7) permitido-se confirmar a
posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Observou-se também
99
OLIVEIRA, F.C.
acoplamento do hidrogênio δ 5,92 (H-6) com o carbono δ 163,8 (C-5) permitido-se confirmar
a posição da hidroxila quelada no anel A. Além disso, observou-se acoplamentos dos
hidrogênios em δ 5,92 (H-6 e H-8) com os carbonos em δ 96,5 (C-8) e 96,6 (C-6),
respectivamente. Observou-se também acoplamentos do hidrogênio δ 5,92 (H-8) com o
carbono δ 163,0 (C-9), do hidrogênio em δ 5,92 (H-6) com o carbono δ 163,8 (C-5), do
hidrogênio δ 5,35 (H-2) com o carbono δ 40,2 (C-3) e acoplamento dos hidrogênios δ 3,00
(H-3a) e 2,70 (H-3b) com o carbono 195,6 (C-4), como representado na Figura 37 e Tabela
18, p. 100.
Figura 37 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-2
O
OO H
H
HH
H
H
H
H
H
H H
OH
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
A partir dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na
literatura (YENJAI et al., 2009) pôde-se confirmar para LEF-2 a estrutura de um flavonóide
do tipo flavanona, registrada na literatura como pinocembrina (Figura 38).
Figura 38 - Estrutura química da pinocembrina (LEF-2)
O
OH
OH
O
Embora a substância pinocembrina (LEF-2) já se encontre relatada na literatura
para o gênero Lippia (LIN et al., 2007), assim com como LEF-1 é a primeira vez que o seu
isolamento a partir da espécie L. rigida é registrado.
100
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 18 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEF-
2, comparados com dados da pinocembrina registrados na literatura (YENJAI et al., 2009 –
CDCl3 + CD3OD)
HSQC HMBC Pinocembrina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 79,1 5,35 (1H, dd, J = 3,0 e
13,0 Hz)
Ha-3; Hb-3 M 79,1
3 40,2 2,73 (1H, dd, J = 3,0 e
17,0 Hz)
3,00 (1H, dd, J = 13,0 e
17,0 Hz)
H-2 43,2
4 195,6 Ha-3; Hb-3 H-2 195,6
5 163,8 H-6 166,2
6 96,5 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-8 96,6
7 166,8 H-8; H-6 166,2
8 96,6 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-6 95,6
9 163,0 H-8 163,1
10 102,4 Ha-3; Hb-3;
H-6
102,6
1’ 138,4 H-2; 138,4
2’ 126,1 H-2; 126,1
3’ 128,8 128,8
4’ 128,8 7,35 (5H, m, H-2', H-3',
H-4', H-5' e H-6')
128,8
5’ 128,8 128,8
6’ 126,1 H-2 126,1
101
OLIVEIRA, F.C.
Figura 39 - Espectro de RMN 1H de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 40 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz)
6 e 8 2
3a 3b
6 e 8
2
3a 3b
102
OLIVEIRA, F.C.
Ha-3 Hb-3 C-3 C-3
Figura 41 - Espectro de RMN 13
C de LEF-2 (acetona-d6, 125 MHz)
Figura 42 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
3’ ;4’; 5’
6 10
8
2 3
2’ e 6’
1’ 9
5
7 4
H-2 C-2
H-6 C-6
H-8 C-8
103
OLIVEIRA, F.C.
O
OOH
OH
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
5 '
6 '
12
9
1011
13
15
14
O
OOH
OH
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
5 '
6 '
6
1
2
3
4
5
7
8
10 2
7
8
9
15
3
1
Figura 43 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 44 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-2 (acetona-d6, 500 x 125
MHz)
2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 f2 (ppm)
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
f 1 ( p p m )
3a
O
OOH
OH
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
3a
3b
2
2
3b
3;4
5;6
11;12
13;14
104
OLIVEIRA, F.C.
4.1.3 Determinação estrutural de LEF-3
O tratamento cromatográfico da fração LEFA (Item 5.5.5, p. 166) obtida pelo
fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido
amorfo amarelo com ponto de fusão entre 229-231 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,37 (c = 0,45,
MeOH), que foi denominado de LEF-3.
O espectro na região do infravermelho de LEF-3 (Figura 45), de forma
semelhante a LEF-1 e LEF-2, mostrou uma banda larga em 3264 cm-1
, correspondente à
deformação axial de ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila; absorções em
2920 e 2848 cm-1
características de deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1638
cm-1
compatível com a deformação axial C=O de carbonila conjugada; as bandas em 1598 e
1519 cm-1
características de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas
em 1260 a 1062 cm-1
compatíveis com deformações axiais de ligações C-O.
Figura 45 - Espectro na região do infravermelho de LEF-3
3264
2920
2848
3119
3800
1638
1466
1306
1466
1519
1598
1135
1260
1062
837 461
105
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEF-3 (Figura 49 e 50, p. 107
108) também apresentou semelhança com LEF-1 e LEF-2, revelando três sinais na faixa δ
7,38 – 5,95, os quais foram associados a hidrogênios ligados a carbonos de anel aromático.
Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 7,38 (2H, d, J = 8,4 Hz) e 6,89 (2H, d, J
= 8,4), como relativos a hidrogênios orto posicionados. O outro sinal, referente a hidrogênio
ligado a carbono aromático, assinalados em δ 5,95 (2H, dd, J = 2,1; 2,1 Hz) foi compatíveis
com hidrogênios meta posicionados. Além disso, foi observado um sinal em δ 5,43 (1H, dd, J
= 2,9 e 12,9 Hz) referente a hidrogênios metínicos de carbono oxigenado e dois sinais em δ
3,17 (1Ha, dd, J = 12,9 e 17,1 Hz) e 2,72 (1Hb, dd, J = 2,9 e 17,1 Hz) referente a dois
hidrogênios diasterotópicos. Observou-se também um sinal em δ 12,18 (1H, s) referente à
hidroxila fenólica quelada, (Tabela 19, p. 107). O padrão de acoplamentos apresentado por
LEF-3, pela semelhança com LEF-1 e LEF-2, se mostrou compatível com um esqueleto
flavonônico 5,7,4’-trissubstituido, Figura 46.
No espectro de RMN 13
C [125 MHz, (CD3)2CO] (Figura 51, p. 108) de LEF-3
observou-se treze linhas espectrais, sendo um destes em δ 198,2 (C-4) referente a carbono
carbonílico, dez sinais referentes a carbonos aromáticos e dois sinais em δ 80,9 (C-2) e 44,4
(C-3) referentes a carbonos com hibridização sp3, sendo o primeiro oxigenado. Duas linhas
espectrais (δ 129,9 e 117,1) foram relacionados a dois carbonos cada, após análise do espectro
de 1H,
13C-HSQC (Figura 53, p. 109). O espectro de correlação heteronuclear a uma ligação
1H,
13C-HSQC permitiu associar de maneira inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a
seus respectivos carbonos, conforme descrito na Tabela 19, p. 107.
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 52, p. 109), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 7,38), com os hidrogênios
H-3’ e H-5’ (δ 6,89), respectivamente. Além disso, observou-se acoplamento entre os dois
hidrogênios diasterotópicos H-3a (δ 3,17) e H-3b (δ 2,72), assim como destes com o H-2 (δ
5,43), como representado na Figura 46.
Figura 46 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-3
O
O
H
H
Ha
Hb
H
H
H
H
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
106
OLIVEIRA, F.C.
Análise do espectro de HMBC (Figura 54 e 55, p. 110), permitiu confirmar a
posição das hidroxilas através dos acoplamentos dos hidrogênios em δ 5,95 (H-8 e H-6) com
o carbono em δ 168,4 (C-7), dos hidrogênios em δ 6,89 (H-3’ e H-5’) com o carbono δ 159,6
(C-4’), dos hidrogênios em δ 7,38 (H-2’ e H-6’) com o carbono δ 159,6 (C-4’), Figura 47,
Tabela 19, p. 108. Verificou-se, ainda, os acoplamentos do hidrogênio em δ 5,95 (H-8) com o
carbono δ 165,3 (C-9), do hidrogênio em δ 5,95 (H-6) com o carbono em δ 166,2 (C-5), do
hidrogênio em δ 5,43 (H-2) com o carbono em δ 44,4 (C-3) e acoplamento dos hidrogênios
em δ 3,17 (H-3a) e 2,72 (H-3b) com o carbono em δ 198,2 (C-4).
A partir dos dados analisados, foi possível verificar que LEF-3 apresentava uam
estrutura semelhante a LEF-1, sendo a única diferença a presença da hidroxila no carbono C-
7 ao invés de uma metoxila.
Figura 47 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-3
O
O
O H
OH
OH
H
HH
H
H
H
H
H
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
A partir dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na
literatura (ALMEIDA et al., 2005) pôde-se confirmar para LEF-3 a estrutura de um
flavonóide do tipo flavanona, registrada na literatura como naringenina (Figura 48).
Figura 48 - Estrutura química da naringenina (LEF-3)
OOH
O H
O H
O
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '
A flavanona naringenina (LEF-3) também já se encontre relatada na literatura
para o gênero Lippia (COSTA, 2001), porém, é a primeira vez que o seu isolamento a partir
da espécie L. rigida é registrado.
107
OLIVEIRA, F.C.
OH-5
3a 3b
Tabela 19 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEF-
3, comparados com a literatura (ALMEIDA et al., 2005 – acetona-d6).
HSQC HMBC Naringenina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 80,9 5,43 (1H, dd, J = 13,0 e 2,8
Hz)
Ha-3; Hb-3 H-2’;H-6’ 80,0
3 44,4 3,17 (1Ha, dd, J = 13,0 e 17,1
Hz)
2,72 (1Hb, dd, J = 2,9 e 17,1
Hz)
H-2 43,5
4 198,2 Ha-3; Hb-3 H-2 197,3
5 166,2 H-6 165,3
6 97,8 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 96,9
7 168,4 H-8; H-6 167,4
8 96,8 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 95,9
9 165,3 H-8 164,4
10 104,1 H-3; H-6 103,3
1’ 131,6 H-2; H-2’;
H-6’
Ha-3; Hb-
3; H-3’; H-
5’
130,8
2’ 129,9 7,38 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-3’ H-2 129,0
3’ 117,1 6,89 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-2’ H-5’ 116,2
4’ 159,6 H-2’; H-6’ H-3’; H-5’ 158,7
5’ 117,1 6,89 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-6’ H-3’ 116,2
6’ 129,9 7,38 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-5’ H-2 129,0
Figura 49 - Espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).
2’;6’
3’;5’
6;8
2
108
OLIVEIRA, F.C.
4’
Figura 50 - Expansão do espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).
Figura 51 - Espectro de RMN 13
C de LEF-3 (acetona-d6, 125 MHz).
4 7
5 9
1’
2’;6’
3’;5’
10
6
8
2
3
4’
109
OLIVEIRA, F.C.
Ha-3 Hb-3 C-3 C-3
H-2 C-2
H-6’ C-6’
H-5’ C-5’
H-2’ C-2’
H-3’ C-3’
H-6 C-6
H-8 C-8
3’;5’ 2’;6’
Figura 52 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).
Figura 53 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).
O
O
O H
OH
OH
H
H
Ha
Hb
H
H
H
H
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
3a
3b
2
2
3a
3b
3’;5’
2’;6’
O
O
O H
OH
OH
H
H
Ha
Hb
H
H
H
H
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
110
OLIVEIRA, F.C.
O
OOH
OH
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H O H
6
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
12
13
14
15
161 2
3;4 5 11;12
13;14
15;16
O
OOH
OH
H
HHa
Hb
H
H
H
H
H O H19
17
23
18
20
22
21
24
25
27
26
20;21
22
23
Figura 54 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).
Figura 55 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125
MHz)
6
7
8
9;10
18
19
24;25
26;27
23
111
OLIVEIRA, F.C.
4.1.4 Determinação estrutural de LEF-4
O tratamento cromatográfico da fração LEFA (Item 5.5.5, p. 166), obtida pelo
fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido
amorfo amarelo com ponto de fusão entre 182,8-183,9 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,14 (c =
0,42, MeOH) , que foi denominado de LEF-4.
De forma semelhante a LEF-1, LEF-2 e LEF-3, o espectro na região do
infravermelho de LEF-4 (Figura 56), mostrou duas bandas em 3463 e 3364 cm-1
,
correspondentes à deformações axiais de ligação O-H, caracterizando a presença de grupo
hidroxila; absorções em 2927 cm-1
características de deformação axial de ligação Csp3-H; uma
banda em 1625 cm-1
característica de deformação axial C=O de carbonila conjugada; uma
banda em 1512 cm-1
típicas de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as
bandas em 1294 a 1089 cm-1
compatíveis com deformações axiais de ligações C-O.
