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ESTUDIO METABOLÓMICO DE LA MADURACIÓN DEL LULO (Solanum quitoense) POR MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

EXHAUSTIVA Y GC/MS

Eduardo Javid Corpas Iguarán

Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias

Manizales, diciembre de 2015

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ESTUDIO METABOLÓMICO DE LA MADURACIÓN DEL LULO (Solanum quitoense) POR MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

EXHAUSTIVA Y GC/MS

Eduardo Javid Corpas Iguarán – Estudiante

Gonzalo Taborda Ocampo – Director Maite del Pilar Rada Mendoza

Henry Reyes Pineda


Manizales, diciembre de 2015

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Los abajo firmantes, convocados por el Programa de Doctorado en Ciencias agrarias de la Universidad de Caldas, hemos revisado el informe final de la tesis

doctoral:

ESTUDIO METABOLÓMICO DE LA MADURACIÓN DEL LULO (Solanum quitoense) POR MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EXHAUSTIVA Y GC/MS

Presentada por: Eduardo Javid Corpas Iguarán

Como requisito parcial para obtener el título de Doctor en Ciencias Agrarias

y certificamos su aprobación

________________________________________ Nombre completo 1er miembro ________________________________________ Nombre completo 2do miembro ________________________________________ Nombre completo 3er miembro


ESTUDIO METABOLÓMICO DE LA MADURACIÓN DEL LULO (Solanum quitoense) POR MÉTODOS DE EXTRACCIÓN EXHAUSTIVA Y GC/MS

________________________________________________________

Tesis Presentada a:

Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias Facultad de Ciencias Agropecuarias

Universidad de Caldas

________________________________________________________

Como requisito parcial para obtener el título de

Doctor en Ciencias Agrarias

________________________________________________________

Por Eduardo Javid Corpas Iguarán

Gonzalo Taborda Ocampo, PhD. Director de Tesis

Diciembre de 2015

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AGRADECIMIENTOS

- A mi familia por la comprensión, la paciencia, el apoyo, los sacrificios y la motivación de cada día.

- Al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias), ente responsable de la financiación de mis estudios a través de la convocatoria de becas 528-2011. - Al grupo de investigación en cromatografía y técnicas afines, en especial a mi tutor PhD. Gonzalo Taborda Ocampo, quien dispuso su tiempo, su conocimiento y los recursos del grupo para el desarrollo de la tesis y mi formación doctoral. - Al comité evaluador por las oportunas y acertadas indicaciones para el desarrollo de la tesis. - Al profesor PhD. Milton Rosero Moreano por sus valiosos aportes y las asignaturas orientadas. - A la Universidad del Quindío por las orientaciones recibidas. - A la Universidad Católica de Manizales por permitir, a través de la comisión de estudios, el desarrollo del proceso académico-investigativo con la tranquilidad y el tiempo requerido. - A la profesora PhD. Cristina Nerín de la Puerta y el grupo de investigación GUIA de la Universidad de Zaragoza, en especial a Magdalena Wrona y Paula Vera Estacho por las valiosas orientaciones durante la pasantía. - A los profesores Omar Tapasco Alzate y Carmen Dussan Luberth, quienes suministraron una valiosa asesoría para la construcción de los experimentos y el análisis estadístico de la información. - Al profesor PhD. Francisco Javier Henao, director del doctorado, quien facilitó con total disposición cada requerimiento y sirvió de apoyo en cada etapa. - Al comité del doctorado, donde tuve el rol de representante estudiantil, aspecto que derivó en una experiencia complementaria gratificante y memorable.

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TABLA DE CONTENIDOS

Agradecimientos…………………………………………………………………………..i Tabla de contenido……………………………………………………………………….ii Lista de figuras………………………………………………………………………….viii Lista de tablas…………………………………………………………………………….x CAPÍTULO I 1. INTRODUCCIÓN ...……………………………………………………………….…..1 1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...……………………………………….….1 1.2. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………….…2 1.3. OBJETIVOS……………………………………………………………………….…3 1.3.1. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………...…....3 1.3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………….....3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………....4

CAPÍTULO II

2. REVISIÓN DE LITERATURA…………………………………………………….…..6

2.1. ANTECEDENTES……………………………………………………………….…..6

2.1.1. Antecedentes relacionados con el estudio de compuestos volátiles

en la fruta y la experiencia del grupo de investigación…………………………….…6

2.1.2. Antecedentes relacionados con el estudio de compuestos volátiles

en otras frutas……………………………………………………………...……………..7

2.2. MARCO CONCEPTUAL...………………………………………………………..10

2.2.1. Lulo (Solanum quitoense L.)....……...…………………………………......….10

2.2.1.1. Taxonomía y variedades existentes…………………………………….…..10

2.2.1.2. Características del fruto...……………………………………………...….…10

2.2.1.3. Cambios fisicoquímicos del fruto durante la maduración...….......……....10

2.2.1.4. Usos principales del fruto...…………………………………………………..11

2.2.1.5. Producción y mercado del fruto…...……………………………....…….…..11

2.2.2. Los compuestos volátiles: metabolitos secundarios claves para el

sabor y aroma de las frutas……………………………………………………….…..12

2.2.2.1. Etapa de formación y función de los compuestos volátiles del aroma.....12

2.2.2.2. Importancia de los compuestos volátiles en el contexto frutícola…….….13

2.2.2.3. Rutas biosintéticas principales para la formación de compuestos

volátiles....…………………………………………………………………………….….13

2.2.2.4. Factores que afectan la concentración de volátiles en las frutas....….….13

2.2.2.5. Clases químicas que albergan los volátiles existentes…………………...14

2.2.3. Metodología para el análisis de compuestos de volátiles…………………..15

2.2.3.1. Extracción por SDE…………………………………………………………...16

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2.2.3.2. Extracción por SPME……………………………………………...………….17

2.2.3.2.1. Fundamento del método de extracción SPME…………………………..19

2.2.3.2.2. Tipos de extracción existentes en SPME………………………………...19

2.2.3.2.3. Tipos de desorción existentes……………………………………………..20

2.2.3.2.4. Factores que determinan la eficiencia del proceso de SPME………….20

2.2.3.2.5. Fibras comerciales utilizadas en SPME compatibles con GC…….…….21

2.2.3.3. Separación e identificación por GC-MS…………………………….…….....22

2.2.3.3.1. Funcionamiento de un cromatógrafo de gases...……………….……..…22

2.2.3.3.2. Espctrometría de masas como sistema de detección en

cromatografía de gases....………………………………………………….……….….23

2.2.4. Métodos de conservación durante el almacenamiento de la pulpa de

fruta…………………………………………………………………………………….….24

2.2.4.1. Escaldado...……………………………………………………………….…....24

2.2.4.1.1 Efecto del escaldado sobre los alimentos………………………………....24

2.2.4.2. Refrigeración....…………………………………………………………….…..25

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...…………………………………………….…..26

CAPÍTULO III 3. EVALUACIÓN COMPARATIVA DEL ANÁLISIS DE COMPUESTOS VOLÁTILES EN PULPA DE LULO (S. quitoense L.) POR HS-SPME/GC-MS Y SDE/GC-MS……………………………………………………………………….…..33 3.1. ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DE S. quitoense L. MEDIANTE HS-SPME/GC-MS…………………………………………………….…..34 3.1.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles por HS-SPME/GC-MS….…………………………………………………………….…34 3.1.1.1. Selección de la fruta...…………………………………………….….……….34 3.1.1.2. Diseño experimental para la implementación del análisis por HS-SPME/GC-MS…..………………………………………………………………….35 3.1.1.3. Fibras de HS-SPME utilizadas......…………………………………………..35 3.1.1.4. Procedimiento de extracción.....………………………………………….….35 3.1.1.5. Análisis e identificación de los compuestos volátiles de S. quitoense L..35 3.1.2. Compuestos volátiles de S. quitoense L. obtenidos por HS-SPME acoplado GC/MS utilizando diferentes fibras y temperaturas de adsorción…….37 3.1.2.1. Efecto de los factores evaluados sobre las áreas totales de volátiles….39 3.1.2.1.2. Evaluación de supuestos para la variable área total de volátiles……..39 3.1.2.1.3. Análisis de regresión y establecimiento del modelo predictivo para la variable área total de volátiles…………………………………………………….40 3.1.2.2. Comportamiento de los grupos funcionales utilizando diferentes tipos de fibra y temperaturas de adsorción……………………………………………….40 3.1.2.2.1. Efecto de los factores evaluados sobre las áreas de los grupos funcionales de volátiles……………………………………………………………….41 3.1.2.3. Comportamiento del número de compuestos volátiles utilizando diferentes tipos de fibra y temperaturas de adsorción……………………………..41 3.1.2.4. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles

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utilizando diferentes tipos de fibra y temperaturas de adsorción…………………42 3.1.2.5. Comparación de los resultados obtenidos con HS-SPME frente a otros métodos de extracción en pulpa de lulo………………………………………45

3.2. ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DE S. quitoense L. MEDIANTE SDE/GC-MS……………………………………………………………..47 3.2.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles por SDE/GC-MS…………………………………………………………………….…..47 3.2.1.1. Selección de la fruta……………………………………………….………….47 3.2.1.2. Diseño experimental para la implementación del análisis por HS-SPME/GC-MS...……………..………………………………………….….….……47 3.2.1.3. Procedimiento de extracción……………………………………..…………..47 3.2.1.4. Análisis e identificación de los compuestos volátiles…………….………..47 3.2.2. Compuestos volátiles de S. quitoense L. obtenidos por SDE acoplado a GC-MS utilizando diferentes solventes……………………………………………….48 3.2.2.1. Efecto del tipo de solvente sobre el área total de volátiles en la extracción por SDE……………………………………………………………………..50 3.2.2.2. Comportamiento de los grupos funcionales utilizando diferentes tipos de solventes en la extracción por SDE……………….………………………………50 3.2.2.2.1. ANOVA y prueba de rangos múltiples aplicado a las áreas de los grupos funcionales de volátiles por SDE/GC-MS con diferentes solvente...……..50 3.2.2.3. Comportamiento del número de volátiles en los grupos funcionales obtenidos por SDE/GC-MS con diferentes solvente………………………………...51 3.2.2.4. Comportamiento de los compuestos mayoritarios en los grupos funcionales obtenidos por SDE/GC-MS con diferentes solvente…………………..52 3.3 COMPARACIÓN ENTRE LOS TRATAMIENTOS DE HS-SPME Y SDE EN CUANTO A LA EXTRACCIÓN DE VOLÁTILES DE S. quitoense L……………….52 3.4. COMPORTAMIENTO DEL ESTÁNDAR INTERNO UTILIZADO PARA ESTABLECER LA CONCENTRACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES….55 CONCLUSIONES………………………………………………………………………..56 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………...……57 CAPÍTULO IV 4. IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES BIOQUÍMICOS EN LA PULPA DE LULO (S. quitoense L.) DURANTE SU MADURACIÓN Y SENESCENCIA………62 4.1. COMPORTAMIENTO DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DURANTE LA MADURACIÓN DE S. quitoense L………………………………………………….....64 4.1.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles durante la maduración de S. quitoense L. por SDE/GC-MS………………………..64 4.1.1.1. Selección de la fruta…………………………………………………...………64 4.1.1.2. Diseño experimental para el análisis por HS-SPME/GC-MS en pulpa de S. quitoense L. durante su maduración……………………………………………….64 4.1.1.3. Fibra de HS-SPME utilizada, procedimiento de extracción, análisis y cuantificación de volátiles durante la maduración de S. quitoense L…………….64 4.1.2. Concentración de los compuestos volátiles durante la maduración de S. quitoense L….…………………………………………………………………………64 4.1.2.1. Efecto de la maduración sobre la concentración de los grupos

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funcionales de los volátiles de S. quitoense L………………………………………..67 4.1.2.2. Efecto del estadio de maduración sobre los compuestos volátiles en la pulpa de S. quitoense L…………………………………………………………………68 4.1.2.2.1. PCA aplicado a los datos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la maduración…………………………………………...…...68 4.1.2.2.2. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles durante la maduración de S. quitoense L………………………………………………………68 4.1.2.2.3. PLS para la identificación de compuestos marcadores durante la maduración de S. quitoense L………………………………………………………….71 4.1.2.2.4. DA para determinar el estadio de maduración según la concentración de los compuestos de S. quitoense L………………………………………………….72 4.1.2.3. Rutas metabólicas probablemente asociadas a la producción de volátiles en la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración…………………….73 4.2. COMPORTAMIENTO DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DURANTE LA SENESCENCIA DE S. quitoense L……………………………………………………76 4.2.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles durante la senescencia de S. quitoense L. por SDE/GC-MS……………………….76 4.2.1.1. Selección de la fruta……………………………………………………………76 4.2.1.2. Fibra de HS-SPME utilizada, procedimiento de extracción, análisis y cuantificación de volátiles durante la senescencia de S. quitoense L……………..76 4.2.1.3. Diseño experimental para el análisis de S. quitoense L. por HS-SPME/GC-MS durante la senescencia…………………………………………...76 4.2.2. Concentración de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la senescencia………………………………………………………………………………77 4.2.2.1. Concentración total de los grupos funcionales de volátiles durante la senescencia de S. quitoense L…………………………………………………………79 4.2.2.1.1. Efecto la senescencia sobre la concentración de los grupos funcionales de los volátiles de S. quitoense L………………………………………..80 4.2.2.2. Efecto del tiempo de senescencia sobre los compuestos volátiles en la pulpa de S. quitoense L…………………………………………………………………80 4.2.2.2.1. PCA aplicado a los datos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la senescencia……………………………………………….80 4.2.2.2.2. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles de S. quitoense L. durante la senescencia…………………………………………….....81 4.2.2.2.3. PLS para la identificación de compuestos marcadores durante la senescencia de S. quitoense L…………………………………………………………82 4.2.2.2.4. DA para determinar el tiempo de senescencia según la concentración de los compuestos de S. quitoense L………………………………………………….83 CONCLUSIONES………...……………………………………………………………...86 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………...……………………87 CAPÍTULO V COMPUESTOS PRESENTES EN LA FRACCIÓN VOLÁTIL DE LA PULPA DE LULO (S. quitoense L.) BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO…………………………………………………………………….92 5.1. CONDICIONES DE MUESTREO, EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE COMPUESTOS VOLÁTILES POR HS-SPME/GC-MS………………………….93

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5.1.1. Selección de la fruta……………………………………………………………...93 5.1.2. Experimento para el análisis por HS-SPME/GC-MS en pulpa de S. quitoense L. bajo diferentes condiciones de almacenamiento……………….....94 5.1.3. Fibra de HS-SPME utilizada, procedimiento de extracción, análisis y cuantificación de volátiles de S. quitoense L bajo diferentes condiciones de almacenamiento……………………………………………………………………...94 5.2. CONCENTRACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DURANTE LA MADURACIÓN DE S. quitoense L……..……………………………………………...94 5.2.1. Efecto de las condiciones de almacenamiento sobre la concentración de los grupos funcionales de los volátiles de S. quitoense L…………………………...98 5.2.2. Efecto del almacenamiento en diferentes condiciones sobre los compuestos volátiles en la pulpa de S. quitoense L………………………………..100 5.2.2.1. PCA aplicado a los datos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. usando diferentes condiciones de almacenamiento……………..100 5.2.2.2. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles en pulpa de S. quitoense L. usando diferentes condiciones de almacenamiento……………..101 CONCLUSIONES…………………...………………………………………………….105 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………….106 CAPÍTULO VI. PASANTÍA EFECTO DE UN EMPAQUE BIOACTIVO CON CANELA EO SOBRE EL RECUENTO DE MOHOS EN CORONA Y LA COMPOSICIÓN VOLÁTIL EN PULPA DE PLÁTANO…………………………………………………………………110 6.1. MATERIALES Y MÉTODO...........………………………………………………112 6.1.1. Selección de la fruta…………………………………………………………….112 6.1.2. Evaluación del papel bioactivo sobre los mohos en corona de plátano…..112 6.1.2.1. Medios utilizados……………………………………………………………...112 6.1.2.2. Experimento en corona de plátano………………………………………....112 6.1.2.3. Procedimiento analítico para el recuento mohos en corona de plátano..112 6.1.3. Extracción y Análisis de volátiles por GC-MS y GC-O-MS en pulpa……...113 6.1.3.1. Tipo de fibra y estándares utilizados……………………………………….113 6.1.3.2. Disposición de los tratamientos en pulpa de plátano……………………..113 6.1.3.3. Procedimiento de extracción por HS-SPME……………………………….114 6.1.3.4. Separación e identificación de compuestos volátiles……………………..114 6.1.3.5. Análisis por GC-O-MS………………………………………………………..114 6.1.3.6. Cuantificación de los compuestos volátiles………………………………..115 6.1.4. Extracción y análisis de canela EO presente en el papel bioactivo……….116 6.2. RESULTADOS………………...…………………………………………………..116 6.2.1. Comportamiento del recuento mohos en corona de plátano....……………116 6.2.1.1. Comportamiento del recuento mohos en corona de plátano…………….116 6.2.1.2. Comportamiento de la canela EO en el papel bioactivo………………….117 6.2.2. Comportamiento de los compuestos volátiles en pulpa de plátano……….119 6.2.2.1. Valores de penetrometría obtenidos durante la maduración…………….119 6.2.2.2. Separación cromatográfica de los compuestos volátiles analizados……119 6.2.2.3. Parámetros de cuantificación para hallar la concentración de los compuestos volátiles durante la maduración………………………………………..119 6.2.2.4. Concentración de los compuestos volátiles durante la maduración…….120

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6.2.2.5. PCA a partir de las concentraciones de los compuestos en plátano durante la maduración…………………………………………………………………122 6.2.3. Análisis de la pulpa de plátano mediante olfatometría……………………...124 CONCLUSIONES………………………………………………………………………126 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………….127

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LISTA DE FIGURAS Figura Página 1. Aspecto de la cáscara y la pulpa de la fruta en cada uno de sus grados de maduración…………………………………………………………………11 2. Características de la patente de invención del dispositivo de SDE…………...16 3. Dispositivo comercial de extracción por SPME………………………………….18 4. Componentes de un cromatógrafo de gases…………………………………….22 5. Cromatogramas sobrepuestos de los compuestos de S. quitoense L. por HS-SPME/GC-MS con diferentes fibras a 40 ºC (arriba) y 60 ºC (abajo)…...…..37 6. Gráfico de interacción para el área total de volátiles de la pulpa de S. quitoense L. por GC-MS con diferentes fibras y temperaturas de adsorción…...39

7. Gráficos de interacción para las áreas de los grupos funcionales de S. quitoense L. con diferentes fibras y temperaturas de adsorción……………….....41 8. Número de volátiles obtenidos por GC-MS a partir de la pulpa de S. quitoense L. con diferentes fibras y temperaturas de extracción…………………42 9. Cromatogramas sobrepuestos obtenidos de S. quitoense L. por SDE/GC-MS con diferentes solventes……………………………………………....48 10. Áreas de los grupos funcionales obtenidos por GC-MS a partir de la pulpa de S. quitoense L. con diferentes fibras y temperaturas de extracción…………50 11. Número de volátiles obtenidos mediante SDE/GC-MS a partir de la pulpa de S. quitoense L. con diferentes solventes………………………………………...51 12. Concentración del estándar interno en relación con la respuesta del detector de masas…………………………………………………………………..…55 13. Cromatograma del análisis de volátiles en pulpa de S. quitoense L. en los estadios uno (figura superior) y cinco (figura inferior) de maduración……….65 14. Concentración (izquierda) y Ln de la concentración (derecha) de los grupos funcionales a partir de la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración……..67 15. Primer plano factorial de los compuestos de S. quitoense L. según el estadio de maduración………………………………………………………………...68 16. Concentración (izquierda) y Ln de la concentración (derecha) de los compuestos mayoritarios en pulpa de S. quitoense L. durante la maduración.. 69 17. Identificación de marcadores en la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración……………………………………………………………………..……71 18. Mapa territorial de los compuestos volátiles en los estadios de S. quitoense L. durante la maduración………………………………………………….73 19. Ruta biosintética probable de compuestos volátiles C6 en pulpa de S. quitoense L…………………………………………………………………………..75 20. Cromatogramas del análisis de volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante la senescencia…………………………………………………..……………77 21. Concentración (izquierda) y raíz cuadrada de la concentración (derecha) de los grupos funcionales durante la senescencia de S. quitoense L……………....79 22. Primer plano factorial de los compuestos de S. quitoense L. según el tiempo de senescencia………………………………………………………………………...81 23. Concentración (izquierda) y Ln de la concentración (derecha) de los

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compuestos mayoritarios en pulpa de S. quitoense L. durante la senescencia..82 24. Identificación de marcadores en la pulpa de S. quitoense L. durante la senescencia………………………………………………………………...………..82 25. Mapa territorial de los compuestos volátiles en la senescencia de S. quitoense L………………………………………………………………………...……84 26. Concentración de los grupos funcionales en S. quitoense L. sometida a diferentes condiciones de almacenamiento…………………………………...….98 27. Porcentaje relativo de la concentración de los grupos funcionales en S. quitoense L. sometida a diferentes condiciones de almacenamiento……………99 28. Primer plano factorial de los compuestos de S. quitoense L. bajo diferentes condiciones de almacenamiento……………………………...………..100 29. Concentración de los compuestos mayoritarios en la pulpa de S. quitoense L. bajo diferentes condiciones de almacenamiento…………………………...…102 30. Raíz cuadrada del recuento de mohos en corona de plátano…………...….117 31. Concentración del bioactivo en el papel durante diferentes tiempos de análisis…………………………………………………………………………………117 32. Valores de penetrometría en plátano durante la maduración……………….119 33. Concentración de volátiles en pulpa de plátano durante la maduración......120 34. PCA de la concentración de volátiles en plátano durante la maduración….122

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LISTA DE TABLAS Figura Página

1. Estudio de compuestos volátiles realizados en diferentes frutas…………...…..8

2. Clasificación por color en el lulo de acuerdo a su etapa de maduración……..10

3. Características de algunos compuestos volátiles……………………………….15

4. Fibras comerciales usadas en SPME compatibles con GC…………………....21

5. Constituyentes volátiles obtenidos por HS-SPME/GC-MS en la pulpa de

S. quitoense L. utilizando diferentes fibras…………………………………………38

6. Coeficientes del análisis de regresión para el área total de volátiles, teniendo como variables explicativas la temperatura de adsorción y el tipo de fibra…….40 7. Estudios comparativos de la extracción por HS-SPME utilizando diferentes fibras…………………………………………………..……………….……44 8. Compuestos volátiles obtenidos por HS-SPME que previamente se han reportado en pulpa de lulo usando diferentes métodos de extracción…...…46 9. Constituyentes volátiles obtenidos por SDE/GC-MS en la pulpa de S. quitoense L. utilizando diferentes solventes………………………………………...49 10. Pruebas de rangos múltiples de Tukey aplicada al área total de volátiles obtenida en cada grupo funcional por SDE con diferentes solventes….51

11. Prueba t de comparación de medias para muestras independientes aplicada a las áreas de los grupos funcionales obtenidos por HS-SPME y SDE………...53

12. Concentración de los compuestos volátiles durante la maduración de S. quitoense L…………………………………………………………………………..66 13. Concentración de los compuestos volátiles de S. quitoense L. obtenidos durante la senescencia………………………………………………...….78 14a. Concentración de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante el almacenamiento - ambiente……………………………………………..95 14b. Concentración de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante el almacenamiento - escaldado…………………………………………....96 14c. Concentración de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante el almacenamiento - refrigeración…………………………………........…97 15. Correlaciones entre las variables activas y los factores suministrados…….101 16. Separación cromatográfica e índices de retención de los compuestos presentes en plátano………………………………………………………………....119 17. Parámetros de regresión y cuantificación para los principales compuestos volátiles obtenidos en plátano……………………………………………………….120 18. Prueba de Tukey aplicada a la raíz cuadrada de las concentraciones de los volátiles en pulpa de plátano en diferentes estadios de maduración…………...121 19. Frecuencia modificada (%) de los compuestos volátiles percibidos en el análisis por olfatometría durante la maduración del plátano……………...……..124

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CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Durante el evento normal de maduración, las frutas experimentan diversos procesos de catálisis enzimática que desembocan en el desarrollo de características volátiles responsables de su flavor (Zhang et al., 2008; Dourtoglou et al., 1995). Cada estadio madurativo posee un perfil específico de compuestos volátiles, por lo que las variaciones del equilibrio metabólico pueden derivar en la alteración de las características sensoriales mencionadas, y consecuentemente, en la afectación de la aceptación y preferencia del producto por parte del consumidor. Diferentes estudios han permitido identificar los compuestos del lulo en estadio de plena madurez, principalmente mediante extracción con mezclas de solventes, como pentano/éter dietílico (1:1) (Suárez y Duque, 1991), pentano/éter (2:1) (Brunerie and Maugeais, 1992), éter etílico/pentano (1:1) (Mora y Pinzón, 2004), diclorometano/éter etílico (7:3) (Forero et al., 2015). Sin embargo, no se conocía el comportamiento de la fracción volátil de S. quitoense Lam., durante sus estadios de maduración de consumo, las vías metabólicas de relevancia durante la fase madurativa, y los compuestos susceptibles de constituir marcadores bioquímicos en estas etapas. A lo anterior se suma el desconocimiento en torno a los cambios ocurridos en la fracción volátil de S. quitoense L. durante su fase de senescencia y sobre la existencia de marcadores de la degradación de la fruta en esta etapa. Los compuestos volátiles de la fruta provienen de diversas rutas metabólicas, por consiguiente, su naturaleza química es variada (Min et al., 2003; Qin et al., 2012). Consecuentemente, la fidelidad del perfil obtenido a partir de una fruta en particular depende de las características del método de extracción (Vas y Vékey, 2004; Schulz et al., 2007; Reinhard et al., 2008; Rowan, 2011). En el caso de los tradicionales, se han evidenciado inconvenientes como la formación de artefactos, baja recuperación de compuestos con menor peso molecular y/o en concentraciones traza, además de la dependencia a la naturaleza del solvente utilizado en estos métodos, aspectos que dificultan la identificación de marcadores y de tendencias concretas del comportamiento de los grupos funcionales presentes durante la maduración.

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1.2. JUSTIFICACIÓN Entre las especies de lulo, S. quitoense L., nativa de Suramérica (Pulido et al., 2008), es la especie cultivada y consumida en Colombia debido a su placentero y delicado aroma (Osorio et al., 1991; Osorio et al., 2003), así como sus características nutricionales (Caicedo e Higuera, 2007). El cultivo del lulo fue incluido hace más de 20 años en en el plan de desarrollo nacional con el propósito de impulsar su cultivo (Suárez y Duque, 1991) y es considerarda por parte de la Comunidad Económica Europea (CCE), como una de las frutas andinas con mayor potencial de exportación (Mejía et al., 2012). A nivel interno, el consumo de lulo ha sufrido un incremento a expensas del constante consumo doméstico y a la potencialidad existente en cuanto a la transformación industrial (Suárez y Duque, 1992). A pesar del incremento en el área de siembra, estimada en 5,467 ha durante el 2006 (representada en una producción anual de 41.064 ton) (Arias, Támara y Arbeláez, 2006; citado en: Lobo et al., 2007), hasta un área estimada actual de 6.637 ha (con producción anual de 64.432 ton) (Mejía et al., 2012), se ha generado la necesidad de importar de Ecuador una cifra cercana al 21% del volumen consumido por año, representado en 2.746 ton. (Mejía et al., 2012). El panorama esbozado da cuenta de la relevancia de esta fruta dentro del ciclo productivo del país, cuyo posicionamiento, depende de factores como el sostenimiento de condiciones de calidad en cada fase de la cadena productiva. La exploración de los compuestos volátiles durante la maduración y senescencia de la fruta, y la identificación de marcadores en estas fases, permitieron establecer el momento temporal en el que la fruta debe ser cosechada para aprovechar mejor las características ligadas a su estos metabolitos. Además, esta base de conocimientos permitirán en estudios futuros, el desarrollo de estrategias para retardar la aparición de estos compuestos, coadyuvando a la prolongación de la vida útil de la fruta. El lulo muestra un gran potencial de producción para el procesamiento industrial de la pulpa (Arizala et al., 2011), al tiempo que actualmente las exigencias del mercado se relacionan con el consumo de alimentos minimamente procesados, en los cuales se puedan conservar las características físicoquímicas y organolépticas del producto original. En este sentido, el análisis de la evolución de la fracción volátil de la pulpa de lulo durante la etapa de almacenamiento, después de ser sometida a diferentes condiciones de conservación, permitió indagar sobre los efectos que se generan en la integridad de la fracción volátil de la fruta. Finalmente, los resultados del presente estudio permitieron también disponer de una metodología estandarizada, susceptible de ser ofertada al sector agroindustrial.

3

1.3. OBJETIVOS 1.3.1. OBJETIVO GENERAL Realizar el estudio metabolómico del lulo (S. quitoense L.) para la identificación de marcadores bioquímicos durante su maduración y deterioro. 1.3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Implementar los métodos de extracción por SDE y HS-SPME para la obtención de compuestos volátiles en la pulpa de lulo (S. quitoense L.), en perspectiva de una evaluación comparativa. Implementar el método de análisis por GC-MS, para la determinación de la composición química de la fracción volátil en la pulpa de lulo (S. quitoense L.). Establecer la presencia de marcadores bioquímicos en la pulpa de lulo (S. quitoense L.) durante la maduración y el deterioro de la fruta. Evaluar la evolución de los compuestos presentes en la fracción volátil de la pulpa de lulo (S. quitoense L.), al aplicar diferentes métodos de conservación.

4

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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6

CAPÍTULO II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. ANTECEDENTES

2.1.1. Antecedentes relacionados con el estudio de compuestos volátiles en

la fruta y la experiencia del grupo de investigación. Aunque no existen

estudios sobre el perfil volátil de la pulpa en la especie S. quitoense L. durante la

maduración y senescencia, se han realizado investigaciones sobre los volátiles del

aroma en su madurez plena, que serán objeto de contrastación con los resultados

del presente estudio en el siguiente capitulo. Además, se han evaluado las

características volátiles de la pulpa de la fruta, en la especie S. vestissimum por

destilación con vapor y extracción con solventes simultaneos (eter dietil pentano

1:1) y subsecuente análisis de la fracción volátil por GC capilar (CGC) y GC-MS.

Fue así como se obtuvo por primera vez un perfil constituído por 65 compuestos

volátiles a partir de una especie de lulo, con predominio de esteres como

propionato de metilo, acetato de butilo, (E)-2-butenoato de metilo, acetato de 3-

metilbutilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, hexanoato de etilo y acetato de hexilo

(Suárez y Duque, 1991). Los mismos autores estudiaron la concentración de los

compuestos volátiles de esta especie por cromatografía de gases de alta

resolución (HRGC) y HRGC acoplada a MS, encontrándo incremento en el

contenido de ésteres durante la maduración (Suárez y Duque, 1992).

El grupo de investigación en cromatografía y ciencias afines ha desarrollado

propuestas relacionadas con el análisis de la fracción volátil en diferentes frutas. A

partir del capacho de la uchuva (Lycopersicum esculentum Mill.) se econtraron

principalmente terpenos como el mirceno, limoneno, trans-β-ocimeno, α-

terpinoleno y trans-cariofileno, mientras que la pulpa fue asociada a butirato de

butilo, octanoato de etilo y butirato de etilo. Además, a partir del tomate se

encontraron compuestos relacionados con la producción de aroma como (Z)-3-

hexenal y el hexanal (Restrepo, 2009). También se destaca la evaluación de la

composición volátil del tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), donde el

perfil volátil se constituyó principalmente de terpenos, esteres, alcoholes, ácidos

carboxílicos libres de cadena corta, aldehídos, bencenos y compuestos

heterocíclicos (Tigreros, 2012). Así mismo, la pulpa fresca y tratada mediante

escaldado, correspondiente a la fruta exótica arazá (Eugenia stipitata) ha sido

estudiada por el grupo de investigación, encontrándose un predomino de esteres

en las muestras de ambos tratamientos. Además se encontraron mayores niveles

de terpenos, ácidos, éteres e hidrocarburos en la pulpa fresca que en la sometida

al escaldado (Lodoño y López, 2012).

7

2.1.2. Antecedentes relacionados con el estudio de compuestos volátiles en

otras frutas. La Tabla 1 ofrece una panorámica amplia sobre el desarrollo de gran

parte de los estudios realizados sobre los compuestos volátiles en diversas frutas,

principalmente climatéricas, dado que en estas, la elevación en la generación de

etileno es concomitante con los picos bruscos de producción de volátiles durante

la maduración (Borges et al., 2011). Un aspecto importante denotado en la Tabla

1, es el predominio de esteres, compuestos generados por esterificación de

alcoholes y acil CoAs (coenzimas A), catalizados por la alcohol o-aciltransferasa

(AAT) (Villatoro et al., 2008) que confieren aromas característicos a la fruta (El

Arem et al., 2011), así como la presencia constante (no obstante la variedad de

frutas analizadas en los estudios referenciados) de similares grupos dentro de los

perfiles, aparte de los esteres, como son las cetonas, alcoholes y aldehídos, e

hidrocarburos, aunque dependiendo del tipo de fruta es posible encontrar una

diversidad significativa de compuestos volátiles de origen ampliamente diverso. En

la Tabla 1 se puede apreciar el uso en los estudios referenciados, de algunas

bibliotecas, entre las que sobresale la biblioteca de espectros del NIST, así como

la adopción de otras estrategias de identificación como son, el uso de estándares

de referencia, los cuales son de adquisición comercial y se obtienen

principalmente cuando se conocen los compuestos de interés que se pretenden

extraer e identificar a partir del espécimen analizado, y los espectros publicados,

que han sido generados a partir de diversos estudios.