Figura 56 - Espectro na região do infravermelho de LEF-4
O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEF-4 (Figura 60 e 61, p. 115)
apresentou semelhança com LEF-1, mostrando quatro sinais na faixa δ 7,43 – 6,06, os quais
foram associados a hidrogênios ligados a anel aromático. Destes, foram assinalados os
3463
3364
2927
1453
1512
1367
1625
1294 1155
1089
997 831
112
OLIVEIRA, F.C.
dubletos centrados em δ 7,43 (2H, d, J = 8,4 Hz) e 6,91 (2H, d, J = 8,4), como relativos a
hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais, assinalados em δ 6,09 (1H, d, J = 2,2 Hz)
e 6,06 (1H, d, J = 2,2 Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta posicionados, assim
como foi visto para LEF-1. Também form observado sinais em δ 5,12 (1H, d, J = 11,6 Hz) e
em δ 4,69 (1H, d, J = 11,6 Hz) referentes a hidrogênios oxigenados. Um sinal em δ 11,71
(1H, s) referente a hidroxila fenólica quelada e um sinal em δ 3,87 (3H, s) referente à
metoxila, (Tabela 20, p. 114).
No espectro de RMN 13
C [125, MHz, (CD3)2CO] (Figura 62, p. 116) foram
obsevados quatorze linhas espectrais. Sendo uma destas em δ 199,6 referente a carbono
carbonilíco, dez sinais na faixa δ 170,2-95,6, referentes a carbonos de anel aromático e dois
sinais em δ 85,4 e δ 74,1 referentes a carbonos sp3 oxigenados. Duas destas linhas espectrais
(δ 131,2 e 116,9) foram relacionadas a dois carbonos cada, após análise do espectro 1H,
13C-
HSQC (Figura 63, p. 116)
Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H,
13C-
HSQC, duas das linhas foram relacionadas a dois carbonos cada, permitiu associar com
segurança os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos, conforme descrito na
Tabela 20, p.114.
A semelhança dos dados analisados com os dados de LEF-1, permitiu sugerir
para LEF-4 uma estrutura semelhante, diferindo apenas pela presença de uma hidroxila no
carbono C-3. A confirmação da estrutura foi possível apartir da análise dos espectros
bidimensionais de RMN.
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 64, p. 117), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 7,43) com os hidrogênios
H-3’ e H-5’ (δ 6,91) e acoplamento do H-2 (δ 5,12) com H-3 (δ4,69), Figura 57.
Figura 57 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-4
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
113
OLIVEIRA, F.C.
No espectro de HMBC (Figura 65 e 66, p. 118), foi possível identificar os
acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,06 (H-8), 6,09 (H-6) e 3,87 (metoxila) com o carbono
em δ 170,2 (C-7) confirmando-se a posição da metoxila no carbono 7 do esqueleto
flavonoídico. Observou-se também, os acoplamentos dos hidrogênios δ 6,91 (H-3’ e H-5’)
com o carbono δ 159,8 (C-4’), acoplamentos dos hidrogênios δ 7,43 (H-2’ e H-6’) com o
carbono δ 159,8 (C-4’), confimando-se a posição da hidroxila no anel B, Figura 58, Tabela
20, p. 114.
Outros acoplamentos importantes foram observados dentre eles, do hidrogênio δ
6,06 (H-8) com o carbono δ 164,9 (C-9), do hidrogênio δ 6,09 (H-6) com o carbono δ 165,6
(C-5), do hidrogênio δ 5,12 (H-2) com o carbono δ 74,1 (C-3) e do hidrogênio δ 4,69 (H-3)
com o carbono 199,6 (C-4), confirmando a posição na hidroxila no anel C, Figura 58.
Figura 58 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-4
O
O H
OH
H 3CO
H
H
H
H
H
H
H
O H
H
O
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
Mediante comparação dos dados analisados com os dados descritos na literatura
(ALMEIDA et al., 2005) pôde-se confirmar para LEF-4 a estrutura de um flavonóide do
flavanonol, registrado na literatura como 7-metoxi-aromadendrina (Figura 59).
Figura 59 - Estrutura química de 7-metoxi-aromadendrina (LEF-4)
O
O
O H
MeO
O H
O H
2
34
5
6
7
8
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '9
114
OLIVEIRA, F.C.
Embora o flavononol 7-metoxi-aromadendrina (LEF-4) já tenha sido relatada
(FREITAS et al., 2008) este é o seu primeiro relato o gênero Lippia e conseguentemente para
a família Verbenaceaea.
Tabela 20 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEF-
4, comparados com a literatura (ALMEIDA et al., 2005 – acetona-d6).
HSQC HMBC 7-metoxi-
aromadendrina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 85,4 5,1 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-3 H-2’; H-6’ 85,3
3 74,1 4,7 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-2 74,0
4 199,6 H-3 H-2 198,8
5 165,6 11,7 (1H, s) H-6 165,6
6 96,7 6,1 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 97,7
7 170,2 H-8; H-6;
OCH3
169,1
8 95,6 6,0 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 96,7
9 164,9 H-8 164,9
10 103,1 H-3; H-6 102,2
1’ 129,9 H-2; H-2’;
H-6’
H-3;H-3’;
H-5’
129,6
2’ 131,2 7,4 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-3’ H-2; H-6’ 130,7
3’ 116,9 6,9 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-2’ H-5’ 116,5
4’ 159,8 H-2’; H-6’ H-3’; H-5’ 159,5
5’ 116,9 6,9 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ H-3’ 116,5
6’ 131,2 7,4 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-5’ H-2; H-2’ 130,7
57,3 3,9 (3H, s)
115
OLIVEIRA, F.C.
OH-5
2’;6’ 3’;5’
Figura 60 - Espectro de RMN 1H de LEF-4 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 61 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-4 (acetona-d6, 500 MHz)
6 8
2 3
O
O
O H
OH
O
H
HO H
H
H
H
H
H
H
CH 3 2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
116
OLIVEIRA, F.C.
H-3 C-3
H-2 C-2
H-2’ C-2’
H-6’ C-6’
Figura 62 - Espectro de RMN 13
C de LEF-4 (acetona-d6, 125 MHz)
Figura 63 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
H-6 C-6
H-8 C-8
H-3’ C-3’
H-5’ C-5’
4 7
5 9
4’
2’;6’
1’
3’;5’
10
6
8 2
3
OCH3
O
O
O H
OH
O
O H
CH 3 2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
117
OLIVEIRA, F.C.
Figura 64 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 500 MHz)
2 3
2
3
2’;6’ 3’;5’
2’;6’
3’;5’
118
OLIVEIRA, F.C.
O
OO H
O
H
HO H
H
H
H
H
H
H O H
CH 3 2
34
5
6
78
9
10
1 '
2 '3 '
5 '
6 '
5
1
2
3
4
6
7
8
11
12
13
14
9
10
O
OO H
O
H
HO H
H
H
H
H
H
H O H
CH 3 2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
5 '
6 '
16
2015
17
19
18
21
22
24
23
19
Figura 65 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
Figura 66 - Expansão do espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-4 (a cetona-d6, 500 x 125
MHz)
1
20
2 3
4
5
6
7;8
9;10
11;12
13;14
15 16
17 18
21;22
23;24
OCH3
119
OLIVEIRA, F.C.
4.1.5 Determinação estrutural de LEF-5
O tratamento cromatográfico da fração LEFA (Item 5.5.5, p. 166), obtida pelo
tratamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido
amorfo amarelo com ponto de fusão entre 288-290 ºC, que foi denominado de LEF-5.
O espectro na região do infravermelho de LEF-5 (Figura 67), mostrou uma banda
larga em 3255 cm-1
, correspondente à deformação axial de ligação O-H, caracterizando a
presença de grupo hidroxila; absorções em 2935 e 2844 cm-1
características de deformação
axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1612 cm-1
característica de deformação axial C=O de
carbonila conjugada; uma banda em 1507 cm-1
típica de deformação axial de ligação C=C de
anel aromático e a banda em 1155 cm-1
compatível com deformações axiais de ligações C-O.
Figura 67 – Espectro na região do infravermelho de LEF-5 (KBr)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
20
30
40
50
60
70
1 1 5 5 ,0
1 3 7 6 ,8
1 4 3 5 ,9
1 5 0 7 ,51 6 1 1 ,8
1 6 8 3 ,4
2 8 4 4 ,4
2 9 3 5 ,5
3 2 5 5 ,3
T%
cm-1
L E F -6
O espectro de RMN 1H [300 MHz, piridina-d5] de LDF-1 (Figura 70, p. 122),
mostrou quatro sinais na faixa δ 7,96 – 6,60, os quais foram associados a hidrogênios ligados
a anel aromático. Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 7,96 (2H, d, J = 8,8
Hz) e 7,29 (2H, d, J = 8,8), relativos a hidrogênios orto posicionados, um singleto em δ 6,92
3255
2935
2844
1436
1683
1612 1507
1377
1155
120
OLIVEIRA, F.C.
(1H, s) e outros dois sinais, referentes a hidrogênios ligados a anel aromático, em δ 6,71 (1H,
d, J = 2,2 Hz) e 6,60 (1H, d, J = 2,2 Hz) os quais foram compatíveis com hidrogênios meta
posicionados. Foram observados ainda um sinal em δ 13,61 (1H, s) característico de uma
hidroxila fenólica quelada e um sinal em δ 3,79 (3H), tipico de grupo metoxila.
O espectro de RMN 13
C [75 MHz, piridina-d5], (Figura 71, p. 123) foram
obsevadas quatoze linhas espectrais, duas das quais (δ 129,4 e 117,3) foram relacionadas a
dois carbonos cada, após análise do espectro de 1H,
13C-HSQC (Figura 74, p. 124).
Comparação do espectro de RMN 13
C totalmente desacoplado, com o espectro de RMN 13
C-
DEPT 135º [75 MHz, piridina-d5], (Figura 72, p. 123), permitiu identificar a presença de um
carbono metílico (δ 56,3), sete carbonos monoidrogenados (δ 129,4-93,3). Os oito sinais
restantes foram identificados como carbonos não hidrogenados, sendo um, característico de
corbono de carbonila cetônica conjugada (δ 183,2), (Tabela 21).
Tabela 21 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise
comparativa entre os espectros de RMN 13
C-BB e DEPT 135° de LEF-5
C CH CH3 Fórmula molecular
183,2 (C=O) 129,4 (2X) 56,3 (C-O)c
166,2 (C-O)b 117,3 (2X)
165,2 (C-O)a 104,4
163,3 (C-O)a 98,9
163,1 (C-O)c 93,3
158,5 (C-O)c
122,5
106,2
8 C 7 CH 1 CH3 C16H12O6
a – carbono sp
2 ligado a hidroxila;
b – carbono sp
2 ligado a grupo metoxila;
c – carbono ligado
oxigênio de éter.
Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H,
13C-HSQC
foi possível associar de forma inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos
carbonos. A análise de todos os dados descrito possibilitou sugerir um esqueleto flavonônico
para LEF-5.
121
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 68) forneceu o
pico correspondente ao íon molecular m/z 284,0 daltons, condizente com a fórmula molecular
C16H12O5.
Figura 68 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-5
No espectro de HMBC (Figura 75, p. 125), foi possível identificar os
acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,71 (H-8), 6,60 (H-6) e 3,97 (metoxila) com o carbono
em δ 166,2 (C-7) determinando a posição da metoxila no carbono 7 do esqueleto
flavonoídico. Identificou-se também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 7,29 (H-3’ e H-
5’) com o carbono δ 163,3 (C-4’), dos hidrogênios em δ 7,95 (H-2’ e H-6’) com o carbono δ
163,3 (C-4’) permitido-se determinar a posição da hidroxila no anel B. Observou-se ainda o
acoplamento do hidrogênio δ 6,71 (H-8) com o carbono δ 158,5 (C-9) e do hidrogênio δ 6,60
(H-6) com o carbono δ 163,1 (C-5).
Com base nos dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na
literatura (AGRAWAL, 1989) pôde-se propor para LEF-5 a estrutura de um flavonol e
registrado na literatura como genkwanina (Figura 69).
Figura 69 - Estrutura química de genkwanina (LEF-5)
O
O H
OO H
MeO
Embora a flavona genkwanina (LEF-5) já tenha sido relatada (gênero Aloysia
(Verbenaceae) (VANDRESEN et al., 2010) este é o seu primeiro relato para o gênero Lippia
(Verbenaceaea).
122
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 22 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de LEF-
5, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)
HSQC HMBC Genkwanina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 1165,2 H-2’;H-6’ 166,0
3 104,4 104,2
4 183,2 181,4
5 163,1 13,62 (1H, s) H-6 161,4
6 98,9 6,60 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 99,2
7 166,2 H-8; H-6;
OCH3
167,1
8 93,3 6,71 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 93,7
9 158,5 H-8 157,4
10 106,2 H-8 106,5
1’ 122,5 H-3;H-3’; H-5’ 122,9
2’ 129,4 7,95 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-6’ 129,6
3’ 117,3 7,29 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-5’ 117,2
4’ 163,3 162,8
5’ 117,3 7,29 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-6’ 117,2
6’ 129,4 7,95 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-2’ 129,6
OMe 56,3 3,79 (3H, s) 56,7
Figura 70 - Espectro de RMN 1H de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)
2’;6’
3’;5’
8
6 OH-5
3
OCH3
123
OLIVEIRA, F.C.
Figura 71 - Espectro de RMN 13
C de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)
Figura 72 - Espectro de RMN 13
C – DEPT 135º de LEF-5 (piridina-d5, 125 MHz)
3’ ; 5’
6
10
8
2
3
2’ ; 6’
1’ 9
5
7
4
4’
OCH3
124
OLIVEIRA, F.C.
Figura 73 – Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEF-5 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 74 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)
3’;5’ 3 6
6
3
3’;5
’
8
8
6H 6C
8H 8C
3’H 3’C
5’H 5’C
2’H 2’C
6’H 6’C
3H 3C
125
OLIVEIRA, F.C.
Figura 75 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)
1
2
5
6
7
8
11
4
3
9
13
12
14 10
15
O
OH
H 3CO
H
H
H
H
H
H O H
H
O
4
2
3
1
67
5
9
8
10
5
7
6
11
11
12
13
14
15
126
OLIVEIRA, F.C.
4.1.6 Determinação estrutural de LDF-1
O tratamento cromatográfico da fração LDFA (Item 5.5.9, p. 171), obtida pelo
fracionamento cromatográfico do decocto das folhas de L. rigida, forneceu um sólido amorfo
amarelo com ponto de fusão entre 196,0-197,9 ºC, que foi denominado de LDF-1.
O espectro na região do infravermelho de LDF-1 (Figura 76), mostrou uma banda
larga em 3261 cm-1
, correspondente à deformação axial de ligação O-H, caracterizando a
presença de grupo hidroxila; absorções em 2923 e 2851 cm-1
características de deformação
axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1664 cm-1
característica de deformação axial C=O de
uma carbonila conjugada; as bandas em 1586 e 1508 cm-1
típicas de deformação axial de
ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1234 a 1162 cm-1
compatíveis com
deformações axiais de ligações C-O.
Figura 76 – Espectro na região do infravermelho de LDF-1 (KBr)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 3 ,6
1 1 6 2 ,0
3 4 9 0 ,3
1 5 0 7 ,5
1 6 6 3 ,9
1 5 8 6 ,1
2 8 5 0 ,6
2 9 2 3 ,0
3 2 6 1 ,5
T %
cm-1
L D F P A -12
3261 2923
2851
1664
1586 1508 1162
1234
127
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [300 MHz, piridina-d5] de LDF-1 (Figura 80, p. 130),
apresentou quatro sinais na faixa δ 8,59 – 6,62, os quais foram associados a hidrogênios
ligados a anel aromático. Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 8,59 (2H, d, J
= 8,4 Hz) e 7,39 (2H, d, J = 8,4), relativos a hidrogênios orto posicionados. Os outros dois
sinais, assinalados em δ 6,75 (1H, d, J = 2,2 Hz) e 6,63 (1H, d, J = 2,2 Hz) foram compatíveis
com hidrogênios meta posicionados. Além disso, foi observado um sinal em δ 3,80 (3H, s)
compatível com os hidrogênios de grupo metoxila.
No espectro de RMN 13
C [75 MHz, piridina-d5], (Figura 81, p. 130) foram
obsevadas quatoze linhas espectrais, das quais duas (δ 130,2 e 116,2) foram relacionadas a
dois carbonos cada, após análise do espectro de 1H,
13C-HSQC (Figura 84, p. 132).
Comparação do espectro de RMN 13
C totalmente desacoplado, com o espectro de RMN 13
C-
DEPT 135º [75 MHz, piridina-d5], (Figura 82, p. 131), permitiu identificar a presença de um
carbono metílico (δ 55,7), seis carbonos monoidrogenados (δ 130,2-91,9). Os noves sinais
restantes foram identificados como carbonos não hidrogenados, sendo um, característico de
carbono de carbonila de cetona conjugada (δ 176,9), (Tabela 23).
Tabela 23 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise
comparativa entre os espectros de RMN 13
C-BB e DEPT 135° de LDF-1
C CH CH3 Fórmula molecular
176,9 (C=O) 130,2 (2X) 55,7 (C-O)c
165,2 (C-O)b 116,2 (2X)
161,7 (C-O)a 97,8
160,6 (C-O)a 91,9
156,8 (C-O)c
148,0 (C-O)c
137,3 (C-O)a
122,8
105,0
9 C 6 CH 1 CH3 C16H12O6
a – carbono sp
2 ligado a hidroxila;
b – carbono sp
2 ligado a grupo metoxila;
c – carbono ligado
oxigênio de éter.
128
OLIVEIRA, F.C.
Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H,
13C-HSQC
permitiu associar de forma inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos
carbonos. A análise de todos os dados até aqui descritos possibilitou sugerir um esqueleto
flavonônico para LDF-1.
A semelhança dos dados analisados com os dados de LEF-5, permitiu sugerir
para LDF-1 uma estrutura semelhante, diferindo apenas pela presença de uma hidroxila no
carbono C-3 (δ 135,5).
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 83, p. 131), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 8,58) com os hidrogênios
H-3’ e H-5’ (δ 7,39), como representado na Figura 77.
Figura 77 – Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de LDF-
1
O
O
H
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
78
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
O espectro de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 78) forneceu o
pico correspondente ao íon molecular m/z 300,0 daltons, condizente com a fórmula molecular
C16H12O6.
Figura 78 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDE-1
No espectro de HMBC (Figura 85, p. 132), foi possível identificar os
acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,75 (H-8), 6,63 (H-6) e 3,80 (metoxila) com o carbono
em δ 165,2 (C-7) possibilitou-se determinar a posição da metoxila no carbono C-7 do
esqueleto flavonoídico. Mostrou também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 4,39 (H-3’ e
129
OLIVEIRA, F.C.
H-5’) com o carbono em δ 160,6 (C-4’), dos hidrogênios em δ 8,58 (H-2’ e H-6’) com o
carbono δ 160,6 (C-4’) permitido-se confirmar a posição da hidroxila no anel B.
Após análise de todos os dados e comparação com os dados descritos na literatura
(AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LDF-1 a estrutura de um flavonóide do tipo
flavonol, registrado na literatura como ramnocitrina (Figura 79).
Figura 79 - Estrutura química de ramnocitrina (LDF-1)
O
O H
O H
OO H
MeO
Embora o flavonol ramnocitrina (LED-1), já tenha sido relatada (BACHHETI et
al., 2011), este é o seu primeiro relato para o gênero Lippia e consequentemente para a família
Verbenaceaea.
Tabela 24 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de LDF-
1, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)
HSQC HMBC Ramnocitrina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 148,0 H-2’;H-6’ 147,2
3 137,5 135,9
4 176,9 176,0
5 161,7 H-6 160,3
6 97,8 6,63 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 97,4
7 165,2 H-8; H-6;
OCH3
164,9
8 91,9 6,75 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 92,1
9 156,8 H-8 156,1
10 105,1 H-8 104,0
1’ 122,8 H-2’; H-6’ H-3;H-3’;
H-5’
121,6
2’ 130,2 8,58 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ 129,4
3’ 116,2 7,39 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-5’ 115,4
4’ 160,6 159,3
5’ 116,2 7,39 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ 115,4
6’ 130,2 8,58 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-2’ 129,4
OMe 55,7 3,80 (3H, s)
130
OLIVEIRA, F.C.
Figura 80 - Espectro de RMN 1H de LED-1 (piridina-d5, 500 MHz)
Figura 81 - Espectro de RMN 13
C de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz)
3’ ; 5’
6
10
8
2
3
2’ ; 6’
1’ 9
5
7 4
4’
OCH3
2’;6’ 3’;5’
8 6
OCH3
131
OLIVEIRA, F.C.
Figura 82 - Espectro de RMN 13
C – DEPT 135º de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz)
Figura 83 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LED-1 (Piridina-d5, 500 MHz)
6 8
OCH3
3’;5’ 2’;6’
2’;6’
6
6
3’;5
’
8
8
3’;5’
2’;6’
O
O
H
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
78
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
132
OLIVEIRA, F.C.
Figura 84 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)
Figura 85 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)
1
2 8
5
6
7
9
11
13
O
OH
MeO
H
H
H
H
H
H O H
O H
O
4
2
3
1
67
5
10
9
8
1112
5
7
6
13
13
14
14
4
3
10
12
14
6H 6C
8H 8C
3’H 3’C
5’H 5’C
2’H 2’C
6’H 6’C
133
OLIVEIRA, F.C.
4.1.7 Determinação estrutural de LDF-2
O tratamento cromatográfico do decocto LDFA (Item 5.5.9, p. 171), obtida pelo
fracionamento cromatográfico do decocto das folhas de L. rigida, forneceu um sólido amorfo
amarelo com ponto de fusão entre 255-257 ºC, que foi denominado de LDF-2.
De forma semelhante a LDF-1 o espectro na região do infravermelho de LDF-2
(Figura 86), mostrou uma banda larga em 3451 cm-1
, correspondente à deformação axial de
ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila; absorção em 2923 cm-1
características de deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1618 cm-1
característica
de deformação axial C=O de uma carbonila conjugada; ama banda em 1501 cm-1
típica de
deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1234 a 1175 cm-1
compatíveis com deformações axiais de ligações C-O.
Figura 86 - Espectro na região do infravermelho de LED-2 (KBr)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
25
30
35
40
45
1 1 7 5
1 2 3 41 3 9 7
1 5 0 1
1 6 1 8
1 6 6 4
2 9 2 3
3 4 5 1
T%
cm-1
134
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [300 MHz, (CD3)2CO] de LDF-2 (Figura 90, p. 136),
mostrou quatro sinais na faixa δ 8,15 – 6,27, os quais foram associados a hidrogênios ligados
a anel aromático. Destes, os dubletos centrados em δ 8,15 (2H, d, J = 8,8 Hz) e 7,01 (2H, d, J
= 8,8), foram associados a hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais, assinalados em
δ 6,53 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 6,27 (1H, d, J = 2,0 Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta
posicionados.
No espectro de RMN 13
C [75 MHz, (CD3)2CO], (Figura 91, p. 137) foram
observadas treze linhas espectrais, das quais duas (δ 131,4 e 117,3) foram relacionadas a dois
carbonos cada, após análise do espectro de 1H,
13C-HSQC (Figura 93, p. 138). Sendo um
destes em δ 177,6 (C-4) referente a carbono carbonilico conjugado e os dez sinais na faixa δ
165,9-95,5, relacionados a carbonos de anel aromático. Os sinais em δ 148,0 (C-2) e δ 137,6
(C-3) relacionados a carbonos sp2 oxigenados.
Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H,
13C-
HSQC, foi possível associar de forma inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a seus
respectivos carbonos, conforme descrito na Tabela 25, p. 136.
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 92, p. 137), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 8,15) com os hidrogênios
H-3’ e H-5’ (δ 7,01). Além disso, observou-se acoplamento dos hidrogênios meta
posicionados em H-8 (δ 6,53) com o hidrogênio H-6 (δ 6,27), como representado na Figura
87.
Figura 87 – Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de LDF-
2
O
O
H
H
H
H
H
H
2
3
4
5
6
78
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
O espectro de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 88, p. 135)
forneceu o pico correspondente ao íon molecular m/z 286,0 daltons, condizente com a fórmula
molecular C15H10O6.
135
OLIVEIRA, F.C.
Figura 88 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDF-2
No espectro de espectro de HMBC (Figura 94, p. 138), foi possível identificar os
acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,53 (H-8) e 6,27 (H-6) com o carbono em δ 165,9 (C-7)
determinando a posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Mostrou
também, os acoplamentos dos hidrogênios em δ 7,01 (H-3’ e H-5’) com o carbono em δ 161,2
(C-4’) e dos hidrogênios em δ 8,15 (H-2’ e H-6’) com o carbono em δ 161,2 (C-4’) permitido-
se determinr a posição da hidroxila no anel B. Verficou-se ainda acoplamento dos hidrogênio
em δ 6,53 (H-8) com o carbono em δ 158,8 (C-9) e do hidrogênio δ 6,27 (H-6) com o carbono
δ 163,3 (C-5).
A partir dos dados analisados, comparação com os dados de LDF-1 e comparação
com os dados descritos na literatura (AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LDF-2 a
estrutura de um flavonóide do tipo flavonol, registrado na literatura como canferol (Figura
89).
Figura 89 - Estrutura química do canferol (LDF-2)
O
O H
O H
OO H
OH
Embora o flavonol canferol (LDF-2), já tenha sido descrita para o gênero Vitex
(Verbenaceae) (CHEN et al., 2011) este é o seu primeirorelato para o gênero Lippia
(Verbenaceaea).