8

Tabla 1. Estudio de compuestos volátiles realizados en diferentes frutas.

Nombre

Nombre común

Tipo de

maduración

Métodos de extracción y

análisis

Herramienta de

identificación

Grupos identificados

Compuestos principales

identificados

Fuente

Rubus idaeus

Frambuesa

No climatérica.

Polimero poroso – GC-MS.

- Espectros publicados y estándares de referencia.

Hidrocarburos alifáticos y aromáticos, aldehídos, cetonas, alcoholes y esteres, monoterpenos y sesquiterpenos.

-ionona, -ionona, felandreno -felandreno, ácido hexanoico, acetato de metilo, acetato de etilo y acetato de propilo.

(Robertson et al., 1995).

Spondias purpurea

Siriguela.

Climatérica.

HS-SPME y GC-MS.

- Espectros de biblioteca Wiley 6ta edición. - Estándares de referencia.

2 cetonas, 4 alcoholes, 7 aldehídos, 9 esteres y 5 hidrocarburos terpénicos.

Hexanal, (E)-2-hexenal, 3-hexen-1-ol, 2-hexen-1-ol, acetato de etilo y acetato de hexilo.

(Ceva-Antunes et al., 2006).

Durio zibethinus.

Durian.

Climatérica.

HS-SPME y GC-MS.

- Espectros de biblioteca del NIST. - Estándares de referencia.

22 esteres, 9 alcanos, 3 tioacetales, 2 tioesteres, 2 tiolanos y 1 alcohol.

Etanotiol, propanotiol, propanoato de etilo, propanoato de propilo, 2-metilbutanoato de etilo y metilo.

(Chin et al., 2007).

Passiflora edulis Sims.

Maracuyá púrpura.

Climatérica.

HS-SPME y GC-MS.

- Espectros de biblioteca del NIST.

51 compuestos. Esteres de etilo (82.8%), alcoholes superiores, compuestos carbonilos.

Butanoato de hexilo, hexanoato de hexilo, hexanoato de etilo y (Z)-edulan I.

(Pontes et al., 2009).

P. edulis Sims f. flavicarpa

Maracuyá amarilla

Climatérica.

HS-SPME y GC-MS.


24 compuestos. Esteres de etilo (77.4%), alcoholes superiores, compuestos carbonilos.

Hexanoato de metilo, (E)-metil-2-hexenoato y benzoato de metilo.


P. mollissima

Curuba

Climatérica.

HS-SPME y GC-MS.


21 compuestos. Esteres de etilo (39.9), alcoholes superiores, compuestos carbonilos.

(Z)-β-ocimeno, butanoato de hexilo, Hexil hexanoato y hexanol.


Solanum lycopersicum

Tomate

Climatérica.

HS-SPME GC-FID y GC-MS.

- Estándares de referencia.

10 alcoholes, 6 terpenos y lactonas, 1 ester, 2 compuestos azufrados, 2 ácidos libres.

(Z)-3-hexenal, 6-metil-5-hepten-2-ona, bencil alcohol, geranial, neral, 2-heptenona y 2-isobutil-tiazol.

(Markovic et al., 2007).

Pyrus ussuriensis

Pera China

Climatérica.

HS-SPME y GC-MS.

- Espectros de biblioteca del NIST. - Estándares de referencia.

66 esteres, 9 aldehídos, 10 alcoholes, 3 cetonas y 14 hidrocarburos.

(E,Z)-2,4-decadienoato y metil (E,Z)-2,4-decadienoato.

(Qin et al., 2012).

Malus × domestica Borkh

Manzana “Pink Lady®”

Climatérica.

HS y GC-MS.


21 esteres, 6 alcoholes y 1 terpeno.

Acetato de hexilo, hexanoato de hexilo, butanoato de hexilo, butanoato de etilo y hexanoato de etilo.

(Villatoro et al., 2008).

Psidium guajava

Guayaba blanca

Climatérica.

HS y GC-MS.

- Base de datos de espectros.

2 compuestos carbonilos, 6 esteres, 3 monoterpenos y 7 sesquiterpenos.

(E)2-hexenal y (Z)-3-hexenal, acetato de (Z)-3-Hexenilo, trans-3-

hexenyl, cariofileno, y-bisaboleno.

(Diniz et al., 2007).

Capsicum annuum

Pimiento

Parcialmente climatérica.

HS-SPME y GC–MS.


Aldehído, cetona, terpeno, alcohol, pirazina,

Hexanal, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2,3-butanodiona, 3-careno, trans-2-hexenal y linalol.

(Mazida et al., 2005)

Cyphomandra betacea Sendt

Tomate de árbol

No climatérica.

HS-SPME / GC-MS.


26 esteres, 6 aldehídos, 6 cetonas, 5 alcoholes y 3 ácidos.

Eucaliptol, (E)-2-hexenal, hexanoato de metilo, butanoato de metilo.

(Tigreros, 2012).

Arbutus unedo

Madroño

Climatérica.

HS-SPME / GC–MS.

- Estándares de referencia. - Espectros de biblioteca del NIST.

10 alcoholes, 10 aldehídos, 10 esteres, 2 norisoprenoides, 4 sesquiterpenos y 5 monoterpenos.

(Z)-3-hexen-1-ol, 1-hexanol, hexanal, (E)-2-hexenal, (Z)-3-hexenil acetato y hexenil acetato.

(Oliveira et al., 2011).

9

Tabla 1. Continuación.

Nombre

Nombre común

Tipo de

maduración

Método de extracción / purificación

Herramienta de

identificación

Grupos identificados

Compuestos principales

identificados

Fuente

Mangifera indica

Mango

Climatérica.

Extracción por solvente / GC–FID y GC–MS.

- Espectros de biblioteca del NIST. - Espectros de biblioteca de la Oficina Nacional de Normalización (NBS).

3 alcoholes, 3 aldehídos, 18 monoterpenos, 9 monoterpenos oxigenado, 17 sesquiterpenos, 7 sesquiterpenos oxigenados, 8 lactona, 5 cetona y 7 hidrocarburos.

-3-careno, (Z)-ocimeno, (E)-ocimeno,

-mirceno, limoneno, -cariofileno, furaneol, allo-ocimeno y (Z)-2,6-dimetil-3,5,7-octatrieno-2-ol.

(Pandit et al., 2009).

Lycopersicon esculentum var. Commune

Tomate común

Climatérica.

HS-SPME / SDE y extracción de vapor/ GC-MS.


Alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos libres y esteres.

Hexanal, (E)-2-hexenal, ácido 2-metil-1-metilethil propanoico y acido 2-hidroxi-1-metiletil benzoico.

(Zhang et al., 2008).

Phoenix dactylifera

Dátil (fruto de palma datilera)

Climatérica.

HS-SPME / GC-EIMS (Espectro de masas con impacto electrónico).

- Espectros de biblioteca del NIST. - Espectros publicados y estándares de referencia.

20 esteres, 19 alcoholes, 10 terpenos, 13 aldehídos, 6 cetonas, 12 hidrocarburos y 1 lactona.

2-propanol, isoamil alcohol, feniletil alcohol, isoamilacetato, hexil isovalerato, (E)-2-decenal, tridecanal,

8-cineole, -tujona, (Z)-2-trideceno, (E)-2-trideceno, n-undecano.

(El Arem et al., 2011).

Hancornia speciosa Gomes

Mangaba

Climatérica.

SDE / GC–FID y GC–MS.

- Estándares de referencia. - Espectros de biblioteca del NIST.

En etapa madura: esteres (40.9%), alcoholes (18.4%), 9 aldehídos (10.2%) y cetonas (9.7%).

3-hidroxi-2-butanona, 2,4,5-trimetil-1,3-dioxolano, 3-metil-1-butanol, furfural, 3-metil-1-butanil acetato y 3-metil-3-buten-1-il acetato.

(Santos y Nogueira, 2006).

S. vestissimum

Lulo

Climatérica.

SDE / GC-MS.

- Espectros publicados y estándares de referencia.

24 hidrocarburos, 23 esteres, 8 alcoholes alifáticos, 9 alcoholes terpenos, 2 aldehídos, 1 ácido, y 1 eter aromático.

Metil propionato, metil butanoato, butil acetato, metil (E)-2-butenoato, 3-metilbutil acetato, metil hexanoato, metil (E)-2-metil-2-butenoato, acetato de (Z)-3-hexenilo, metil benzoato, (Z)-

3-hexenol, linalol, y -terpineol.

(Suárez y Duque, 1991).

S. vestissimum

Lulo

Climatérica.

SDE / GC-MS.

- Espectros publicados y estándares de referencia. - Espectros de bibliotecas EPA/NIH.

15 hidrocarburos, 6 esteres, 8 alcoholes alifáticos, 5 alcoholes y aldehídos.

Butil acetato, metil (E)-2-butenoato, 3-metilbutil acetato, metil hexanoato, acetato de (Z)-3-hexenilo, metil benzoato, (Z)-3-hexenol, linalol.

(Suárez y Duque, 1992).

Fragaria x annanasa Duch

Fresa

Climatérica.

HS-SPME / GC-MS.

- Espectros de biblioteca del NIST. - Índices de retención.

Ésteres, alcoholes, aldehídos, lactonas, cetonas, terpenos.

1-penten-3-ol, 1-hexanol, hexanal, 2-hexenal, butanoato de metilo, acetato de pentilo, hexanoato de metilo.

(Vandendriessche et al., 2013)

Parinari curatellifolia

Ciruela

Climatérica.

HS-SPME / GC–FID y GC–MS.


Ésteres (67%), alcoholes (11%), heteroátomos (14%) sesquiterpenos (4%), fenoles (3%).

Butirato de etilo, isovalerato de etilo, hexanoato de etilo, benzoato de etilo, isovalerato de isoamilo.

(Shoko et al., 2013)

Psidium guajava L.

Guayaba

Climatérica.

HS-SPME / GC–FID y GC–MS-O.


Ésteres, alcoholes, aldehídos, terpenos.

(Z)-3-hexenal, hexanal, butanoato de etilo, (E)-2-hexenal, (Z)-3-hexen-1-ol, hexanoato de etilo y acetato de hexilo.

(Pino et al., 2012)

S. quitoense L

Lulo

Climatérica.

Extracción por solvente / GC–FID y GC–MS.

- Estándares de referencia e índices de retención.

8 ésteres, 2 alcoholes, 3 aldehídos, 2 ácidos, 1 lactona.

Benzoato de metilo, ácido acético, butanoato de etilo, (Z)-3-hexenal, 4-Hidroxi-2,5-dimetil-3(2H)-furanona.

(Forero et al., 2015)

10

2.2. MARCO CONCEPTUAL

2.2.1. Lulo (Solanum quitoense L.).

2.2.1.1. Taxonomía y variedades existentes. La planta pertenece a la sección

Lasiocarpa, clase que incluye diferentes especies tropicales (Bohs, 2004). El

centro primario de diversidad genética del taxón comprende Colombia, Ecuador y

Perú, encontrándose ampliamente cultivada entre los 1200 y 2300 msnm (Lobo y

Medina, 2000; citado en: Lobo et al., 2007). S. quitoense L. presenta dos

variedades botánicas, variedad quitoense, forma sin espinas encontrada en el sur

de Colombia y Ecuador, y variedad septentrionale, forma con espinas encontrada

en Colombia Central, Panamá y Costa Rica (Bedoya-Reina y Barrero, 2010).

2.2.1.2. Características del fruto. S. quitoense L. presenta frutos en baya con

cáscara de color amarillo anaranjado cuando la fruta está completamente madura,

con pulpa amarilla verdosa, ácida y con gran cantidad de semillas (Suárez y

Duque, 1991; Suárez y Duque, 1992; Díaz y Manzano, 2002). El trabajo realizado

por (Gómez, 2004) para caracterizar y normalizar S. quitoense L. ilustra sobre la

variación en el tamaño de la fruta, proveniete de los cultivos de la planta en

Colombia, con pesos entre 18 y 191 g, diámetros ecuatoriales fluctuando entre 32

y 78 mm y diámetros polares en un rango entre 29 mm y 72 mm.

2.2.1.3. Cambios fisicoquímicos del fruto durante la maduración. Los

principales parámetros fisicoquimicos relacionados con la calidad del lulo son:

- Color. Los cambios de color se deben a la clorofila por sistemas enzimáticos que

conducen a desenmascarar los pigmentos carotenoides (naranjas y amarillos) y

antocianinas (azul, roja), sustancias que influyen en la calidad y cantidad de estos

pigmentos, relacionados con el estadio de madurez (Gómez, 2004; Mejía et al.,

2012). De acuerdo a la norma tecnica Colombiana (NTC) 5093, se han establecido

grados de maduración en forma ascendente (Tabla 2), de manera que el grado 0

es el más inmaduro y el 5 indica el mayor nivel de madurez (ICONTEC, 20021).

Tabla 2. Clasificación por color en el lulo de acuerdo a su etapa de maduración.

Color 0 Fruta fisiológicamente madura verde oscura.

Color 1 Fruta de color verde oscura con ligeros tonos verdosos.

Color 2 Fruta de color verde claro con algunas tonalidades anaranjadas.

Color 3 Fruta de color verde verde naranja con toques de fruta al centro.

Color 4 Fruta de color verde anaranjada con pocos matices verdes.

Color 5 Fruta de color naranja.

Fuente: ICONTEC, 20021.

11

Complementariamente a la Tabla de clasificación por color, la norma NTC 5093

ofrece una imagen del color de la cáscara y la pulpa que permiten ayudar a

establecer el grado de maduración en el cual se encuentra la fruta (Figura 1).

Figura 1. Aspecto de la cáscara y la pulpa de la fruta en cada uno de sus grados

de maduración. Fuente: ICONTEC, 20021.

- Sólidos solubles. Los °Brix aumentan a medida que la fruta se madura, con un

rango entre 4.2 (etapa 0) a 10.3 (etapa 5), debido a la hidrólisos de almidón en

vacuolas y espacios intrercelulares (Mejía et al., 2012), siendo el parámetro que

guarda mejor relación con la tabla de color (Gómez, 2004).

- Acidez titulable (%). En el lulo fluctua entre 2.63 y 3.0. Se presenta un

incremento en las etapas verdes (0-2) y decrecimiento en la etapa 3, considerada

como la del momento óptimo para la cosecha, elevándose nuevamente en las

etapas 4 y 5 (Mejía et al., 2012). El decrecimiento en el inicio es debido a la

actividad de deshidrogenasas y a los ácidos orgánicos usados como sustratos

para la respiración en la síntesis de nuevos componentes (Mejía et al., 2012).

2.2.1.4. Usos principales del fruto. Por ser ácidos, los frutos se disponen para

destinaciones diversas (Díaz y Manzano, 2002), entre estas, el jugo constituye el

principal uso por ser refrescante y diurético (Suárez y Duque, 1991). Además, por

su agradable sabor y valor nutricional (Pulido et al., 2008) el lulo muestra un gran

potencial de procesamiento para jugos, gelatinas, helados, yogurt y saborizante

comercial (Suárez et al., 1991; Suárez y Duque, 1992; Arizala et al., 2011).

2.2.1.5. Producción y mercado del fruto. En Colombia, el cultivo está distribuido

en cerca de 22 departamentos y representa el 1.7% de la producción nacional de

frutas (Caicedo e Higuera, 2007), con un 74% establecido como economía

campesina tradicional y un 26% cultivado bajo economía empresarial (Arizala et

al., 2011). En el año 2000 S. quitoense L. ocupaba un área de 4.804 ha con una

producción promedio de 37.477 t∙ha-1 (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural,

2001; citado en: Casierra-Posada et al., 2004), luego, en el 2006 existía un área

sembrada de 5467 hectáreas y una oferta de fruta de 41064 toneladas (Arias,

12

Támara y Arbeláez, 2006; citado en: Lobo et al., 2007). Al finalizar la misma

década, se cultivaban alrededor de 5.631 ha de lulo, equivalentes a una

producción de unas 48.0000 toneladas de la fruta al año (CORPOICA, 2010) y

actualmente existe un área cultivada de 6.637 ha, con una producción anual de

64.432 toneladas (Mejía et al., 2012). El principal productor en el país es el

departamento del Huila con 1.470 ha, seguido de Valle del Cauca con 893 ha y

Cauca con 476 ha (CORPOICA, 2010), mientras, en los departamentos del eje

cafetero el área sembrada en el cultivo de lulo es de 257 ha (Rios et al., 2004).

2.2.2. Los compuestos volátiles: metabolitos secundarios claves para el

sabor y aroma de las frutas. El metabolismo secundario se relaciona con la

biosíntesis, transformación y degradación de compuestos endógenos mediante

proteínas especializadas (Valdés y Balbín, 2000; citado en: García, 2004). Los

productos se consideran secundarios porque no participan en procesos

fotosintéticos, respiratorios, de asimilación de nutrientes, transporte o

biomoléculas esenciales (Ávalos y Pérez-Urria, 2009), sin embargo, requieren del

metabolismo primario el suministro de sustratos iniciales para sus variadas rutas.

Los volátiles son de bajo peso molecular (entre 50 y 200 Daltons) y alta presión de

vapor en condiciones ambientales, lo cual les permiten actuar como señalizadores

químicos y defensivos que aportan información entre organismos (Rowan, 2011).

2.2.2.1. Etapa de formación y función de los compuestos volátiles del aroma.

Después de alcanzar una etapa de madurez fisiológica, cuando se completa el

desarrollo y cesa el crecimiento, las frutas inician la maduración y adquiere las

características organolépticas para ser consumidas (Manrique y Lajolo, 2004;

citado en: Diniz et al., 2007); es así como la fruta se ablanda, se vuelve más dulce,

incrementa su respiración y la producción de CO2 (Borges et al., 2011). La emisión

de compuestos volátiles se relaciona con las siguientes funciones:

Atracción selectiva de dispersores de semilla con fines de reproducción, (García,

2004; Rowan, 2011; Borges et al., 2011; Pontes et al., 2009).

Repelencia de animales mediante generación de sabores amargos en la planta

(García, 2004; Ávalos y Pérez-Urria, 2009).

Marcadores para la diferenciación cualitativa del alimento, (Min et al., 2003).

Indicación de hábitat para supervivencia (Rowan, 2011).

Indicación de la senescencia de la fruta (Obando-Ulloa et al., 2009) y deterioro por

causas como la manipulación en poscosecha (Maul et al., 2000).

Indicación diferencial de composición entre variedades de la misma especie para

promover las de determinadas características (Qin et al., 2012).

Actuación como toxinas aleopáticas para inhibición de la germinación y del

crecimiento temprano de la raíz en otras especies de plantas (Rowan, 2011).

13

2.2.2.2. Importancia de los compuestos volátiles en el contexto frutícola. A

pesar del escaso entendimiento sobre el mecanismo bajo el cual el se percibe el

aroma (Tieman et al., 2007), se tiene claro que este proviene de una mezcla

compleja de compuestos volátiles aromáticos (Min et al., 2003; Qin et al., 2012) y

existen evidencias de la estrecha relación entre su formación y la maduración de

la fruta (Grant et al., 1998; Maul et al., 2000; Min y Zhang, 2003; Santos y

Nogueira, 2006; Diniz et al., 2007; Zhang et al., 2009; El Arem et al., 20011;

Borges et al., 2011). Los volátiles contribuyen a la palatabilidad y apreciación de

los alimentos, y junto con azucares, ácidos orgánicos y sales, son responsables de

la percepción del sabor en los receptores gustativos (Ordóñez, 2005).

2.2.2.3. Rutas biosintéticas principales para la formación de compuestos

volátiles. Las siguientes son rutas comunmente encontradas en frutas:

Ruta de los ácidos grasos. Es conocida como la ruta de los volátiles de hojas

verdes (VHV); los compuestos se sintetizan a partir del ácido linoleíco y sus

respectivos hidroperóxidos, que son fragmentados para formar compuestos de 12

y 6 carbonos, los cuales mediante reordenamientos, reducciones o

esterificaciones, producen una variedad de volátiles, como (Z)-3-hexenol, (Z)-3-

hexenal y acetato de (Z)-3-hexenilo, todos con 6 átomos de carbono (C6) y olor

característico (Márquez, 2009).

Ruta de los isoprenoides. Se da a partir de las vías del mevalonato y del no

mevalonato, dando origen a gran parte de los terpenos como los homoterpenos

(iononas, geranil acetona), monoterpenos (linalol, limoneno, mirceno),

sesquiterpenos (α-farmeseno, nerolidol, cariofileno) y diterpenos (cembreno, fitol).

Ambas vías tienen cómo intermediario común el isopentenil pirofosfato (IPF) y de

acuerdo al sitio de síntesis originan monoterpenos o sesquiterpenos (Mckaskill y

Croteau, 1998; citado en: Márquez, 2009).

Ruta de la β-oxidación. Es conocida cómo vía del ácido shikimico, en la cual, el

primer paso en la biosíntesis de los bencenoides se lleva a cabo por la fenilalanina

amonio liasa (FAL) al desaminar la alanina para generar ácido cinámico (AC)

precursor en la cadena de formación de una amplia gama de compuestos y

participante en la vía de la β-oxidación dependiente de CoA (Boatright et al. 2004;

citado en: Márquez, 2009).

2.2.2.4. Factores que afectan la concentración de volátiles en las frutas. La

contribución de cada volátil al perfil del aroma depende de la actividad y

especificidad de sustrato que puedan tener las enzimas relevantes en la ruta

biosintética, la disponibilidad del sustrato y la presencia de otros compuestos

(Rizzolo et al., 2006; citado en: Villatoro et al., 2008). Su concentración depende

de factores agronómicos (variedad, condiciones climáticas, etapa de maduración)

14

y tecnológicos (cosecha, postcosecha, almacenamiento y condiciones de proceso)

(Pontes et al., 2009). Existen contextos naturales incidentes, como la condición

climatérica de la fruta (Borges et al., 2011), y la senescencia, que provoca

degradación de volátiles generando una menor complejidad en el perfil de aroma

(Obando-Ulloa et al., 2009). Además, la cosecha prematura causa deficiencia de

sabor, por las bajas tasas de síntesis de precursores (Villatoro et al., 2008). Song

y Bangerth (1996) demostraron que la fruta cosechada 3 semanas previo al

climaterio no alcanzó el espectro total de aroma observado con la cosechada justo

antes del climaterio (Song y Bangerth, 1996; citado en: Song y Bangerth, 2003).

2.2.2.5. Clases químicas que albergan los volátiles existentes. Los terpenos

derivan de la unión de unidades de isopreno (que contienen 5 átomos de C) de

forma que se clasifican por el número de unidades (los monoterpenos por ejemplo,

tienen dos unidades C5) (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). Se sintetizan a partir de dos

rutas: la del ácido mevalónico, activa en el citosol, en la que tres moléculas de

acetil-CoA se condensan para formar ácido mevalónico que reacciona hasta

formar isopentenil difosfato (IPP), o la ruta del metileritritol fosfato (MEP) que

funciona en cloroplastos y genera también IPP (García, 2004; Ávalos y Pérez-

Urria, 2009). Se caracterizan por olores herbáceos y florales (El Arem et al., 2011).

Además resaltan los esteres, producidos por las especies de frutos blandos

durante su maduración (Pontes et al., 2009) y generados por esterificación de

alcoholes y acil-CoAs, reacción catalizada por la alcohol o-aciltransferasa (AAT),

cuya actividad sigue un patrón concomitante con la regulación del etileno en frutas

climatéricas (El Arem et al., 2011), aunque en estas frutas se presentan también

regulaciones etileno-independientes, lo que indica que la generación de esteres

puede depender del abastecimiento de sustratos (Villatoro et al., 2008). Un

estudio en manzanas reveló que durante la maduración no se presentan

variaciones en la actividad de la AAT, a pesar del incremento de los esteres,

relacionados con la mayor disponibilidad de sustrato (Villatoro et al., 2008).

Los aldehídos por su parte, parecen estar presentes en frutas inmaduras y

trabajan como compuestos de impacto en el aroma de frutas como la guayaba

madura (Diniz et al., 2007) y las lactonas, cuya presencia y estabilidad se

considera positiva en productos como el mango (Pandit et al., 2009). La Tabla 3

muestra las características de algunos de los volátiles conocidos, donde se puede

apreciar la diversidad de clases químicas, entre las cuales resaltan los esteres,

alcoholes, aldehídos y terpenos; así también, resaltan las características

sensoriales que estos volátiles suministran, como olores relacionados con la

senescencia y putrefacción, aromas verdes de la fruta, olores herbáceos y olores

específicos que identifican una determinada fruta.

15

Tabla 3. Características de algunos compuestos volátiles.

Volátil

Fórmula

Peso molecular

bp °C ((760

mmHg)

Clase química / biosíntesis

Fuente / bioactividad

Etileno

C2H4

28

−102

Hidrocarburo a partir de metionina.

Hormona de planta con roles en maduración, senescencia y respuesta a estrés.

Acetato de etilo

C4H8O2

88

77

Ester.

Ester de acetato que otorga olores frutales de manzana.

3-mercaptohexan-1-ol

C6H14OS

134

250

Alcohol.

Tiol volátil de aroma en maracuyá.

Metanetiol

CH3SH

48

6

Sulfuro.

Biogénica, olor de repollo podrido.

Isopreno

C5H8

68

34

Terpenoide.

Respuesta de estrés oxidativo de plantas.

Etanol C2H5OH 46 78 Alcohol. Respiración anaerobia.

Dimetil disulfuro CH3SSCH3 94 109 Disulfuro. Cebolla, ajo, sabor de café.

Hexanal

C6H12O

100

131

Aldehído via Lipoxigenasa.

Volátil de olor verde herbáceo.

Nonanal

C9H18O

142

191

Aldehído.

Aroma verde y fresco del dátil.

Etil 2-metibutanoato

C7H14O2

130

133

Ester a partir de isoleucina.

Compuesto clave del sabor (flavor) de la fruta.

(Z)-3-hexen-1-ol

C6H12O

100

156

Alcohol vía lipoxigenasa.

Volátil de hoja verde, olor herbáceo.

-ionona C13H20O 192 271 Cetona. Aroma floral de violetas.

Methional

C4H8S1O1

104

165

Tioéter aldehído.

Compuesto de sabor (flavor).

Linalol

C10H18O

154

198

Alcohol monoterpeno. Volátil común de planta con olor floral.

2-Z,6E-nocadienal

C9H14O1

138

203

Aldehído vía lipoxigenasa.

Sabor (flavor) del pepino.

Furaneol*

C6H8O3

128

216

Derivado del azúcar.

Furanona de fresa, aromatizante carnoso.

δ-octalactona

C8H14O2

142

238

Oxidación de ácidos grasos.

Microbial, alimentos lácteos-coco,fruta cremosa.

Hexyl hexanoato

C12H24O2

200

245

Ester a partir de la oxidación de ácidos grasos.

Ester frutal.

Escatol

C9H9N1

131

265

Heterociclo aromático.

Triptófano, olor afrutado fecal en niveles bajos.

α-farneseno

C15H24

204

280

Sesquiterpeno.

Volátil de flor y precursor del sabor (flavor).

Fuentes: Baldermann et al., 2005; Carbonell-Barrachina et al., 2006; El Arem et

al., 2011; Rowan, 2011; Fedrizzi et al., 2012.

2.2.3. Metodología para el análisis de compuestos de volátiles. La extracción y

concentración de los compuestos volátiles son necesarias previo al análisis

cromatográfico (Cai et al., 2001), por métodos que incluyen la SDE, la extracción

de vapor por destilación (EVD), la extracción en espacio de cabeza dinámica

(HSD) o estática (HSD), la SPME, y la extracción por fluido supercrítico (EFS)

(Kende et al., 2010; Rowan, 2011). Los métodos tradicionales de extracción han

sido la SDE y la EVD (Pontes et al., 2009), pero requieren largos tiempos de

extracción, grandes cantidades de solventes, múltiples etapas, y en el caso de la

16

extracción térmica, el muestreo convencional podrían generar la descomposición y

degradación de muchos compuestos volátiles inestables (Zhang et al., 2008).

Adicionalmente, la heterogeneidad en la composición de los compuestos volátiles

limita el rango de volátiles que pueden ser medidos por un método (Rowan, 2011).

2.2.3.1. Extracción por SDE. La extracción convencional consiste en que la

muestra interactúa con el disolvente y se produce una separación de fases en la

que el analito se distribuye entre estas, alcanzando un equilibrio denotado por una

constante denominada coeficiente de partición (K=concentración del analito en la

fase orgánica/ concentración del analito en la fase acuosa) (Vidal, 2009), mientras,

la destilación implica la evaporación por calor de una mezcla, con recogida de

estos vapores donde se encuentran los compuestos del flavor (Fisher y Scott,

1997). Alternativamente Likens y Nickerson en 1964 desarrollaron un método que

combina ambos fundamentos, SDE (Blanch et al., 1996). En 1984 se desarrolló un

prototipo micro-SDE, descrito por Godefroot et al. Una versión a escala reducida

del SDE original (Saxby, 1996). Blanch et al. (1993) modifican el sistema de micro

SDE, aportando una ampliación de la superficie de condensación para prevenir las

pérdidas de los componentes de elevada volatilidad, aumentando la eficiencia de

recuperación de los compuestos estudiados. Tal como se aprecia en la Figura 2, el

dispositivo posee 2 recipientes, el (1) contiene la muestra y el (10) contiene el

disolvente. El calentamiento controlado de ambos recipientes vaporiza los volátiles

y el disolvente; luego, los vapores se encuentran y se mezclan en una cámara (2)

y pasan a la zona de refrigeración (3) donde recorren un camino ascendente y uno

descendente, impulsados por vacío (13). El condensado posterior cae a un

depósito de decantación (4), enfriado, donde las fases se separan, de modo que la

fase pesada es dirigida hacia el recipiente (1), a través de (7) y (8), mientras la

ligera es dirigida al otro recipiente (10) (Blanch et al., 1993).

17

Figura 2. Características de la patente de invención del dispositivo de SDE.

Fuente: Blanch et al., 1993.

En general, la eficiencia de SDE es afectada por el tipo de solvente, la adición de

sal, que disminuye la solubilidad del compuesto volátil en agua, el tiempo de

extracción, cuyo exceso disminuye el número de compuestos recuperados, y la

temperatura de extracción (Yang et al., 2007). La SDE puede extraer diversidad de

compuestos, incluso de alto y bajo peso molecular al igual que la SPME, pero es

menos sensible que esta a los componentes traza (Cai et al., 2001), además, si se

disuelven compuestos de punto de ebullición elevado, estos no podrían ser

separados en la etapa subsiguiente por cromatografía de gases (Guadayol et al.,

1. Calderín de la muestra.

2. Cámara de mezcla.

3. refrigerante.

4. Depósito de separación de fases refrigerado.

5. Camisa de refrigeración.

6. Rebosadero de fase ligera.

7-8. Sifón de fase pesada.

9. Venteo del sifón (opcional).

10. Calderín del disolvente.

13. Venteo (conexión al vacío).

18

1997). Igualmente, el método de SDE comparado con métodos como SPME,

requiere mayores tiempos de extracción, volumen significativo de solvente y varias

etapas, incluyendo la extracción térmica, susceptible de generar degradación de

muchos compuestos volátiles inestables (Chen et al., 2006; Yang et al., 2007).

Se han realizado estudios de corte comparativo donde se han evidenciado las

diferencias,en las eficiencia y los tipo de compuesto recuperados a causa de las

características de la SDE, previamente enunciadas. En tomate, la SDE permitió

aislar compuestos de estructura química saturada, estables durante la destilación,

pero algunos compuestos obtenidos por SPME no fueron encontrados por SDE,

además, SDE generó artefactos, posiblemente a partir de la degradación térmica

de compuestos inestables, los cuales no fueron encontrados en SPME (Zhang et

al., 2008). La formación de artefactos durante la extracción por SDE, puede ser

debido a la polución, oxidación y reacciones térmicas (Yang et al., 2007). La SDE

también se ha utilizado para la extracción de volátiles en ciruelas azucaradas,

principalmente ácidos grasos de cadena saturada (Nunez et al., 2008), además se

han efectuado contrastaciones en frutas como uva, entre SDE y extracción sobre

barras magnéticas (EBM), con recuperaciones del 28.4% para EBM, contra 86.9%

en SDE (Caven-Quantrilla y Buglass, 2006), y en análisis de aceite proveniente de

oliva virgen, donde la SDE generó las más altas extracciones de terpenos, en

comparación con SPME, que tuvo mayor afinidad por alcoholes y cetonas (Vichi et

a., 2007).

2.2.3.2. Extracción por SPME. Este método fue introducido desde 1990 por

Pawliszyn y sus colaboradores (Ceva-Antunes et al., 2006), utilizada ampliamente

en estudios de aroma (Zhuo-Min, and Gong-Ke, 2007), tiene el propósito de

extraer y concentrar los analitos a partir de la muestra, utilizando una fase

estacionaria (Cai et al., 2001), que corresponde a una fibra de sílice fundida de

aproximadamente 1cm de longitud y 0.11mm de diámetro interno, químicamente

inerte, estable a altas temperaturas (Vidal, 2009) y recubierta por un sorbente de

80-100 µm, en la mayoría de los casos polimérico no volátil, seguida de la

desorción térmica en el inyector de un cromatógrafo de gases (Peñalver, 2002;

Zhang et al., 1994; citado en: Riu, 2005; Márquez, 2009;S koog et al., 2005).