136
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 25 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LDF-
2, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)
HSQC HMBC Canferol
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 148,0 H-2’; H-6’ 146,8
3 137,5 135,6
4 177,6 175,9
5 163,3 H-6 160,7
6 100,1 6,27 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-8 98,2
7 166,0 H-8; H-6 163,9
8 95,5 6,53 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-6 93,5
9 158,8 H-8 156,2
10 105,1 H-8 H-6 103,1
1’ 124,3 H-2’; H-6’ H-3;H-3’; H-5’ 121,7
2’ 131,4 8,15 (2H, d, J = 8,5 Hz) H-6’ 129,5
3’ 117,3 7,01 (2H, d, J = 9,0 Hz) H-5’ 115,4
4’ 161,2 159,2
5’ 117,3 7,01 (2H, d, J = 9,0 Hz) H-6’ 115,4
6’ 131,4 8,15 (2H, d, J = 8,5 Hz) H-2’ 129,5
Figura 90 - Espectro de RMN 1H de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz)
2’;6’ 3’;5’
8 6
OH-5
137
OLIVEIRA, F.C.
Figura 91 - Espectro de RMN 13
C de LED-2 (acetona-d6, 125 MHz)
Figura 92 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz)
3’ ; 5’
6
10
8
2 3
2’ ; 6’
1’
9 5
7 4
4’
2’;6
’
3’;5
’ 6
6
3’;5
’
2’;6
’
6
8
138
OLIVEIRA, F.C.
Figura 93 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
Figura 94 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
6H 6C
8H 8C
3’H 3’C
5’H 5’C
2’H 2’C
6’H 6’C
1
2 8
5
6
7
9
11
13
O
OH
MeO
H
H
H
H
H
H O H
O H
O
4
2
3
1
67
5
10
9
8
1112
5
7
6
13
13
14
14
4
3
10
12
14
139
OLIVEIRA, F.C.
4.1.8 Determinação estrutural de LDF-3
O tratamento cromatográfico da fração LDFA (Item 5.5.9, p. 171), obtida pelo
fracionamento cromatográfico do decocto das folhas de L. rigida, forneceu um sólido amorfo
amarelo com ponto de fusão entre 289-291 ºC, que foi denominado de LDF-3.
De forma semelhante a LDF-1 e LDF-2 o espectro na região do infravermelho de
LDF-3 (Figura 95), mostrou uma banda larga em 3419 cm-1
, correspondente à deformação
axial da ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila; uma banda em 1618 cm-1
característica de deformação axial C=O de uma carbonila conjugada; uma banda em 1514
cm-1
típica de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1247 a
1162 cm-1
compatíveis com deformações axiais de ligações C-O.
Figura 95 – Espectro na região do infravermelho de LDF-3 (KBr)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
30
35
40
45
50
55
60
65
1 1 6 2
1 2 4 71 3 7 1
1 5 1 4
1 6 1 8
1 6 6 43 4 1 9
T%
cm-1
140
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [300 MHz, (CD3)2CO] de LDF-3 (Figura 99, p. 142),
apresentou cinco sinais na faixa δ 7,81 – 6,26, os quais foram associados a hidrogênios
ligados anel aromático. Destes, foram assinalado a um singleto largo em δ 7,81 (1H, sl), um
duplo dubleto em δ 7,69 (1H, dd, J = 8,2 e J = 1,4 Hz), relativos a hidrogênios em posições
orto e meta, repectivamente e o dubleto em δ 6,99 (1H, d, J = 8,4), foram assinalados como
hidrogênios orto posicionados. Os outros dois sinais, referentes a hidrogênios ligados a
carbonos aromáticos, assinalados em δ 6,39 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz)
foram compatíveis com hidrogênios meta. Foi observado também, um sinal em δ12,17 (s)
característico de hidroxila fenólica quelada.
No espectro de RMN 13
C [75 MHz, (CD3)2CO], (Figura 100, p. 143) foram
observadas quinze linhas espectrais. Sendo um destes em δ 177,5 (C-4) referente a carbono
carbonílico conjugados. Os doze sinais na faixa δ 165,9-95,4, forma relacionados a carbonos
de anel aromático e dois sinais em δ 147,9 (C-2) e 137,7 (C-3) foram compatíveis com
carbonos sp2 oxigenados, Tabela 26, p. 142.
Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H-
13C-HSQC
(Figura 102, p. 144), foi possível associar de forma inequívoca os sinais de todos os
hidrogênios a seus respectivos carbonos, conforme descrito na Tabela 26, p. 142. Após análise
de todos os dados até aqui descritos possibilitou sugerir também para LDF-3 um esqueleto
flavonônico.
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 101, p. 143), confirmou os
acoplamentos dos hidrogênios H-8 (δ 6,51) com o hidrogênio H-6 (δ 6,26), e do hidrogênio
H-6’ (δ 7,69) com o hidrogênio H-5’ (δ 6,99), como representado na Figura 96.
Figura 96 – Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de LDF-3
O
H
H
H
H
H
O
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
141
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 97) forneceu o
pico correspondente ao íon molecular m/z 302 daltons, condizente com a fórmula molecular
C15H10O7.
Figura 97 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDF-3
O espectro de HMBC (Figura 103, p. 144), mostrou os acoplamentos dos
hidrogênios em δ 6,51 (H-8) e 6,26 (H-6) com o carbono em δ 166,0 (C-7) permitido-se
confirmar a posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Observou-se
também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,99 (H-5’) e 7,69 (H-6’) com o carbono δ
148,3 (C-4’), permitido-se confirmar a posição das hidroxilas no anel B. Além disso,
observou-se os acoplamento do hidrogênio em δ 6,51 (H-8) com o carbono δ 158,7 (C-9) e do
hidrogênio δ 6,26 (H-6) com o carbono δ 163,3 (C-5) .
A partir dos dados analisados, comparação com os dados descritos na literatura
(AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LDF-3 a estrutura de um flavonóide do tipo
flavonol, registrado na literatura como quercetina (Figura 98).
Figura 98 - Estrtura química de quercetina (LDF-3)
O
O H
O H
OO H
OH
O H
Embora a substância quercetina (LDF-3) já tenha sido relatado para o
gênero Lippia (COSTA et al., 2001), é a primeira vez que o seu isolamento a partir da espécie
L. rigida é registrado.
142
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 26 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LDF-
3, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)
HSQC HMBC Quercetina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 147,9 H-2’; H-6’ 147,5
3 137,7 136,5
4 177,5 176,5
5 163,3 12,17 (OH,s) H-6 161,0
6 100,1 6,26 (1H, sl) H-8 99,5
7 166,0 H-8; H-6 166,0
8 95,4 6,51 (1H, sl) H-6 94,5
9 158,7 H-8 156,7
10 105,1 H-6; H-8 104,0
1’ 124,3 H-2’ H-5’ 123,0
2’ 116,7 7,81 (1H, sl) H-6’ 116,0
3’ 146,8 H-2’ H-5’ 145,7
4’ 149,3 H-5’ H-6’ 148,1
5’ 117,2 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz) H-6’ 116,5
6’ 122,4 7,69 (1H, dd, J = 8,5 e 1,5
Hz)
H-5’ H-2’ 121,0
Figura 99 - Espectro de RMN 1H de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz)
2’
5’
8 6
OH-5
6’
143
OLIVEIRA, F.C.
Figura 100 - Espectro de RMN 13
C de LED-3 (acetona-d6, 125 MHz)
Figura 101 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz)
5’
6
10
8
2 3
6’
1’ 9 5
7
4
4’ 3’
2’
6’ 5’
6
6
5’
8
8
2’
6’
2’
144
OLIVEIRA, F.C.
Figura 102 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
Figura 103 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz
6H 6C
8H 8C
5’H 5’C
2’H 2’C
6’H 6’C
1
2
5
6
7
8
10
12 4
3
9 11
13
14
O
OH
OH
H
H
O H
H
H
H O H
O H
O
4
2
3
1
5
9
8
1011
5
7
6
12
13
14
145
OLIVEIRA, F.C.
4.1.9 Determinação estrutural de LEC-1
O tratamento cromatográfico da fração LECA (Item 5.5.10, p. 174), obtida pelo
fracinamento cromatográfico do extrato etanólico do caule de L. rigida, forneceu um sólido
amorfo amarelo com ponto de fusão entre 137-139 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,05 (c = 0,42,
MeOH) , que foi denominado de LEC-1.
O espectro na região do infravermelho de LEC-1 (Figura 104), mostrou uma
banda larga em 3262 cm-1
, correspondente à deformação axial da ligação O-H, caracterizando
a presença de grupo hidroxila; absorções em 2923 e 2851 cm-1
características de deformação
axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1664 cm-1
característica de deformação axial C=O de
uma carbonila conjugada; as bandas em 1586 e 1508 cm-1
típicas de deformação axial de
ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1234 a 1162 cm-1
compatíveis com
deformações axiais de ligações C-O.
Figura 104 – Espectro na região do infravermelho de LEC-1 (KBr)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 3 ,6
1 1 6 2 ,0
3 4 9 0 ,3
1 5 0 7 ,5
1 6 6 3 ,9
1 5 8 6 ,1
2 8 5 0 ,6
2 9 2 3 ,0
3 2 6 1 ,5
T %
cm-1
L D F P A -12
3262 2923
2851
1664
1586 1508
1162
1234
146
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEC-1 (Figura 108, p. 149),
apresentou cinco sinais na faixa δ 7,07 – 5,94, os quais foram associados a hidrogênios
ligados a anel aromático. Destes, foi assinalado um dubleto em δ 7,07 (1H, d, J = 1,9 Hz),
relativos a hidrogenio com acoplamento meta, um duplo dubleo com acoplamento orto e
meta, respectivamente, em δ 6,91 (1H, dd, J = 8,1 e 1,9), um dubleto em δ 6,86 (1H, d, J = 8,1
Hz), relativos a hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais, referentes a hidrogênios
ligados a anel aromático, assinalados em δ 5,99 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 65,95 (1H, d, J = 2,0
Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta posicionados. Além disso, foram observados
dois sinais em δ 5,01 (1H, d, J = 11,6 Hz) e em δ 4,61 (1H, d, J = 11,6 Hz) referentes a
hidrogênios ligados a carbonos sp3 oxigenados. E mais um sinal em δ 11,71 (1H, s) referente
a hidroxila fenólica quelada, (Tabela 27, p. 148). O padrão de acoplamentos apresentado por
LEC-1 se mostrou compatível com um núcleo flavonoídico 3,5,7,3’,4’-pentassubstituido.
No espectro de RMN 13
C [125, MHz, (CD3)2CO] (Figura 109, p. 149) observou-se
quinze linhas espectrais. Sendo uma destas em δ 199,1 (C-4) referente a carbono carbonilíco,
doze sinais na faixa δ 168,9-97,0, referentes a carbonos de anel aromáticos e dois sinais em δ
85,5 e 74,1 referentes a carbonos sp3 oxigenados, Tabela 27, p. 148.
O espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H-
13C-HSQC (Figura 111,
p. 150) permitiu associar os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos,
conforme descrito na Tabela 27, p. 148.
A análise do espectro de RMN 1H,
1H-COSY (Figura 110, p. 150), confirmou os
acoplamento do hidrogênio H-6’ (δ 6,91) com o hidrogênio H-5’ (δ 6,86) e acoplamento do
hidrogênio H-2 (δ 5,01) com o hidrogênio H-3 (δ 4,61), como representado na Figura 105.
Figura 105 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEC-1
O
H
H
H
H
H
H
O
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
147
OLIVEIRA, F.C.
O espectro de HMBC (Figura 112, p. 151), mostrou os acoplamentos dos
hidrogênios em δ 5,95 (H-8) e 5,99 (H-6) com o carbono em δ 168,9 (C-7) permitido-se
confirmar a posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Observou-se
também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,86 (H-5’) com o carbono em δ 147,6 (C-4’),
dos hidrogênios em δ 7,07 (H-2’) com o carbono em δ 147,6 (C-4’) permitido-se confirmar a
posição da hidroxila no anel B. Além disso, observou-se os acoplamentos dos hidrogênio em
δ 5,95 (H-8) com o carbono em δ 165,1 (C-9), do hidrogênio em δ 5,99 (H-6) com o carbono
em δ 165,9 (C-5), do hidrogênio em δ 5,01 (H-2) com o carbono δ 74,1 (C-3) e do hidrogênio
em δ 4,61 (H-3) com o carbono 199,1 (C-4), confirmando a posição na hidroxila no anel C,
como representado na Figura 106 e Tabela 27, p. 148.
Figura 106 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEC-1.
O
O H
OH
OH
H
H
O H
H
H
H
O H
H
O
H
2
34
5
6
7
8
9
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '
A partir da análise de todos os dados obtidos foi possível verifica uma grande
similaridade estrutural entre LEC-1 e LDF-3. Sendo que, enquanto LDF-3 apresentava uma
ligação dupla entre C-2 e C-3; LEC-1 apresentava estas posições reduzidas e com a presença
de uma hidroxila em C-3.
A partir dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na
literatura (AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LEC-1 a estrutura de um flavonóide do
tipo flavanonol, registrado na literatura como taxifolina (Figura 107, p.148).
148
OLIVEIRA, F.C.
Figura 107 - Estrutura química de taxifolina (LEC-1)
O
O H
OH
OH
O H
O
O H
2
34
5
6
7
8
10
1 '
2 '3 '
4 '
5 '
6 '9
Embora a substância taxifolina (LEC-1) já tenha sido relatada na literatura
(HEEMANN et al., 2006), ainda não foi relatada na literatura para o gênero Lippia
(Verbenaceaea), sendo este o primeiro relato de isolamento para o gênero Lippia.
Tabela 27 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,
13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEC-
1, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)
HSQC HMBC Taxifolina
C δC δH 2JCH
3JCH δ
13C
2 85,5 5,01 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-3 H-2’; H-6’ 85,3
3 74,1 4,61 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-2 74,0
4 199,1 H-3 H-2 198,8
5 165,9 11,71 (1H, s) H-6 165,6
6 98,1 5,99 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 97,7
7 168,9 H-8; H-6; 169,1
8 97,0 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 96,7
9 165,1 H-8 164,9
10 102,5 H-3; H-6 102,2
1’ 130,7 H-2; H-2’;
H-6’
H-3;H-3’;
H-5’
129,6
2’ 116,9 7,07 (1H, d, J = 2,0Hz) H-3’ H-2; H-6’ 130,7
3’ 146,7 H-2’ H-5’ 116,5
4’ 147,6 H-2’; H-6’ H-3’; H-5’ 159,5
5’ 116,8 6,86 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ H-3’ 116,5
6’ 121,8 6,91 (1H, dd, J = 8,4 e 2,0
Hz)
H-5’ H-2; H-2’ 130,7
149
OLIVEIRA, F.C.
Figura 108 - Espectro de RMN 1H de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 109 - Espectro de RMN 13
C de LEC-1 (acetona-d6, 125 MHz)
5’
6
10
8
2
3
6’
1’
9 5
7
4
4’ 3’
2’
2’ 3
8 6
OH-5
6’
5’
2
150
OLIVEIRA, F.C.
Figura 110 - Espectro de RMN 1H,
1H-COSY de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)
Figura 111 - Espectro de RMN 1H,
13C-HSQC de LEC-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
6’
5’ 6
6
5’
2
8
2’
6’ 2’
8
3
6H 6C
8H 8C
3H 3C
5’H 5’C
2’H 2’C
6’H 6’C
2H 2C
151
OLIVEIRA, F.C.
Figura 112 - Espectro de RMN 1H,
13C-HMBC de LEC-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)
1
2
5
6
7
8 10
12 4
3
9 11
13
14
16
15
O
OH
OH
H
H
O H
H
H
H O H
O HO
H
H
4
2
3
1
5
9
8
1011
5
7
6
12
14
13
15 16
152
OLIVEIRA, F.C.
4.2 Caracterização da composição química do óleo essencial das folhas de L. rigida
O óleo essencial das folhas de L. rigida, obtido por hidrodestilação, apresentou
um rendimento de 0,18% (v/m). A Tabela 28, mostra a identificação e a quantificação relativa
dos constituintes químicos do óleo.
Tabela 28 - Composição química do óleo essencial das folhas de L. rigida Schauer
IK* Indice de Kolvats calculado IK#
Indice de Kolvats da literatura
Composto IK* IK# % Relativo
CG-DIC
α-Pineno 956 944 2,1
Limoneno 1035 1031 0,8
Trans-β-ocimeno 1048 1043 1,5
Linalol 1095 1096 3,3
Nerol 1230 1229 0,5
Ácido Nerólico 1314 1316 2,7
Acetato nerila 1364 1362 0,3
α-Cubebeno 1373 1380 0,3
Acetato geranila 1382 1383 0,8
α-Copaeno 1400 1394 2,8
β-Cariofileno 1441 1443 13,0
β-Cubebeno 1449 1449 0,7
E-β-Farneseno 1465 1460 0,9
α-Humuleno 1471 1460 42,3
Alloaromadendreno 1479 1481 1,8
α-Amorfeno 1489 1485 1,7
Germacreno-D 1495 1499 8,6
Biciclogermacreno 1509 1500 3,9
γ-Cadineno 1522 1523 0,6
δ-Cadineno 1529 1530 2,9
trans-nerolidol 1556 1561 0,4
Espatulenol 1573 1572 0,6
Óxido de cariofileno 1579 1580 1,1
δ-Cadinol 1625 1636 0,5
Total 94,1
153
OLIVEIRA, F.C.
Segundo a Tabela 28, p. 152, foram identificados um total de 24 constituintes
(94,1%), sendo 11,2% de monoterpenos e 82,9% de sesquiterpenos. Os sesquiterpenos α-
humuleno (42,3%) e β-cariofileno (13,0%) foram identificados como componentes
majoritários. De acordo com a literatura os constituintes mais comuns encontrados em óleos
essenciais de plantas do gênero Lippia são limoneno, β-cariofileno, p-cimeno, cânfora, linalol,
α-pineno e timol (PASCUAL et al., 2001)
A presença do sequiterpeno α-humuleno como componente majoritário em óleos
essenciais de espécies do gênero Lippia, só foi relatada apena para a espécie Lippia aff.
microphylla (SILVA et al., 2010). Geralmente o α-humuleno é enconrado em pequenas
concentrações em espécies do gênero Lippia. Para a espécie L. gracilis o teor de α-humuleno
está abaixo de 1% (MENDES et al., 2010), enquanto que para óleos essenciais de diversas
espécies de Lippia da Colômbia, o teor de α-humuleno varia entre 1,0 e 6% (ESCOBAR et
al., 2010).
O cromatograma e os espectros de massa dos constituintes químicos identificados
do óleo essencial das folhas de L.rigida estão ilustrados nas figuras 113-138 (p. 153-157).
Figura 113 - Cromatograma da análise de OEFLR por CG/EM
Figura 114 - Espectro de massa do α-pineno
154
OLIVEIRA, F.C.
Figura 115 - Espectro de massa do limoneno
Figura 116 - Espectro de massa do trans-β-ocimeno
Figura 117 - Espectro de massa do linalol
O H
Figura 118 - Espectro de massa do nerol
O H
Figura 119 - Espectro de massa do ácido nerolico
O HO
Figura 120 - Espectro de massa do acetato nerila
O
O
Figura 121 - Espectro de massa do α-cubebeno
155
OLIVEIRA, F.C.
Figura 122 - Espectro de massa do acetato de geranila
O
O
Figura 123 - Espectro de massa do α-copaeno
Figura 124 - Espectro de massa do β-cariofileno
Figura 125 - Espectro de massa do β-cubebeno
Figura 126 - Espectro de massa do E-β-farneseno
Figura 127 - Espectro de massa do α-humuleno
Figura 128 - Espectro de massa do alloaromadendreno
156
OLIVEIRA, F.C.
Figura 129 - Espectro de massa do α-amorfeno
Figura 130 - Espectro de massa do germacreno-D
Figura 131 - Espectro de massa do biciclogermacreno
Figura 132 - Espectro de massa do γ-cadineno
H
H
Figura 133 - Espectro de massa do Δ-cadineno
Figura 134 - Espectro de massa do trans-nerolidol
O H
Figura 135 - Espectro de massa do espatulenol
O H
157
OLIVEIRA, F.C.
Figura 136 - Espectro de massa do óxido de cariofileno
OH
H
Figura 137 - Espectro de massa do δ-cadinol
O H
Figura 138 – Espectros de massa dos compostos não identificados
158
OLIVEIRA, F.C.
159
OLIVEIRA, F.C.
5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
5.1 Material botânico
As folhas e o caule de L. rigida foram coletados em junho de 2010 no município
de Mucugê-BA, pelo professor Dr. Edilberto R. Silveira. A identificação botânica foi
realizada pela professora Ms. Maria Lenise Silva Guedes do Departamento de Botânica da
Universidade Federal da Bahia. A exsicata n° 1240, representando a coleta encontra-se
depositada no Herbário Alexandre Leal Costa (ALCB).
5.2 Métodos cromatográficos
5.2.1 Cromatografia de adsorção
Para o fracionamento dos extratos brutos e frações, bem como a separação e
purificação de substâncias, foram utilizadas cromatografias de adsorção em coluna aberta
(CCA) utilizando-se como suportes gel de sílica 60 (70-230 mesh), silica para cromatográfia
“flash” (230-400 mesh) e gel de dextrana Sephadex® LH-20. Os eluentes utilizados nas
separações foram: hexano, diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt), clorofórmio
(CHCl3), metanol (MeOH) e água (H2O), puros ou em misturas, sendo todos da marca Synth.
O monitoramento das frações obtidas após os processos cromatográficos foi
realizado por cromatografia em camada delgada, CCD, (gel de sílica 60 F254 = 0,2 mm) em
folhas de alumínio da marca Merck®. Como revelador não destrutivo foi utilizada a radiação
ultravioleta no comprimento de onda de 365 nm, e como destrutiv o solução ácida de vanilina.
As placas foram cortadas nas dimensões apropriadas para cada situação de
análise. A amostra foi aplicada por meio de um tubo capilar a uma altura de ≈ 0,9 cm com
uma distância de ≈ 0,3 cm de uma para a outra.
Para cromatografia de adsorção em coluna sob baixa pressão (flash) utilizou-se
sílica gel 60 (0,040 – 0,063 mm; 230 – 400 mesh) da Merck®. O diâmetro e o comprimento
das colunas variaram de acordo com as quantidades das amostras e com valores de Rf. Para a
eluição sob baixa pressão, utilizou-se um sistema adaptado com bomba compressora do
fabricante NS Indústria de Aparelhos Médicos Ltda. referência R-60.
160
OLIVEIRA, F.C.
5.2.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi realizada em equipamento
da marca Shimadzu®, constituído por três bombas de alta pressão, modelo Shimadzu
® LC-
20AT e um detector Shimadzu® SPD-M20A. Nas separações foram usadas uma coluna
Phenomenex® RP-18 (250 x 10 mm, 5 μm), mantida num forno a temperatura ambiente.
Foram empregados solventes de grau CLAE [MeOH, CH3CN (Tedia®
) e H2O (Milli-Q®
)]
que foram filtrados através de membranas de nylon com poros de 0,45 μm (Phenomex®
). As
amostras foram dissolvidas nas fases móveis empregadas em cada análise e filtradas em
membranas de teflon com poros de 0,45 μm (Waters®).
5.3 Métodos físicos
Os dados espectrais deste trabalho foram obtidos nos equipamento da Central
Analítica do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do
Ceará.
5.3.1 Ponto de fusão
Os pontos de fusão das substâncias isoladas foram determinados em equipamentos
de microdeterminação digital da Mettler Toledo® com placa aquecedora FP82HT e uma
central de processamento FP90. As determinações foram realizadas a uma velocidade de
aquecimento de 2 ºC/min e não foram corrigidos.
5.3.2 Rotação óptica [α]D
As rotações ópticas foram obtidas em polarímetro 341 da Perkin-Elmer®
,
operando a 589 nm, a temperatura de 25 ºC e utilizando uma cubeta de 5 mL.
161
OLIVEIRA, F.C.
5.4 Métodos espectrométricos e espectroscópicos
5.4.1 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 (RMN 13
C), uni e bidimensionais, foram
obtidos em espectrômetro Bruker®, modelo Avance DRX-500, operando na freqüência de 500
MHz para o hidrogênio e na frequência de 125 MHz para o carbono, localizado no Centro
Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal
do Ceará (CENAUREMN-UFC).
Os solventes deuterados utilizados na dissolução das amostras e obtenção dos
espectros foram: acetona [(CD3)2CO], piridina (C5D5N) e metanol (CD3COD). Seus
deslocamentos químicos (δ) foram expressos em parte por milhão (ppm) e referenciados nos
espectros de RMN 1H pelos picos dos hidrogênios pertencentes as moléculas residuais não-
deuteradas (δH, 2,06), (δH, 8,71; 7,55 e 7,19) e (δH 3,31), respectivamente. Nos espectros de
carbono 13, os deslocamentos químicos foram referenciados pelos picos dos carbonos-13 (δC
206 e 30,2), (δC 150,3; 135,9 e 123,9) e (δC 49,2), respectivamente.
As multiplicidades das absorções foram indicadas segundo a convenção: s
(singleto), d (dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto), ddd (duplo dubleto dubleto) e m
(multipleto).
O padrão de hidrogenação dos carbonos no espectro de RMN 13
C foi determinado
através do emprego da técnica DEPT (Distortionless Enhacement by Polarization Transfer),
com ângulo de nutação (θ) de 135º com CH e CH3 com amplitude em oposição aos CH2, e foi
descrito conforme a convenção: C (carbono não hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2
(carbono metilênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não hidrogenados foram
caracterizados pela subtração dos espectros de DEPT 135º e do espectro BB (Broad Band),
além das correlações dos espectros de HMBC e HSQC.
5.4.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV)
Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em Espectrômetro Perkin
Elmer®, modelo FT-IR Espectrum 1000, utilizando-se pastilhas de KBr para análise das
amostras.
162
OLIVEIRA, F.C.
5.5 Estudo dos constituintes não voláteis de L. rigida
5.5.1 Preparação dos extratos
As folhas (1,6 kg) e caule (3,1 kg) de L. rigida, secos à temperatura ambiente e
triturados, foram submetidos à extração com hexano seguido de etanol em intervalos de 24 h
(Fluxograma 1). As soluções resultantes das extrações foram filtradas e concentradas sob
pressão reduzida em evaporador rotativo, fluxograma 1.