La SPME en conjunción con GC-MS ha sido ampliamente usada en el análisis de

alimentos, con el propósito de permitir la determinación global de las sustancias

volátiles presentes (Béné et al., 2001; Cai et al., 2001). Este acople ha mostrado

resultados importantes en frutas, al analizarse satisfactoriamente compuestos

volátiles en siriguela (Ceva-Antunes et al., 2006), tomate (Markovic et al., 2007),

durian (Chin et al., 2007), maracuyá (Pontes et al., 2009), curuba (Pontes et al.,

2009), mango (Pandit et al., 2009), arazá (Londoño y López, 2012), pera (Qin et

19

al., 2012), entre otros. Además en la aplicación de SPME acoplada a GC-MS se

ha optado por la estrategia de congelación / descongelación de la muestra previo

a la extracción, obteniéndose desviaciones estándar relativas menores al 12% al

utilizar 3 réplicas, con mejoramiento en la sensibilidad de la técnica (Flores et al.,

2006). Como se aprecia en la Figura 3 (dispositivo comercial de extracción), el

pequeño tamaño de la fibra y su geometría cilíndrica permiten incorporarla a una

jeringa, facilitando la manipulación y protegiéndola cuando no se encuentra en uso

(Peñalver, 2002; Márquez, 2009).

Figura 3. Dispositivo comercial de extracción por SPME.

Fuente: Peñalver, 2002.

Las ventajas de la SPME frente a las técnicas tradicionales de preconcentración

son la rapidez de ejecución y simplicidad (Peñalver, 2002; Zhuo-Min, and Gong-

Ke, 2007;Zhang et al., 2008), bajo costo, (Riu, 2005; Chin et al. 2007),

automatizable (Peñalver, 2002; Vidal, 2009), versatilidad de matriz de análisis

(gaseosas, sólidas y liquidas) (Béné et al., 2001), compatibilidad con un amplio

rango de métodos de identificación (Chin et al. 2007), posibilidad de trabajar bajo

muestreo on-line (Vidal, 2009), no usa disolvente orgánico (Riu, 2005), facilidad de

transporte (Riu, 2005), permite una transferencia de masa rápida durante la

extracción y desorción (Vidal, 2009), ofrece mejor fidelidad en cuanto al perfil real

de la fruta (Pontes et al., 2009) y permite preconcentrar volátiles a partir del

espacio de cabeza o desde una solución, previo al análisis (Rowan, 2011). Las

principales desventajas son la pequeña cantidad de recubrimiento que dificulta la

obtención de límites de detección bajos (Peñalver, 2002), fragilidad de la fibra que

facilita su rápido deterioro, y los posibles efectos de memoria que se pudiesen

presentar (Vidal, 2009).

20

2.2.3.2.1. Fundamento del método de extracción SPME.

- Etapa de adsorción. Se basa en la partición de los analitos entre la matriz de la

muestra y el recubrimiento de la fibra, de manera que cuando la fibra y la muestra

entran en contacto, los analitos son transportados de la muestra a la fibra, y la

extracción finaliza cuando la concentración del analito logra un equilibro de

distribución entre ambas (Rowan, 2011). La aguja se inserta en la muestra y la

protección de la fibra es retraída para que esta quede expuesta a la muestra,

luego el polímero de la cubierta actúa como una esponja, concentrando el analito

por procesos de absorción o adsorción (Vas y Vékey, 2004).

- Etapa de desorción. Se efectúa en el inyector caliente del cromatógrafo de

gases y consiste en inyectar la aguja de metal para luego exponer la fibra de

manera que los analitos allí retenidos sean liberados en el cromatógrafo y se

puedan dar los procesos de separación subsiguientes (Vas y Vékey, 2004).

2.2.3.2.2. Tipos de extracción existentes en SPME. Existen principalmente dos

tipos de extracción por SPME:

SPME por inmersión directa de la fibra dentro de la muestra (ID-SPME).

Utilizada para la recuperación de metabolitos poco volátiles, el cual causa tiene

como desventajas la disminución la vida útil de la fibra y dificulta la

reproducibilidad de la extracción (Peñalver, 2002).

SPME de espacio de cabeza (HS-SPME). Implica la colocación de la fibra en el

espacio de cabeza de la muestra y los analitos pasarán a la fase gaseosa en

función de su presión de vapor (Peñalver, 2002; Márquez, 2009); tiene como

ventaja el alargamiento de la vida útil de la fibra, ya que se evitan interferencias

con otros componentes de la muestra, por lo cual, es el tipo de extracción más

utilizado para los analitos volátiles y semivolátiles. Este método se utiliza en

muestras líquidas, sólidas y gaseosas (Riu, 2005). El muestreo por espacio de

cabeza tiene la ventaja de una extracción más rápida y la selectividad es

frecuentemente mejorada en comparación con la inmersión directa (Vas y Vékey,

2004). Se recomienda que el volumen del espacio de cabeza sea lo más pequeño

posible, ya que el rendimiento de la extracción disminuye cuando aumenta el

volumen del espacio de cabeza por efecto de la dilución (Pillonel et al., 2002;

citado en: Riu, 2005).

2.2.3.2.3. Tipos de desorción existentes. Existen dos tipos de desorción para la

liberación de metabolitos a partir de la fibra de extracción:

Desorción térmica. Se lleva a cabo cuando el SPME se acopla a un cromatógrafo

de gases. Después de un tiempo de fijada, la fibra se retira y se inserta en el

puerto de un inyector calentado del cromatógrafo de gases, donde los volátiles son

21

desorbidos (desorción térmica) (Rowan, 2011). El inyector se encuentra a

temperatura elevada para que cuando el émbolo de la jeringa se baje

nuevamente, los analitos se desorban y entren a la columna de cromatografía. La

optimización del tiempo y temperatura utilizados para la desorción mejoran la

recuperación (Vas y Vékey, 2004).

Desorción por adición de solvente orgánico. Es un sistema útil para aquellos

compuestos que son térmicamente inestables o poco volátiles y, por tanto, no se

pueden desorber directamente a las altas temperaturas del inyector del

cromatógrafo. Se utiliza en los casos donde se combina la SPME con

cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) (Vas y Vékey, 2004).

2.2.3.2.4. Factores que determinan la eficiencia del proceso de SPME.

Temperatura y tiempo de extracción. En el muestreo por ID, el aumento de la

temperatura incrementa la cantidad del analito extraído, mientras en el muestreo

de HS, al aumentar la temperatura aumenta la concentración de los analitos en el

espacio de cabeza porque la extracción es más rápida al necesitar menos tiempo

para alcanzar el equilibrio, pero se reduce la eficacia de extracción por

disminución de los coeficientes de partición del analito entre el espacio de cabeza

y la fibra, con lo que decrece la cantidad de analito extraída por la fibra en

equilibrio (Riu, 2005). Se debe determinar el tiempo necesario para llegar al

estado de equilibrio, aquel a partir del cual, la cantidad de analito que se extrae se

mantiene constante y es característico de cada pareja analito-fibra (Pawliszyn,

1997; citado en: Riu, 2005).

Agitación de la muestra sometida a extracción. La implementación de agitación

disminuye el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en compuestos poco

volátiles (Jordán, 1999).

Presencia de sales en la muestra sometida a extracción. Puesto que las sales

aumentan el coeficiente de distribución de los analitos presentes en forma no

ionizada, la concentración del metabolito extraído aumenta, mientras que si el

metabolito está en forma ionizada, se reduce la eficacia de extracción por aumento

del coeficiente de actividad de las especies iónicas al aumentar la fuerza iónica de

la solución (Pawliszyn, 1997; citado en: Riu, 2005).

Volumen de la muestra sometida a extracción. La selección del volumen debe

realizarse en función de los coeficientes de distribución de los analitos, Kfs (Riu,

2005).

Temperatura y tiempo de desorción. Generalmente, la temperatura de

desorción óptima es igual al punto de ebullición del analito menos volátil y su

aumento hace decrecer la afinidad de los compuestos, con el consecuente

arrastre rápido por la fase móvil, lo que genera sobreposición de los picos (Vas y

Vékey, 2004); mientras el tiempo de desorción depende de la temperatura del

22

inyector y la velocidad de flujo lineal alrededor de la fibra y su limitación deriva en

una desorción insuficiente (Vas y Vékey, 2004).

2.2.3.2.5. Fibras comerciales utilizadas en SPME compatibles con GC. La

cinética de extracción es afectada por la geometría de la fibra, al punto de

considerarse el tipo y grosor de la fibra, como la característica más importante de

rendimiento en SPME. Se ha establecido que el tiempo de extracción se

incrementa con el aumento del espesor de la fibra y con menores coeficientes de

difusión del analito de la muestra, mientras que el uso de métodos de agitación

promueve su disminución (Vas y Vékey, 2004). Como se puede apreciar en la

Tabla 4, en el mercado existe una disponibilidad de fibras que se diferencian en

aspectos como el grosor, la temperatura máxima de trabajo, la polaridad (las fibras

polares son utilizadas para metabolitos polares y las no polares para metabolitos

no polares) y el tipo de proceso de extracción utilizado (absorción ó adsorción),

condiciones que pueden brindar mayor o menor ventaja de acuerdo al metabolito

que se pretende estudiar.

Tabla 4. Fibras comerciales usadas en SPME compatibles con GC.

Fase estacionaria

Espesor

T° máxima de uso

Proceso de extracción

Polaridad

PDMS (polidimetilsiloxano)

100m fase no enlazada 280°C

Absorción

No polar

30m fase no enlazada 280°C

Absorción

No polar

7m fase enlazada 340°C

Absorción

No polar

PDMS/DVB (divinilbenceno)

65m fase parcialmente entrecruzada

270°C

Adsorción

Bipolar

65m fase muy entrecruzada

270°C

Adsorción

Bipolar

PA (poliacrilato) 85m fase parcialmente entrecruzada

320°C

Absorción

Polar

CAR/PDMS (carboxen/PDMS)


320°C

Adsorción

Bipolar

CW/DVB (carbowax/DVB)


265°C

Adsorción

Polar

70m fase muy entrecruzada

265°C

Adsorción

Polar

DVB/CAR/PDMS

50/30m fase muy entrecruzada

1

270°C

Adsorción

Bipolar

50/30m fase muy entrecruzada

2

270°C

Adsorción

Bipolar 1fibra con recubrimiento depositado sobre una fibra de sílice fundida flexible; 2longitud especial de 2 cm.

Fuente: Riu, 2005.

23

2.2.3.3. Separación e identificación por GC-MS. La GC es un procedimiento de

separación de compuestos volátiles que son arrastrados por un gas a través de

una fase estacionaria fija en un tubo largo y fino (Willard et al., 1991). Luego, los

compuestos, al ser arrastrados por la fase móvil, son adsorbidos por la fase

estacionaria, y retenidos con mayor o menor fuerza, antes de llegar al detector en

el final de la columna (Kirk et al., 1996).

2.2.3.3.1. Funcionamiento de un cromatógrafo de gases. La muestra se inyecta

en un cromatógrafo de gases y el efluente pasa a la entrada de un espectrómetro

de masas, luego la fuente fragmenta e ioniza las moléculas, se analiza su masa y

se detecta. En GC-MS, el espectrómetro barre repetidas veces las masas (un

barrido puede durar un segundo) y el sistema suma la abundancia de iones en

cada espectro y representa la gráficas en función del tiempo para generar un

cromatograma total (Skoog et al., 2005). La Figura 4 muestra los principales

componentes de un cromatógrafo de gases, los cuales son: el gas de arrastre (1),

el inyector (2), la columna y horno (3), el detector (4) y el computador (5).

Figura 4. Componentes de un cromatógrafo de gases.

Fuente: Restrepo, 2009.

El gas (helio, argón, nitrógeno o hidrógeno) es el encargado de conducir la la

muestra a través de la columna hasta el detector (Willard et al., 1991), por lo que

debe ser químicamente inerte (Skoog y Leary, 1994), con una velocidad de flujo

de 25-150 mL/min en columnas empacadas y de 1-25mL/min en columnas

capilares tubulares abiertas (Skoog et al., 2005). Otro componente en GC es el

sistema de inyección, que permite utilizar microjeringa para líquidos y fibras de

SPME para gases, para que la muestra sea inyectada (0.5 a 10 µl) a través de un

diafragma o “septum” de goma de silicona en una cámara de vaporización

instantánea situada en la cabeza de la columna, donde se mezcla con el gas

vehículo caliente (Skoog y Leary, 1994). El puerto de muestras se mantiene a 50

°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra

(Skoog et al., 2005). Por su parte, las columnas pueden ser empaquetadas o

24

capilares, estas últimas son de uso constante por su rapidez y eficiencia (Matissek

et al., 1992). Las columnas son mantenidas en hornos con capacidad para ser

calentados y enfriados rápidamente (Willard et al., 1991). El modo isotermo

restringe el análisis por GC a compuestos con punto de ebullición dentro de un

intervalo estrecho, dado que los que ebuyen a temperaturas bajas son eluídos

rápidamente (Matissek et al., 1992), por ello, en caso de muestras con intervalos

de ebullición amplio se recomienda el uso de un programa de temperaturas, con

incremento térmico escalonado para mejores (Skoog et al., 2005).

2.2.3.3.2. Espectrometría de masas como sistema de detección en

cromatografía de gases. Se ha considerado que un detector idóneo debe tener

una sensibilidad entre 10-8 y 10-15 gr de soluto/seg, buena estabilidad y

reproducibilidad, un intervalo de temperatura desde la ambiental hasta 400 °C,

rápido tiempo de respuesta, facilidad de empleo y similitud en la respuesta a todos

los solutos (Skoog et al., 2005).

Entre los detectores utilizados, el espectrómetro de masas es el más sofisticado

para GC (Kirk et al., 1996), y mide la relación masa/carga (m/z) de iones que se

producen a partir de la muestra. En cuanto a su funcionamiento, en el caso de la

GC, la muestra entra en la forma de vapor y con interfase entre el sistema de GC

a presión atmosférica y el sistema del espectrómetro de masas. La fuente de

ionización del espectrómetro de masas rompe los enlaces químicos de las

moléculas en la muestra produciendo fragmentos (iones moleculares) ionizados y

moléculas no ionizadas, luego el analizador divide los iones según su valor m/z y

el sistema genera un gráfico de la intensidad de los iones frente al valor m/z. En el

caso del CO2, la ruptura del enlace C–O en el ion molecular produce CO+ (m/z=28)

y O+ (m/z=16), además de la pérdida de ambos átomos de oxígeno, que origina C+

(m/z=12) (Skoog et al., 2005). El espectrometro de masas posee un sistema de

entrada que permite la la introducción de una muestra representativa en la fuente

de iones, con la mínima pérdida de vacío (Skoog y Leary, 1994), una fuente de de

ionización, que para el caso de GC-MS puede ser de impacto electrónico (IE)

donde se bombardea a la molécula con un haz de electrones, produciendo iones

positivos, negativos y especies neutras, y los iones positivos se dirigen hacia el

analizador por repulsión electrostática (Skoog et al., 2005); o de ionización

química (IQ), donde hay interacciones químicas iónico moleculares entre una gran

cantidad de iones, formados a partir de un gas reactivo y las moléculas neutras

procedentes de una pequeña cantidad de muestra (Willard et al., 1991). Otros

componentes son los analizadores, encargados de separar los iones producidos

en la fuente iónica, de acuerdo con sus diferentes relaciones de m/z (Willard et al.,

1991), siendo utilizados en GC-MS el de cuadrupolo y las trampas de iones

(Skoog et al., 2005). El espectrómetro de masas cuenta con detector de iones,

25

fundamentado en la colisión de estos con una superficie detectora, la cual provoca

la emisión de electrones, fotones u otros iones, posteriormente decodificados

mediante transformación de Fourier (Skoog et al., 2005). Finalmente, los soportes

de identificación involucran el reconocimiento de espectros que son comparados

con patrones o librerias comerciales (Reinhard et al., 2008).

2.2.4. Métodos de conservación durante el almacenamiento de la pulpa de

fruta.

2.2.4.1. Escaldado. Es un tratamiento térmico suave, por medio de agua o vapor,

pero no un método de conservación per se, su aplicación se realiza entre la

preparación y subsecuente procesado del producto y consiste en el calentamiento

rápido del producto hasta una temperatura predeterminada, mantenimiento

durante un tiempo adecuado y un enfriamiento rápido (Brennan, 2008). Las

enzimas y los microorganismos son los principales causantes del deterioro de los

alimentos, ambos susceptibles al calor (Coles et al., 2004), por lo cual, este

proceso se utiliza para destruir la actividad enzimática de frutas y verduras, y

reducir en alguna medida el desarrollo microbiano (Shafiur, 2003). Las

combinaciones de tiempo y temperatura utilizadas para la inactivación de estas

enzimas son muy variables para los distintos alimentos, considerándose

tratamientos comunes aquellos en los que se administra 70-100°C durante 1-15

minutos (Brennan, 2008). Los factores que determinan el tiempo de escaldado son

el tipo de fruta, tamaño, la temperatura de escaldado y el sistema de

calentamiento (Fellows, 2007), mientras que el grado de calor necesario para

conseguir un producto estable dependerá de la naturaleza del producto, presencia

de enzimas, número y tipo de microorganismos presentes y condiciones de

almacenamiento del producto (Coles et al., 2004).

2.2.4.1.1 Efecto del escaldado sobre los alimentos. La cantidad de calor que el

alimento recibe durante el escaldado altera inevitablemente su valor nutritivo y

características organolépticas, aunque los cambios son menores a tratamientos

como la esterilización (Fellows, 2007). El control del tiempo y temperatura

disminuye el efecto sobre algunas condiciones de la fruta, como las que a

continuación se describen:

Durante el escaldado se pierden minerales vitaminas hidrosolubles, principalmente

por la termodestrucción y en menor grado por la oxidación.

El escaldado insuficiente produce aromas extraños en el almacenamiento.

El escaldado excesivo puede producir ablandamiento del fruto.

En el escaldado con agua se puede presentar la pérdida de sólidos solubles.

Se pueden presentar pérdidas de nutrientes y vitaminas.

26

El encogimiento y ablandamiento de los tejidos es otra consecuencia del

escaldado (Shafiur, 2003; Fellows, 2007; Brennan, 2008).

2.2.4.2. Refrigeración. Se entiende como el empleo de temperaturas en un

ámbito inferior a las del medio circundante y por encima de la del inicio de la

congelación del producto (Tscheuschner, 2001), específicamente, esta operación

unitaria implica mantener la temperatura del producto entre 0°C y 5°C (Coles et al.,

2004). Los objetivos principales que persigue el proceso de refrigeración son, la

conservación del producto a través de la reducción del ritmo de deterioro de las

transformaciones microbianas y bioquímicas del alimento (Tscheuschner, 2001).

La importancia de la refrigeración de la fruta radica en el interés de los mercados

por características como el flavor y los atributos nutricionales, capaces de ser

mantenidos por los procesos de refrigeración (Brennan, 2008).


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CAPÍTULO III. EVALUACIÓN COMPARATIVA DEL ANÁLISIS DE COMPUESTOS VOLÁTILES EN PULPA DE LULO (S. quitoense L.) POR HS-

SPME/GC-MS Y SDE/GC-MS - Resumen. Inicialmente se realizó un diseño de dos vías, teniendo como factores el tipo de fibra de HS-SPME y la temperatura de adsorción. Igualmente, un diseño experimental completamente aleatorizado se aplicó al tipo de solvente utilizado en SDE con tres niveles (hexano, diclorometano y acetato de etilo). En ambos casos se estudió el efecto de estos factores sobre el área total de los volátiles en la fruta. Finalmente, se compararon las áreas totales y las áreas de grupos químicos obtenidas por ambos métodos de extracción. Con HS-SPME, el análisis de varianza aplicado al área total de volátiles mostró un efecto significativo en la interacción entre el tipo de fibra y la temperatura de adsorción (P valor= 0.00). El grupo de mayor área obtenida por HS-SPME con todas las fibras fue el de los

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ésteres, seguido de los alcoholes y aldehídos. A través de SDE se obtuvieron principalmente hidrocarburos, ésteres y aldehídos. La prueba de Tukey indicó que los ésteres, alcoholes, aldehídos, cetonas y ácidos tuvieron un área estadísticamente superior con acetato de etilo, mientras el diclorometano fue el más eficiente recuperando hidrocarburos. La prueba t aplicada al método de extracción indicó diferencias entre las áreas medias de los ácidos, aldehídos y cetonas a favor de la extracción por SDE/GC-MS, mientras los ésteres, alcoholes e hidrocarburos tuvieron áreas superiores con HS-SPME/GC-MS. Palabras claves. Compuestos volátiles, Fruta, HS-SPME, Metabolitos secundarios, SDE. - Abstract. Initially was performed a two-way design, having as factors the type of fiber of HS-SPME and the adsorption temperature. Likewise, a completely randomized experimental design was applied to the type of solvent used in SDE, with three levels (hexane, dichloromethane and ethyl acetate). In both cases, the effect of these factors on the total areas of volatiles in the fruit was examined. Finally, the total areas and the areas of the groups obtained by both extraction methods were compared. With HS-SPME, the analysis of variance applied to the total area of volatiles showed a significant effect in the interaction among the type of fiber and adsorption temperature (P value= 0.00). The group of greater area obtained by HS-SPME with all fibers was the esters, followed by the alcohols and aldehydes. Through SDE were obtained mainly hydrocarbons, aldehydes and esters. The Tukey test indicated that esters, alcohols, aldehydes, ketones and acids had a statistically superior area with ethyl acetate, whereas dichloromethane was the most efficient recovering hydrocarbons. The t test applied to the extraction method indicated differences between the means areas of acids, aldehydes and ketones in favor of the extraction by SDE/GC-MS, while esters, alcohols and hydrocarbons had higher areas with HS-SPME/GC-MS. Keywords. Fruit, HS-SPME, SDE, Secondary metabolites, Volatile compounds. - Introducción. Los compuestos volátiles son considerados metabolitos terminales responsables de la generación del aroma en frutas (Suárez y Duque, 1992; El Arem et al., 2011), los cuales se sintetizan durante las etapas que conducen a la maduración (Grant et al., 1998; Pesis, 2005; Zhang et al., 2008; Kende et al., 2010). La generación de volátiles tiene influencia sobre el aroma del producto (Min et al., 2003; Chen et al., 2006; Markovic et al., 2007; Pandit et al., 2009; Kende et al., 2010; Qin et al., 2012), y consecuentemente sobre su calidad (Oliveira et al., 2010) y aceptabilidad por los consumidores (Rowan, 2011; Carbonell-Barrachina et al., 2006). Se han realizado diferentes estudios para comparar el efecto del tipo de fibra de SPME sobre la adsorción de los componentes volátiles en las frutas (Pellati et al., 2005; Quijano y Pino, 2006; Ceva-Antunes et al., 2006; De Oliveira et al., 2007; Reinhard et al., 2008; Pontes et al., 2009; Cheong et al., 2011; Pereira et al., 2011; Pino et al., 2012). Dentro de los referentes explorados sin embargo, no existen contrastaciones del comportamiento de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense Lam. utilizando diferentes fibras de SPME.

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Respecto al análisis de volátiles en lulo, un referente comparativo entre las fracciones volátiles de las pulpa de S. quitoense Lam. originarias de Colombia y Costa Rica, usando extracción con pentano y éter (2:1), mostró que la fruta de Colombia tenía mayor riqueza en ésteres relacionados con notas frutales (Brunerie and Maugeais, 1992). Además, las características volátiles de la fruta se han analizado mediante CO2 super crítico obteniéndose principalmente ésteres y alcoholes, siendo los de mayor concentración: benzoato de metilo, ácido acético, hexadecano y hexanoato de metilo (Parada et al., 1993). Otra especie de lulo, S. vestissimum ha sido objeto de evaluación en cuanto a sus características volátiles por SDE con eter dietílico y pentano (1:1) y GC-MS, con predominio de hidrocarburos y esteres, así como una presencia cuantitativa superior de compuestos como propionato de metilo, butanoato de metilo, acetato de butilo, (E)-2-butenoato de metilo, acetato de 3-metilbutilo, hexanoato de metilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, benzoato de metilo y (Z)-3-hexenol (Suárez y Duque, 1991). El estudio realizado permitió obtener la fracción volátil de la pulpa de lulo mediante SDE/GC-MS con solventes de diferente polaridad, y con HS-SPME/GC-MS usando diferentes fibras, en perspectiva de un análisis comparativo. 3.1. ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DE S. quitoense L. MEDIANTE HS-SPME/GC-MS 3.1.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles por HS-SPME/GC-MS 3.1.1.1. Selección de la fruta. Las unidades experimentales de S. quitoense L. fueron seleccionadas en la finca “Villa Malicia”, localizada a 1 km de Manizales (Caldas, Colombia), con una altitud aproximada de 2.160 MSNM. Las frutas provenían de cultivos obtenidos por reproducción de tejido y desarrollados a través de propagación in vitro de semillas, en la empresa biotecnológica Agro in-vitro S.A.S, ubicada en Manizales. Los cultivos de S. quitoense L. crecieron sin adición de compuestos agroquímicos como los organoclorados, organofosforados y carbamatos, y sus controles biológicos se llevaron a cabo con Beauveria bassiana, Bacillus thuringiensis y fungicidas "Sello Verde". Las unidades de lulo tuvieron como criterio experimental de inclusión las siguientes condiciones: estar en estadio cinco de maduración de acuerdo con la tabla de la Norma Técnica Colombiana NTC 5093, tener un diámetro entre 5 y 6 cm y grados brix de 10.3 ± 0.2 de acuerdo a Mejía et al., (2012). Adicionalmente, las unidades experimentales con signos como heridas y manchas producidas por microorganismos o insectos fueron descartadas. Se utilizaron separadores plásticos para evitar el deterioro de sus condiciones originales por fricción o aplastamiento durante el transporte.

3.1.1.2. Diseño experimental para la implementación del análisis por HS-SPME/GC-MS. Se realizó un diseño factorial a dos vías, donde el primer factor fue el tipo de fibra con cuatro niveles (PDMS, CAR/PDMS, PDMS/DVB y

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DVB/CAR/PDMS) y el segundo fue la temperatura de adsorción con 2 niveles (40 ºC y 60 ºC). La variable de respuesta fue el área total de volátiles y por cada tratamiento se efectuaron cinco repeticiones. Los datos obtenidos fueron analizados con ayuda del software SPSS® version 22. 3.1.1.3. Fibras de HS-SPME utilizadas. Se utilizaron cuatro fibras para la detección de los volátiles a partir de las pulpas de la fruta: polidimetilsiloxano (PDMS, 100 µm), carboxeno/polidimetilsiloxano (CAR/PDMS, 75 µm), polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB, 65 µm), divinilbenceno/carboxeno/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS, 50/30 µm). Cada fibra fue previamente acondicionada de acuerdo a las instrucciones del fabricante para permitir la activación de los grupos funcionales en su superficie. 3.1.1.4. Procedimiento de extracción. La unidad de muestra de S. quitoense L. fue lavada con agua destilada durante 20 segundos y cortada con un cuchillo estéril para la separación de la cáscara y obtención de la pulpa. De cada unidad de análisis, fueron pesados 10 g de pulpa en un vial con capacidad de 20 ml. Al vial se le adicionó además 1 g de cloruro de sodio y 5 µl de una solución de 1-octanol, usada como estándar interno, con una concentración de 0.0018 mol/L. El contenedor fue sellado con un tabique de teflón de recubierto de silicona y colocado en un baño de agua. La fibra respectiva de SPME fue insertada manualmente en el espacio de cabeza de la pulpa (a un distancia aproximada de 3 cm), y expuesta por 30 minutos manteniendo una temperatura de 40 o 60 ºC de acuerdo con el experimento propuesto. Posteriormente, la fibra fue extraída e introducida en el puerto de inyección del equipo de GC-MS para la desorción posterior. Finalmente, se retiró la fibra del puerto de inyección. Después de cada análisis, se realizó un ensayo sin exposición de la fibra a la pulpa de S. quitoense L. para asegurar la ausencia de trazas de volátiles que pudiesen afectar el análisis subsecuente (efectos de memoria). 3.1.1.5. Análisis e identificación de los compuestos volátiles de S. quitoense L. Se utilizó el cromatógrafo de gases Shimadzu® GCMS/QP 2010 Plus con inyector split/splitless acoplado a un detector de espectrometría de masas (MSD). Los volátiles fueron desorbidos por 2 min a 230 ºC en el inyector, en modo splitless. Se utilizó un liner de SPME 0.75 mm I.D. (Supelco, Bellefonte, PA). El helio fue el gas de arrastre que circuló a una tasa de flujo constante de 4 mL/min, a través de una columna analítica semipolar Shimadzu® SHRVGC (30 m x 0.25 mm ID x 1.4 µm DF), con un rango de temperatura de -40 ºC a 240/260 ºC. El control de flujo trabajó en modo velocidad lineal (36 cm s-1), la presión fue de 55.2 kPa, el flujo de la columna fue 0.98 mL min-1. La rampa de temperatura fue la siguiente: después de un periodo inicial de un minuto a 50 ºC, la temperatura se aumentó 2.5 ºC/min hasta alcanzar 150 ºC, permaneciendo por siete minutos, luego fue elevada 15 ºC/min hasta llegar a 220 ºC, manteniéndose por tres minutos y finalmente, fue incrementada 15 ºC/min hasta llegar a 230 ºC, nivel en el que continuó por otros dos minutos. La adquisición de datos y el control del sistema fueron alcanzados con el software “GC solution” versión 2.5 (Shimadzu Scientific Instruments, Inc).

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El espectrómetro de masas mantuvo la temperatura de la fuente de iones en 235 ºC, la temperatura de la interfase correspondió a 240 ºC, el tiempo de equilibrio fue de un minuto, se tuvo un tiempo para corte de solvente de tres minutos, el modo de ionización fue por impacto de electrones (EI) a 70 eV, con un rango de masas entre 33 y 350 Da. El detector operó con 1.0 kV, y cada análisis se realizó en un tiempo de 50 minutos. Para cada metabolito volátil obtenido en el cromatograma, se determinó el total del área de los picos y la identificación se basó en la comparación de su espectro de masas con los del Sistema de Identificación y Deconvolución de Espectro de Masas Automatizado (AMDIS) del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (Biblioteca del NIST®, versión 08), teniendo como criterio de identificación una concordancia igual o superior al 93%. La cantidad de cada volátil fue expresada como área relativa del pico (abundancia relativa del compuesto). La figura 5 muestra en sobreposición los cromatogramas obtenidos al analizar los volátiles de S. quitoense L. por HS-SPME/GC-MS utilizando las fibras PDMS/DVB (picos de color verde), CAR/PDMS (picos de color azul), DVB/CAR/PDMS (picos de color negro) y PDMS (picos de color rojo).

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Figura 5. Cromatogramas sobrepuestos de los compuestos de S. quitoense L. por HS-SPME/GC-MS con diferentes fibras a 40 ºC (arriba) y 60 ºC (abajo). 3.1.2. Compuestos volátiles de S. quitoense L. obtenidos por HS-SPME acoplado GC/MS utilizando diferentes fibras y temperaturas de adsorción. El proceso de extracción utilizando diferentes fibras favoreció una recuperación de 64 compuestos volátiles diferentes (Tabla 5), entre los cuales, hubo un predominio de ésteres (23.43%), seguidos por aldehídos (20.31%) y alcoholes (17.18%). Con la fibra compuesta de CAR/PDMS fue obtenido un mayor número de compuestos (50 entre ambas temperaturas), mientras con la fibra de PDMS fueron recuperados menos de 15 compuestos.

39

Tabla 5. Constituyentes volátiles obtenidos por HS-SPME/GC-MS en la pulpa de S. quitoense L. utilizando diferentes fibras.