Fluxograma 1 - Obtenção dos extratos hexânico e etanólico das folhas e do caule de L.
rigida.
5.5.2 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida (LEF)
Parte do extrato LEF (23,0 g) foi adsorvido em 40 g de gel de sílica, pulverizada
em gral de porcelana e acondicionada sobre 203 g de gel de sílica em coluna cromatográfica
de 6,3 cm de diâmetro. Os solventes usados na eluição durante o fracionamento foram hexano
(2500 mL), diclorometano (3000 mL), acetato de etila (2800 mL) e metanol (1800 mL) puros
e em ordem crescente de polaridade. Após evaporação dos solventes, sob pressão reduzida em
evaporador rotativo, às massas foram sumarizadas na Tabela 29, p.163.
Material Botânico
Folhas (1,6 kg); caule (3,1 kg)
1.Pulverização 2. Extração com hexano (3x) 3. Evaporação do solvente
Extrato Hexânico (LHF) 13,0 g; (LCH) 25,1 g
(25,13 g)
Torta
1. Extração com etanol (3x)
2. Evaporação do solvente
Extrato Etanólico
(LEF) 45,0 g; (LEC) 51,0 g
Resíduo
163
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 29 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das
folhas (LEF)
Eluente Fração Massa (mg) Rendimento (%)
Hexano LEFH 465,0 2,0
Diclorometano LEFD 3916,0 17,0
Acetato de etila LEFA 12108,0 52,6
Metanol LEFM 1978,0 8,6
Total 18467,0 80,3
5.5.3 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico do caule de L. rigida (LEC)
Parte do extrato LEC (32,3 g) foi adsorvido em 35,0 g de gel de sílica,
pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 202 g de gel de sílica em coluna
cromatográfica de 6,3 cm de diâmetro. Os solventes usados na eluição durante o
fracionamento foram hexano (2300 mL), diclorometano (3000 mL), acetato de etila (2800
mL) e metanol (1900 mL) puros e em ordem crescente de polaridade. Após evaporação dos
solventes, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, as massas foram sumarizadas na
Tabela 30.
Tabela 30 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das
folhas (LEC)
Eluente Fração Massa (mg) Rendimento (%)
Hexano LECH 146,0 0,4
Diclorometano LECD 1768,0 5,5
Acetato de etila LECA 5738,0 17,8
Metanol LECM 21186,0 65,8
Total 28838,0 89,5
5.5.4 Fracionamento cromatográfico da fração LEFD e isolamento de LEF-1 e LEF-2
Parte da fração LEFD (3,0 g) foi adsorvida em 5,4 g de gel de sílica, pulverizada
em gral de porcelana e acondicionada sobre 55 g de gel de sílica em coluna cromatográfica de
2,4 cm de diâmetro (Fluoxograma 2, p. 166). Os solventes usados na eluição foram
diclorometano e metanol em misturas binárias, em ordem crescente de polaridade, além de
164
OLIVEIRA, F.C.
metanol puro. Foram obtidas 58 frações de 10 mL cada, que foram concentradas a
temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 31.
Tabela 31 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
CH2Cl2/MeOH 10% 1-16 1-5 0,6
CH2Cl2/MeOH 20% 17-29 6-10 266,5
CH2Cl2/MeOH 30% 30-41 11-15 1608,0
CH2Cl2/MeOH 40% 42-50 16-20 915,2
MeOH 100% 51-58 21-26 50,9
27-28 10,2
29-30 7,5
31-33 12,5
34-58 12,0
Total 2883,4
A fração LEFD-11-15 (1,608 g) foi recromatografada por cromatografia de
exclusão em gel de dextrana Sephadex® LH-20 em coluna (2,8 cm de diâmetro e 39 cm de
altura). A eluição foi feita com metanol e foram coletadas 47 frações de 10 mL, que após
análise por CCD foram reunidas como descrito na Tabela 32.
Tabela 32 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico por exclusão de LEFD-(11-15)
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
Metanol 48 1-11 31,3
12-14 128,0
15-19 97,0
20-26 241,7
27-29 388,0
30-36 177,0
37-40 2,2
41-48 3,4
Total 1068,6
165
OLIVEIRA, F.C.
A fração LEFD-(11-15)-(30-36) (177 mg) foi adsorvida em 4,7 g de sílica “flash”,
pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 26,6 g de sílica para cromatografia
“flash” em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa pressão.
O solvente usado na eluição isocrática foi hexano/acetato de etila 30% (500 mL). Foram
obtidas 51 frações de aproximadamente 10 mL cada, que foram reunidas após análise em
CCD, como descrito na Tabela 33. A fração (8-9) apresentou 59 mg de um sólido amorfo
amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LEF-1.
Tabela 33 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(30-36) e
isolamento de LEF-1
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
Hexano/AcOEt 30% 1-51 1-7 8,7
8-9 59,0
10-17 57,8
18-49 41,9
Total 167,4
A fração LEFD-(11-15)-(27-29) 388,0 mg foi adsorvida em 6,3 g de sílica para
cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 106 g de gel
de sílica em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa pressão
Os solventes usados na eluição durante o fracionamento foram hexano, acetato de etila e
metanol, puros ou em misturas binárias. Foram obtidas 67 frações de 10 mL cada, que foram
reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 34. A fração (10-13) apresentou 6
mg de um sólido amorfo amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LEF-2.
Tabela 34 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(27-29) e
isolamento de LEF-2
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
Hexano/AcOEt 20% 1-13 1-5 2,5
Hexano/AcOEt 30% 14-22 6-7 4,7
Hexano/AcOEt 40% 23-32 8-9 3,4
Hexano/AcOEt 50% 33-41 10-13 6,0
Hexano/AcOEt 60% 42-50 14-18 79,6
AcOEt 100% 51-59 19-25 223,0
MeOH 60-67 26-67 54,3
Total 373,5
166
OLIVEIRA, F.C.
Fluxograma 2 - Fracionamento cromatográfico da fração LEFD, isolamento de LEF-1 e
LEF-2
5.5.5 Fracionamento cromatográfico da fração LEFA e isolamento de LEF-3, LEF-4 e
LEF-5
Parte da fração LEFA (4,2 g) foi submetida à fracionamento por exclusão
molecular em gel de dextrana de Sephadex® LH-20 em coluna cromatográfica (ф = 2,8 cm e
39 cm de altura) (Fluxograma 3, p. 169). A eluição foi feita com metanol e foram coletadas 96
frações de 10 mL, que após análise por CCD foram reunidas, como descritas na Tabela 35 (p.
167).
LEFD
(3,02 g)
LEFD-(11-15)
(1608,0 mg)
Demais frações (1008,0 g)
Demais frações (267,0 mg)
Coluna cromatográfica
Coluna Sephadex LH-20
Demais frações (520,0 mg)
Demais frações (3,5 mg)
LEFD-(27-29)
(484,0 mg)
LEFD-(30-36)
(177,0 mg)
Coluna “flash”
LEF-1
(59,0 mg)
Demais frações (97,0 mg)
Demais frações (8,7 mg)
Coluna “flash”
LEF-2
(6,0 mg)
Demais frações (366,9 mg)
Demais frações (10,6 mg)
167
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 35 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFA por exclusão
molecular em gel de dextrna Sephadex® LH-20
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
Metanol 1- 96 1-11 6,4
12-20 26,2
21-25 131,0
26-29 72,9
30-33 174,0
34-35 255,0
36-54 3083,0
55-58 3,2
59-70 21,0
71-76 47,0
77-80 5,0
81-84 7,7
85-89 5,2
90-96 8,5
Total 3846,5
Uma alíquota da fração LEFA-(36-54) 3,1 g foi adsorvida em 8,7 g de sílica para
cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 51,3 g de
sílica “flash” em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa
pressão. Os solventes usados na eluição durante o fracionamento foram diclorometano,
acetato de etila e metanol em misturas ternárias. Foram obtidas 161 frações de 10 mL cada,
que foram reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 36.
Tabela 36 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFA-(36-54)
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 89/10/1 % 1- 34 1-4 1,9
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 88/10/2 % 35-56 5-9 32,5
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 84/13/3 % 57-68 10 29,6
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 80/15/5 % 69-76 11 26,7
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 70/20/10 % 77-86 12-27 1183
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 60/25/15 % 87-98 28-47 666,7
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 50/30/20 % 99-108 29-35 5,6
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 40/35/25 % 109-119 36-42 5,7
CH2Cl2/AcOEt/MeOH 30/40/30 % 120-130 43-59 22,4
AcOEt/MeOH 50/50 % 131-139 60-79 42,5
MeOH 100% 140-161 80-99 30,3
100-128 11,7
129-147 9,8
148-161 6,5
Total 2074,9
168
OLIVEIRA, F.C.
Uma alíquota de 360,0 mg da fração LEFA-(77-86) foi analisada por CLAE, em
coluna semi-preparativa (C-18) em condições de fase reversa utilizando-se MeOH/H2O
(80:20) como fase móvel em modo isocrático, empregando-se um fluxo de 4,5 mL/min. O
cromatograma (Figura 139) exibiu seis picos a 284 nm. A fração referente ao pico 2 (250,0
mg; tR = 3,7 min) foi denominada LEF-3, ao pico 3 (42,1 mg; tr = 4,2 min) foi denominada
LEF-4 e ao pico 5 (7 mg; tr = 6,9 min) foi denominado de LEF-5.
Figura 139 – Cromatograma de análise da fração LEFA-(36-54)-(12-27) por CLAE, em
condições de fase reversa (MeOH/H2O 80:20, fluxo 4,5 mL/min e λ = 284 nm).
LEF-3
LEF-4
LEF-5
169
OLIVEIRA, F.C.
Fluxograma 3 – Fracionamento cromatográfico de LEFA e isolamento de LEF-3, LEF-4 e
LEF-5
5.5.6 Obtenção do óleo essencial e decocto das folhas de L. rigida
As folhas secas de L. rigida (424 g) foram trituradas mecanicamente e submetida
à extração por hidrodestilação (Fluxograma 4, p. 170) por 2 h em aparelho tipo Cleavenger
modificado. O óleo coletado foi seco com sulfato de sódio anidro (Na2SO4), acondicionado
em frasco de vidro âmbar hermeticamente fechado e armazenado sob refrigeração em freezer
para análise posterior. A solução aquosa resultante foi filtrada e concentrada sob pressão
reduzida em evaporador roatativo, rendendo 63,0 g de decocto que foi denominado LDF.
Demais frações
666,0 mg
LEFA-(36-54)
3080,0 mg
Demais frações
98,0 mg
LEFA
4,2 g
Coluna Sephadex LH-20
Demais frações
64,0 mg
LEFA-(36-54)-12-27)
360,0 mg
Demais frações
801,0 mg
Coluna “flash”
LEF-5
15,9 mg
Demais frações
8,0 mg
CLAE
LEF-3
250,0 mg
LEF-4
42,1 mg
Demais frações
39,0 mg
170
OLIVEIRA, F.C.
Fluxograma 4 - Extração do óleo essencial e obtenção do decocto das folhas de L. rigida
5.5.7 Análise química do óleo essencial por CG-EM e CG-DIC
A análise do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a
espectrômetro de massas (CG-EM) Shimadzu®
modelo QP-2010, equipado com coluna
capilar DB-5 (J W Scientific®, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) e detector série 5973 nas
seguintes condições operacionais: gás carreador hélio, fluxo de gás de 0,87 mL/min, razão de
split 1:100, temperatura programada inicial de 60 ºC por 3 min, taxa de aquecimento de 15
ºC/min até 290 ºC, temperatura do injetor de 280 ºC e temperatura da interface de 280 ºC. A
energia de ionização foi de 70 eV, o volume da amostra de 0,5 µL (CH2Cl2), modo varredura
com velocidade de 1,0 scan/s e intervalo de aquisição de 40 a 400 m/z.
A quantificação relativa dos constituintes foi realizada por CG-DIC em aparelho
Shimadzu®, modelo QP-2010, utilizando coluna capilar DB-5 (J W Scientific, 20 m x 0,18
mm x 0,25 µm), gás de arraste hélio, fluxo de gás de 1,0 mL/min, volume de injeção da
amostra de 1,0 µL (solução de 1,0 mg/mL de óleo em CH2Cl2) e razão de split 1:30. As
temperaturas do injetor e do detector foram fixadas em 220 e 280 °C, respectivamente e a
Material Botanico
(Folhas)-424,0 g
Óleo + hidrolato Folhas + solução aquosa
Hidrodestilação
Fase aquosa Fase orgânica
Óleo essencial
(OEFLR)-767,9 mg
Separação
1. Na2SO4
2. Filtração
Identificação
Análise por CG-EM e CG-DIC
Decocto (LDF)
(63,0 g)
Concentração sob
pressão reduzida
171
OLIVEIRA, F.C.
temperatura do forno foi programada a partir de 60-280 °C a 3 °C/min, mantendo-se 10 min a
280 °C no final da análise. A quantificação percentual relativa dos constituintes foi
determinada com base na área de cada pico em relação à área total dos picos no
cromatograma.
Cada componente do óleo essencial foi identificado com base no tempo de
retenção, índice de Kovats corrigido por regressão linear, bem como, por comparação do
padrão de fragmentação de cada componente com espectros de massa registrados na literatura.
5.5.8 Fracionamento por extração líquido-líquido de LDF
Parte do decocto LDF (41,6 g) foi solubilizada em 200 mL de MeOH/H2O na
proporção 4/6 e aquecida a uma temperatura de 40 °C. Em seguida foram feitas extrações
sucessivas com diclorometano (5 x 80mL), acetato de etila (5 x 80 mL) e n-butanol (5 x 80
mL). Após evaporação dos solventes, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, as massas
foram sumarizadas na Tabela 37.
Tabela 37 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do decoto das folhas de L.
rigida (LDF)
Eluente Fração Massa (mg) Rendimento (%)
Diclorometano LDFD 2014,0 4,8
Acetato de etila LDFA 11544,0 27,8
n-Butanol LDFB 8210,0 19,7
Total 21768,0 52,4
5.5.9 Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-1, LDF-2 e
LDF-3
Parte da fração LDFA (3,3 g) foi adsorvida em 5,4 g de gel de sílica, pulverizada em
gral de porcelana e cromatografada sobre 55 g de gel de sílica em coluna cromatográfica de
2,4 cm de diâmetro (Fluoxograma 5, p. 174). Os solventes usados na eluição foram
diclorometano e metanol em misturas binárias, em ordem crescente de polaridade, além de
metanol puro. Foram obtidas 89 frações de 10 mL cada, que foram concentradas a
temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 38, p. 172.
172
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 38 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDFA
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
CH2Cl2/MeOH 10% 1-15 1-12 11,1
CH2Cl2/MeOH 20% 16-30 13-14 53,0
CH2Cl2/MeOH 30% 31-42 15-18 86,2
CH2Cl2/MeOH 40% 43-52 19-23 162,0
CH2Cl2/MeOH 60% 53-59 24-39 1900,0
CH2Cl2/MeOH 80% 60-72 40-49 640,6
MeOH 100% 73-89 50-53 49,0
54-89 94,1
Total 2996,0
A fração LDFA-(40-49) (640,6 mg) foi recromatografada sobre 56,6 g de gel de
sílica, por cromatografia “flash” em coluna (2,3 cm de diâmetro e 35 cm de altura). Os
solventes usados na eluição foram diclorometano e metanol em mistura binária, além de
metanol puro, em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas 129 frações de 10 mL cada,
que foram concentradas a temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD, como
descrito na Tabela 39. A fração (12-16) apresentou 30,0 mg de um sólido amorfo amarelo,
solúvel em metanol, que foi denominado de LDF-1.
Tabela 39 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDFA-(40-49) e
isolamento de LFD-1
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
CH2Cl2/MeOH 5% 1-6 1-11 3,0
CH2Cl2/MeOH 10% 7-15 LDF-1 30,0
CH2Cl2/MeOH 15% 16-24 17-21 89,2
CH2Cl2/MeOH 20% 25-42 22-31 80,2
CH2Cl2/MeOH 30% 43-56 32-38 9,3
CH2Cl2/MeOH 40% 57-68 39-50 29,4
CH2Cl2/MeOH 50% 69-79 51-58 28,8
CH2Cl2/MeOH 60% 80-92 59-91 59,2
CH2Cl2/MeOH 80% 93-116 92-129
MeOH 100% 117-129
Total 309,1
173
OLIVEIRA, F.C.
A fração LDFA-(40-49)-(22-31) 80,2 mg foi adsorvida em 3,7 g de sílica para
cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 38 g de sílica
para cromatografia “flash” em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada
sobre baixa pressão. Como solventes de eluição foram usados diclorometano e metanol em
misturas binárias, em ordem crescente de polaridade, além de metanol puro. Foram obtidas
87 frações de 10 mL cada, que foram concentradas a temperatura ambiente e reunidas após
análise em CCD, como descrito na Tabela 40. A fração (11-17) apresentou 38,9 mg de um
sólido amorfo amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LDF-2 e a fração (38-48)
apresentou 9,0 mg de um sólido amorfo amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de
LDF-3.
Tabela 40 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDF-(40-49)-(22-31) e
isolamento de LFD-2 e LFD-3.
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
CH2Cl2/MeOH 5% 1-11 1-10 2,0
CH2Cl2/MeOH 10% 12-22 11-17 31,9
CH2Cl2/MeOH 15% 23-36 18-19 9,0
CH2Cl2/MeOH 20% 37-47 20-37 14,6
CH2Cl2/MeOH 30% 48-58 38-48 9,0
CH2Cl2/MeOH 50% 59-68 49-60 3,7
CH2Cl2/MeOH 80% 69-78 61-89 2,9
MeOH 100% 79-87
Total 73,1
174
OLIVEIRA, F.C.
Fluxograma 5 - Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-1,
LDF-2 e LDF-3
5.5.10 Fracionamento cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-1
Parte da fração LECA (5,3 g) foi submetida a fracionamento cromatográfico em
coluna (ф = 2,8 cm e 23 cm de altura) (Fluxograma 6, p. 177). A eluição foi feita com
diclorometano, acetato de etila e metanol, em misturas binárias e ternárias. Foram coletadas
61 frações de 10 mL, que após análise por CCD foram reunidas em 8 frações, como descrito
na Tabela 41, p. 175.
LDFA
(3,3 g)
LDFA-(40-49)
(640,6 mg)
Demais frações (143,1mg)
Demais frações (1912,0 mg)
Coluna cromatografica
Coluna flash
Demais frações (3,0 mg)
Demais frações (126,7 mg)
LDF-1
(30,0 mg)
LDF-(22-31)
(80,2 mg)
LDF-(17-20) (89,2 mg)
Coluna flash
LDF-2
(31,9 mg)
Demais frações (2,0 mg)
LDF-(18-37)
(23,6 mg)
Demais frações (6,6 mg)
LDF-3
(9,0 mg)
175
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 41 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA
Eluente Frações Frações
reunidas
Massa (mg)
CH2Cl2/Acetato de etila/MeOH 90/9/1 1-13 1-11 125,2
CH2Cl2/Acetato de etila/MeOH 80/18/2 14-20 12-14 120,5
CH2Cl2/Acetato de etila/MeOH 70/25/5 21-27 15-18 116,8
CH2Cl2/Acetato de etila/MeOH 60/30/10 28-34 19-20 88,9
CH2Cl2/Acetato de etila/MeOH 20/50/30 40-46 21-26 317,9
Acetato de etila/MeOH 60/40 47-53 27-28 130,0
MeOH 100% 54-61 29-31 172,9
32-61 3587,0
Total 4659,0
Uma alíquota da fração LECA-(32-61), 3587,0 mg, foi adsorvida em 4,7 g de
sílica para cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sob 52,3
g de sílica para cromatografia “flash” em coluna cromatográfica de 2,3 cm de diâmetro e
cromatografada sobre baixa pressão. Os solventes usados na eluição foram hexano, acetato de
etila e metanol puro, em misturas binárias e ternárias. Foram obtidas 97 frações de 10 mL
cada, que foram reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 42.
Tabela 42 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)
Eluente Frações Frações
reunidas
Massa (mg)
Hexano/Acetato de etila/MeOH 28/70/2 1-27 1-12 36,7
Hexano/Acetato de etila/MeOH 15/80/5 28-38 13-17 125,3
Hexano/Acetato de etila/MeOH 5/88/7 39-49 18-25 254,5
Acetato de etila/MeOH 90/10 50-58 26-30 526,1
Acetato de etila/MeOH 80/20 59-69 31-97 962,6
Acetato de etila/MeOH 50/50 70-80
Acetato de etila/MeOH 30/70 81-91
MeOH 100% 92-97
Total 1904,4
A fração LECA-(32-61)-(18-25), 254,5 mg, foi recromatografada, por
cromatografia de exclusão molecular em gel de dextrana de Sephadex® LH-20 em coluna (2,8
176
OLIVEIRA, F.C.
cm de diâmetro e 39 cm de altura). A eluição foi feita com metanol e foram coletadas 54
frações de 10 mL, que após análise por CCD foram reunidas, como descrito na Tabela 43.
Tabela 43 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-25)
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
Metanol 54 1-12 15,4
13-16 36,7
17-20 38,4
21-29 38,1
30 2,6
31-37 87,7
38-54 15,6
Total 234,5
A fração LECA-(32-61)-(18-25)-(31-37) 87,7 mg foi adsorvida em 3,3 g de sílica
para cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 33,3 g de
gel de sílica em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa
pressão. Os solventes usados na eluição foram diclorometano e metanol em misturas binárias,
em ordem crescente de polaridade, além de metanol puro. Foram obtidas 103 frações de 10
mL cada, que foram concentradas a temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD,
como descrito na Tabela 44. A fração (20-27) apresentou 60,0 mg de um sólido amorfo
amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LEC-1.
Tabela 44 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-25)-(31-
37)
Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)
CH2Cl2/MeOH 5% 1-12 1-16 2,0
CH2Cl2/MeOH 10% 13-24 17-18 3,0
CH2Cl2/MeOH 20% 25-33 19 2,0
CH2Cl2/MeOH 30% 34-43 20-27 60,0
CH2Cl2/MeOH 40% 44-54 28,54 2,3
CH2Cl2/MeOH 60% 55-65 55-103 3,1
CH2Cl2/MeOH 80% 66-76
MeOH 100% 77-103
Total 72,4
177
OLIVEIRA, F.C.
Fluxograma 6 - Fracionamento cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-1
Coluna Sephadex® LH-20
LECA
(5,3 g)
LECA-(32-61) (3587,0 mg)
Demais frações (1072,0 mg)
Coluna cromatografica
Coluna “flash”
Demais frações (162,0 mg)
Demais frações (1488,0 mg)
LECA-(18-25)
(254,5 mg)
Demais frações (131,2 mg)
Demais frações (15,6 mg)
LECA-(31-37)
(87,7 mg)
Demais frações (7,0 mg)
Demais frações (5,4 mg)
LEC-1
(60,0 mg)
178
OLIVEIRA, F.C.
6. ATIVIDADES BIOLOGICAS
6.1 Ensaio de atividade de citotoxicidade in vitro frente à linhagem de células
cancerígenas.
A investigação de citotoxicidade do óleo essencial das folhas de L. rigida foi
realizada com 3 linhagens tumorais (MDA-MB435, HCT-8 e SF-295) pelo método de
redução do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo tetrazolina (MTT), seguida de
análise colorimétrica. As amostras foram testadas em triplicatas e em dose única de 50 µg/mL
para determinação do percentual de inibição do crescimento celular.
O óleo essencial apresentou boa atividade de citotoxicidade contra as linhagens de
células cancerígenas MDAMB-435, HCT-8 e SF-295, com IC% de 83,79; 86,80 e 79,41%,
respectivamente. De acordo com a literatura, os componentes majoritários do óleo (α-
humuleno e β-cariofileno) apresentam atividade citotóxica. Bem como os sequiterpenos
germacreno-D (8,6%) e α-copaeno (2,8%) também apresentam atividade citotóxica (WRIGHT
et al., 2007) e um efeito de sinergia dos constituintes poderia estar contribuindo para a
atividade citotóxica do óleo essencial de L. rigida.
Os ensaios de citotoxicidade dos extratos e dos flavonóides isolados foram
realizados somente com a linhagem de célula HCT-8 (cólon) em concentração única de 50
μg/mL. De acordo com a Tabela 45, p.179, somente os flavonoides LEF-1 (sakuranetina);
LDF-3 (quercetina) e LEF-4 (7-metoxi aromadendrina) apresenteram atividade citotóxica
significativa. O flavonoide LEF-4, com 94,74% de IC pode ser considerada uma substância
com elevada citotoxicidade e com potencial de atividade anticâncer.
O ensaio de atividade citotoxicidade frente a linhagem de células cancerígenas foi
realidado no Laboratório de Oncologia Experimental, sob a supervisão da profesora Dra.
Letícia V. Costa-Lotufo do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC.
179
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 45 - Percentual de inibição do crescimento celular de amostras testadas em
concentração única (50 μg/mL) frente à linhagem de células tumorais HCT-8 (cólon)
6.2 Ensaio de atividade larvicida com o óleo essencial das folhas de L. rigida
No ensaio de atividade larvicida, os ovos de A. aegypti foram eclodidos em água
isenta de cloro à temperatura ambiente. Em condições normais, os ovos maduros eclodem
quando submersos em meio líquido e apresentam quatro estágios larvários, sendo
selecionadas larvas de estágio 3 para serem utilizadas nos ensaios.