Nombre del compuesto Tiempo de retención promedio

CAR/PDMS DVB/CAR/PDMS PDMS/DVB PDMS

40 ºC 60 ºC 40 ºC 60 ºC 40 ºC 60 ºC 40 ºC 60 ºC

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Área promedio

% de Área

Acetato de metilo 3.28 14654011 3.89 8439839 1.76 2680994 1.14 1740335 1.05 370398 0.19 - - 43164 0.48 32337 0.72 No identificado 1 3.74 9630613 2.57 2887994 0.60 1944216 0.83 637699 0.39 464067 0.24 219798 0.19 65010 0.73 92211 2.06 2-metil propanal 3.99 113237 0.03 - - - - - - - - - - - - - - Acetato de etilo 4.97 3483665 0.93 2213864 0.46 230605 0.10 147980 0.09 131318 0.07 - - - - - -

Propionato de metilo 5.36 937759 0.25 565121 0.12 210817 0.09 - - - - - - - - - - No identificado 2 5.77 772475 0.21 1310856 0.27 974278 0.42 1354106 0.82 346396 0.18 1094440 0.96 - - - -

Acetato de metiletilo 6.35 392981 0.10 162496 0.03 - - - - - - - - - - - - Ácido acético 7.12 341335 0.09 284000 0.06 - - 123695 0.08 - - - - - - - - (E)-2-butenal 7.40 293031 0.08 - - 191814 0.08 134018 0.08 - - - - - - - - 1-penten-3-ol 7.72 1779914 0.47 1427206 0.30 247712 0.11 113388 0.07 177441 0.09 - - - - - -

1-penten-3-ona 8.08 418922 0.11 452101 0.09 124701 0.05 56551 0.03 - - - - - - - - 3-pentanol 8.22 133130 0.04 - - - - - - - - - - - - - - Pentanal 8.46 710511 0.19 552868 0.12 120465 0.05 - - - - - - - - - -

Butanoato de metilo 9.46 4199820 1.12 3043884 0.63 614693 0.26 269839 0.16 494419 0.26 - - - - - - Propanoato de 2-metil-2-propilo 9.71 241059 0.06 177414 0.04 - - - - - - - - 15213 0.16 - -

Tolueno 9.62 3300707 0.88 7328125 1.52 1444063 0.61 442537 0.26 861033 0.44 - - 29644 0.31 - - 2-butenoato de metilo 11.04 1414531 0.38 1689797 0.35 688254 0.3 772184 0.47 123761 0.06 - - - - - -

Propanoato de 2-metilpropilo 11.21 472544 0.13 361165 0.08 148490 0.06 - - 76260 0.04 - - - - - - (E)-2-pentenal 12.47 712128 0.19 904742 0.19 236984 0.10 291748 0.18 - - - - - - - -

(Z)-2-penten-1-ol 12.32 1039871 0.28 1319366 0.27 182524 0.08

- - - - - - - - 2-metil-1-penten-1-ona 13.24 538814 0.14 864111 0.18 345539 0.15 164207 0.10 156315 0.08 - - - - - -

Hexanal 13.36 8501900 2.27 9478684 1.97 3271647 1.40 1034491 0.63 1871099 0.98 917465 0.80 56450 0.61 31605 0.68 o-xileno 14.91 557634 0.15 - - - - - - - - - - - - - -

(E)-3-Hexen-1-ol 19.06 1397845 0.37 1759317 0.37 451444 0.19 278086 0.17 391627 0.20 206856 0.18 - - - - (Z)-3-Hexen-1-ol 16.93 81002246 21.58 109660632 22.83 38612828 16.52 27378682 16.62 29242829 15.29 18018103 15.63 902630 9.98 780396 17.23

1-hexanol 17.48 45799929 12.21 60788460 12.65 24231385 10.36 16135362 9.80 19605285 10.24 10570324 9.18 639148 7.04 385630 8.56 (E)-2-hexenal 17.99 72391001 19.29 96683171 20.12 42730002 18.29 32145091 19.51 16522399 8.63 11343149 9.86 707404 7.81 610967 13.43

Acetato de (Z)-2-penten-1-ol 18.77 1557557 0.42 1912917 0.40 1147564 0.49 477474 0.29 1154536 0.60 319905 0.28 - - - - Acetato de pentilo 18.97 250300 0.07 291244 0.06 - - - - 144714 0.08 - - - - - - No identificado 3 19.28 - - - - 166055 0.07 - - - - - - - - - - No identificado 4 20.06 204190 0.05 279861 0.06 - - - - - - - - - - - -

Decano 21.49 297568 0.08 683908 0.14 177368 0.08 - - - - - - - - - - (E.E)-2,4-hexadienal 22.97 1582894 0.42 2378771 0.50 270957 0.12 478276 0.29 - - - - - - - -

1-octen-3-ol 23.92 255063 0.07 - - 281234 0.12 - - - - - - - - - - 1-octen-3-ona 24.31 430436 0.11 - - 640250 0.27 302217 0.18 424617 0.22 395507 0.34 - - - - (Z)-2-heptenal 24.47 1642947 0.44 1494823 0.31 1474597 0.63 678900 0.41 1058918 0.55 - - - - - -

Acetato de (Z)-3-Hexenilo 24.67 82733792 22.05 106869329 22.25 78903956 33.75 41721988 25.29 87345123 45.55 36031982 31.09 5085064 55.61 1877480 40.72 Acetato de hexilo 24.98 20892974 5.56 27260494 5.67 17933565 7.67 9846636 5.95 18526695 9.64 7677780 6.60 942637 10.11 236380 5.06

Octanal 25.55 576087 0.15 418084 0.09 395528 0.17 192202 0.12 403631 0.21 137240 0.12 - - - - 1-metiletil éster del ácido hexanoico 25.88 - - 259301 0.05 - - - - - - 75541 0.06 - - - -

3-hidroxibutanal 26.63 - - - - 110932 0.05 - - - - - - - - - - Ácido hexanoico 27.22 225356 0.06 869046 0.18 326937 0.14 629298 0.38 263959 0.14 630122 0.55 - - - -

2,2,6-trimetil ciclohexanona 27.73 237697 0.06 321977 0.07 292571 0.12 208627 0.13 161823 0.08 174454 0.15 - - - -

Ácido (E)-3-hexenoico 28.98 289986 0.08 891388 0.19 386548 0.17 795329 0.49 329803 0.17 702755 0.61 - - - - Ácido (E)-2-hexenoico 30.37 2200808 0.59 6883908 1.43 2018504 0.86 6218748 3.79 2121006 1.11 3199198 2.78 - - - -

No identificado 5 30.59 - - - - - - - - - - - - 43608 0.48 193210 4.23 3,7-dimetil-1.6-octadien-3-ol 30.60 1146909 0.31 6150670 1.28 1905467 0.81 8028817 4.86 1560545 0.81 8345835 7.21 - - - -

Acetofenona 31.40 597398 0.16 532770 0.11 371239 0.16 431733 0.27 283239 0.15 480243 0.42 - - - - Nonanal 31.68 588674 0.16 1258515 0.26 742400 0.32 861734 0.53 798200 0.42 1190221 1.03 - - - -

Undecano 31.93 310760 0.08 1317128 0.27 386640 0.17 369052 0.22 294210 0.15 1112521 0.96 - - - - 2-metilpropil éster del ácido hexanoico 32.83 - - 421035 0.09 391327 0.17 272051 0.16 351609 0.18 142626 0.12 - - - -

Butanoato de (Z)-3-hexenil 34.91 - - 279709 0.06 232273 0.10 227936 0.14 281197 0.15 301900 0.26 - - - - 5-etildihidro-2(3H)-furanona 35.51 - - - - - - 114257 0.07 - - - - - - - -

1,7,7-trimetil-biciclo[2.1.1]-heptan-2-ona 35.80 2480627 0.66 1260762 0.26 3274923 1.40 3065696 1.86 3224477 1.68 3854460 3.34 322760 3.60 131619 2.90 No identificado 6 35.99 - - - - 395433 0.17 895256 0.54 369424 0.19 1034065 0.89 - - - -

3-ciclohexen-1-metanol 36.53 - - 636721 0.13 - - 1367938 0.83 - - 1850328 1.59 - - - - Decanal 38.67 280553 0.07 1114660 0.23 312411 0.13 390081 0.24 - - 1291819 1.10 - - - -

Ácido octanoico 38.30 - - 611634 0.13 - - 226751 0.14 - - - - - - - - No identificado 7 39.38 265004 0.07 - - - - - - - - - - - - - -

2,6,6-trimetil-1-ciclohexen-1-carboxialdehído 39.39 - - 233713 0.05 339083 0.14 552066 0.33 308982 0.16 614935 0.53 - - - -

No identificado 8 40.27 - - - - - - - - - - 1506662 1.28 - - - - 4-heptanona 41.30 545535 0.15 435940 0.09 687303 0.29 1774030 1.07 618478 0.32 2189027 1.89 140597 1.57 87399 1.94

No identificado 9 42.16 - - 1394436 0.29 - - 222611 0.13 310671 0.16 - - - - - - 6,7-dodecanodiona 43.06 352556 0.09 254164 0.05 536742 0.23 1286235 0.78 473859 0.25 - - 138865 1.53 108807 2.46

40

3.1.2.1. Efecto de los factores evaluados sobre las áreas totales de volátiles. Con ambas temperaturas se obtuvo mayor eficiencia en la extracción de metabolitos volátiles mediante la fibra de CAR/PDMS, mientras que a partir de la fibra recubierta con PDMS se exhibió una menor área total de estos compuestos. Además, con las fibras revestidas por PDMS, PDMS/DVB y DBV/CAR/PDMS se obtuvo una media mayor a 40 ºC que a 60 ºC, situación contraria al promedio de áreas obtenido con la fibra compuesta por CAR/PDMS (Figura 6). El análisis de varianza respectivo mostró un efecto significativo en la interacción entre el tipo de fibra y la temperatura de adsorción (valor P= 0.00). La interacción entre los factores suministrados durante la extracción de los metabolitos volátiles de S. quitoense L. se presentó porque cada fibra posee una condición polar diferente debido a la composición de su recubrimiento, e igualmente, porque cada compuesto volátil posee un comportamiento diferente en cuanto a punto de ebullición, polaridad y peso molecular, de manera que la extracción de la composición volátil de cada fruta tendrá mayor o menor eficiencia dependiendo de la interacción entre la temperatura y el tipo de fibra administradas.

Figura 6. Gráfico de interacción para el área total de volátiles de la pulpa de S. quitoense L. por GC-MS con diferentes fibras y temperaturas de adsorción. 3.1.2.1.2. Evaluación de supuestos para la variable área total de volátiles. En cuanto a la evaluación de los supuestos estadísticos, la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, con un valor P de 0.243 (Estadístico W= 0.96) indica que los datos de los residuos correspondientes a la variable de respuesta “área total de volátiles” son normales. Igualmente, los resultados de la prueba de homocedasticidad de Levene muestran que los datos de la variable de respuesta “área total de volátiles” poseen varianzas homogéneas, con un valor P de 0.082. Finalmente se aplicó la prueba de Durbin-Watson a los residuales, obteniéndose un valor P de 0.141 (Estadístico D= 2.035), el cual indica que no existe autocorrelación entre los datos obtenidos de las respectivas áreas totales.

41

3.1.2.1.3. Análisis de regresión y establecimiento del modelo predictivo para la variable área total de volátiles. Los resultados del análisis de varianza para la regresión múltiple indicaron que el área total de volátiles se encuentra asociada con al menos uno de los factores estudiados (P= 0.000). Además, el coeficiente de correlación de la regresión tuvo un valor de 0.999 indicando alta correlación entre la variable de respuesta y los factores administrados. Al establecer los coeficientes del análisis de regresión entre los factores tipo de fibra y temperatura de adsorción frente a la variable área total de volátiles, se evidenció asociación significativa de las interacciones evaluadas con la respectiva variable dependiente (Tabla 6). Tabla 6. Coeficientes del análisis de regresión para el área total de volátiles, teniendo como variables explicativas la temperatura de adsorción y el tipo de fibra.

Parámetro Coeficientes Error típico

Estadístico t

Probabilidad

Intervalo de confianza del 95%

L. Inferior L. Superior

Intercepción 18260501 11173116 1.634 0.11199199 -4498391 41019393 Temperatura -228207 219123 -1.041 0.30546703 -674546 218130 X2 146967041 15801172 9.301 1.2945E-10 114781107 179152976 X3 353383409 15801172 22.364 4.21E-21 321197475 385569343 X4 325414064 15801172 20.594 4.99E-20 293228130 357599998 X2*Temperatura 5481101 309886 17.687 4.43E-18 4849883 6112319 X3*Temperatura -3218258 309886 -10.385 8.92E-12 -3849476 -2587040 X4*Temperatura -3572547 309886 -11.528 6.25E-13 -4203765 -2941329

Lo anterior indica que para establecer el valor predictivo del área (Â) con cada temperatura y fibra utilizada se deben tener en cuenta las estimaciones de todos los parámetros, dentro del siguiente modelo:

Â = 182605E7 – 228208 * Tº + 146967E8 * X2 + 353383E8 * X3 + 325414E8 * X4 + 54811E6 * Tº

* X2 - 321826E6 * Tº * X3 - 357255E6 * Tº * X4

Los valores predictivos del modelo indican que para el análisis de S. quitoense L. utilizando una fibra de extracción compuesta por CAR/PDMS a una temperatura de adsorción de 60 ºC se obtendría un área total cercana a 480401155, mientras que con esta misma fibra a 40 ºC, el valor esperado del área total es menor y está alrededor de 375343284. Con las demás fibras el valor predictivo es menor en ambas temperaturas en comparación con la fibra de CAR/PDMS. 3.1.2.2. Comportamiento de los grupos funcionales utilizando diferentes tipos de fibra y temperaturas de adsorción. La Figura 7 muestra el gráfico de interacción para las áreas de los grupos funcionales obtenidos al analizar la pulpa de S. quitoense L. utilizando diferentes fibras a 40 ºC (Figura 7, izquierda) y 60 ºC (Figura 7, izquierda). El grupo de mayor área obtenido por HS-SPME con todas las fibras fue el de los ésteres, seguido de los alcoholes y aldehídos. En el caso del tipo de fibra a 40 ºC, la compuesta por CAR/PDMS tuvo mayor afinidad para la extracción de ésteres, alcoholes, y aldehídos, mientras la fibra de CAR/PDMS/DVB fue la segunda con mayor nivel de extracción, teniendo una mayor área de alcoholes y aldehídos y una menor área de ésteres, en comparación con la fibra revestida por PDMS/DVB. Los grupos cetonas,

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hidrocarburos y ácidos se comportaron de manera similar en cuanto a la extracción mediante las diferentes fibras a 40 ºC. La extracción a 60 ºC mostró también un predominio de la fibra recubierta por CAR/PDMS para la extracción de alcoholes, ésteres y aldehídos, sin embargo, los ésteres tuvieron mayor recuperación a 60 ºC con la fibra de CAR/PDMS/DVB en comparación con la fibra de PDMS/DVB y las cetonas fueron recuperadas en mayor nivel por la fibra de CAR/PDMS/DVB que con la compuesta por CAR/PDMS. Finalmente, en ambas temperaturas la fibra recubierta por PDMS mostró una recuperación limitada de los diferentes grupos funcionales.

Figura 7. Gráficos de interacción para las áreas de los grupos funcionales de S. quitoense L. con diferentes fibras y temperaturas de adsorción. 3.1.2.2.1. Efecto de los factores evaluados sobre las áreas de los grupos funcionales de volátiles. El análisis de varianza aplicado a los datos de las áreas correspondientes a los grupos funcionales basado en el cuadrado medio del error residual indicó una interacción significativa grado III (P= 0.00), entre los factores: tipo de fibra, temperatura de adsorción y grupos funcionales. Esto denota que la eficiencia en la extracción de un grupo funcional de volátiles en particular, obtenido de la pulpa de S. quitoense L., depende de la interacción entre las características físicas y químicas del grupo (afinidad polar, punto de ebullición, entre otras), la temperatura suministrada y la composición de la fibra utilizada.

3.1.2.3. Comportamiento del número de compuestos volátiles utilizando diferentes tipos de fibra y temperaturas de adsorción. En general, el número de compuestos fue similar en todos los grupos al comparar las temperaturas utilizadas. Se obtuvo un número mayor de ésteres, excepto en la fibra de DBV/CAR/PDMS, la cual tuvo mayor cantidad de aldehídos en comparación con los demás grupos tanto a 40 como a 60 ºC; los aldehídos resaltaron por su mayor número con las fibras de CAR/PDMS y DBV/CAR/PDMS en comparación con las

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demás fibras (Figura 8). Además, con todas las fibras, excepto con la de PDMS, se presentó un número de cetonas mayor o igual a cinco, lo cual contrasta con su nivel limitado en cuanto a las áreas obtenidas, previamente esbozadas. Igualmente, los hidrocarburos tuvieron mayor número en la fibra de CAR/PDMS con ambas temperaturas.

Figura 8. Número de volátiles obtenidos por GC-MS a partir de la pulpa de S. quitoense L. con diferentes fibras y temperaturas de extracción. 3.1.2.4. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles utilizando diferentes tipos de fibra y temperaturas de adsorción. Al comparar los compuestos mayoritarios obtenidos de la pulpa de S. quitoense L. teniendo en cuenta los factores administrados se observa que los niveles del área promedio de estos cinco metabolitos fueron mayores al utilizar una temperatura de 40 ºC con todas las fibras empleadas, excepto con la compuesta por CAR/PDMS, la cual permitió mayor recuperación de estos a 60 que a 40 ºC (datos no mostrados). También se aprecia una limitada recuperación con la fibra recubierta por PDMS, en comparación con las restantes tres fibras. En ambas temperaturas el acetato de (Z)-3-hexenilo fue el compuesto de mayor área extraído con todas las fibras, excepto con la de CAR/PDMS, con la cual predominó el alcohol (Z)-3-hexen-1-ol, además este éster mostro mayor nivel de recuperación a 40 que a 60 ºC con las fibras DVB/CAR/PDMS y PDMS/ DVB. Así mismo, el aldehído (E)-2-hexenal, tuvo mayor área con la fibra recubierta por CAR/PDMS, de manera tal que los niveles alcanzados con esta fibra fueron superiores a los obtenidos de los demás compuestos en las restantes fibras a 60 ºC, y a 40 ºC con excepción del acetato de (Z)-3-hexenilo a 40 ºC.

Las diferencias referidas al usar diferentes fibras son atribuibles a la polaridad y el peso molecular de los volátiles presentes en cada fruta (Chin et al., 2007). Las fibras CAR/PDMS, PDMS/DVB y DVB/CAR/PDMS son afines a volátiles pequeños

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(C3-C12), polares y no polares, mostrando una recuperación apropiada en frutas con predominio de clases no polares como los ésteres, e igualmente de compuestos polares como los terpenos y aldehídos (Ceballos y Pino, 2005), mientras las fibras con PDMS son no polares y favorecen principalmente la recuperación de ésteres (De Oliveira et al., 2007). Otro factor que se tiene en cuenta es el grosor de la capa polimérica, donde los volátiles precisan de una capa gruesa y los semivolátiles una capa más delgada (Ceballos y Pino, 2005). Las fibras utilizadas han mostrado ser apropiadas para la extracción de volátiles en numerosas frutas, principalmente a 40 ºC. En el caso de la compuesta por PDMS/DVB, ha sido utilizada satisfactoriamente para la extracción de compuestos volátiles a 40 ºC y posterior análisis por GC/MS con predominio de ésteres en piña (Ananas comosus [L.] Merr.) (Steingass et al., 2014), pera (Pyrus ussuriensis) (Qin et al., 2012) y madroño (Arbutus unedo L) así como de terpenos en higos (Ficus carica L.), mientras la fibra de DVB/CAR/PDMS demostró ser apropiada para la extracción, principalmente de ésteres en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013), guayaba (Psidium guajava L.) (Pino et al., 2012), y de alcoholes en melón (C. melo L. var. reticulatus) (Condurso et al., 2012). Los aldehídos, que tuvieron apropiada recuperación con la fibra de CAR/PDMS a 40 ºC, predominaron en aguacate (Persea americana) con igual tipo de fibra (Obenland et al., 2012). Las extracciones a 60 ºC con HS-SPME son por el contrario, menos utilizadas en matrices frutales, salvo excepciones como en banana (Musa spp.) usando la fibra de DVB/CAR/PDMS (De Vasconcelos et al., 2012) y banana “Cavendish” con la compuesta por PDMS (Boudhrioua et al., 2003), en ambos casos con predominio de ésteres.

Los referentes previos en los cuales se comparó el efecto de diferentes fibras sobre la extracción de los componentes volátiles en frutas mostraron algunas diferencias (Tabla 7). En las frutas evodia (Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth) (Pellati et al., 2005), tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn., var. roja) (Quijano y Pino, 2006), limón (Citrus limon (L.) Burman f.) (Pereira et al., 2011), maracuyá púrpura (Passiflora edulis Sims), maracuyá amarilla (P. edulis Sims f. flavicarpa) y curuba (P. mollissima) (Pontes et al., 2009) la fibra con mejor rendimiento fue la revestida con PDMS–DVB y los esteres fueron la clase química predominante, excepto para evodia y limón, cuyo predominio correspondió a los terpenos. Por el contrario, la fibra recubierta con DVB–CAR–PDMS mostró ser la más apropiada para la extracción de estos metabolitos en siriguela (Spondias purpurea L.) (Ceva-Antunes et al., 2006), guayaba (Psidium guajava L. cv. Suprema Roja) (Pino et al., 2012), guanábana (Annona muricata) (Cheong et al., 2011) y jugos comerciales de varias frutas (Reinhard et al., 2008), siendo los ésteres el grupo funcional prevalente respecto al número de compuestos obtenidos. En naranja (Citrus aurantium L.) la fibra de PDMS resultó más eficiente para la extracción de volátiles, principalmente ésteres (De Oliveira et al., 2007), mientras la fibra revestida de CW–DVB tuvo mejor rendimiento en Kiwi (Actinidia deliciosa cv. Hayward) y papaya (Carica papaya Linn) con predominio de furanos y ésteres respectivamente (Pereira et al., 2011). La fibra escogida por su mayor rendimiento de extracción de los componentes volátiles en el presente estudio

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(CAR/PDMS) fue también la más apropiada para la recuperación de estos compuestos en guayaba Guanábana (Annona muricata) (Cheong et al., 2011). Tabla 7. Estudios comparativos de la extracción por HS-SPME utilizando diferentes fibras.

Matriz alimentaria

Fibras comparadas

Fibra escogida

Clase predominante

(número)

Referencia

Evodia (Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth)

PDMS 100 μm CW/DVB 65 μm

PDMS/DVB 65 μm DVB/CAR/PDMS 50/30 μm

PDMS–DVB

DVB–CAR–PDMS

Terpenos

(Pellati et al., 2005)

Ciruela de huesito (Spondias purpurea L.)

PDMS 100 μm CW/DVB 65 μm

CAR/PDMS 75 μm DVB/CAR/PDMS 50/30 μm

DVB/CAR/PDMS

Ésteres

(Ceva-Antunes et al., 2006)

Albaricoque (Prunus armeniaca)

PDMS 100 μm PDMS/DVB 65 μm CAR/PDMS 75 μm

CAR/PDMS

Alcoholes, aldehídos y

ésteres

(Guillot et al., 2006)

Tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendtn., var. roja)

PDMS 100 μm CAR/PDMS 75 μm PDMS/DVB 65 μm

PDMS/DVB

Ésteres

(Quijano C. y Pino, 2006)

Café (Coffea arabica)


Poliacrilato (PA) 85 μm DVB/CAR/PDMS 50/30 μm

Carbowax/DVB 65 μm

DVB–CAR–PDMS

Furanos

(Akiyama et al., 2007)

Naranja (Citrus aurantium L.)

PA 85 μm PDMS 100 μm

PDMS

Ésteres

(De Oliveira et al., 2007)

Limón, uva, mandarina y naranja (jugos comerciales)


CW/DVB 65 μm PDMS/DVB 65 μm

DVB/CAR/PDMS 50/30 μm

DVB/CAR/PDMS

No se especificó

(Reinhard et al., 2008)

Maracuyá púrpura (Passiflora edulis Sims); maracuyá amarilla (P. edulis Sims f. flavicarpa) y curuba (P. mollissima)


CAR/PDMS 75 μm PDMS/DVB 65 μm


PDMS/DVB

Ésteres

(Pontes et al., 2009)

Kiwi (Actinidia deliciosa cv. Hayward); Papaya (Carica papaya Linn)


CW/DVB 70 μm PDMS/DVB 65 μm CAR/PDMS 85 μm

CW–DVB

Furanos (kiwi);

Ésteres (Papaya)

(Pereira et al., 2011)

Limón (Citrus limon (L.) Burman f.); Ciruela (Prunus angustifolia Marsh. var. angustifolia)


CW/DVB 70 μm PDMS/DVB 65 μm CAR/PDMS 85 μm

PDMS–DVB

Terpenos (limón);

Aldehídos (Ciruela)

(Pereira et al., 2011)

Guanábana (Annona muricata)


CAR/PDMS 75 μm DVB/CAR/PDMS 50/30 μm

CAR/PDMS

Ésteres

(Cheong et al., 2011)

Guayaba (Psidium guajava L. cv. Suprema Roja)

PDMS 100 μm PDMS/DVB 65 μm


DVB/CAR/PDMS

Ésteres y terpenos

(Pino et al., 2012)

Papaya (Carica papaya L.)

PDMS 100 μm PDMS/DVB 65 μm

DVB/CAR/PDMS 50/30 μm CAR/PDMS 85 μm

DVB/CAR/PDMS

Ésteres

(Pino, 2014)

Lulo (S. quitoense L.)



CAR/PDMS

Ésteres y alcoholes

(Taborda y Corpas, 2015)

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Los compuestos mayoritarios encontrados en la pulpa de S. quitoense L. también han sido hallados en altos niveles en otras matrices frutales usando la extracción por SPME. El (Z)-3-hexen-1-ol es uno de los compuestos principales obtenidos de la pulpa de Siriguela (Spondias purpurea L.) (Ceva-Antunes et al., 2006), guayaba comercial (cv. Suprema Roja) (Pino et al., 2012), madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011), ciruela (Prunus angustifolia Marsh. var. angustifolia) (Pereira et al., 2011) y tomate de árbol (Quijano y Pino, 2006). Igualmente, se ha encontrado predominio de acetato de (Z)-3-hexenilo en guanábana (Annona muricata L. cv. ELITA) (Márquez, 2009), madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011) y guayaba (Psidium guajava) (Diniz et al., 2007). Así mismo, el metabolito volátil (E)-2-hexenal ha sido reportado como uno de los principales compuestos en frutas maduras como siriguela (Spondias purpurea L.) (Ceva-Antunes et al., 2006), cereza (Prunus avium L.) (Zhang et al., 2007), fresa (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013), kiwi (Actinidia deliciosa cv. Hayward) (Pereira et al., 2011), tomate común (Solanum lycopersicum) (Bai et al., 2011) (Solanum spp.) (Markovic et al., 2007), tomate español (Lycopersicum esculentum var. Muchamiel) (Carbonell-Barrachina et al., 2006), manzana (Malus spp.) (Li et al., 2008), guayaba pera deshidratada (Psidium guajava L) (Quijano et al., 2012), guayaba comercial (cv. Suprema Roja) (Pino et al., 2012), mango (Mangifera indica L.) (Pandit et al., 2009), Madroño (Arbutus unedo L.) (Oliveira et al., 2011), ciruela (S. purpurea) (Lemos et al., 2011) (Prunus salicina Lindl.) (Louw and Theron, 2012), aguacate (Persea americana) (Obenland et al., 2012). Por su parte, el 1-hexanol se ha hallado predominando en ciruela (Prunus salicina Lindl.) (Louw and Theron, 2012), Fresa (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013) y kiwi (Actinidia deliciosa (A. Chevalier) (Wan et al., 1999). Finalmente, El Acetato de hexilo se ha encontrado en melón (Cucumis melo var. makuwa Makino) (Condurso et al., 2012), madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011), guayaba comercial (cv. Suprema Roja) (Pino et al., 2012) y fresa (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013). En cuanto a la relevancia de los compuestos mayoritarios de S. quitoense L. como metabolitos sugestivos del estadio de madurez total en otras frutas, el (Z)-3-hexen-1-ol es indicativo de maduración en guayaba (Psidium guajava) (Diniz et al., 2007), guayaba cv. Suprema Roja (Pino et al., 2012) y frambuesa (Rubus idaeus) (Robertson et al., 1995), mientras el acetato de hexilo ha sido indicado como indicador de la madurez total y aportante de características de olor en manzanas ‘Pink Lady®’ (Villatoro et al., 2008) y melón (Cucumis melo var. makuwa Makino) (Liu et al., 2012), y el (E)-2-hexenal predomina en niveles superiores en la madurez del madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011), frambuesa (Rubus idaeus) (Robertson et al., 1995) y tomate común (Lycopersicon esculentum var. commune) (Zhang et al., 2008). 3.1.2.5. Comparación de los resultados obtenidos con HS-SPME frente a otros métodos de extracción en pulpa de lulo. La tabla 8 muestra los compuestos extraídos por HS-SPME en el presente estudio, que previamente han sido reportados utilizando otros métodos de extracción en pulpa de las especies

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de lulo (S. quitoense L. y S. vestissimum). 14 de los 28 compuestos previamente reportados corresponden a ésteres y alcoholes y entre los más comúnmente reportados se encuentran: acetato de etilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, butanoato de metilo, (E)-2-butenoato de metilo, ácido acético, hexanal, (E)-2-hexenal y (Z)-3-hexen-1-ol. Esta contrastación también permitió establecer compuestos obtenidos por HS-SPME que previamente no han sido identificados al analizar las especies de la fruta, como son: acetato de pentilo, acetato de (Z)-2-penten-1-ol, pentanal, butanoato de (Z)-3-hexenilo, 1-penten-3-ona, 4-heptanona y 6,7-dodecanodiona. Estos compuestos se encontraron en áreas menores en relación al área total de los respectivos cromatogramas, de manera que su dificultad de recuperación usando los métodos tradicionales se relacionaría con encontrarse en la fruta en concentraciones traza. Tabla 8. Compuestos volátiles obtenidos por HS-SPME que previamente se han reportado en pulpa de lulo usando diferentes métodos de extracción.

Compuestos volátiles

S. quitoensea

S.

quitoenseb

S. quitoense

c

S. vestissimum

d

S. quitoense

e Colombi

a Costa Rica

Acetato de metilo +

Acetato de etilo + + + + +

Acetato de hexilo + + + +

Acetato de (Z)-3-hexenilo + + + +

Acetofenona + +

Ácido acético + + + + +

Ácido hexanoico +

Ácido (E)-3-hexenoico + +

Ácido (E)-2-hexenoico + +

Ácido octanoico +

Butanoato de metilo + + +

(E)-2-Butenoato de metilo + + + + +

Decano + +

3,7-Dimetil-1,6-octadien-3-ol +

(E)-2-Hexenal + + + +

(E)-3-Hexen-1-ol + +

(E,E)-2,4-hexadienal +

Hexanal + + + +

1-Hexanol + + +

o-xileno +

3-Pentanol + + +

1-Penten-3-ol +

Propionato de metilo +

Tolueno + +

Undecano + +

(Z)-3-Hexen-1-ol + + + +

(Z)-2-heptenal +

(Z)-2-penten-1-ol + + a= Extracción con solvente, pentano/éter (2:1) (Brunerie and Maugeais, 1992).

b= Extracción con CO2 supercrítico

(Parada et al., 1993). c= Extracción con solvente, diclorometano/éter etílico (7:3) (Forero et al., 2015).

D= SDE,

Pentano/éter dietílico (1:1) (Suárez y Duque, 1991). e= SDE, éter etílico/pentano (1:1) (Mora y Pinzón, 2004).

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3.2. ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DE S. quitoense L. MEDIANTE SDE/GC-MS 3.2.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles por SDE/GC-MS 3.2.1.1. Selección de la fruta. Las condiciones de selección fueron idénticas a las descritas para la extracción por HS-SPME en el numeral 3.1.1.1. del presente capítulo. 3.2.1.2. Diseño experimental para la implementación del análisis por HS-SPME/GC-MS. Se realizó un diseño completamente aleatorizado teniendo como factor el tipo de solvente con tres tratamientos (Hexano, Diclorometano y Acetato de etilo) y como variable de respuesta el área total de volátiles. Por cada tratamiento se efectuaron seis repeticiones. Los datos obtenidos fueron analizados con ayuda del software SPSS® version 22. 3.2.1.3. Procedimiento de extracción. Las frutas fueron lavadas con agua destilada por 20 segundos y cortada con un cuchillo estéril para la separación de la cáscara y obtención de la pulpa. Se pesaron 200 g de pulpa y se depositaron en un balón de vidrio con capacidad de 500 ml. La extracción se efectuó en un aparato Likens-Nickerson modificado, en el primer tubo lateral se adaptó el balón que contenía la muestra y en el segundo se instaló otro balón con capacidad de 25 ml para la extracción con el solvente respectivo. Los balones fueron colocados a la temperatura de ebullición de cada solvente y la extraccón por SDE se llevó a cabo durante 1 hora. Posteriormente se recogió un volumen destilado de aproximadamente 20 ml y se llevó a volumen fijo de 50 ml con cada solvente. El extracto se conservó en refrigeración a 4 ºC. Finalmente se adicionó 1 ml de muestra en un vial de capacidad de 2 ml y se agregaron además 5 µl de una solución de 1-octanol, usada como estándar interno, con una concentración de 0.0018 mol/L. 3.2.1.4. Análisis e identificación de los compuestos volátiles. Las condiciones de análisis fueron idénticas a las descritas en el numeral 3.1.1.5. del presente capítulo, excepto que para los análisis de las muestras extraídas por SDE se inyectó 1 µl del extracto, se utilizó un liner de 3.4 mm I.D. (Shimadzu) para conducir los metabolitos volátiles a la columna y cada análisis se realizó en un tiempo de 60 minutos. La figura 9 muestra en sobreposición los cromatogramas obtenidos al analizar los volátiles de S. quitoense L. por SDE/GC-MS utilizando los solventes hexano (picos de color amarillo), diclorometano (picos de color blanco) y acetato de etilo (picos de color verde).

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Figura 9. Cromatogramas sobrepuestos obtenidos de S. quitoense L. por SDE/GC-MS con diferentes solventes. 3.2.2. Compuestos volátiles de S. quitoense L. obtenidos por SDE acoplado a GC-MS utilizando diferentes solventes. Mediante SDE con los solventes utilizados se obtuvieron 47 metabolitos volátiles, principalmente hidrocarburos (42.55%), seguidos de aldehídos (17.02%) y ésteres (17.02%) y un menor predominio correspondió a los alcoholes (10.63%) cetonas (6.38%) y ácidos (4.25%) (Tabla 9). Además, se resalta el mayor porcentaje de área obtenido en compuestos como el ácido acético, decanal, furfural, butanoato de metilo, y nonanal.

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Tabla 9. Constituyentes volátiles obtenidos por SDE/GC-MS en la pulpa de S. quitoense L. utilizando diferentes solventes.