Em um béquer de 50 mL, à temperatura ambiente, as amostras testadas, em
diferentes concentrações (12,5 µg/mL a 500 µg/mL) foram dissolvidas em 0,3mL de DMSO e
a cada solução foram adicionadas 50 larvas de estágio 3, completando-se o volume para 20
mL com água. Após 24 horas, à temperatura ambiente, as larvas mortas foram contadas e
calculada a percentagem letal e posteriormente a CL50. Os testes foram feitos em triplicatas.
Utilizando-se como controle negativo a solução DMSO 1,5%. O ensaio foi realizado no
Laboratório de Entomologia do Núcleo de Endemias da Secretária de Saúde do Estado do
Ceará, sob coordenação da prof.ª Dra. Gilvandete Maria Pinheiro Santiago.
A investigação da atividade larvicida do óleo essencial de L. rigida contra as
larvas do mosquito A. aegypti revelou uma CL50 de 138,9 ± 1,2 μg/mL, que pode ser
considerada uma atividade moderada.
Amostra 50 μg/mL Amostra 50 μg/mL
% Inibição % Inibição
LCH -12,35% LEF-4 94,74%
LCA 2,60% LEF-6 49,40%
LCE 1,74% LEC-1 65,75%
LEF-1 73,76% LDF-1 49,78%
LEF-2 4,27% LDF-2 65,37%
LEF-3 30,87% LDF-3 76,07%
180
OLIVEIRA, F.C.
6.3 Ensaio de atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase
A inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), foi realizada segundo a
metodologia descrita por ELLMAN (ELLMAN, 1961), modificada por RHEE (RHEE et al.,
2001). Neste ensaio, as amostras, forma testadas nas concentrações de 4 mg/mL para extratos
e de 2 mg/mL para óleo essencial, substâncias isoladas e do controle positivo (fisoestigmina).
As amostras foram aplicadas em CCD (Silicagel 60 F254, 0,2 mm Merck) por meio de um
capilar de vidro e deixadas em repouso até a evaporação do solvente. Em seguida, pulverizou-
se a placa com uma solução contendo o substrato (ATCI, 1mM e tampão 1) e o reagente de
Ellman (ácido 5,5’-ditiobis-[2-nitrobenzóico], DTNB, 1mM em tampão 1) e aguardou-se a
secagem da placa durante 3 a 5 minutos. Após esse tempo borrifou-se a enzima AChE na
concentração de 3 U/mL em tampão 1. Decorridos 7 minutos, a cromatoplaca desenvolveu
uma coloração amarela, com o aparecimento de halo branco em torno dos “sports” das
amostras onde houve inibição da enzima, cujos diâmetros foram imediatamente medidos. Em
virtude de sua eficácia o método de Ellman tem sido rotineiramente empregado, como ensaio
preliminar, na avaliação da atividade de metabólitos secundários sobre a enzima AChE.
O ensaio de atividade de inibição da enzima acetilcolinesterase foi realizado no
Laboratório de Pesquisa em Química (LPQ), sob a supervisão da Profa. Dra. Jane Eire Silva
Alencar de Menezes, do Curso de Química - Faculdade de Educação de Itapipoca (FACEDI),
Universidade Estadual do Ceará – UECE.
Conforme a Tabela 46, p.181, os extratos (LEC e LDF) e as substâncias LEF-1
(sakuranetina), LDF-2 (canferol) e LEC-1 (taxifolina), apresentaram bons resultados, quando
comparados com o padrão fisostigmina.
O óleo apresentou um halo de inibição de 9 mm, o mesmo apresentado pela
fisoestigmina (controle positivo). A elevada atividade apresentada pelo óleo de L. rigida pode
estar relacionada com a presença dos constituintes α-humuleno, limoneno, α-pineno e linalol,
os quais apresentam ação inibitória da AChE descrita na literatura (HOWES e HOUGHTON,
2003; PERRY et al., 2003).
181
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 46 – Medida do halo de inibição da enzima acetilcolinesterase
Amostra Halo de inibição (mm) Amostra Halo de inibição (mm)
LEC 7 LEF-5 Negativo
LDF 8 LDF-2 8
LEF Negativo LDF-3 Negativo
LEF-1 8 LEC-1 8
LEF-2 Negativo OEFLR 9
LEF-3 Negativo Fisostigmina
(padrão)
9
LEF-4 7
6.4 Ensaio de atividade de citotoxicidade frente Artemia salina
O ensaio de toxicidade foi realizado, utilizando-se a metodologia de Meyer. Os
cistos de Artemia salina foram mantidos por 24 h em um aquário com água do mar artificial
(38 g/L) filtrada, sob aeração suave e iluminação intensa, até a eclosão dos naupilus. Dez
naupilus de Artemia salina foram transferidos para cada um dos frascos contendo água do mar
artificial/DMSO 1% (v/v) e as amostras a serem testadas em quatro concentrações diferentes
(1000; 100; 10 e 1 ppm). Os frascos foram mantidos sob iluminação e a contagem dos
naupilus mortos e vivos foi realizada após 24 h. como controle positivo utilizou-se a cafeína e
como controle negativo utilizou-se a solução de água do mar artificial com DMSO 1%. As
análises foram feitas em triplicatas e utilizou-se o método de Probitos de análise para
obtenção dos valores DL50 (HOWES e HOUGHTON, 2003).
De acordo com a Tabela 47, p.182, os extratos etanólicos do caule e das folhas
LEC e LEF apresentaram valores de DL50 892,92 e 67,67, respectivamente. Já o extrato
obtido do decocto das folhas (LDF) apresentou uma DL50 de 78,91 μg/mL. O óleo essencial
das folhas (OEFLR) se mostrou bastante ativo com uma DL50 de 18,9 μg/mL. Desta forma, a
elevada citotoxicidade apresentada pelo óleo essencial corrobora a atividade de citotoxicidade
apresentada frente à linhagens de células cancerígenas.
182
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 47 - Percentual de citotoxicidade frente as larvas de Artemia salina.
Amostra DL50 (µg/mL)
LEC 892,92
LDF 78,91
LEF 67,67
OEFLR 18,9
Cafeína
(padrão)
280,9
6.5 Ensaio de atividade antioxidante
O método utilizado para avaliar a atividade antioxidante foi DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazil) (Figura 154)(YEPEZ et al., 2002). Sendo que em um tubo de ensaio, colocou-
se 3,9 mL de uma solução metanólica de radical livre DPPH 6,5 x 10-5
M de coloração roxa.
Em seguida adicionou-se ao tubo 0,1 mL da solução metanólica do óleo essencial (0,1 g/mL)
a ser testado. Mediu-se a absorbância em um espectrofotômetro ajustando-se a um
comprimento de onda de 515 nm no intervalo, de 0 até 60 minutos. Não se observou o
desaparecimento da coloração do DPPH na presença de substâncias antioxidantes.
A atividade antioxidante de óleos essenciais é determinada através da sua
capacidade de sequestar o radical DPPH onde se calcula o potencial de inibição do DPPH da
amostra em percentagem (PI%) usando-se a formula:
P I
A D P P H A a m ostra
A D P P H
x 100
Sendo ADPPH a absorbância inicial da solução de DPPH e AAMOSTRA a absorbância final,
decorridos 60 minutos. A leitura é feita na proporção molar eugenol/DPPH de 0,5.
Figura 140 - Estrutura química do radical livre DPPH
N N
O 2 N
O 2 N
NO 2
183
OLIVEIRA, F.C.
O ensaio de atividade antioxidante foi realidado no Laboratório Produtos Naturais
e Biotecnologia, sob a supervisão da profesora Dra. Telma Leda Gomes de Melo, do
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, da UFC.
O óleo essecnial foi submetido ao ensaio de atividade antioxidade, porém se
mostrou inativo. Os metabolitos secundários não foram testados porque já havia relato na
literatura, para todos os compotos isolados.
6.6 Ensaio de atividade nematicida
As massas de ovos de nematóides (Meloidogyne incogna) foram extraídas de das
raízes de Vernonia sp e colocados em uma placa de Petri de 5 cm de diâmetro, durante 24 h
em água destilada para a eclosão dos juvenis. Após a eclosão, porções de 50 μL de água
destilada contendo cerca de 100 juvenis (J2) foram colocadas em placa de Elisa, e
acrescentados soluções das amostras a serem testadas dissolvidas em uma solução DMSO 2%
em 4 concentrações (1000; 500; 250 e 100 µg/mL). Em seguida foi adicionada uma solução
de H2O:DMSO 2% até completar o volume de 1 mL. Os ensaios foram realizados em
triplicata, utilizando-se como controle negativo de DMSO 2%. As placas de Elisa foram
mantidas a temperatura ambiente para posterior contagem dos nematóides mortos.
O óleo essecnial e os extratos não apresentaram atividade nematicida.
6.7 Ensaio de atividade antibacteriana
A determinação da atividade antibacteriana das amostras foi realizadas pelo o
método de difução de Agar, em disco de papel. Os extratos e quatro dos flavonóides isolados
foram testados frente à cepas de diferentes espécies de Vibrio, além de outras espécies
causadoras de problemas na carcinicultura.
Os ensaios foram realizados no LABOMAR sob a supervisão da professora Dra
Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira. Segundo mostra a Tabela 48 e Figura 141, p. 184,
somente o flavonóide LEF-3 se mostrou ativo contra Pseudomanas aerugina com halo de
inibição de 12,21 mm.
184
OLIVEIRA, F.C.
Tabela 48 - Resultado – Atividade antibacteriana pelo teste de difusão em disco Média e DP
dos halos de inibição.
Código Cepas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
LDF - - - - - - - - - - - - - - -
LFA - - - - - - - - - - - - - - -
LFE - - - - - - - - - - - - - - -
LFH - - - - - - - - - - - - - - -
LEC - - - - - - - - - - - - - - -
LEF - - - - - - - - - - - - - - -
LEF-1 - - - - - - - - - - - - - - -
LEF-3 - - - - - - - - - - - - 12,21±0,39 - -
LEF-4 - - - - - - - - - - - - - - -
LEC-1 - - - - - - - - - - - - - - -
Código Espécie Origem Código Espécie Origem
1 V. xuii Hemolinfa
L. vannamei 9 V. ponticus Ostra C.
rhizophorae
2 V. parahaemolyticus Hemolinfa
L. vannamei 10 V. rumoiensis Ostra C.
rhizophorae
3 V. brasiliensis Hemolinfa
L. vannamei 11 V.
parahaemolyticus
ATCC
17802
4 V. vulnificus Hemolinfa
L. vannamei 12 Escherichia coli ATCC
25922
5 V. cholerae Hemolinfa
L. vannamei 13 Pseudomonas
aeruginosa
ATCC
27853
6 V. parahaemolyticus Ostra C.
rhizophorae 14 Staphylococcus
aureus
ATCC
25923
7 V. parahaemolyticus Ostra C.
rhizophorae 15 Samonella IOC
8 V. proteolyticus Ostra C.
rhizophorae
Figura 141 - Halo de inibição do crescimento bacteriano de Pseudomonas aeruginosa pelo
método de difusão em disco.
185
OLIVEIRA, F.C.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O primeiro estudo químico do extrato etanólico das folhas de L. rigida Schauer
(Verbenaceae) permitiu o isolamento de 9 flavonóides do tipo flavanonas: sakuranetina,
pinocembrina, naringenina, quercetina, 7-metoxi aromadendrina, taxifolina, genkwanina e
ramnocitrina e canferol, sendo que os quatro primeiros flavonóides já foram relatados para o
gênero Lippia, e os demais estão sendo descritos pela primeira vez para o gênero Lippia.
Os compostos sakuranetina, a 7-metoxi aromadendrina e quercetina, apresentaram
considerável atividade citotoxicidade contra a linhagem de célula HCT-8. Os extratos (LEC e
LDF) e as substâncias sakuranetina, canferol e taxifolina, apresentaram signifivativa atividade
de inibição da enzima acetilcolinesterase, quando comparados com o padrão fisostigmina.
Com relação a atividade antibacteriana o flavonoide naringenina apresentou uma considerável
atividade. Já com relação a atividade namaticida os extratos mostraram-se inativos.
O estudo de caracterização da composição química do óleo essencial das folhas de
L. rigida posibilitou a identicação de 24 constituintes (94,1%), sendo 11,2% de monoterpenos
e 82,9% de sesquiterpenos. A presença do sesquiterpeno α-humuleno (42,3%) como
constituinte majoritário revelou um perfil químico diferenciado para o óleo essencial de L.
rigida em relação às demais espécies do gênero. O óleo demonstrou moderada atividade
larvicida com CL50 de 138,9 ± 1,2 μg/mL e elevado potencial citotóxico, relacionados,
possivelmente, ao efeito sinérgico dos sesquiterpenos presentes. A elevada atividade de
inibição da enzima acetilcolinesterase in vitro, sugere a continuidade de estudos para um
melhor conhecimento deste potencial. Os resultados obtidos neste estudo demonstram a
importância química e biológica de plantas do gênero Lippia na busca de agentes naturais
ativos.
Além disso, o isolamento de flavonóides da espécie L. rigida corrobora com a
dispersão quimiotaxonômica desta classe para o gênero Lippia contribuido para um melhor
conhecimento químico do gênero.
186
OLIVEIRA, F.C.
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