Nombre del compuesto

Hexano Diclorometano Acetato de etilo

Tiempo de retención promedio

Área promedio

% de área


Área promedio

% de área


Área promedio

% de área

Acetato de 1-metiletilo - - - - - - 6.57 8349569 0.73 Ácido acético - - - - - - 7.03 711173709 62.21

Acetato de n-propilo - - - - - - 8.27 3325308 0.29 Butanoato de metilo 8.14 13700138 6.45 8.29 30231061 7.83 8.43 12751611 1.11 2.3-Pentanodiona - - - - - - 8.53 3560892 0.31

(E)-2-Pentenal - - - 10.05 3211431 0.83 - - - (E)-2-Butenoato de metilo - - - 10.64 1977985 0.51 10.70 3319264 0.29

2,4-Dimetil-1-hepteno 11.24 8830760 4.21 11.29 8535166 2.23 - - - Ácido butanoico - - - 15.01 2350855 0.61 15.07 9328692 0.82 (Z)-3-Hexen-1-ol - - - - - - 16.28 9680148 0.85

Furfural - - - 16.86 12087306 3.13 16.88 100354393 8.78 (E)-2-Hexenal - - - 17.78 4522348 1.16 17.32 6357839 0.56

2,4-Hexadien-1-ol - - - - - - 18.27 4760558 0.42 Hexanoato de metilo - - - 18.64 12840318 3.33 - - -

5-Metil-2(3H)-furanona - - - - - - 19.73 8646088 0.76 Decano 20.13 8592208 3.98 20.15 7840464 2.02 - - - Octanal 20.37 8700512 4.05 20.39 8467739 2.19 - - -

Undecano - - - 22.85 4170176 1.08 - - - No identificado 1 23.07 3313142 1.53 23.09 3818386 0.97 - - -

Acetato de (Z)-3-hexenilo - - - - - - 23.85 44026559 3.84 Acetato de hexilo - - - - - - 24.20 16183208 1.41 No identificado 2 24.80 8977702 4.14 24.81 7430529 1.94 - - - No identificado 3 25.02 9002962 4.12 25.03 8388167 2.17 - - -

5-metil-2-furancarboxaldehído - - - - - - 25.15 7957055 0.69 Benceno acetaldehído 28.96 9221058 4.36 28.99 2726208 0.72 28.99 74545677 6.49

3,7-dimetil-1.6-octadien-3-ol - - - - - - 29.74 7697874 0.68 Benzoato de metilo - - - 30.47 7296803 1.85 - - -

Nonanal 31.22 1628773 0.76 31.25 48365026 12.60 - - - No identificado 4 - - - 32.03 3709879 0.97 - - -

4,6-dimetil-undecano 33.89 6087865 2.85 33.89 7167158 1.85 - - - No identificado 5 - - - - - - 34.50 3567490 0.31 No identificado 6 34.97 6544510 3.00 34.98 4775928 1.22 - - -

3-ciclohexeno-1-metanol - - - - - - 35.59 6984032 0.62 No identificado 7 35.94 2993714 1.37 35.94 3582355 0.92 - - -

Decanal 36.12 25733315 11.62 36.13 37443212 9.64 - - - 4,6-dimetil-dodecano 37.78 13243309 6.16 37.79 17255615 4.45 - - -

Hexadecano 38.24 19228523 8.91 38.25 27105021 6.98 - - - Heptadecano 38.71 13375019 6.32 38.72 18284273 4.72 - - -

2-metoxi-4-vinilfenol - - - - - - 45.59 78240184 6.83 Octadecano 46.46 6573614 3.03 46.48 8604822 2.20 - - -

Eicosano 47.84 5020961 2.23 47.12 8283655 2.14 - - - No identificado 8 50.72 7562784 3.48 47.92 7906485 2.03 - - - No identificado 9 51.05 11795471 5.46 50.74 8948913 2.30 - - - No identificado 10 51.30 11519071 5.33 51.08 14333226 3.67 - - - No identificado 11 51.64 13065763 6.06 51.34 11436293 2.94 - - - No identificado 12 51.94 7662815 3.55 51.67 14376827 3.67 - - - No identificado 13 - - - 51.98 9024703 2.30 - - -

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3.2.2.1. Efecto del tipo de solvente sobre el área total de volátiles en la extracción por SDE. El ANOVA mostró diferencias estadísticamente significativas entre los datos obtenidos para el factor tipo de solvente (P= 0.00). Al efectuar la prueba de rangos múltiples de Tukey se comprobó que las extracciones con acetato de etilo, permitieron obtener una mayor área de volátiles (datos no mostrados). Respecto de la evaluación de supuestos, mediante la prueba de Shapiro-Wilk se obtuvieron valores P para los datos de extracción con hexano (0.369), diclorometano (0.496) y acetato de etilo (0.914) que indicaron su normalidad; y se demostró la homocedasticidad de estos conjuntos de datos a partir del estadístico de Levene, con un valor P de 0.506. 3.2.2.2. Comportamiento de los grupos funcionales utilizando diferentes tipos de solventes en la extracción por SDE. La comparación de las áreas obtenidas mediante extracción por SDE con diferentes solventes acoplada al análisis por GC-MS, indicó un predominio de hidrocarburos en los tratamientos con hexano (solvente no polar) y diclorometano (solvente con polaridad intermedia), mientras con acetato de etilo (solvente polar) predominaron los ácidos y no se recuperaron hidrocarburos, en razón a la naturaleza no polar de la mayoría de estos compuestos (Figura 10). Además se observó una mayor área de ácidos, ésteres, alcoholes y aldehídos conforme se utiliza un solvente de mayor polaridad (Figura 10, de izquierda a derecha), mientras que con hexano no se obtuvieron alcoholes ni cetonas, dado que estos compuestos son de carácter polar.

Figura 10. Áreas de los grupos funcionales obtenidos por GC-MS a partir de la pulpa de S. quitoense L. con diferentes fibras y temperaturas de extracción.

3.2.2.2.1. ANOVA y prueba de rangos múltiples aplicado a las áreas de los grupos funcionales de volátiles por SDE/GC-MS con diferentes solvente. El ANOVA evidenció diferencias estadísticas entre las áreas de los grupos funcionales con los solventes de extracción usados, por lo que podemos deducir que las áreas obtenidas dependen del tipo de solvente utilizado y consecuentemente de su afinidad polar por los compuestos de la pulpa de S. quitoense L. Igualmente se aplicó la prueba de Tukey a las áreas de los grupos químicos, determinándose que los ésteres, alcoholes, aldehídos, cetonas y ácidos obtenidos con acetato de etilo pertenecen a un subconjunto con medias estadísticamente superiores a las obtenidas con hexano y diclorometano, mientras

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los hidrocarburos extraídos con diclorometano pertenecen a un subconjunto de mayor área que con los demás solventes (Tabla 10). Tabla 10. Pruebas de rangos múltiples de Tukey aplicada al área total de volátiles obtenida en cada grupo funcional por SDE con diferentes solventes. Tipo de solvente

utilizado

N Subconjunto para alfa = 0.05

Grupo funcional 1 2 3

Hexano 6 13700138 Ésteres Diclorometano 6 52346167 Acetato de etilo 6 87955518

Hexano 6 0.0 Alcoholes Diclorometano 6 3709878 Acetato de etilo 6 376498328

Hexano 6 45283656 Aldehídos Diclorometano 6 116823269 Acetato de etilo 6 189214963

Acetato de etilo 6 0.0 Hidrocarburos Hexano 6 163390190 Diclorometano 6 201268158

Hexano 6 0.0 Cetonas Diclorometano 6 0.0 Acetato de etilo 6 18045202

Hexano 6 0.0 Ácidos Diclorometano 6 2350855 Acetato de etilo 6 720502401 a= Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 6.

3.2.2.3. Comportamiento del número de volátiles en los grupos funcionales obtenidos por SDE/GC-MS con diferentes solvente. Entre los solventes utilizados, el diclorometano permitió un mayor número de compuestos volátiles (33 compuestos) (Figura 11). Mediante la extracción con hexano y diclorometano el número de hidrocarburos obtenidos correspondió respectivamente al 75% y 60% del número total de volátiles recuperados por SDE, mientras con acetato de etilo se presentó predominio de ésteres, cuyo número representó el 30% de los compuestos extraídos. El segundo grupo con mayor número de volátiles fue el de los aldehídos con un 20% para hexano y diclorometano, mientras con acetato de etilo el número de compuestos de este grupo correspondió al 21% de los volátiles recuperados. Igualmente, el mayor número de alcoholes se obtuvo con acetato de etilo, único solvente que permitió obtener compuestos del grupo de las cetonas.

Figura 11. Número de volátiles obtenidos mediante SDE/GC-MS a partir de la pulpa de S. quitoense L. con diferentes solventes.

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3.2.2.4. Comportamiento de los compuestos mayoritarios en los grupos funcionales obtenidos por SDE/GC-MS con diferentes solvente. Entre los compuestos mayoritarios extraídos por SDE/GC-MS se encuentran principalmente aldehídos, además de hidrocarburos y ésteres. Los compuestos de mayor área fueron el ácido acético, furfural y el benceno acetaldehído extraídos con acetato de etilo, mientras el nonanal fue el de mayor recuperación con diclorometano, seguido del decanal que a su vez, fue el de mayor promedio con hexano. 3.3 COMPARACIÓN ENTRE LOS TRATAMIENTOS DE HS-SPME Y SDE EN CUANTO A LA EXTRACCIÓN DE VOLÁTILES DE S. quitoense L. El método de SDE, fundamentado en la obtención de compuestos por afinidad polar a un solvente orgánico paralelamente destilado, promueve la obtención de numerosas clases químicas (Yang et al., 2007), sin embargo, se ha establecido que es menos sensible a los compuestos en concentraciones traza (Cai et al., 2001), requiere grandes cantidades de muestra, el tiempo de extracción es prolongado (Chen et al., 2006) y puede causar pérdida de metabolitos altamente volátiles (Pino, 2014). Alternativamente, la HS-SPME, basada en el sobrepaso de la transferencia de masas para generar un equilibrio de partición del metabolito entre la fibra y la matriz analizada (Soler et al., 2011), se ha perfilado como una técnica rápida, fácil, sensible, libre de solvente, requiere una cantidad mínima de muestra y evita pérdida de volátiles de bajo punto de ebullición (Chen et al., 2006; Nunes et al., 2008; Cheong et al., 2012). Al contrastar el método de extracción por HS-SPME con la fibra y temperatura

más apropiada (CAR/PDMS 75 m a 60 ºC) con el método de extracción por SDE con el solvente más conveniente, teniendo como variable de respuesta el área total de volátiles, se presentó una mayor recuperación mediante SDE. Es importante tener en cuente que la extracción por HS-SPME utilizó 30 minutos y una cantidad de muestra de 10 g, mientras la aplicación de SDE se llevó a acabo durante 60 minutos y se utilizaron 200 g de muestra. Al realizar una prueba t para varianzas desiguales (P valor= 0.005) con el propósito de contrastar las medias de los tratamientos más eficientes de HS-SPME y SDE para la extracción de volátiles, se encontraron diferencias entre las medias (P valor= 0.000) en favor del área total correspondiente a la extracción por SDE. En cuanto a los grupos funcionales, mientras con HS-SPME (CAR/PDMS) predominó el área de ésteres, con SDE el área de los ácidos fue superior a la de los demás grupos químicos, además, los alcoholes y ésteres tuvieron una limitada área con SDE en comparación con la extracción por HS-SPME y los aldehídos mostraron mayor área de extracción con el solvente. La mayor recuperación de ácidos mediante SDE se dio exclusivamente a expensas de los niveles superiores de ácido acético, compuesto de alta polaridad y baja volatilidad, que de manera contrastante exhibió una menor área de recuperación con HS-SPME. Otros aspectos a considerar como factores promotores de las diferencias de extracción evidenciadas son la mayor sensibilidad de HS-SPME a compuestos presentes en

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concentraciones traza, que permitió la recuperación de un mayor número de estos metabolitos, y el rango de afinidad más amplio en cuanto a polaridad con la fibra de HS-SPME utilizada (CAR/PDMS). Finalmente se realizó una prueba t para establecer diferencias entre las medias de los grupos funcionales obtenidos con los tratamientos más eficientes de HS-SPME (CAR/PDMS) y SDE (Acetato de etilo) (Tabla 11). Se encontraron diferencias entre las medias (P valor= 0.00) del área de los grupos funcionales ácidos, aldehídos y cetonas a favor de la extracción por SDE, mientras para los ésteres, alcoholes e hidrocarburos se presentaron diferencias estadísticas que indican mayor extracción con HS-SPME. Tabla 11. Prueba t de comparación de medias para muestras independientes aplicada a las áreas de los grupos funcionales obtenidos por HS-SPME y SDE.

Prueba de Levene calidad de varianzas Prueba t para la igualdad de medias

F Sig. t gl Sig.

(bilateral) Diferencia de medias

Diferencia de error estándar

95% de intervalo de confianza de la diferencia

Inferior Superior

Ésteres

Se asumen varianzas iguales No se asumen varianzas iguales

6.085 0.036 -24.46 9 0.000 -94264792 3852873 -1.030E8 -85548986

-26.32 6.76 0.000 -94264792 3581263 -1.028E8 -85737039


0.802 0.394 -37.75 9 0.000 -1.248E8 3306690 -1.323E8 -1.173E8

Alcoholes

-38.81 8.94 0.000 -1.248E8 3216035 -1.321E8 -1.175E8


4.946 0.053 10.93 9 0.000 74997733 6858963 59481680 90513785

Aldehídos

11.93 5.80 0.000 74997733 6283756 59493714 90501751

Hidrocarburos


15.568 0.003 -21.75 9 0.000 -9863187 453486 -10889044 -8837330

-19.63 4.00 0.000 -9863187 502382 -11258024 -8468350

Cetonas


14.901 0.004 4.65 9 0.001 13428672 2884563 6903336 19954008

5.14 5.02 0.004 13428672 2610189 6728241 20129103

Ácidos


11.228 0.009 33.74 9 0.000 710703624 21061589 663058998 758348250

37.30 5.00 0.000 710703624 19052916 661745002 759662247

En concordancia con los resultados obtenidos, estudios previos han evidenciado la complementariedad entre SDE y HS-SPME para la obtención de fracciones volátiles más completas en diversas frutas. En papaya (Carica papaya L.) SDE con éter dietílico permitió la obtención de 44 componentes volátiles, adicionales a los obtenidos con la fibra semipolar DVB/CAR/PDMS, siendo los ésteres la clase química dominante (Pino, 2014), mientras de la ciruela ‘‘Ameixa d’Elvas”, se obtuvieron 70 compuestos por extracción con diclorometano y 40 con la fibra recubierta de Carbowax/divinilbenceno (CW/DVB), con predominio de ésteres (Nunes et al., 2008). También hubo mayor nivel de ésteres en banana (Musa spp. AAA group, cv. Giant Cavendish) al realizar la extracción con éter dietílico y usando la fibra DVB/CAR/PDMS, permitiendo la identificación de 146 compuestos (Pino and Febles, 2013). En naranjas Pontianak (Citrus nobilis var microcarpa) de Indonesia, Mosambi (Citrus sinensis var mosambi) de India y Dalandan (Citrus

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reticulata) de Filipinas se realizó la extracción de 70 compuestos volátiles utilizando la fibra DVB/CAR/PDMS y de 44 mediante el solvente éter dietílico (Dharmawan et al., 2006). Así mismo, en albaricoque (Prunus armeniuca L. var. Xinshiji) se identificaron 70 compuestos por medio de la fibra de PDMS, con predominio de ésteres y 40 por SDE con hexano siendo los alcoholes monoterpenos la clase principal (Chen et al., 2006). Para la extracción en mora (Rubus glaucus Benth.) se utilizó la fibra de PDMS-DVB recuperándose 71 volátiles principalmente ésteres y 55 con el solvente pentano/éter con mayor abundancia relativa para los ácidos orgánicos (Meret et al., 2011). Además, dos variedades de jugo de pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck PO 51 y PO 52), fueron sometidas a extracción con diclorometano y con la fibra CAR/PDMS, obteniéndose 49 y 65 volátiles respectivamente, con predominio de hidrocarburos mono y sesquiterpenos en el extracto y alcoholes en HS-SPME (Cheong et al., 2012). El aumento de los compuestos usando SDE y HS-SPME se da a expensas de la afinidad de cada método por compuestos de determinada polaridad y peso molecular. Los extractos de SDE muestran compuestos de alto peso molecular y son más pobres en metabolitos de alta volatilidad (Matich et al., 2003), mientras con HS-SPME la obtención de volátiles pesados es limitada (Chen et al., 2006). Así mismo, cada fruta posee una fracción volátil con características diferentes, lo que amerita en algunos casos, el uso de solventes no polares como el éter dietílico en papaya (Carica papaya L.) (Almora et al., 2004), bananas (Musa spp. AAA group, cv. Giant Cavendish) (Pino and Febles, 2013), grosella (Phyllanthus acidus L.) (Pino and Queris, 2008) y naranjas (Citrus spp.) (Dharmawan et al., 2006), o solventes de polaridad intermedia como dicloromentano en pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck PO 51 y PO 52) (Cheong et al., 2012), ciruela ‘‘Ameixa d’Elvas” (Nunes et al., 2008), banano (Musa spp.) (Aurore et al., 2011), mango (Mangifera indica L.) (Pandit et al., 2009) y gulupa (Passiflora maliformis) (Restrepo y Duque, 1988). De manera similar, la extracción con HS-SPME se ha realizado en frutas como albaricoque (Prunus armeniuca L. var. Xinshiji) mediante la fibra compuesta por PDMS (Chen et al., 2006), pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) con la conformada por CAR/PDMS (Cheong et al., 2012), en mora (Rubus glaucus Benth.) por la de PDMS-DVB (Meret et al., 2011) y papaya (Carica papaya L.) usando la recubierta con DVB/CAR/PDMS (Pino, 2014), posterior a su selección como fibras de mayor rendimiento en la recuperación de estos metabolitos en cada fruta. Además, esta combinación de métodos permite elucidar la formación de artefactos (Soler et al., 2011). En el caso específico de la extracción con solvente, el uso concomitante de mezclas integradas por disolventes diferente polaridad y punto de ebullición permite favorecer la extracción. Se han realizado extracciones con resultados relevantes en mamey (Mammea americana L) usando pentano/éter etílico (2:1, v/v) (Morales et al., 1993), naranja (Citrus sinensis cv. Kozan) con pentano-diclorometano (2:1, v/v) (Selli et al., 2004), mora (Rubus glaucus Benth.) utilizando pentano/éter (1:1, v/v) (Meret et al., 2011) curuba (Passiflora mollissima (Kunth) L. H. Bailey) mediante pentano/éter etílico (1:1, v/v) (Conde-Martínez et al., 2014) y en la fruta originaria de Mozambique maphilwa (Vangueria infausta) por medio de

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pentano y éter de dietilo (1:1, v/v) (Tique et al., 2011). Así mismo, se podría tener en cuenta otro tipo de combinación de métodos como HS-SPME/hidrodestilación (HD) contemplada para la extracción de volátiles en pulpa de mango (Mangifera indica var. coquinho) (Soler et al., 2011) y SDE/HD, utilizada para obtener estos compuestos del fruto de la Xylopia aromatica (Lamarck) (Stashenko et al., 2004). 3.4. COMPORTAMIENTO DEL ESTÁNDAR INTERNO UTILIZADO PARA ESTABLECER LA CONCENTRACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES. Dado que la fibra compuesta por CAR/PDMS fue la escogida entre las utilizadas para llevar a cabo el estudio de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la maduración, senescencia y para evaluar la evolución de los compuestos volátiles de la fruta sometida a diferentes métodos de conservación, se realizó un análisis del comportamiento del estándar interno (1-octanol) a diferentes concentraciones, ensayos llevados a cabo por duplicado. Mediante la aplicación del modelo de la línea recta se obtuvo un coeficiente de determinación (R2) de 0.993, que muestra apropiada reciprocidad entre el área obtenida su respectiva concentración (Figura 12).

Figura 12. Concentración del estándar interno en relación con la respuesta del detector de masas.

La cuantificación de los compuestos volátiles de la pulpa de S. quitoense L. en las fases posteriores del presente estudio, teniendo en cuenta el estándar interno, se planteó según la siguiente ecuación:

C= Ac* FRc * Cei Ecuación 1 Ae Donde C indica la concentración del compuesto; Ac es el área de cada compuesto volátil; FRc constituye el factor de respuesta del respectivo compuesto (cociente entre el área del compuesto y el área del estándar interno); Cei es la concentración del estándar interno y Ae concierne al área del estándar interno del respectivo análisis.

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CONCLUSIONES

Entre las fibras de SPME utilizadas, la compuesta por CAR/PDMS favoreció una mayor eficiencia en la extracción del área total y de los grupos funcionales volátiles a partir de la pulpa de S. quitoense L. en las temperaturas suministradas, con predominio de ésteres, siendo los compuestos mayoritarios, acetato de (Z)-3-hexenilo, (Z)-3-hexen-1-ol, (E)-2-hexenal, 1-hexanol y acetato de hexilo, que representaron más del 70% del área total en cada tratamiento. El presente estudio permitió la obtención de los compuestos acetato de pentilo, acetato de (Z)-2-penten-1-ol, pentanal, butanoato de (Z)-3-hexenilo, 1-penten-3-ona, 4-heptanona y 6,7-dodecanodiona que previamente no habían sido encontrados en la pulpa de las especies de lulo S. quitoense L. y S. vestissimum, utilizando métodos de extracción diferentes a HS-SPME. El acetato de etilo fue el solvente más eficiente para la recuperación de volátiles en la pulpa de S. quitoense L. por SDE/GC-MS, permitiendo la obtención de áreas estadísticamente mayores en los grupos ésteres, alcoholes, aldehídos, cetonas y ácidos, mientras los hidrocarburos tuvieron mayor extracción con diclorometano. Los compuestos de mayor área fueron el decanal extraído con hexano, nonanal con diclorometano y ácido acético con acetato de etilo. Mediante HS-SPME con la fibra de PDMS de condición no polar y SDE usando el solvente no polar hexano, no se obtuvieron compuestos ácidos y las áreas obtenidas de alcoholes y aldehídos fueron menores que las de los demás tratamientos en cada método de extracción, indicando que la extracción de volátiles de S. quitoense L. se limita con el uso de solventes o fibras no polares. Las diferencias entre las áreas medias de los ácidos, aldehídos y cetonas a favor de la extracción por SDE/GC-MS, y las abundancias superiores de ésteres, alcoholes e hidrocarburos mediante HS-SPME/GC-MS indican complementariedad entre estos métodos de extracción.

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CAPÍTULO IV. IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES BIOQUÍMICOS EN LA PULPA DE LULO (S. quitoense L.) DURANTE SU MADURACIÓN Y

SENESCENCIA - Resumen. Se realizó un diseño a dos vías, teniendo como primer factor el grupo funcional y como segundo factor, el estadio en el caso de la maduración y el tiempo transcurrido en el caso de la senescencia. Además, en ambos casos se realizó el Análisis de Componentes Principales (PCA), la prueba de Tukey para establecer los compuestos mayoritarios, la regresión de Mínimos Cuadrados Parciales (PLS) para la identificación de marcadores y el análisis discriminante (DA), para identificar los compuestos que por los cambios en su concentración predicen el estadio y tiempo de senescencia de la fruta. Tanto en la maduración como en la senescencia se presentó interacción de II grado entre los factores estudiados (P= 0.00), así como niveles importantes de alcoholes y ésteres. Según el PCA, en la maduración los alcoholes se asociaron al primer estadio y los ésteres tuvieron fuerte correlación con los estadios cuatro y cinco, mientras en la senescencia los ésteres de metilo se correlacionaron con el día 8. La prueba de Tukey indicó que los compuestos mayoritarios durante la maduración fueron: acetato de hexilo, 1-hexanol, acetato de (Z)-3-hexenilo, (Z)-3-hexen-1-ol y (E)-2-hexenal. Estos tres últimos compuestos también fueron mayoritarios durante la senescencia junto a varios ésteres de metilo. Los marcadores de maduración fueron principalmente ésteres de acetato, mientras en la senescencia correspondieron esencialmente a ésteres ramificados. El DA generó modelos predictivos, donde las dos primeras funciones discriminantes explicaron el 98.3% de la variabilidad en la maduración y 88.9% en la senescencia, utilizando 18 y 27 volátiles respectivamente. Palabras claves. Compuestos volátiles; Maduración de la fruta; Marcador bioquímico, Perfil metabólico, Senescencia de la fruta, S. quitoense L. - Abstract. A two-way design was performed, having as a first factor the functional group and as a second factor, the stage in the case of ripening and the elapsed time in the case of the senescence. Moreover, in both cases was carried out the Principal Component Analysis (PCA), the Tukey test to establish the majoritarian compounds, the regression of Partial Least Squares (PLS) for identification of markers, and the discriminant analysis (DA) to identify the compounds which due to the changes in their concentration predict the stage and the senescence time of the fruit. In both ripening and senescence, grade II interaction occurred between the factors studied (P= 0.00), as well as significant levels of alcohols and esters. According to the PCA, in the ripening, alcohols were associated to the first stage and the esters had a strong correlation with stages four and five, while in the senescence methyl esters were correlated with the day 8.The Tukey test indicated that the majoritarian compounds during ripening were: hexyl acetate, 1-hexanol, (Z)-3-hexenyl acetate, (Z)-3-hexen-1-ol and (E)-2-hexenal. The latter three compounds were also majoritarian in the senescence together with several methyl esters. Ripening markers were mainly acetate esters, while in the senescence corresponded essentially to branched esters. The DA generated predictive models

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in which the first two discriminant functions explained the 98.3% of the variability in the ripening and 88.9% in the senescence, using 18 and 27 volatiles respectively. Keywords. Biochemical marker, Fruit ripening, Fruit senescence, metabolic profile, S. quitoense L., Volatile compounds. - Introducción. Los compuestos volátiles de las frutas son producidos por degradación enzimática de sustratos como aminoácidos y ácidos grasos (Díaz et al., 2009). La obtención de un perfil volátil completo de la fruta en madurez de consumo es necesaria, considerando la existencia de metabolitos en concentraciones traza de significativo impacto en el aroma (Pino, 2014), criterio relevante en la evaluación de la calidad de las frutas cuando alcanzan su madurez de consumo (Chen et al., 2006; Dávila-Aviña et al., 2011), y por ser el primer atributo de calidad que experimenta modificaciones durante el almacenamiento (Díaz et al., 2009). Con el propósito de identificar los compuestos existentes y sus variaciones durante las etapas que preceden a la madurez de consumo, se han realizado estudios del perfil de volátiles en diferentes frutas como kiwi (Actinidia deliciosa var. deliciosa cv. Hayward) (Wan et al., 1999), guayaba (Psidium guajava) (Diniz et al., 2007), manzana “Pink Lady®” (Villatoro et al., 2008), fresa (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013), piña (Ananas comosus [L.] Merr.) (Steingass et al., 2014), mangaba (Hancornia speciosa Gomes) (Santos y Nogueira, 2006), cereza (Prunus avium L.) (Zhang et al., 2007), madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011), entre otras. También existen referentes sobre el contenido de los volátiles posterior a la madurez total de algunas frutas (Ortiz et al., 2009; Obando-Ulloa et al., 2009; Santana et al., 2014; Bai et al., 2014; Steingass et al., 2014). Sin embargo, no existen estudios en S. quitoense L., especie predominante en Colombia, sobre las vías metabólicas de relevancia en la maduración, así como el comportamiento de los grupos funcionales y la identificación de marcadores bioquímicos en la maduración y senescencia. Los volátiles en frutas provienen de diversas rutas metabólicas, y por consiguiente, su naturaleza química es variada (Min et al., 2003; Qin et al., 2012), por lo que se requiere un método de extracción con alta fidelidad respecto del perfil real de la fruta analizada. En comparación con las metodologías tradicionales, la SPME, basada en la generación de un equilibrio de partición del metabolito entre la fibra y la matriz analizada (Soler et al., 2011), permite la obtención de compuestos de diferente polaridad, es rápida, fácil, sensible, libre de solvente, requiere poca muestra y evita la formación de artefactos (Chen et al., 2006; Nunes et al., 2008; Cheong et al., 2012), siendo considerada como alternativa confiable para la obtención de perfiles volátiles precisos, que permitan dilucidar el comportamiento metabolómico durante la maduración y senescencia de S. quitoense L. El presente estudio permitió conocer el comportamiento de la fracción volátil de S. quitoense L. durante la maduración y senescencia, permitiendo establecer las variaciones en los grupos funcionales e identificar los compuestos susceptibles de ser considerados marcadores bioquímicos en estas fases.

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4.1. COMPORTAMIENTO DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DURANTE LA MADURACIÓN DE S. quitoense L. 4.1.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles durante la maduración de S. quitoense L. por SDE/GC-MS 4.1.1.1. Selección de la fruta. Las condiciones de selección fueron idénticas a las descritas para la extracción por HS-SPME en el numeral 3.1.1.1. del capítulo III, excepto que para cada estadio las muestras se recolectaron teniendo en cuenta el color de la cáscara conforme a la norma NTC 5093 y los °Brix de acuerdo con el estadio requerido para los ensayos respectivos, según Mejía et al. (2012): 5.4 +/- 0.2 °Brix para estadio 1; 6.4 +/- 0.2 °Brix para estadio 2; 8.6 +/- 0.2 °Brix para estadio 3; 9.3 +/- 0.35 °Brix para estadio 4; 10.3 +/- 0.2 °Brix para estadio 5. 4.1.1.2. Diseño experimental para el análisis por HS-SPME/GC-MS en pulpa de S. quitoense L. durante su maduración. Los datos obtenidos fueron analizados con ayuda de los programas estadísticos SPSS® 22, Minitab® 17 y MetaboAnalyst® 3.0. Se estudiaron las concentraciones totales de los grupos químicos, a partir del análisis descriptivo de los promedios obtenidos, la aplicación de un diseño a dos vías, teniendo como primer factor el grupo funcional con seis niveles (Ésteres, Alcoholes, Aldehídos, Cetonas, Hidrocarburos y Ácidos) y como segundo factor el estadio de maduración con cinco niveles (desde el estadio uno hasta el cinco), con cinco repeticiones buscando determinar el comportamiento de estos grupos de volátiles conforme transcurría la maduración. Finalmente, se realizó un análisis del comportamiento de los compuestos volátiles usando el PCA, utilizando la prueba de Tukey para establecer los compuestos mayoritarios, se utilizó la Regresión de PLS para identificar los marcadores de maduración y senescencia, se realizó un análisis de perfiles de estos compuestos y se aplicó un DA, técnica multivariada para predecir el estadio de la fruta dadas las concentraciones de los compuestos durante su maduración. 4.1.1.3. Fibra de HS-SPME utilizada, procedimiento de extracción, análisis y cuantificación de volátiles durante la maduración de S. quitoense L. Para todos los ensayo se utilizó la fibra compuesta por CAR/PDMS a una temperatura de 60 ºC durante 30 minutos, de acuerdo a los resultados obtenidos en la evaluación de diferentes fibras de SPME, y los ensayos se llevaron a cabo bajo las condiciones de extracción, análisis e identificación descritas en los numerales 3.1.1.4. y 3.1.1.5. del capítulo III. Además, la cuantificación de los compuestos volátiles se realizó teniendo en cuenta el estándar interno, usando la ecuación planteada en el numeral 3.4. del capítulo III. 4.1.2. Concentración de los compuestos volátiles durante la maduración de S. quitoense L. La Figura 13 muestra los cromatogramas obtenidos del análisis de volátiles en S. quitoense L. para los estadios 1 (superior) y 5 (inferior). Durante la maduración se obtuvieron esencialmente los mismos metabolitos, con variaciones en las áreas de la mayor parte de estos compuestos. Respecto al número de compuestos, los ésteres, alcoholes, aldehídos e hidrocarburos tuvieron

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diferencias de máximo un compuesto entre los diferentes estadios, mientras los ácidos y cetonas fluctuaron entre dos y cuatro y entre dos y seis compuestos respectivamente.

Figura 13. Cromatograma del análisis de volátiles en pulpa de S. quitoense L. en los estadios uno (figura superior) y cinco (figura inferior) de maduración. La Tabla 12 muestra los compuestos extraídos de S. quitoense L. y sus concentraciones en los diferentes estadios. Los ésteres fueron el grupo predominante en número y concentración, seguido de los alcoholes y aldehídos, además, los compuestos obtenidos en su mayoría fueron volátiles de bajo peso molecular, con un rango entre 60 y 198.

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Tabla 12. Concentración de los compuestos volátiles durante la maduración de S. quitoense L.

Compuesto

Fórmula química

Peso

molecular

Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 4 Estadio 5

Promedio (mg/g)

Desviación estándar

Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Ésteres

Acetato de metilo C3H6O2 74.1 9.94E-08(1)

5.79E-08 1.20E-06(1)

6.99E-07 2.76E-06(1)

5.20E-07 4.25E-06(1)

1.86E-06 1.73E-05(2)

9.20E-06

Acetato de etilo C4H8O2 88.1 2.07E-08(1)

9.87E-09 2.86E-07(1)

2.04E-07 5.52E-07(1)

7.39E-08 5.68E-06(2)

7.22E-07 2.14E-05(3)

4.53E-06

Propionato de metilo C4H8O2 88.1 4.08E-09(1)

1.40E-09 2.50E-08(1)

9.19E-09 1.06E-07(2,3)

1.66E-08 7.86E-08(2)

1.41E-08 1.24E-07(3)

4.53E-08

Butanoato de metilo C5H10O2 102.1 6.85E-08(1)

2.05E-08 5.36E-07(1)

1.71E-07 3.27E-06(1,2)

8.63E-07 7.80E-06(2)

8.43E-07 1.46E-05(2)

7.83E-06

(E)-2-Butenoato de metilo C5H8O2 100.1 ND - 3.20E-08(1)

6.79E-09 2.93E-07(1)

1.94E-08 1.20E-06(2)

9.59E-08 4.40E-06(3)

1.53E-06

Acetato de (Z)-2-penten-1-ol C7H12O2 128.1 1.41E-07(1)

1.94E-08 1.86E-06(1)

3.06E-07 2.09E-05(2)

1.18E-06 4.00E-05(3)

3.56E-06 6.98E-05(4)

1.13E-05

Acetato de pentilo C7H14O2 130.2 5.20E-09(1)

1.87E-09 9.76E-08(1)

1.78E-08 6.62E-07(2)

7.30E-08 1.29E-06(3)

9.13E-08 2.25E-06(4)

7.53E-07

Acetato de (E)-3-hexenilo C8H14O2 142.2 1.79E-07(1)

1.25E-07 7.90E-07(1,2)

2.98E-07 1.83E-06(1,2)

6.27E-07 3.00E-06(2,3)

1.03E-06 4.96E-06(3)

2.80E-06

Acetato de (Z)-3-hexenilo C8H14O2 142.2 2.09E-03(1)

4.12E-04 1.31E-02(2)

2.97E-03 6.13E-02(3)

4.20E-03 7.09E-02(4)

2.23E-03 1.03E-01(5)

3.86E-03

Acetato de hexilo C8H16O2 144.2 1.62E-04(1)

4.90E-05 1.27E-03(2)

1.67E-04 8.66E-03(3)

3.08E-04 1.30E-02(4)

4.21E-04 1.46E-02(5)

1.11E-03

Hexanoato de 1-metiletilo C9H16O2 158.2 5.34E-08(1)

1.85E-08 1.29E-07(2)

3.52E-08 ND - ND - ND -

Butanoato de (Z)-3-hexenilo C10H18O2 170.2 3.81E-08(1)

8.90E-09 1.44E-07(2)

5.57E-08 2.24E-07(1,2)

8.49E-08 3.80E-07(2,3)

9.77E-08 4.77E-07(3)

1.69E-07

Hexanoato de 2-metilpropilo C10H20O2 172.2 6.26E-09(2)

2.17E-09 ND - ND - ND - ND -

Total Ésteres 0.002257942 0.014364196 0.069993675 0.083962643 0.117863551

Alcoholes

1-Penten-3-ol C5H10O 86.1 1.82E-07(2)

7.20E-08 2.01E-07(2)

7.84E-08 5.19E-08(1)

3.55E-08 4.70E-08(1)

1.47E-08 6.18E-08(1)

2.15E-08

3-Pentanol C5H12O 88.1 ND - 7.74E-09(2)

7.56E-09 2.90E-09(1,2)

3.05E-09 1.55E-09(1,2)

1.11E-09 7.73E-10(1,2)

8.29E-10

(Z)-2-Penten-1-ol C5H10O 86.1 1.74E-07(1)

1.30E-07 8.50E-08(1)

2.85E-08 4.44E-08(1)

4.16E-08 2.30E-07(1)

3.63E-07 1.11E-07(1)

1.32E-07

(E)-3-Hexen-1-ol C6H12O 100.1 2.15E-07(2)

9.70E-08 1.09E-07(1)

3.63E-08 6.23E-08(1)

1.76E-08 9.82E-08(1)

4.55E-08 7.30E-08(1)

1.46E-08

(Z)-3-Hexen-1-ol C6H12O 100.1 1.54E-03(3)

3.58E-04 7.51E-04(2)

1.98E-04 2.35E-04(1)

9.01E-05 3.04E-04(1)

2.92E-05 1.29E-04(1)

2.47E-05

1-Hexanol C6H14O 102.1 7.02E-04(3)

1.82E-04 4.14E-04(2)

1.31E-04 1.54E-04(1)

6.71E-05 1.87E-04(1)

3.62E-05 4.74E-05(1)

2.18E-05

3,7-Dimetil-1,6-octadien-3-ol C10H18O 154.2 2.57E-05(3)

2.73E-06 9.97E-06(2)

3.47E-06 7.38E-06(2)

1.18E-06 2.76E-06(1)

1.22E-06 7.39E-07(1)

1.19E-07

3-Ciclohexen-1-metanol C7H12O 112.1 1.29E-06(3)

9.94E-08 3.90E-07(2)

1.71E-07 2.11E-07(1,2)

1.09E-07 1.25E-07(1)

5.74E-08 3.06E-08(1)

8.57E-09

Total alcoholes 0.002274107 0.001176088 0.000396689 0.000494609 0.000177676

Aldehídos

Pentanal C5H10O 86.1 3.20E-08(1)

3.25E-08 1.98E-08(1)

9.98E-09 7.36E-09(1)

5.57E-09 8.17E-09(1)

9.74E-09 1.21E-08(1)

1.06E-08

(E)-2-Pentenal C5H8O 84.1 1.41E-07(1)

3.98E-08 4.86E-07(1)

4.21E-07 2.59E-07(1)

3.89E-07 9.29E-07(1)

1.12E-06 1.01E-06(1)

3.88E-07

Hexanal C6H12O 100.1 2.95E-07(1)

6.47E-08 2.47E-07(1)

7.55E-08 2.33E-07(1)

1.08E-07 2.18E-06(1)

1.14E-06 3.16E-05(2)

1.44E-05

(E)-2-Hexenal C6H10O 98.1 2.39E-04(2)

1.07E-04 1.06E-04(1)

1.87E-05 1.09E-04(1)

2.85E-05 3.79E-04(2,3)

6.25E-05 4.97E-04(3)

1.27E-04

Octanal C8H16O 128.2 8.02E-08(1)

3.32E-08 1.08E-07(1)

6.02E-08 7.62E-08(1)

2.05E-08 7.61E-08(1)

6.54E-08 1.17E-07(1)

9.46E-08

Nonanal C9H18O 142.2 3.36E-07(1)

2.52E-07 4.08E-07(1)

1.42E-07 1.60E-07(1)

1.10E-07 3.24E-07(1)

1.34E-07 2.99E-07(1)

2.03E-07

Decanal C10H20O 156.2 1.43E-07(1)

7.82E-08 2.21E-07(1)

7.51E-08 1.69E-07(1)

5.04E-08 4.35E-07(2)

5.56E-08 4.21E-07(2)

1.35E-07

Total aldehídos 0.000240271 0.000107675 0.000109991 0.000383188 0.000530298

Hidrocarburos

Tolueno C7H8 92.1 4.52E-07(2)

1.03E-07 5.86E-07(2)

2.87E-07 8.06E-07(3)

7.17E-08 5.76E-07(2)

1.28E-07 2.04E-07(1)

7.39E-08

o-Xileno C8H10 106.1 ND - ND - ND - 1.80E-08(1)

2.18E-08 2.06E-08(1)

1.98E-08

Decano C10H22 142.2 2.09E-07(2)

1.58E-07 9.64E-08(1,2)

5.79E-08 2.78E-08(1)

2.92E-08 1.29E-07(1,2)

8.24E-08 1.97E-08(1)

3.72E-09

Undecano C11H24 156.3 5.81E-07(1)

3.41E-07 2.83E-07(1)

1.99E-07 1.44E-07(1)

4.14E-08 5.65E-07(1)

3.84E-07 2.06E-07(1)

5.58E-08

N.I. 3 - - 4.71E-08(1)

4.49E-08 2.13E-08(1)

1.35E-08 1.65E-08(1)

9.67E-09 3.37E-08(1)

2.32E-08 1.60E-08(1)

5.77E-09

Total hidrocarburos 1.29E-06 9.86E-07 9.95E-07 1.32E-06 4.66E-07

Ácidos

Ácido acético C2H4O2 60.0 ND - 2.71E-08(2,3)

1.03.E-08 1.66E-08(1,2)

1.64.E-08 2.80E-08(2,3)

1.27.E-08 4.24E-08(3)

3.29.E-08

Ácido hexanoico C6H12O2 116.1 2.35E-07(1)

4.22.E-08 8.73E-07(1)

2.26.E-07 1.76E-07(1)

6.11.E-08 1.54E-06(2)

2.35.E-07 4.56E-07(3)

1.95.E-07

Ácido (E)-3-hexenoico C6H10O2 114.1 ND - ND - ND - 7.83E-08(3)

3.44.E-08 3.85E-08(2)

2.36.E-08

Ácido (E)-2-hexenoico C6H10O2 114.1 1.24E-06(2)

6.39.E-07 1.27E-06(2)

5.17.E-07 2.15E-07(1)

1.89.E-07 1.06E-06(1,2)

6.39.E-07 2.01E-07(1)

2.84.E-07

Total ácidos 1.48E-06 2.17E-06 4.09E-07 2.70E-06 7.38E-07

Cetonas

1-Penten-3-ona C5H8O 84.1 5.25E-09(1)

4.00E-09 7.56E-09(1)

4.71E-09 3.23E-08(1)

1.93E-08 2.68E-08(1)

1.13E-08 1.47E-07(2)

9.33E-08

1-Octen-3-ona C8H14O 126.2 ND - ND - ND - ND - 9.28E-09(2)

5.06E-09

Acetofenona C8H8O 120.1 ND - ND - ND - ND - 2.50E-09(2)

9.78E-10

1,7,7-Trimetil-biciclo[2.1.1]-heptan-2-ona

C10H16O

152.2 1.30E-07

(1) 6.81E-08 1.13E-07

(1,2) 6.06E-08 1.57E-07

(1,2) 6.58E-08 3.82E-08

(1,2) 1.36E-08 5.77E-08

(2) 3.98E-08

4-Heptanona C7H14O 114.1 ND - ND - ND - ND - 2.22E-08(2)

7.01E-09

6,7-Dodecanodiona C12H22O2 198.3 2.58E-08(1)

3.54E-08 ND - ND - 4.12E-08(2,3)

1.91E-08 6.66E-08(3)

1.96E-08

Total cetonas 1.61E-07 1.21E-07 1.89E-07 1.06E-07 3.06E-07

Otros

N.I. 1 - - 1.92E-08(1)

1.31E-08 3.75E-08(1)

3.53E-08 5.04E-08(1)

4.71E-08 8.32E-09(1)

5.23E-09 1.28E-08(1)

9.15E-09

N.I. 2 - - 2.08E-07(1)

8.48E-08 1.69E-07(1)

1.20E-07 5.50E-07(1)

2.44E-07 2.69E-07(1)

1.66E-07 2.91E-07(2)

1.76E-07

Total otros 2.27E-07 2.07E-07 6.01E-07 2.77E-07 3.04E-07

Total de compuestos volátiles 0.0048 0.0157 0.0705 0.0848 0.1186

Los valores promedio tienen un superíndice que corresponde al subconjunto en que cada compuesto se agrupa según la prueba de Tukey. ND= No detectado.

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4.1.2.1. Efecto de la maduración sobre la concentración de los grupos funcionales de los volátiles de S. quitoense L. Debido a que la concentración de ésteres (en escala superior) dificultó apreciar las tendencias de comportamiento en los demás grupos funcionales (Figura 14, izquierda), se realizó una transformación de los datos, a partir de su logaritmo natural (Ln) (Figura 14, derecha). Los ésteres constituyeron el grupo químico de mayor concentración en todos los estadios, aunque en el estadio 1 compartieron el predominio con los alcoholes, además, los aldehídos fueron el tercer grupo predominante. El nivel de ésteres aumentó invariablemente desde el estadio uno hasta el final de la maduración, mientras los alcoholes disminuyeron, pasando de ser predominantes en el primer estadio, hasta constituir la tercera mayor concentración en el estadio cinco. Además, los aldehídos aumentaron en las fases finales, alcanzando un nivel superior al de los alcoholes en el estadio cinco. El análisis de varianza demostró una interacción grado II (P= 0.00) entre los factores respectivos (datos no mostrados), lo cual indica que el comportamiento de las concentraciones obtenidas en los grupos funcionales de la pulpa de S. quitoense L. depende del estadio en que se encuentre esta fruta.

Figura 14. Concentración (izquierda) y Ln de la concentración (derecha) de los grupos funcionales a partir de la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración. Las tendencias de los grupos señaladas en el presente estudio son confluentes con las identificadas en otros trabajos de investigación. En kiwi (Actinidia deliciosa var. deliciosa cv. Hayward) (Wan et al., 1999), guayaba (Psidium guajava) (Diniz et al., 2007), manzana “Pink Lady®” (Villatoro et al., 2008), fresa, (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013), también hubo predominio de ésteres en los diferentes estadios, con incremento paulatino a medida que se acercaba la maduración (Wan et al., 1999), mientras en piña (Ananas comosus [L.] Merr.) este grupo químico aumentó tanto en la maduración en planta, como en el almacenamiento en post-cosecha de las frutas verde-maduras (Steingass et al., 2014). De manera similar al comportamiento en S. quitoense L., en mangaba

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(Hancornia speciosa Gomes) (Santos y Nogueira, 2006) y cereza (Prunus avium L.) (Zhang et al., 2007), además de los ésteres, hubo incremento de los aldehídos en las fases finales de la maduración (Santos y Nogueira, 2006). En madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011) también se presentó predominio de ésteres y alcoholes. 4.1.2.2. Efecto del estadio de maduración sobre los compuestos volátiles en la pulpa de S. quitoense L. 4.1.2.2.1. PCA aplicado a los datos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la maduración. El PCA, basado en la matriz de correlaciones a partir de las concentraciones de los compuestos obtenidos en los estadios de la fruta tuvo un eigenvalor que representa el 58% de la variabilidad total de los datos, y el primer plano factorial, compuesto por los dos primeros componentes retuvo el 78.4% de la variabilidad total. El gráfico muestra que los compuestos asociados al primer estadio y que evidencian una fuerte correlación entre ellos son principalmente alcoholes (Figura 15), entre ellos 1-penten-3-ol, (Z) y (E)-3-hexen-1-ol, 1-hexanol, decano, 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol, nonanal y 3-ciclohexen-1-metanol. Además, los estadios cuatro y cinco se caracterizan por presentar en general, afinidad a los mismos compuestos, que en su mayoría corresponden a ésteres de acetato, sólo que estos metabolitos continúan con una tendencia de incremento en sus concentraciones. Entre estos compuestos están: acetato de metilo, acetato de etilo, propionato de metilo, ácido acético, butanoato de metilo, (E)-2-butenoato de metilo, acetato de (Z)-2-penten-1-ol, acetato de pentilo, acetato de (E)-3-hexenilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, acetato de hexilo.

Figura 15. Primer plano factorial de los compuestos de S. quitoense L. según el estadio de maduración. 4.1.2.2.2. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles durante la maduración de S. quitoense L. La prueba comparativa de Tukey aplicada a los compuestos volátiles de S. quitoense L. indicó que a través de los estadios de

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maduración, la concentración de la mayoría de volátiles se agrupó en el primer subconjunto, mientras los compuestos acetato de (Z)-3-hexenilo, acetato de hexilo, (Z)-3-hexen-1-ol, 1-hexanol y (E)-2-hexenal se ubicaron en subconjuntos diferentes, por lo que se denota el carácter de mayoritario para estos cinco compuestos (datos no mostrados). Puesto que la diferencia de concentración entre los volátiles mayoritarios dificultó la visualización del comportamiento de algunos de estos compuestos (Figura 16, izquierda) se obtuvo un nuevo gráfico a partir de su Ln (Figura 16, derecha). Los ésteres acetato de (Z)-3-hexenilo y acetato de hexilo tuvieron un comportamiento creciente a través de la maduración, pasando de 0.002 y 0.00015 mg/g en el estadio uno a una concentración de 0.1 y 0.015 mg/g en el estadio cinco respectivamente, de manera que manera que el acetato de (Z)-3-hexenilo predominó durante la maduración de la fruta como el compuesto de mayor concentración y el acetato de hexilo pasó de tener la quinta concentración en el estadio uno, a la segunda mayor concentración en el estadio cinco. Por el contrario, los alcoholes, (Z)-3-hexen-1-ol y 1-hexanol mostraron una tendencia decreciente durante la maduración de la fruta, pasando de concentraciones de 0.0017 y 0.0008 mg/g en el estadio uno a 1.2E-04 y 5.3E-05 en el estadio cinco. Además, el (E)-2-hexenal tuvo un descenso inicial y en las fases finales de maduración se incrementó (Figura 16, derecha).

Figura 16. Concentración (izquierda) y Ln de la concentración (derecha) de los compuestos mayoritarios en pulpa de S. quitoense L. durante la maduración. Los ésteres acetato de (Z)-3-hexenilo y acetato de hexilo también se han encontrado en altas concentraciones en madroño (Arbutus unedo L), pero disminuyendo a medida que la fruta se maduraba (Oliveira et al., 2011), mientras en mangaba (Hancornia speciosa Gomes) (Santos y Nogueira, 2006) fueron característicos del estadio intermedio. Adicionalmente, el acetato de (Z)-3-hexenilo fue encontrado con niveles importantes en frambuesa (Rubus idaeus) declinando

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durante la maduración (Robertson et al., 1995) y el acetato de hexilo predominó además en manzana “Pink Lady®”, aumentando en los estadios finales (Villatoro et al., 2008). También en manzanas (Malus domestica Borkh.), la etapa de mejor calidad se caracterizó por un mayor contenido de ésteres (Vanoli et al., 1995). Los compuestos alcohólicos (Z)-3-hexen-1-ol y 1-hexanol también se han obtenido en altas concentraciones en mangaba (Hancornia speciosa Gomes) (Santos y Nogueira, 2006) y madroño (Arbutus unedo L) (Oliveira et al., 2011), con la tendencia decreciente encontrada en S. quitoense L. en el transcurso de la maduración. En cereza (Prunus avium L.) 1-hexanol aumentó mientras 3-hexen-1-ol decreció en las etapas iniciales y luego se incrementó (Zhang et al., 2007). Adicionalmente, el (Z)-3-hexen-1-ol estuvo entre los compuestos de mayor concentración en guayaba (Psidium guajava) (Diniz et al., 2007) y frambuesa (Rubus idaeus) (Robertson et al., 1995), con niveles máximos en la madurez total y 1-hexanol se incrementó en la maduración de las variedades de ciruela “Laetitia” y “Angelino” (Prunus salicina Lindl.) (Louw and Theron, 2012). En estudios de volátiles durante la maduración, el (E)-2-hexenal se ha encontrado con altas concentraciones en mangaba (Hancornia speciosa Gomes) (Oliveira et al., 2011), tomate común (Lycopersicon esculentum var. commune) y tomate cherry (Lycopersicon esculentum var. cerasiforme) (Zhang et al., 2008), disminuyendo en la maduración. En guayaba (Psidium guajava) este compuesto mostró niveles superiores en la fase inmadura, con reducción al pasar al estadio intermedio (Diniz et al., 2007), tendencia contraria a la que se presentó en frambuesa (Rubus idaeus) donde hubo aumento en la maduración (Robertson et al., 1995). Además, en manzana (Malus domestica Borkh.) este compuesto se encontró en mayor abundancia al transcurrir la maduración (Vanoli et al., 1995). En cuanto a los compuestos de menor concentración, los ésteres minoritarios encontrados en S. quitoense L. tuvieron también tendencia a incrementarse en la madurez de otras frutas. El acetato de etilo fue el principal compuesto liberado en el estadio final del mango (Mangifera indica L. cv. Tommy Atkins) (Marques et al., 2009) y se consideró indicativo de la maduración en banana “Cavendish” (Boudhrioua et al., 2003), kiwi (Actinidia deliciosa var. deliciosa cv. Hayward) (Wan et al., 1999) y cereza (Prunus avium L.) (Zhang et al., 2007; Robertson et al., 1995), mientras el acetato de metilo creció en aguacate (Persea americana) (Obenland et al., 2012) y frambuesa (Rubus idaeus) (Robertson et al., 1995). Además, el propionato de metilo fue uno de los ésteres incrementados en kiwi (Actinidia deliciosa var. deliciosa cv. Hayward) (Wan et al., 1999). Entre los aldehídos minoritarios, los referentes de otras frutas develan similaridad y contraste en el comportamiento durante la maduración. El pentanal, que aumentó su concentración en S. quitoense L. al llegar a los estadios finales, mostró un comportamiento similar en cereza (Prunus avium L.) (Zhang et al., 2007) y aguacate (Persea americana) (Obenland et al., 2012). Por otro lado, el Hexanal, decreciente entre el estadio uno y el tres y creciente en los dos últimos estadios también presentó aumento en ciruela (Prunus salicina Lindl.) (Louw and

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Theron, 2012), manzana (Malus domestica Borkh.) (Vanoli et al., 1995) y frambuesa (Rubus idaeus) (Robertson et al., 1995) al final de la maduración, pero disminuyó en la madurez del aguacate (Persea americana) (Obenland et al., 2012). Octanal, nonanal y decanal tuvieron niveles mayores en la madurez de frambuesa (Rubus idaeus) (Robertson et al., 1995), mientras en el presente estudio, el decanal fue el único que mostró una tendencia concreta al aumentarse durante la maduración de S. quitoense L. En el caso de los alcoholes minoritarios el 1-penten-3-ol, disminuido en la maduración de la fruta investigada en el presente estudio, fue demarcado como indicador de la inmadurez en fresa (Fragaria x ananassa Duch.) (Vandendriessche et al., 2013), mientras el 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol, decreciente en S. quitoense L. también se redujo en mangaba (Hancornia speciosa Gomes) (Santos y Nogueira, 2006) y ciruela (Prunus salicina Lindl.) (Louw and Theron, 2012). En cuanto a compuestos de otros grupos en la fruta, 1-penten-3-ona decreció en aguacate (Persea americana) (Obenland et al., 2012), contrario a lo que sucedió con S. quitoense L., y el ácido (E)-3-hexenoico estuvo ausente en el estadio inicial de la cereza (Prunus avium L.) (Zhang et al., 2007) al igual que en lulo. 4.1.2.2.3. PLS para la identificación de compuestos marcadores durante la maduración de S. quitoense L. La figura 17 muestra los compuestos marcadores de la maduración de S. quitoense L., obtenidos mediante regresión de PLS. Entre los metabolitos marcadores se encuentran compuestos que poseen concentraciones estadísticamente diferenciales respecto de cada estadio, siendo el (E)-2-butenoato de metilo, el de mayor puntaje; además, se encuentran compuestos como 4-heptanona, con concentraciones estadísticamente superiores solamente al llegar al estadio de maduración total. De manera coherente con los hallazgos obtenidos en el PCA, varios ésteres de acetato, entre ellos los mayoritario acetato de (Z)-3-hexenilo y acetato de hexilo tuvieron concentraciones que se incrementaron de manera diferencial al transcurrir la maduración.

Figura 17. Identificación de marcadores en la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración.

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4.1.2.2.4. DA para determinar el estadio de maduración según la concentración de los compuestos de S. quitoense L. El DA es una técnica multivariada de clasificación que permite asignar a una muestra, un grupo definido de acuerdo a los valores medidos en ella. En particular, se buscó determinar el estadio de la fruta dados los valores de las concentraciones registradas. Entre las restricciones de la técnica, está que el número de variables, que en este caso corresponde al número de concentraciones registradas, 45 en total, debe ser inferior al número de observaciones menos el número de grupos de la variable de interés, que para el caso serían 25-5=20 (25 observaciones, 5 estadios). Por lo que se hizo necesario un proceso de selección previa del número de variables a estudiar. En primera instancia se ejecutó la prueba Lambda de Wilks determinando los compuestos con diferencias significativas en sus concentraciones medias al pasar de un estadio a otro. Posteriormente, y dado que las variables discriminantes se deben caracterizar por tener una alta variabilidad en el conjunto de datos totales y una baja variabilidad al interior de los grupos, se realizó un proceso de medición de la variabilidad de las concentraciones en los distintos estadios, así como su variabilidad total, acudiendo al coeficiente de variación, y a un indicador que relaciona ambas variabilidades. Específicamente, el coeficiente correspondió al cociente entre el coeficiente de variación de la concentración del compuesto a nivel global y el máximo coeficiente de variación de la concentración del compuesto al interior de los distintos estadios, expresado en forma porcentual, y en donde altos valores de este indicador son indicios de que el compuesto dado presenta una buena capacidad discriminante entre los estadios. Por último, y teniendo en cuenta otro supuesto restrictivo de la técnica de AD, como es el que las variables no pueden ser combinación lineal de otras variables discriminantes, se recurrió a la obtención de la matriz de correlaciones, y se eligen entre los compuestos cuyos coeficientes de correlación sean superiores a 0.9, sólo a uno de ellos, por presentar alta dependencia e ir en contraposición del supuesto mencionado. Del proceso descrito, las 19 variables que se consideraron para la aplicación de la técnica de DA fueron: propionato de metilo(C4), No identificado 2(C5), ácido acético(C6), 1-penten-3-ol(C7), 1-penten-3-ona(C8), 3-pentanol (C9), o-xileno (C17), (E)-3-hexen-1-ol (C18), 1-hexanol(C20), (E)-2-hexenal(C21), 1-octen-3-ona(C25), acetato de (Z)-3-hexenilo(C26), ácido (E)-3-hexenoico(C32), ácido (E)-2-hexenoico(C33), undecano(C37), butanoato de (Z)-3-hexenilo(C39), 1,7,7-trimetil-biciclo[2.1.1]-heptan-2-ona(C40), decanal(C42), 6,7-dodecanodiona(C45). Además, mediante la aplicación de la prueba de tolerancia se descartó al compuesto 45, siendo considerados los 18 compuestos restantes. Las funciones canónicas discriminantes obtenidas tuvieron coeficientes de correlación que evidencian el alto poder predictivo, en donde las dos primeras explican el 98,3% de la variabilidad total de los datos, por lo que se consideraron en los modelos predictivos estas dos primeras funciones. Las puntuaciones obtenidas para las distintas observaciones en las dos primeras funciones discriminantes (Figura 18, izquierda), son ubicadas en el mapa territorial (Figura 18, derecha), donde la función discriminante canónica 1 está representada en el eje X y la función 2 en el eje Y, y permiten pronosticar a que estadio pertenece la

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fruta al analizar posteriormente un determinado compuesto. El reemplazo de los datos obtenidos en los compuestos durante los cinco estadios de maduración tuvo en todos los casos una clasificación del 100%, es decir, al analizar los 18 compuesto en la fruta y establecer con el dato obtenido los coeficientes 1 y 2 previamente mencionados, su intersección entre los ejes (X) y (Y) del mapa territorial indicará apropiadamente en que estadio se encontraba la fruta previo a la determinación de dicho compuesto. Esto también indica que la variabilidad al interior del grupo es baja, denotando homogeneidad entre los datos de los grupos, mientras que la variabilidad entre grupos es alta, lo que favoreció la discriminación obtenida, y consecuentemente, la certidumbre predictiva del modelo en cuestión.

Figura 18. Mapa territorial de los compuestos volátiles en los estadios de S. quitoense L. durante la maduración. 4.1.2.3. Rutas metabólicas probablemente asociadas a la producción de volátiles en la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración. El perfil volátil de las frutas integra compuestos con clases químicas heterogéneas que a su vez poseen diferente número de carbonos (Conde-Martínez et al., 2014), y se originan a partir de aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos (Sanz et al., 1997; Obando-Ulloa et al., 2008). Los ácidos grasos figuran como precursores en frutas, catabolizados por dos rutas oxidativas la β-oxidación, que origina compuestos primarios del aroma, y la vía 13-lipoxigenasa (LOX), que genera metabolitos

Observaciones Funciones

1 2

C 4 3,227E8 -1,298E8

C 5 6932571 -8831356,139

C 6 1,956E8 8,327E7

C 7 -1,785E7 -2,187E7

C 8 -2,094E8 1,702E7

C 9 3,864E8 3,428E8

C 17 -3,163E8 8830340,186

C 18 5,199E7 1842312,680

C 20 -26004 21235,015

C 21 51079 31759,842

C 25 -3,093E8 1,888E9

C 26 2947090 -444080,698

C 32 4902990 -3,373E7

C 33 -1,287E7 -4149885,225

C 37 1,199E7 -1222153,778

C 39 6,047E7 4111470,177

C 40 -4,184E7 -2,322E7

C 42 2,048E7 -6302183,808

(Constante) -44 ,151

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secundarios del aroma (Baldwin, 2002; Matsui et al., 2006). La β-oxidación se presenta primordialmente en la fruta intacta y la acción de LOX tiene lugar en tejido alterado, como ocurre durante la maduración (Defilippi et al., 2009). En el ciclo de la β-oxidación, los ácidos grasos de cadena lineal son activados para atravesar la membrana mitocondrial y llegar a la matriz mitocondrial, donde se realiza este proceso (Sanz et al., 1997). Los derivados de acil-CoA son metabolizados a cadenas más cortas de acil-CoA con pérdida de dos carbonos por ciclo, y las unidades producidas se unen a sustratos alcohólicos, mediante la alcohol aciltranferasa (AAT), formando ésteres (Dávila-Aviña et al., 2011; El Hadi et al., 2013). En curuba (Passiflora mollissima (Kunth) L. H. Bailey) el catabolismo de ácidos grasos de cadena lineal por β-oxidación es utilizado para producir ésteres de acetato (Conde-Martínez et al., 2014). En el caso de la ruta de LOX, las enzimas y sustratos están físicamente separadas a nivel subcelular, y durante la maduración las paredes celulares y membranas pueden hacerse más permeables (Laria et al., 2012; El Hadi et al., 2013), y los ácidos grasos insaturados C18 linoleico o linolénico se someten a oxigenación por acción de la LOX, produciendo dos grupos de compuestos, los derivados de ácidos grasos 9-hidroperoxido y 13-hidroperoxido. Este último, en una rama posterior sufre escisión oxidativa por la hidroperóxido liasa (HPL), dando lugar a aldehídos volátiles de cadena corta, que pueden ser convertidos en sus isómeros por reordenamiento mediante isomerasas (ej. 3Z,2E-enal isomerasa), o reducidos a alcoholes por la acción de la ADH (Ortiz et al., 2003; Villatoro et al., 2008; Sánchez-Ortiz et al., 2013). Además, se pueden generar compuestos C5 de cadena lineal en esta ruta involucrando un radical 13-alcoxil que por β-escisión originaría un radical 1,3-penteno alilico, el cuall, al ser químicamente dimerizado formaría dimeros de penteno, o podría reaccionar con un radical hidroxilo para formar los alcoholes C5 (Sánchez-Ortiz et al., 2013). Entre los volátiles presentes en la pulpa de S. quitoense L. hay presencia de compuestos C6 de cadena lineal pertenecientes a los grupos aldehídos, alcoholes y ésteres, lo que guarda correspondencia principalmente con la degradación oxidativa de ácidos grasos de la vía de LOX. Los metabolitos encontrados en lulo relacionados con la ruta mencionada fueron hexanal, (E)-2-hexenal, 1-hexanol, (Z)-3-hexen-1-ol, (E)-3-hexen-1-ol, acetato de (Z)-3-hexenilo y acetato de hexilo. Además, entre estos compuestos se encuentran los cinco establecidos como mayoritarios por su concentración estadísticamente mayor, a partir de la prueba comparativa de Tukey, lo cual, sumado a la tendencia decreciente de los alcoholes mayoritarios, y el aumento progresivo de los principales ésteres, se considera la vía de LOX como la de mayor relevancia y distinción durante la maduración de S. quitoense L. mientras que la vía de la β-oxidación habría permitido la formación de alcoholes y ésteres de acetato en la fruta sin madurar. La Figura 19 ilustra el origen presuntivo de los compuestos volátiles C6 y ésteres de acetato, obtenidos al analizar la pulpa de S. quitoense L. utilizando las rutas de LOX y la β-oxidación.

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Figura 19. Ruta biosintética probable de compuestos volátiles C6 en pulpa de S. quitoense L. LOX: lipoxigenasa; HPL: hidroperóxido liasa; ADH: alcohol deshidrogenasa; AAT: alcohol aciltransferasa;

3Z,2E-EI: 3Z,2E-enal isomerasa. Adaptado de (Sanz et al., 1997) (El Hadi et al., 2013) (Laria et al., 2012). Ente los compuestos volátiles C6 presentes en la pulpa de S. quitoense L. probablemente obtenidos a partir de la ruta de LOX no se encontró el aldehído (Z)-3-Hexenal. Sin embargo, se ha indicado que la acción de la isomerasa respectiva provoca un rápido incremento en la formación de (E)-2-hexenal (Contreras et al., 2013), además de su transformación en (Z)-3-Hexen-1-ol por la ADH, aspectos que contribuirían a que se encuentre en concentraciones limitadas, y en el caso específico de S. quitoense L. por debajo del límite de cuantificación de la metodología de análisis utilizada. La actividad de la ruta de LOX ha sido identificada en la pulpa de diferentes frutas como tomate (Lycopersicon esculentum L., cv. Lichun) (Riley et al., 1996; Gao et al. 2007), curuba (Passiflora mollissima (Kunth) L. H. Bailey) (Conde-Martínez et al., 2014), manzana (Malus × domestica Borkh.) (Defilippi et al., 2005; Ortiz et al., 2011; Contreras and Beaudry, 2013), manzanas de las variedades comerciales “Pink Lady®” (Villatoro et al., 2008) y “Granny Smith®” (Lara and Vendrell, 2003), melocotón (Prunus persica L. Batsch) (Ortiz et al., 2003; Xi et al., 2014), pera (Pyrus ussuriensis Maxim) (Li et al., 2014) (Pyrus communis L.) (Chervin And Truett, 1999), oliva (Olea europaea L.) (Laria et al., 2012; Sánchez-Ortiz et al., 2013), melón (Cucumis melo L.) (Zhang et al., 2014), mango (Mangifera indica L. cv. Alphonso) (Pandit et al., 2010) (Mangifera indica L. cv. Kensington Pride) (Lalel et al., 2003) y banana (Musa spp. AAA group, Cavendish subgroup) (Yang et al., 2011). Se ha identificado que los genes de esta ruta PuLOX1, PuLOX8, PuADH3 y PuAAT tienen un rol principal en la formación de ésteres en pera (Pyrus ussuriensis Maxim) (Li et al., 2014) y el gen MpAAT1 utiliza un rango de sustratos de alcoholes para producir diversos ésteres en manzana (Malus pumila cv. Royal Gala) (Souleyre et al., 2005). En tomate se han identificado hasta ahora cinco genes de lipoxigenasas: TomloxA, TomloxB, TomloxC, TomloxD y TomloxE, aunque su rol en la maduración de las frutas es incierto (Dávila-Aviña et al., 2011). Otras fuentes importantes para la formación de volátiles (principalmente ésteres ramificados) son los aminoácidos, entre los cuales la alanina, valina, leucina,

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isoleucina, fenilalanina y ácido aspártico se consideran los precursores principales (Sanz et al., 1997; Baldwin, 2002). Cada uno puede ser precursor en una fruta (y no serlo en otra), decreciendo durante la formación de dicha fruta y con niveles constantes durante la maduración (Defilippi et al., 2009), aunque sus niveles pueden no siempre estar relacionados con la formación de un volátil específico (Wyllie and Fellman, 2000). Inicialmente son transformados por la piruvato descarboxilasa (PDC) en aldehídos, que luego son convertidos en alcoholes por la ADH. Finalmente se forman ésteres a partir de alcoholes y acil-CoAs mediante la actividad del grupo de las AATs, que puede realizar múltiples combinaciones entre diversos alcoholes y acil-CoAs (Baldwin, 2002). La isoleucina es un precursor de ésteres como acetato de 2-metilbutilo y butanoato de 2-metil-metilo en melón (Allwood et al., 2014) y 2-metilbutanoato en banana (El Hadi et al., 2013). 4.2. COMPORTAMIENTO DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DURANTE LA SENESCENCIA DE S. quitoense L. 4.2.1. Condiciones de muestreo, extracción y análisis de compuestos volátiles durante la senescencia de S. quitoense L. por SDE/GC-MS 4.2.1.1. Selección de la fruta. Las condiciones de selección fueron idénticas a las descritas para la extracción por HS-SPME en el numeral 3.1.1.1. del capítulo III. Las frutas fueron recolectadas en estadio cinco conforme a parámetros de color de la norma NTC 5093 y °Brix de 10.3 +/- 0.2 de acuerdo a Mejía et al. (2012), y mantenidas a tempertura ambiente durante la ejecución del experimento. 4.2.1.2. Fibra de HS-SPME utilizada, procedimiento de extracción, análisis y cuantificación de volátiles durante la senescencia de S. quitoense L. Para todos los ensayo se utilizó la fibra compuesta por CAR/PDMS a una temperatura de 60 ºC durante 30 minutos de acuerdo a los resultados en la evaluación de diferentes fibras de SPME, y los ensayos se llevaron a cabo bajo las condiciones de extracción descritas en el numeral 3.1.1.4. y de análisis y cuantificación referidas en el numeral 3.1.1.5. del capítulo III. 4.2.1.3. Diseño experimental para el análisis de S. quitoense L. por HS-SPME/GC-MS durante la senescencia. Las concentraciones de los grupos funcionales en los días posteriores a la madurez total fueron analizadas de manera descriptiva y luego se sometieron al diseño a dos vías, siendo el grupo funcional el primer factor con siete niveles (ésteres, alcoholes, aldehídos, cetonas, hidrocarburos ácidos y lactonas), mientras que el tiempo de senescencia de la fruta fue el segundo factor con seis niveles (día 2 hasta 12, con análisis cada 48 horas). Por cada tratamiento se efectuaron seis repeticiones. Adicionalmente, las tendencias de comportamiento de los compuestos volátiles fueron evidenciadas con ayuda del PCA, se realizó una prueba de Tukey para identificar los compuestos mayoritarios durante la senescencia, los cuales fueron caracterizados a partir de un análisis de perfiles. Finalmente, se aplicó el DA para establecer, a partir de compuestos de alto valor predictivo previamente preseleccionados, el

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tiempo de senescencia de la fruta. Los datos obtenidos fueron analizados con ayuda de los programas estadísticos SPSS® version 22 y Minitab® 17. 4.2.2. Concentración de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la senescencia. La Figura 20 muestra los picos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante el tiempo de senescencia, donde se efectuaron análisis cada 2 día, desde el día 2 al 12. Se pueden observar cambios en la altura de los picos de algunos compuestos, así como picos que por el color evidenciado representan la presencia de los compuestos respectivos solo en determinados día.

Figura 20. Cromatogramas del análisis de volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante la senescencia. Los compuestos obtenidos durante la senescencia estuvieron en un rango de peso molecular entre 60 y 156, siendo los de mayor concentración los ésteres de metilo 2-butenoato de metilo, hexanoato de metilo, benzoato de metilo y butanoato de metilo (Tabla 13). La prueba de Tukey realizada individualmente a cada compuesto mostró que las concentraciones del acetato de metilo, propionato de metilo, 2-butenoato de metilo, (E)-2-hexenal, 2-butenoato de metilo y 1-hexanol se ubicaron en cuatro subconjuntos, lo que indica que fueron los metabolitos con mayor número de variaciones significativas a través de los días de senescencia analizados. Estos compuestos además, mostraron tendencias crecientes y/o decrecientes durante el tiempo de monitoreo establecido.

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Tabla 13. Concentración de los compuestos volátiles de S. quitoense L. obtenidos durante la senescencia.

Compuesto Fórmula química

Peso molecular

Senescencia día 2 Senescencia día 4 Senescencia día 6 Senescencia día 8 Senescencia día 10 Senescencia día 12

Promedio Desviación estándar






Ésteres

Acetato de metilo C3H6O2 74.1 6.8E-05(1)

9.2E-06 3.5E-04(1)

7.1E-05 1.9E-03(3)

5.4E-04 3.3E-03(4)

1.3E-03 1.5E-03(1,2)

1.3E-04 7.2E-04(1,2)

1.2E-04

Acetato de etilo C4H8O2 88.1 9.4E-07(1)

3.6E-07 1.5E-04(3)

3.6E-05 1.0E-06(1)

2.5E-07 3.3E-05(2)

8.9E-06 5.1E-06(1)

8.8E-07 3.4E-06(1)

7.1E-07

Propionato de metilo C4H8O2 88.1 6.2E-07(1)

8.5E-08 1.2E-05(2)

3.5E-06 4.6E-05(4)

1.1E-05 3.2E-05(3)

7.1E-06 3.6E-06(1,2)

5.3E-07 3.3E-06(1,2)

1.0E-06

Acetato de 1-metiletilo C5H10O2 1021 2.7E-07(2,3)

6.3E-08 3.4E-07(3)

2.6E-07 ND - 8.8E-08(1,2)

3.7E-08 ND - ND -

2-metilpropanoato de metilo C5H10O2 102.1 ND - 7.8E-07(1)

6.2E-07 6.1E-06(1)

4.7E-06 5.2E-05(2)

1.6E-05 4.0E-06(1)

4.9E-07 2.6E-06(1)

9.5E-07

2-metil-2-propenoato de metilo C5H8O2 100.1 ND - ND - 5.4E-07(1,2)

3.3E-07 5.2E-06(3)

1.6E-06 1.3E-06(1,2)

3.6E-07 1.7E-06(2)

8.8E-07

Butanoato de metilo C5H10O2 102.1 6.5E-05(1)

2.7E-05 1.9E-03(1)

3.8E-04 1.5E-02(1)

1.3E-03 1.8E-01(3)

3.3E-02 5.1E-02(2)

4.2E-03 1.4E-02(1)

3.1E-03

2-butenoato de metilo C5H8O2 100.1 3.2E-07(1)

8.9E-08 3.5E-06(1)

9.0E-07 4.0E-05(1)

4.7E-06 1.3E-02(4)

2.0E-03 5.5E-03(3)

4.6E-04 1.9E-03(2)

5.8E-04

Butanoato de etilo C6H12O2 116.1 1.9E-07(1)

8.1E-08 1.2E-04(1)

5.8E-05 7.5E-07(1)

9.7E-08 7.6E-04(2)

2.2E-04 1.2E-03(3)

6.2E-05 5.9E-04(2)

2.2E-04

Acetato de butilo C6H12O2 116.1 9.4E-08(1)

1.1E-08 5.7E-07(2)

1.7E-07 ND - ND - ND - ND -

2-metil-2-propenoato de etilo C6H10O2 114.1 ND - ND - ND - 7.1E-08(1)

2.3E-08 1.9E-07(2)

4.1E-08 2.9E-07(3)

5.1E-08

(E)-2-metil-2-butenoato de metilo C6H10O2 114.1 ND - ND - 7.4E-07(1)

2.0E-07 6.2E-04(2,3)

1.5E-04 7.4E-04(3)

1.1E-04 5.0E-04(2)

9.9E-05

Acetato de (Z)-2-penten-1-ol C7H12O2 128.1 3.5E-07(1)

3.5E-07 8.3E-07(1)

4.0E-07 5.1E-07(1)

4.7E-07 2.0E-07(1)

8.7E-08 1.3E-06(1)

1.4E-06 8.9E-07(1)

4.9E-07

Hexanoato de metilo C7H14O2 130.1 6.8E-07(1)

2.8E-07 1.9E-05(1)

7.7E-06 1.6E-03(1)

8.9E-04 2.0E-02(2)

7.5E-03 2.1E-04(1)

3.9E-05 2.3E-04(1)

1.2E-04

3-hexenoato de metilo C7H12O2 128.1 ND - ND - ND - 8.9E-06(2)

9.1E-06 3.6E-06(1,2)

2.3E-06 9.9E-07(1)

3.7E-07

(E)-2-hexenoato de metilo C7H12O2 128.1 ND - ND - ND - 6.8E-04(1)

1.7E-03 6.9E-07(1)

2.1E-07 4.9E-07(1)

2.5E-07

Hexanoato de etilo C8H16O2 144.2 4.0E-07(1)

4.2E-07 5.2E-06(1)

1.7E-06 1.9E-06(1)

1.2E-06 2.2E-05(1)

2.3E-05 2.1E-04(2)

3.9E-05 2.3E-04(2)

1.2E-04

Acetato de (E)-3-hexenilo C8H14O2 142.2 1.1E-06(1,2)

5.2E-07 2.6E-06(3)

5.7E-07 1.8E-06(2,3)

4.7E-07 4.4E-07(1)

2.4E-07 1.7E-06(2,3)

8.7E-07 2.2E-06(2,3)

1.0E-06

Acetato de (Z)-3-hexenilo C8H14O2 142.2 6.4E-04(1)

4.4E-04 1.4E-03(1)

4.5E-04 6.5E-04(1)

4.9E-04 6.9E-04(1)

4.1E-04 3.1E-03(2)

1.6E-03 1.6E-03(1)

4.8E-04

Acetato de hexilo C8H16O2 142.2 2.2E-04(1)

2.0E-04 4.7E-04(1)

2.5E-04 2.8E-04(1)

2.3E-04 9.6E-05(1)

8.0E-05 1.6E-03(2)

1.1E-03 1.9E-04(1)

5.7E-05

Hexanoato de 1-metiletilo C9H16O2 158.2 3.4E-08(1)

8.1E-09 1.5E-06(1)

3.7E-06 ND - ND - ND - ND -

Benzoato de metilo C8H8O2 136.1 2.3E-05(1)

9.5E-06 9.9E-05(1)

2.3E-05 3.8E-03(1,2)

7.6E-04 9.5E-03(2,3)

7.8E-03 1.3E-02(3)

1.2E-03 7.0E-03(2)

2.8E-03

(E)-3-butirato de hexenilo C10H18O2 170.2 9.1E-09(1)

1.3E-09 1.4E-08(1)

5.4E-09 ND - ND - 1.9E-07(2)

4.9E-08 1.9E-07(2)

8.7E-08

Total Ésteres 1.0E-03 4.6E-03 2.4E-02 2.3E-01 7.8E-02 2.7E-02

Alcoholes

1-penten-3-ol C5H10O 86.1 5.7E-06(1)

1.9E-06 5.8E-06(1)

1.0E-06 5.7E-06(1)

8.1E-07 ND - ND - ND -

1-pentanol C5H12O 88.1 2.3E-08(1)

2.9E-08 4.1E-08(1)

6.8E-08 ND - ND - ND - ND -

(Z)-2-penten-1-ol C5H10O 86.1 1.5E-06(2)

4.2E-07 ND - 7.1E-08(1)

2.3E-08 ND - ND - ND -

(E)-3-Hexen-1-ol C6H12O 100.1 2.4E-06(1)

5.5E-07 7.1E-06(2)

2.3E-06 7.8E-06(2)

1.3E-06 ND - ND - ND -

(Z)-3-Hexen-1-ol C6H12O 100.1 3.0E-03(2)

3.9E-04 4.1E-03(3)

6.5E-04 3.0E-03(2)

4.1E-04 2.4E-03(2)

7.1E-04 4.9E-04(1)

1.6E-04 1.8E-04(1)

7.4E-05

1-Hexanol C6H14O 102.1 7.7E-04(3,4)

9.8E-05 8.3E-04(4)

1.0E-04 6.1E-04(3)

1.2E-04 3.7E-04(2)

1.1E-04 3.5E-04(2)

1.1E-04 7.1E-05(1)

2.0E-05

Total Alcoholes 3.7E-03 4.9E-03 3.6E-03 2.7E-03 8.4E-04 2.6E-04

Aldehídos

Pentanal C5H10O 86.1 2.6E-07(2)

1.9E-07 1.4E-07(1,2)

1.3E-07 1.7E-07(1,2)

1.2E-07 ND - ND - ND -

Hexanal C6H12O 100.1 3.0E-04(3)

8.6E-05 1.8E-04(2)

5.6E-05 1.2E-03(3)

1.2E-04 5.7E-07(1)

1.7E-07 5.2E-05(1)

1.4E-05 6.6E-05(1,2)

4.4E-05

(E)-2-hexenal C6H10O 98.1 2.2E-03(3)

4.6E-04 1.2E-03(1)

8.9E-05 3.7E-03(4)

5.6E-04 2.2E-03(2,3)

4.0E-04 2.2E-03(3)

3.7E-04 1.4E-03(1,2)

4.7E-04

(E,E)-2,4-hexadienal C6H8O 96.1 8.6E-06(2)

3.0E-06 5.4E-06(1,2)

2.0E-06 1.5E-05(3)

7.0E-06 4.8E-06(1,2)

4.4E-06 1.4E-06(1)

5.8E-07 1.3E-06(1)

6.7E-07

Decanal C10H20O 156.2 1.9E-09(1)

4.1E-10 ND - ND - ND - ND - ND -

2,2,6-trimetil-1-ciclohexeno-1-carboxialdehído C10H16O

152.2 5.2E-08

(2) 5.7E-09 3.3E-08

(1) 5.6E-09 ND - ND - ND - ND -

Total Aldehídos 2.5E-03 1.4E-03 4.9E-03 2.2E-03 2.3E-03 1.5E-03

Ácidos

Ácido Acético C2H4O2 60 3.1E-08(1)

8.9E-09 3.6E-08(1)

3.2E-08 3.4E-08(1)

1.6E-08 ND - ND - ND -

Ácido hexenoico C6H12O2 116.1 6.3E-08(1)

1.7E-08 7.4E-08(1)

2.9E-08 1.8E-07(2)

2.8E-08 ND - ND - ND -


1.4E-09 3.6E-09(1)

8.6E-10 ND - ND - ND - ND -


1.2E-07 1.9E-07(1,2)

8.9E-08 3.5E-07(2,3)

8.7E-08 5.1E-07(3)

1.1E-07 3.8E-07(2,3)

2.6E-07 ND -

Ácido benzoico C6H10O2 122.1 ND - ND - 5.7E-06(2)

8.1E-07 4.0E-08(1)

2.2E-08 ND - ND -

Total Ácidos 5.6E-07 3.0E-07 6.3E-06 5.5E-07 3.8E-07 0.0E+00

Otros

5-etil-2(5H)-furanona C6H8O2 112.1 ND - ND - 3.7E-07(1)

4.8E-08 3.2E-07(1)

2.8E-07 ND - 1.4E-07(1)

1.5E-07

5-etildihidro-2(3H)-furanona C6H10O2 114.1 ND - ND - 7.4E-08(1)

1.2E-08 6.4E-07(2)

1.5E-07 5.6E-07(2)

2.1E-07 4.9E-07(2)

2.4E-07

1,7,7-Trimetil-biciclo[2.1.1]-heptan-2-ona C10H16O 152.2 3.7E-06(2)

1.3E-06 2.2E-06(1)

4.5E-07 4.0E-06(2)

1.2E-06 ND - ND - ND -

Tolueno C7H8 92.1 4.4E-08(2)

4.6E-08 2.8E-08(1,2)

1.9E-08 ND - ND - ND - ND -

No identificado 1 - - 5.9E-08(2)

6.8E-08 3.8E-08(1,2)

2.3E-08 ND - ND - ND - ND -


1.3E-06 4.4E-06(2)

1.6E-06 ND - ND - ND - ND -


3.5E-08 1.4E-07(1)

1.3E-08 ND - ND - ND - ND -

No identificado 4 - - ND - ND - ND - 4.5E-06(2)

1.2E-06 1.2E-05(1)

5.1E-06 5.3E-06(2)

3.3E-06

No identificado 5 - - ND - ND - 4.4E-08(1)

2.1E-08 4.8E-07(1)

5.2E-07 3.5E-06(2)

2.1E-06 2.8E-06(2)

2.2E-06

No identificado 6 - - ND - ND - 6.6E-08(1,2)

1.2E-08 2.5E-07(2)

2.3E-07 5.6E-07(3)

1.7E-07 ND -


5.7E-09 3.4E-08(1)

9.9E-09 ND - ND - ND - ND -

Total otros 5.9E-06 6.9E-06 4.6E-06 6.2E-06 1.7E-05 8.7E-06

Total de compuestos volátiles 7.3E-03 1.1E-02 3.2E-02 2.4E-01 8.2E-02 2.9E-02

Los valores promedio tienen un superíndice que corresponde al subconjunto en que cada compuesto se agrupa según la prueba de Tukey. ND= No detectado.

80

En cuanto al número de compuestos obtenidos en cada grupo químico durante la senescencia, hubo predominio de ésteres (entre 16 y 21 compuestos), principalmente de metilo y algunos ésteres de acetato, con tendencia a un mayor número al final de la senescencia. Por otra parte, la cantidad de alcoholes cuantificados, exclusivamente de 5 y 6 C, decreció de manera tal que los únicos presentes en las etapas finales fueron (Z)-3-hexen-1-ol y 1-hexanol. Los aldehídos tuvieron un comportamiento similar al de los alcoholes, siendo hexanal, (E)-2-hexenal y (E,E)-2,4-hexadienal los existentes en la fase final de senescencia, etapa en la cual no se evidenciaron ácidos, hidrocarburos ni cetonas. 4.2.2.1. Concentración total de los grupos funcionales de volátiles durante la senescencia de S. quitoense L. Puesto que los ésteres tuvieron niveles mayores a los demás grupos dificultándose apreciar sus tendencias (Figura 21, izquierda), se realizó una transformación de los datos mediante su raíz cuadrada (Figura 21, derecha), además, no se graficaron las concentraciones de grupos que estuviesen ausentes en dos o más días de senescencia. Los ésteres pasaron de tener una concentración de 0.001 mg/g en el día 2 donde estuvieron por debajo de los niveles de alcoholes y aldehídos, hasta alcanzar 0.2 mg/g el día 8, tiempo en el cual representaron entre el 97.08 y 98.15% de la concentración total y posteriormente decrecieron hasta 0.035 mg/g en el día final de senescencia estudiado, donde sin embargo continuaron representando más del 93% de la concentración total de volátiles. Otro aspecto a denotar es el comportamiento de los alcoholes, grupo con incremento leve hacia el día 4 donde su concentración fue de 0.0049 mg/g equivalente al 51.4% de la total obtenida, pero luego decreció de manera invariable hasta llegar a 0.00025 mg/g en el día 12, con solo el 0.68% de la concentración total de S. quitoense L. Los aldehídos también mostraron una tendencia al decrecimiento en los últimos días de análisis de la senescencia, mientras los ácidos se mantuvieron constantes a lo largo de la fase en estudio.

Figura 21. Concentración (izquierda) y raíz cuadrada de la concentración (derecha) de los grupos funcionales durante la senescencia de S. quitoense L. En la fruta de palma de jalea (Butia capitata) el contenido de ésteres fue también dominante, con un contenido relativo cercano al 99% durante el almacenamiento

81

(Santana et al., 2014). Los cambios en este grupo durante la senescencia se relacionan con variaciones de la actividad de enzimas diferentes a la AAT, que generan modificaciones en el suministro de precursores, principalmente alcoholes (Ortiz et al., 2009), esto explica que la concentración de estos últimos haya sido inicialmente superior a la de los ésteres, tal como se reportó en melón (Cucumis melo var. makuwa Makino) (Bai et al., 2014). Se ha indicado además que los ésteres de acetato en tejido senescente son promovidos mediante la acetil-CoA, metabolizada por la vía del ácido cítrico bajo anaerobiosis (Steingass et al., 2014), mientras que la presencia de compuestos metil ramificados estaría relacionada con la reducción de sustratos intermediario y subsecuente esterificación del producto con acetil-CoA (Steingass et al., 2014). En el caso de los aldehídos, la reducción presentada está relacionada con la regulación de enzimas de la ruta de LOX por acción del etileno en la senescencia (Obando-Ulloa et al., 2009). 4.2.2.1.1. Efecto la senescencia sobre la concentración de los grupos funcionales de los volátiles de S. quitoense L. El análisis de varianza aplicado a los grupos funcionales indicó una interacción de II grado entre el tiempo de senescencia y los grupos funcionales (P= 0.00), de manera que la concentración de los grupos funcionales guarda relación de dependencia con el día de senescencia en el que esté la fruta (datos no mostrados). La prueba de comparaciones múltiples de Tukey realizada posteriormente ubicó la concentración de los ácidos, aldehídos y alcoholes en el mismo subgrupo y a los ésteres en un segundo subconjunto por estar en niveles estadísticamente superiores a los demás grupos químicos. 4.2.2.2. Efecto del tiempo de senescencia sobre los compuestos volátiles en la pulpa de S. quitoense L. 4.2.2.2.1. PCA aplicado a los datos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. durante la senescencia. El PCA realizado con base en la matriz de correspondencia de los metabolitos volátiles durante el tiempo de senescencia analizado muestra un alto valor del 48% de representación de la variabilidad de los datos obtenidos y junto con el segundo componente retienen una varianza acumulada del 70%, de manera que entre estos primeros componentes existe una explicación relevante de los cambios que se produjeron durante los días monitoreados. Al analizar el PCA, la primera característica apreciable es que los ésteres de metilo (E)-2-hexenoato de metilo, 2-metilpropanoato de metilo, butanoato de metilo, 2-metil-2-propenoato de metilo, acetato de metilo, 3-hexenoato de metilo muestran asociación relevante hacia el día 8 de senescencia (Figura 22). Por su parte, los alcoholes (Z)-3-hexen-1-ol, (E)-3-hexen-1-ol, 1-pentanol, los ésteres de acetato como el acetato de etilo, acetato de 1-metiletilo y acetato de butilo se encuentran entre los compuestos que caracterizan los días iniciales posterior a la maduración de la fruta. Otros ésteres de acetato como el acetato de (E)-3-hexenilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, acetato de hexilo y Acetato de (Z)-2-penten-1-ol, con predominio creciente durante la maduración de S. quitoense L., muestran fuerte correlación con el día 12 de senescencia, hacia donde puntualmente tuvieron una variación de incremento.

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Figura 22. Primer plano factorial de los compuestos de S. quitoense L. según el tiempo de senescencia. 4.2.2.2.2. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles de S. quitoense L. durante la senescencia. La prueba de Tukey, para definir que compuestos por su concentración pertenecían a un subconjunto estadísticamente mayor (datos no mostrados), indicó que ocho de los 51 compuestos cuantificados tenían concentraciones diferenciadas de los restantes, entre los cuales se destacan principalmente ésteres de metilo, además de acetato de (Z)-3-hexenilo, (E)-2-hexenal y (Z)-3-hexen-1-ol que habían sido los más abundantes durante la maduración de S. quitoense L. Una vez identificados los compuestos mayoritarios, se realizó un diagrama de perfiles, a partir del logaritmo natural de sus concentraciones para apreciar adecuadamente las tendencias. El aspecto general relevante es que los ésteres de metilo butanoato de metilo, 2-butenoato de metilo, hexanoato de metilo, acetato de metilo y benzoato de metilo tuvieron un aumento desde el día 2 hasta el día 8 de senescencia y luego decrecieron en los últimos 4 días, con excepción de este último que solo decreció al pasar al día 12 (Figura 23). El butanoato de metilo pasó de un promedio de 6.48E5 mg/g en el primer día de análisis donde tuvo la quinta mayor concentración y representó el 0.9% del total de volátiles, hasta llegar a 0.18 mg/g en el día 8, valor que constituyó el 76.4% de la concentración promedio, tiempo después del cual se dio un decrecimiento hasta el día final de análisis donde se obtuvieron 0.014 mg/g, lo cual correspondió al 37.6% del total obtenido. También es de resaltar el comportamiento del (Z)-3-hexen-1-ol, con ligero incremento al pasar del día 2 al 4, probablemente por su acumulación, favorecida por el agotamiento de enzimas como la AAT o una limitada isomerización a (E)-3-hexen-1-ol al inicio de la senescencia. Posteriormente, la concentración de (Z)-3-hexen-1-ol disminuyó notable e invariablemente pasando de ser el compuesto de mayor recuperación en el día 4 con 0.004 mg/g (31,9% de la concentración total) a tener 0.00018 mg/g en el día final de análisis, donde solo representó en promedio el 0.49% de la concentración volátil total.

83

Figura 23. Concentración (izquierda) y Ln de la concentración (derecha) de los compuestos mayoritarios en pulpa de S. quitoense L. durante la senescencia. 4.2.2.2.3. PLS para la identificación de compuestos marcadores durante la senescencia de S. quitoense L. Como se puede observar en la figura 24, la mayor parte de los compuestos designados como marcadores a partir del análisis por PLS fueron ésteres, principalmente de cadena ramificada. Además, los alcoholes marcadores 1-penten-3-ol y (E)-3-hexen-1-ol, el aldehído pentanal y la cetona 1,7,7-Trimetil-biciclo[2.1.1]-heptan-2-ona tuvieron concentraciones menores y estadísticamente iguales después del día seis de senescencia. Otro aspecto a denotar es la designación de marcadores sobre tres compuestos que no pudieron ser identificados.

Figura 24. Identificación de marcadores en la pulpa de S. quitoense L. durante la senescencia.

84

4.2.2.2.4. DA para determinar el tiempo de senescencia según la concentración de los compuestos de S. quitoense L. Se buscó determinar el tiempo de senescencia (expresado en días) en el cual se encontraba la fruta S. quitoense L. según los valores de las concentraciones registradas en los análisis respectivos. Como se explicó previamente, el DA tiene como restricción que el número de variables (concentración de cada compuesto), debe ser menor al número de observaciones menos el número de grupos de la variable de interés, que para el caso serían 36-6=30 (36 observaciones, 6 grupos, días de senescencia). Al violar esta condición, se hizo necesario un proceso de selección del número de variables a estudiar, según su potencial diferenciador entre grupos. La aplicación de la prueba Lambda de Wilks permitió excluir cuatro compuestos, por la incapacidad de su concentración para discriminar entre los días de senescencia (P<0.05).

Posteriormente se discriminó con base en la variabilidad inter e intragrupo de los compuestos individuales (explicado en el numeral 4.1.2.2.3.), lo que permitió descartar siete metabolitos. Finalmente, y teniendo en cuenta otro supuesto restrictivo de la técnica de DA, como es el que las variables no pueden ser combinación lineal de otras variables discriminantes, se recurrió a la obtención de la matriz de correlaciones, y se descartaron para el estudio ocho metabolitos que presentaron altas correlaciones con los demás compuestos (P<0,01). Los restantes 27 compuestos fueron considerados para el DA: no identificado 1(C2), propionato de metilo(C4), acetato de 1-metiletilo(C6), 2-metilpropanoato de metilo(C8), 2-metil-2-propenoato de metilo(C10), pentanal(C11), butanoato de metilo(C12), 2-butenoato de metilo(C14), 1-pentanol(C15), butanoato de etilo(C16), (Z)-2-penten-1-ol(C17), acetato de butilo(C18), hexanal(C19), (E)-2-metil-2-butenoato de metilo(C21), (E)-2-hexenal(C25), acetato de (Z)-2-penten-1-ol(C26), hexanoato de metilo(C27), (E,E)-2,4-hexadienal(C29), acetato de (E)-3-hexen-1-ol(C32), acetato de hexilo(C34), Hexanoato de 1-metiletilo(C35), ácido hexenoico(C36), 5-etil-2(5H)-furanona(C37), ácido (E)-3-hexenoico(C39), Benzoato de metilo(C42), (E)-3-butirato de hexenilo(C43), No identificado 5 (C47). Las funciones canónicas discriminantes, con altos coeficientes de correlación, indican que una alta proporción de la varianza es atribuible a las diferencias entre los tiempos de senescencia para los compuestos involucrados en el DA (datos no mostrados). Se registraron cinco funciones dado que el número obtenido es igual al número de grupos menos uno, y para el análisis interpretativo se recurrió a las dos primeras funciones, que representaron en conjunto el 88.9% (78.7% y 10.2% respectivamente). Los coeficientes registrados (Figura 25, izquierda), permiten suministran las puntuaciones discriminantes al evaluar las concentraciones de los compuestos, lo que a su vez conduce a que se puedan localizar las puntuaciones obtenidas en el mapa territorial (Figura 25, izquierda) para pronosticar un grupo de pertenencia, es decir, el tiempo de senescencia de la fruta dadas las concentraciones registradas. El mapa territorial muestra que los tiempos de senescencia día 2, día 4, día 8 y día 10 poseen apropiada discriminación, puesto que presentan área más amplias

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(símbolos 1, 2, 4 y 5), en comparación con los días 6 y 12, no obstante, el modelo pronostica correctamente el 100% de las réplicas en el tiempo de senescencia correcto. Puntualmente, la función discriminante 1 (eje x), contrapone a los días 2 y 8, ubicados a la izquierda y a la derecha del mapa respectivamente, mientras la función discriminante 2 (eje y), contrapone a los días 4 y 10, localizados respectivamente en la parte inferior y superior del mapa.

Figura 25. Mapa territorial de los compuestos volátiles en la senescencia de S. quitoense L. En cuanto a las tendencias registradas, existen referentes previos de comportamiento similar en la concentración de los compuestos durante la fase de deterioro en otras frutas. El incremento de los ésteres mayoritarios, principalmente hexanoatos y butanoatos durante la senescencia fue previamente descrito en melón (Cucumis melo L.), con particular aumento de 2-metilbutanoato de metilo, butanoato de etilo, y decrecimientos de aldehídos como hexanal y nonanal (Obando-Ulloa et al., 2009). Igualmente en fresas maduras (Fragaria x ananassu Duch.) 3 días después del almacenamiento, butanoato de etilo, butanoato de metilo y hexanoato de etilo estuvieron entre los compuestos más relevantes (Larsen and Watkins, 1995). Además, los butanoatos se han destacado en manzanas “Pink Lady®” (Malus × domestica Borkh.) almacenadas largo tiempo,

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sin que per se afecte su aceptabilidad (López et al., 2007). También en manzana (Malus domestica Borkh.), se presentaron altas cantidades de butanoatos durante la sobremaduración y una menor cantidad en el tiempo de óptima calidad (Vanoli et al., 1995), mientras el fruto de la palma de jalea (Butia capitata) con 100% de maduración y tres días de almacenamiento fue influenciado en su composición por aumentos de butanoato de etilo y los hexanoatos de metilo y etilo, que constituyeron el 85% del área relativa (Santana et al., 2014). En contraste, el durián (Durio zibethinus cv. D24) tuvo decrecimiento de butanoatos desde la primera semana posterior a su madurez, que fueron indicadores tempranos de pérdida de la integridad en su fracción volátil (Voon et al., 2007), y en guanábana (Annona muricata L.), (E)-2-butenoato de metilo, butanoato de metilo, y hexanoato de metilo decrecieron durante la sobremaduración (Iwaoka and Zhang, 1993). Los compuestos minoritarios de la senescencia de S. quitoense L. también han sido encontrados en la postmadurez de otras fruta con tendencias similares como contrarias. Los compuestos (Z)-2-penten-1-ol, y pentan-1-ol, con tendencia al decrecimiento en lulo, se incrementaron durante la senescencia de la sandía (Citrullus lanatus Thunb. Matsum. and Nakai, ‘Sugar Heart’) (Saftner et al., 2007). Los ésteres acetato de butilo y acetato de hexilo, de limitadas concentraciones y sin tendencias concretas en la senescencia de S. quitoense L., fueron los más abundantes en melón (Cucumis melo L.) (Fallik et al., 2001), mientras en manzana (Malus domestica Borkh.) acetato de hexilo decreció durante la sobremaduración (Vanoli et al., 1995). Dada la relevancia de algunos compuestos minoritarios se han empleado modificaciones en las técnicas de muestreo por espacio de cabeza para favorecer la sensibilidad en la identificación y la cuantificación, demostrándose la capacidad de la SPME para discriminar entre muestras frescas y rancias (Cognat et al., 2012). Algunos compuestos del lulo durante su etapa de consumo han sido considerados en otras frutas como contribuyentes al “off flavor”, producto de la oxidación de lípidos o descomposición enzimática endógena (Huis, 1996; Wilkes et al., 2000). El hexanal, indicador de deterioro en sandía (Citrullus lanatus Thunb. Matsum. and Nakai, ‘Sugar Heart’) (Saftner et al., 2007) y en piña (Ananas sp.) (Spainer et al., 1998) y el 1-hexanol, correlacionado con olor desagradable en durián (Durio zibethinus cv. D24) almacenado 42 días (Voon et al., 2007), tuvieron decrecimientos durante la vida útil de S. quitoense L., mientras el acetato de etilo, tuvo mayores niveles en la senescencia que en la madurez del lulo, al igual que en fresas maduras (Fragaria x ananassu Duch.), donde se consideró el principal pero no el único relacionado con el detrimento de la fruta (Larsen and Watkins, 1995). El incremento de este compuesto, así como sus notas olfativas, también fue relacionado con el deterioro de piña madura (Ananas sp.) almacenada en refrigeración (Spainer et al., 1998). Sobre el final del almacenamiento del lulo se encontró con abundancia creciente el metabolito 5-etildihidro-2(3H)-furanona, que además no fue determinado durante la maduración de la fruta, por lo cual podría ser un indicador de su detrimento, dado que aportó al olor desagradable durante la vida útil de fresas China (Myrica rubra) (Cheng et al., 2015).

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CONCLUSIONES A través de los estadios de maduración de S. quitoense L. se encontraron esencialmente los mismos compuestos, con pesos moleculares entre 60 y 198 Da, siendo las variaciones en sus concentraciones el factor diferencial. En la maduración de S. quitoense L. se obtuvieron metabolitos volátiles C6 de cadena lineal característicos de la vía de LOX, a la cual pertenecen los cinco compuestos mayoritarios presentes en la pulpa. Esta etapa se caracterizó por la reducción de alcoholes de manera concomitante con el incremento de ésteres. En la senescencia de S. quitoense L. se encontraron compuestos con peso molecular entre 60 y 156. Los ésteres predominaron en número y a partir del día 4 en adelante representaron más del 74% de su concentración volátil total, mientras los alcoholes decrecieron en número y concentración hasta el final de la fase estudiada con menos del 1% de la abundancia total de estos metabolitos. Los compuestos mayoritarios en la senescencia fueron principalmente ésteres, entre los cuales el butanoato de metilo tuvo la mayor concentración durante la segunda mitad del lapso temporal de análisis, con un nivel máximo en el día 8, que representó el 76.4% de la cantidad volátil existente.

La fase de senescencia en S. quitoense L. se caracterizó por niveles superiores de acetato de etilo en comparación con la fruta 100% madura. El PCA respectivo indicó que los ésteres de metilo guardan una fuerte correlación con el día 8 de senescencia, reflejo de los picos de incremento alcanzados en dicho momento temporal. El DA a partir de las concentraciones de los metabolitos volátiles permitió obtener mapas territoriales con modelos de alto poder predictivo del estadio de maduración y tiempo de senescencia de S. quitoense L. Estos modelos son de utilidad para el sector de acopio y transformación industrial de la fruta. Se identificaron los compuestos volátiles marcadores de la maduración y senescencia de S. quitoense L., la mayoría de los cuales estuvieron entre los seleccionados en los respectivos DA.

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CAPÍTULO V. COMPUESTOS PRESENTES EN LA FRACCIÓN VOLÁTIL DE LA PULPA DE LULO (S. quitoense L.) BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE

ALMACENAMIENTO - Resumen. Las pulpas empacadas en bolsas de polietileno correspondientes a los tratamientos de ambiente, refrigeración y escaldado fueron analizadas por triplicado desde el día dos hasta el día 12, mediante HS-SPME/GC-MS. Se evaluó el comportamiento de la concentración y del porcentaje relativo (%R) de la concentración de los grupos funcionales; además, se utilizó el Análisis de Componentes Principales (PCA) para establecer los compuestos con variaciones significativas en sus concentraciones y su relación con los tratamientos aplicados y se establecieron los compuestos mayoritarios mediante la prueba de Tukey. El %R de la concentración de los grupos funcionales mostró una interacción ente ésteres y alcoholes en todos los almacenamientos, de manera que el aumento del %R en uno implica la disminución del otro. Las concentraciones de etanol y acetato de etilo alcanzaron niveles que imposibilitaron su cuantificación, desde el día seis en las muestras sometidas a refrigeración y desde el día cuatro en las restantes. El PCA permitió reconocer siete compuestos con las variaciones más significativas, que además fueron los mismos determinados como mayoritarios: butanoato de metilo y acetato de (Z)-3-hexenilo fueron afines con los diferentes días de análisis durante la refrigeración, mientras (Z)-3-hexen-1-ol, acetato de 2-feniletilo, alcohol feniletilico, 1 hexanol y 3-metil-1-butanol se relacionaron con el almacenamiento al ambiente y en ambiente después de escaldado. Palabras claves. Compuestos volátiles, Fruta, HS-SPME, Metabolitos secundarios, Almacenamiento de pulpa. - Abstract. The flesh packed in polyethylene bags corresponding to the treatments of room temperature, refrigeration, and scalding were analyzed in triplicate from day two until day 12, through HS-SPME/GC-MS. The behavior of the concentration and of the relative percentage (%R) of the concentration of functional groups was evaluated; Besides, Principal Component Analysis (PCA) was used to establish the compounds with significant variations in their concentrations and its relationship with the treatments applied, and the majoritarian compounds were established by the Tukey test. %R of the concentration of the functional groups showed an interaction between esters and alcohols in all treatments, so that increasing in one implies the decrease of the other. The concentrations of ethanol and ethyl acetate reached levels that made it impossible their quantification, from the fifth day in samples submitted at refrigeration and from day three in the others. The PCA allows to recognize seven compounds with the most significant variations which were besides, the same determined as majoritarian metabolites: methyl butanoate and (Z)-3-hexenyl acetate were associated with the different days of analysis during refrigeration, while (Z)-3-hexen-1-ol, 2-phenylethyl acetate, phenylethyl alcohol, 1-hexanol and 3-methyl-1-butanol were related to the storage in room temperature and room temperature after scalding. Keywords. Volatile compounds, Fruit, HS-SPME, Secondary metabolites, Flesh storage.

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- Introducción. Los tratamientos de comercialización de las frutas influyen sobre sus atributos sensoriales, entre los cuales se encuentra el aroma, resultado de una mezcla compleja de volátiles (Mendizábal et al., 2011; Kou et al., 2012; Xi et al., 2012). En el caso de las frutas mínimamente procesadas, el principal obstáculo para su desarrollo comercial es la vida útil limitada, debido al procesamiento (Torri et al., 2010), además, el enfoque tradicional de mantenimiento de la calidad ha tenido en cuenta la apariencia visual y las características bioquímicas (Voon et al., 2007), sin embargo, algunos parámetros como el pH, acidez titulable y ºbrix no son indicadores apropiados porque no cambian significativamente en el almacenamiento después que la fruta pierde su integridad, sobre todo durante la refrigeración (Lamikanra and Richard, 2002). De manera alternativa, el perfil volátil es un atributo de calidad relevante y puede ser afectado en el almacenamiento (Zhang et al., 2008; Torri et al., 2010), teniendo en cuenta que las diversas rutas metabólicas pueden en determinadas condiciones de conservación, privilegiar la producción de compuestos que a nivel sensorial son considerados indeseables (Maul et al., 2000). En frutas recién cortadas como piña (Ananas sp.) por ejemplo, los grandes incrementos en el nivel de alcoholes de bajo punto de ebullición en el almacenamiento se asocian al inicio de eventos de fermentación (Spanier et al., 1998). Dado que los volátiles liberados de la fruta intacta cambian completamente después del corte, debido a la reacción de enzimas activadas durante el procesamiento de la fruta (Farneti et al., 2015), se han usado diversas estrategias para conservar sus características volátiles, entre ellas, el suministro de bajas temperaturas de almacenamiento (Dea et al., 2010; Raffo et al., 2012; Günther et al., 2015), las atmósferas modificadas (López et al., 1998; Lara et al., 2003; Saevels et al., 2004; Imahori et al., 2004; Montero-Calderón et al., 2010) y películas antimicrobianas (Almenar et al., 2009; La Storia et al., 2012). El presente estudio se enfocó en evaluar el comportamiento los metabolitos del lulo durante el almacenamiento de la pulpa, con el propósito de identificar en que condiciones, entre las estudiadas, se produce una mayor restricción en la variación de la fracción volátil original de la pulpa. La metodología de extracción por SPME, utilizada en el presente estudio, permite obtener principalmente compuestos de bajo punto de ebullición (Kou et al., 2012). Este método es una alternativa frente a las de uso tradicional, las cuales emplean largos tiempos de extracción, grandes cantidades de solvente y generan la descomposición y degradación de muchos compuestos volátiles inestables (Zhang et al., 2008). 5.1. CONDICIONES DE MUESTREO, EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE COMPUESTOS VOLÁTILES POR HS-SPME/GC-MS 5.1.1. Selección de la fruta. Las condiciones de selección fueron idénticas a las descritas para la extracción por HS-SPME en el numeral 3.1.1.1. del capítulo III, teniendo en cuenta el color de la cáscara conforme a la norma NTC 5093 y los °Brix según Mejía et al. (2012), para estadio cinco.

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5.1.2. Experimento para el análisis por HS-SPME/GC-MS en pulpa de S. quitoense L. bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Se realizó lavado de las frutas (15 por cada tratamiento) con agua destilada durante 20 segundos. Las frutas destinadas al escaldado fueron peladas superficialmente y sometidas a dicho tratamiento térmico a 70 ºC durante 10 minutos, con el propósito de reducir la carga de microorganismos y enzimas de la cáscara de S. quitoense L. Las frutas en escaldado permanecieron en una parrilla metálica a una distancia de 5 cm del agua en calentamiento constante utilizada para el escaldado. Posteriormente, todas las unidad de muestra fueron cortadas con un cuchillo estéril para la obtención de la pulpa, las cuales fueron empacadas en bolsas de polietileno estériles teniendo en cuenta los tratamientos de ambiente, refrigeración y escaldado. Las pulpas de cada tratamiento fueron analizadas por triplicado desde el día dos hasta el día 12, mediante HS-SPME/GC-MS. Se evaluó el comportamiento de la concentración y del porcentaje relativo (%R) de la concentración de los grupos funcionales; además, se utilizó el Análisis de Componentes Principales (PCA) para establecer los compuestos con variaciones significativas en sus concentraciones y su relación con los tratamientos aplicados y se establecieron los compuestos mayoritarios mediante la prueba de Tukey. Los datos obtenidos fueron analizados con ayuda de los programas estadísticos SPSS® 22 y Minitab® 17. 5.1.3. Fibra de HS-SPME utilizada, procedimiento de extracción, análisis y cuantificación de volátiles de S. quitoense L bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Los ensayos se realizaron usando la fibra de CAR/PDMS a una temperatura de 60 ºC durante 30 minutos, de acuerdo a los resultados obtenidos en la evaluación de diferentes fibras de SPME. Las condiciones de extracción, análisis e identificación correspondieron a las indicadas en los numerales 3.1.1.4. y 3.1.1.5. del capítulo III. Además, la cuantificación de los compuestos volátiles se realizó teniendo en cuenta el estándar interno, usando la ecuación planteada en el numeral 3.4. del capítulo III. 5.2. CONCENTRACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DURANTE LA MADURACIÓN DE S. quitoense L. La Tabla 14 muestra la concentración de los compuestos en pulpa de S. quitoense L. almacenada al ambiente (Tabla 14a), ambiente después de escaldado (Tabla 14b) y refrigeración (Tabla 14c). Durante las tres condiciones de almacenamiento hubo predominio en el número de ésteres (19-20), seguido por los alcoholes (12) y los compuestos obtenidos en su mayoría fueron de bajo peso molecular. Los compuestos acetato de 2-feniletilo, acetato de octilo, dodecanoato de etilo, benzoato de etilo, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanol, 2-Etil-1-hexanol, alcohol feniletílico, 2-metil-1-propanal, ácido butanoico y ácido octanoico no habían sido identificados en los análisis previos de la pulpa de S. quitoense L. durante la maduración y senescencia en el presente estudio.

96

Tabla 14a. Concentración de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante el almacenamiento - ambiente.

Compuesto

Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12

Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Ésteres

Acetato de metilo 8,E-08 7,E-08 1,E-07 1,E-07 ND - ND - 4,E-07 2,E-07 2,E-07 1,E-07 2,E-07 8,E-08 5,E-07 4,E-07 2,E-07 7,E-08 1,E-07 3,E-08 8,E-08 5,E-08

Acetato de etilo 8,E-04 3,E-04 7,E-04 5,E-04 SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ -

Propanoato de etilo 7,E-08 5,E-08 1,E-07 8,E-08 2,E-07 6,E-08 1,E-06 1,E-07 1,E-06 2,E-07 1,E-06 6,E-07 2,E-06 3,E-07 4,E-07 6,E-08 8,E-07 2,E-07 3,E-07 8,E-08 5,E-07 6,E-07

Acetato de n-propilo 1,E-08 9,E-09 4,E-08 3,E-08 2,E-07 5,E-08 4,E-07 4,E-08 4,E-07 6,E-08 4,E-07 5,E-07 2,E-06 2,E-07 ND - ND - ND - ND -

Butanoato de metilo 1,E-06 6,E-07 1,E-06 2,E-07 3,E-07 2,E-07 1,E-06 2,E-07 7,E-07 2,E-07 4,E-07 2,E-07 7,E-07 6,E-07 3,E-05 7,E-06 1,E-05 4,E-06 3,E-06 2,E-06 3,E-05 8,E-06

2-Butenoato de metilo 8,E-06 1,E-06 1,E-05 6,E-06 2,E-06 1,E-07 3,E-05 2,E-05 8,E-06 2,E-06 2,E-06 4,E-07 1,E-06 5,E-07 2,E-07 1,E-07 2,E-07 8,E-08 5,E-06 9,E-06 2,E-08 8,E-09

Butanoato de etilo 1,E-04 6,E-05 4,E-05 1,E-05 9,E-06 4,E-06 3,E-05 1,E-06 4,E-05 2,E-05 7,E-05 3,E-05 1,E-03 3,E-04 4,E-05 1,E-05 3,E-05 1,E-05 3,E-05 8,E-06 1,E-06 4,E-07

Acetato de butilo ND - ND - 4,E-09 2,E-09 1,E-08 1,E-08 ND - ND - ND - 4,E-06 2,E-06 9,E-07 6,E-07 5,E-07 2,E-07 1,E-06 6,E-07

2-Propanoato de metilo 5,E-08 3,E-08 6,E-08 4,E-09 8,E-08 6,E-09 4,E-07 3,E-08 4,E-07 5,E-08 2,E-07 2,E-07 ND - ND - ND - 2,E-07 1,E-07 6,E-08 4,E-08

2-Butenoato de etilo 2,E-06 1,E-07 2,E-06 8,E-07 8,E-07 4,E-07 4,E-06 6,E-07 4,E-06 9,E-07 4,E-06 4,E-07 2,E-05 2,E-05 1,E-06 3,E-07 2,E-06 1,E-07 8,E-07 3,E-07 4,E-08 2,E-08

Acetato de pentilo ND - ND - ND - ND - 5,E-08 1,E-08 1,E-07 6,E-08 ND - ND - ND - ND - ND -

Hexanoato de etilo 2,E-08 1,E-08 6,E-08 5,E-08 4,E-07 2,E-07 3,E-06 2,E-06 1,E-05 3,E-06 5,E-06 9,E-07 8,E-06 2,E-06 6,E-07 8,E-08 1,E-06 6,E-07 3,E-07 5,E-08 1,E-07 1,E-07

Acetato de (Z)-3-hexenilo 1,E-06 2,E-07 2,E-05 1,E-05 5,E-05 1,E-05 1,E-04 5,E-05 3,E-04 1,E-04 9,E-05 5,E-05 1,E-04 5,E-05 1,E-04 9,E-05 1,E-04 9,E-05 4,E-05 2,E-05 1,E-04 2,E-05

Acetato de hexilo 3,E-07 1,E-07 4,E-06 5,E-06 9,E-06 3,E-06 2,E-05 9,E-06 2,E-05 5,E-06 1,E-05 1,E-05 4,E-05 4,E-05 1,E-05 3,E-06 1,E-05 5,E-06 6,E-06 3,E-06 1,E-05 4,E-06

2-Hexenoato de etilo 5,E-08 2,E-08 2,E-07 2,E-08 6,E-07 3,E-07 8,E-06 5,E-06 2,E-05 5,E-06 1,E-05 2,E-06 9,E-06 8,E-06 9,E-07 3,E-07 2,E-06 9,E-07 6,E-07 7,E-08 2,E-07 1,E-07

Benzoato de metilo 7,E-05 3,E-05 1,E-05 1,E-05 1,E-06 5,E-07 2,E-06 1,E-06 3,E-06 1,E-06 2,E-06 2,E-06 5,E-06 3,E-06 3,E-06 5,E-07 8,E-07 3,E-07 2,E-06 1,E-06 2,E-06 8,E-07

Benzoato de etilo ND - ND - ND - 2,E-05 1,E-05 6,E-05 1,E-05 1,E-04 4,E-05 7,E-04 3,E-04 2,E-04 3,E-05 1,E-04 5,E-05 9,E-05 4,E-05 4,E-05 2,E-05

Acetato de octilo 4,E-09 3,E-09 8,E-08 1,E-07 1,E-06 4,E-07 2,E-06 1,E-06 3,E-06 4,E-07 4,E-06 5,E-06 2,E-06 2,E-06 1,E-06 9,E-08 5,E-07 2,E-07 3,E-07 1,E-07 3,E-07 7,E-08

Acetato de 2-feniletilo 1,E-05 6,E-06 4,E-05 8,E-06 1,E-04 5,E-05 5,E-04 2,E-04 2,E-03 2,E-04 3,E-03 4,E-04 2,E-03 4,E-04 1,E-03 2,E-04 6,E-04 2,E-04 3,E-04 1,E-04 3,E-04 9,E-05

Dodecanoato de etilo ND - ND - 8,E-10 3,E-10 1,E-08 9,E-09 3,E-08 6,E-09 1,E-07 2,E-07 7,E-08 5,E-08 1,E-07 8,E-09 1,E-07 3,E-08 7,E-08 8,E-08 4,E-07 5,E-07

Alcoholes

Etanol 4,E-04 4,E-05 5,E-04 1,E-05 SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ -

2-Metil-1-propanol 7,E-06 2,E-07 9,E-06 2,E-06 2,E-05 5,E-06 5,E-05 2,E-05 5,E-05 3,E-06 3,E-05 1,E-05 3,E-05 1,E-05 2,E-05 7,E-06 2,E-05 8,E-06 2,E-05 1,E-05 8,E-06 1,E-06

3-Metil-1-butanol 5,E-04 1,E-04 7,E-04 1,E-04 1,E-03 1,E-04 3,E-03 3,E-04 3,E-03 3,E-04 3,E-03 4,E-04 1,E-03 1,E-04 6,E-04 6,E-05 4,E-04 1,E-04 3,E-04 8,E-05 8,E-05 3,E-05

1-Pentanol 7,E-08 4,E-08 6,E-08 4,E-08 4,E-08 5,E-09 2,E-07 4,E-08 2,E-07 3,E-09 1,E-07 5,E-08 8,E-08 4,E-08 6,E-09 4,E-09 3,E-08 2,E-08 3,E-08 2,E-09 0,E+00 0,E+00

(E)-3-hexen-1-ol 1,E-07 5,E-08 2,E-07 1,E-07 1,E-07 5,E-08 9,E-07 2,E-07 1,E-06 3,E-07 7,E-07 5,E-07 4,E-07 2,E-07 2,E-07 1,E-07 4,E-07 5,E-07 2,E-07 9,E-08 4,E-07 3,E-07

(Z)-3-hexen-1-ol 3,E-04 6,E-05 5,E-04 6,E-05 8,E-04 9,E-05 3,E-03 3,E-04 3,E-03 3,E-04 2,E-03 4,E-04 2,E-03 3,E-04 3,E-03 8,E-04 4,E-03 6,E-04 5,E-03 7,E-04 2,E-03 6,E-04

1-Hexanol 4,E-04 6,E-05 4,E-04 8,E-05 4,E-04 1,E-04 1,E-03 2,E-04 2,E-03 3,E-04 1,E-03 2,E-04 7,E-04 3,E-04 5,E-04 1,E-04 3,E-04 1,E-04 2,E-04 1,E-04 8,E-05 3,E-05

1-Heptanol 1,E-08 1,E-08 2,E-08 1,E-08 5,E-08 2,E-08 3,E-07 1,E-07 3,E-07 2,E-08 1,E-07 2,E-08 2,E-05 4,E-05 1,E-07 3,E-08 5,E-08 1,E-08 4,E-08 7,E-09 3,E-08 2,E-08

2-Etil-1-hexanol 8,E-08 4,E-08 2,E-08 5,E-09 1,E-08 2,E-09 3,E-08 1,E-08 2,E-08 8,E-09 4,E-09 3,E-09 ND - ND - ND - ND - ND -

3,7-Dimetil-1,6-octadien-3-ol 8,E-09 2,E-09 4,E-08 5,E-09 1,E-07 3,E-08 1,E-06 5,E-07 2,E-06 6,E-07 2,E-06 4,E-08 2,E-06 1,E-06 2,E-06 3,E-07 1,E-06 5,E-07 1,E-06 8,E-08 1,E-06 3,E-07

Alcohol feniletílico 3,E-05 2,E-05 8,E-05 3,E-05 4,E-04 1,E-04 1,E-03 3,E-04 2,E-03 4,E-04 2,E-03 3,E-04 3,E-03 7,E-04 3,E-03 5,E-04 2,E-03 4,E-04 2,E-03 3,E-04 1,E-03 2,E-04

Nonanol ND - ND - ND - ND - 6,E-08 2,E-08 7,E-07 6,E-07 0,E+00 0,E+00 1,E-07 8,E-09 1,E-06 2,E-06 5,E-08 2,E-08 ND -

Aldehídos

Acetaldehído 3,E-07 1,E-07 2,E-07 2,E-07 6,E-07 2,E-07 5,E-07 4,E-07 5,E-07 3,E-07 1,E-07 8,E-08 1,E-07 8,E-08 3,E-07 2,E-07 1,E-07 9,E-08 2,E-07 1,E-07 5,E-08 3,E-08

2-Metil-1-propanal 3,E-08 1,E-08 8,E-09 4,E-09 2,E-08 1,E-08 4,E-09 3,E-09 8,E-07 1,E-07 4,E-07 4,E-07 4,E-07 1,E-07 4,E-07 2,E-08 8,E-07 6,E-07 2,E-07 2,E-07 1,E-07 2,E-08

Hexanal 1,E-08 2,E-08 5,E-09 2,E-09 8,E-09 4,E-09 2,E-08 3,E-08 2,E-08 8,E-09 ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Octanal 2,E-08 9,E-09 9,E-07 7,E-07 8,E-07 4,E-07 3,E-07 2,E-07 2,E-07 2,E-08 4,E-07 4,E-07 0,E+00 0,E+00 3,E-07 2,E-07 ND - ND - ND -

Ácidos

Ácido acético 6,E-06 2,E-06 9,E-06 1,E-06 1,E-05 3,E-06 3,E-05 8,E-06 4,E-05 1,E-05 5,E-06 5,E-06 8,E-05 1,E-04 3,E-05 6,E-05 1,E-06 5,E-07 7,E-05 1,E-04 0,E+00 0,E+00

Ácido butanoico 7,E-07 3,E-08 7,E-07 8,E-08 6,E-07 6,E-08 2,E-06 2,E-07 2,E-06 5,E-07 1,E-06 8,E-07 ND - ND - 2,E-07 2,E-07 ND - 9,E-08 1,E-07

Ácido (E)-2-hexenoico 3,E-09 1,E-09 ND - ND - 3,E-08 3,E-08 6,E-08 5,E-08 ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Ácido octanoico 1,E-07 1,E-07 1,E-07 1,E-07 9,E-09 1,E-08 1,E-08 8,E-09 2,E-08 1,E-08 5,E-08 7,E-08 1,E-07 2,E-07 ND - ND - ND - ND -

Cetonas

1,7,7-Trimetilbiciclo-[2.2.1]-heptan-2-ona 2,E-06 2,E-06 1,E-06 2,E-07 2,E-06 6,E-07 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Otros

No identificado 1 5,E-08 4,E-08 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

No identificado 2 0,E+00 0,E+00 1,E-07 2,E-09 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

No identificado 3 3,E-09 5,E-10 5,E-09 4,E-09 0,E+00 0,E+00 3,E-08 1,E-08 ND - ND - ND - ND - 2,E-08 9,E-09 6,E-07 1,E-06 0,E+00 0,E+00

No identificado 4 1,E-07 7,E-08 2,E-07 6,E-08 5,E-07 2,E-07 2,E-06 8,E-07 2,E-06 8,E-07 1,E-06 6,E-07 8,E-08 9,E-08 3,E-08 4,E-09 ND - ND - ND -

No identificado 5 2,E-08 1,E-08 7,E-09 3,E-09 2,E-08 4,E-09 6,E-08 2,E-08 1,E-07 4,E-08 2,E-07 2,E-07 1,E-08 3,E-09 2,E-08 2,E-09 7,E-09 2,E-09 4,E-09 3,E-09 3,E-08 4,E-08

ND= No detectado. SQ= Superior al nivel de cuantificación.

97

Tabla 14b. Concentración de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante el almacenamiento - escaldado. Compuesto


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Ésteres

Acetato de metilo 2,E-04 3,E-05 6,E-05 4,E-05 4,E-08 1,E-08 2,E-07 5,E-08 5,E-07 3,E-07 2,E-06 1,E-06 5,E-07 2,E-07 1,E-07 4,E-08 9,E-08 4,E-08 8,E-07 3,E-07 1,E-07 2,E-08

Acetato de etilo 4,E-05 7,E-06 5,E-04 5,E-04 SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ -


Acetato de n-propilo 2,E-09 8,E-10 4,E-08 3,E-08 3,E-07 3,E-08 5,E-07 2,E-08 2,E-06 3,E-07 3,E-07 5,E-08 2,E-06 3,E-07 2,E-06 8,E-07 4,E-07 1,E-07 8,E-07 2,E-08 4,E-06 2,E-06




Acetato de butilo 1,E-08 1,E-08 ND - ND - ND - 1,E-08 3,E-09 ND - ND - ND - ND - ND - ND -

2-Propanoato de metilo 0,E+00 0,E+00 2,E-08 1,E-08 1,E-07 3,E-08 1,E-06 8,E-08 4,E-07 5,E-08 5,E-08 2,E-08 0,E+00 0,E+00 9,E-08 7,E-08 8,E-08 4,E-08 0,E+00 0,E+00 4,E-08 3,E-08

2-Butenoato de etilo 3,E-09 1,E-09 1,E-07 6,E-08 2,E-06 2,E-07 3,E-06 4,E-07 4,E-06 4,E-07 3,E-06 5,E-07 4,E-06 6,E-07 3,E-07 3,E-07 1,E-07 1,E-07 2,E-07 2,E-07 ND -

Hexanoato de etilo ND - ND - 8,E-07 8,E-08 2,E-06 4,E-07 3,E-06 3,E-06 8,E-06 4,E-06 3,E-06 2,E-06 2,E-06 4,E-07 7,E-07 4,E-07 4,E-06 2,E-07 7,E-07 2,E-07



2-Hexenoato de etilo 2,E-08 1,E-08 6,E-08 4,E-08 5,E-07 8,E-08 2,E-06 6,E-07 5,E-06 4,E-06 1,E-05 5,E-06 3,E-06 3,E-06 1,E-06 2,E-07 1,E-06 2,E-07 1,E-06 2,E-07 9,E-07 6,E-08


Benzoato de etilo ND - ND - 3,E-06 1,E-06 2,E-05 5,E-06 5,E-05 2,E-05 1,E-04 7,E-05 2,E-04 1,E-04 8,E-05 5,E-05 3,E-05 2,E-05 3,E-05 1,E-05 5,E-06 4,E-06




Alcoholes

Etanol 1,E-07 7,E-08 1,E-04 5,E-05 SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ -

2-Metil-1-propanol 4,E-09 4,E-09 1,E-06 9,E-07 4,E-05 7,E-06 1,E-04 1,E-05 9,E-05 1,E-05 5,E-05 3,E-05 3,E-05 4,E-06 3,E-05 3,E-06 3,E-05 9,E-06 2,E-05 4,E-06 2,E-05 5,E-06

3-Metil-1-butanol 3,E-04 2,E-04 2,E-04 1,E-04 2,E-03 4,E-04 4,E-03 5,E-04 4,E-03 6,E-04 5,E-03 8,E-04 3,E-03 4,E-04 2,E-03 3,E-04 2,E-03 2,E-04 2,E-03 2,E-04 1,E-03 4,E-04

1-Pentanol 3,E-09 6,E-10 6,E-08 2,E-08 7,E-08 2,E-08 2,E-07 3,E-08 2,E-07 3,E-08 2,E-07 6,E-08 9,E-08 7,E-09 9,E-08 1,E-08 9,E-08 2,E-08 1,E-07 2,E-08 4,E-08 1,E-08




1-Heptanol 1,E-08 5,E-09 2,E-08 4,E-09 5,E-07 3,E-07 6,E-07 2,E-07 4,E-07 4,E-08 7,E-07 2,E-07 4,E-07 8,E-08 3,E-07 7,E-08 3,E-07 7,E-08 2,E-07 6,E-08 1,E-07 5,E-08

2-Etil-1-hexanol 1,E-08 2,E-09 1,E-07 2,E-07 3,E-08 1,E-08 9,E-08 6,E-08 3,E-08 4,E-09 2,E-08 2,E-08 3,E-08 3,E-08 3,E-09 1,E-09 ND - ND - ND -



Nonanol ND - ND - 6,E-08 4,E-08 5,E-08 2,E-08 2,E-06 3,E-06 3,E-08 2,E-08 0,E+00 0,E+00 2,E-06 4,E-06 3,E-08 2,E-08 0,E+00 0,E+00 9,E-09 4,E-09

Aldehídos


2-Metil-1-propanal 2,E-09 1,E-09 3,E-08 3,E-08 2,E-09 9,E-10 2,E-06 4,E-08 4,E-06 7,E-07 3,E-06 3,E-07 1,E-06 6,E-07 2,E-06 3,E-07 1,E-06 4,E-07 1,E-06 1,E-07 1,E-06 6,E-07

Hexanal 3,E-07 1,E-07 1,E-07 1,E-07 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Octanal 6,E-07 3,E-07 1,E-06 3,E-07 1,E-06 2,E-07 2,E-07 3,E-08 1,E-07 6,E-08 1,E-07 9,E-08 4,E-08 2,E-08 ND - ND - ND - ND -

Ácidos

Ácido acético 3,E-08 3,E-08 1,E-06 1,E-06 9,E-06 6,E-06 3,E-05 6,E-06 1,E-05 2,E-05 2,E-06 2,E-06 4,E-07 5,E-07 1,E-06 2,E-06 2,E-06 3,E-06 3,E-06 3,E-06 1,E-05 1,E-05

Ácido butanoico 6,E-07 2,E-07 2,E-07 2,E-07 9,E-07 3,E-07 2,E-06 3,E-07 2,E-06 2,E-07 1,E-06 4,E-07 2,E-07 9,E-08 1,E-06 1,E-07 5,E-07 4,E-07 5,E-07 4,E-07 7,E-07 5,E-08

Ácido octanoico 3,E-08 2,E-08 4,E-07 4,E-07 7,E-08 4,E-08 8,E-08 9,E-08 1,E-07 8,E-08 3,E-06 1,E-06 3,E-07 1,E-07 2,E-07 1,E-07 2,E-07 4,E-08 5,E-07 1,E-07 2,E-07 2,E-07

Cetonas

1,7,7-Trimetilbiciclo-[2.2.1]-heptan-2-ona 3,E-06 3,E-06 8,E-07 4,E-07 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Otros

N.I. 1 8,E-07 6,E-07 5,E-09 4,E-09 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

N.I. 2 1,E-08 2,E-08 1,E-07 9,E-08 3,E-07 3,E-07 2,E-07 2,E-08 8,E-07 7,E-07 ND - ND - ND - ND - ND - ND -

N.I. 3 5,E-09 3,E-09 3,E-08 4,E-08 2,E-08 1,E-08 2,E-08 3,E-09 3,E-08 2,E-08 3,E-05 7,E-06 2,E-05 4,E-06 5,E-06 9,E-06 5,E-06 6,E-06 1,E-05 3,E-06 3,E-06 3,E-06




98

Tabla 14c. Concentración de los compuestos volátiles en pulpa de S. quitoense L. durante el almacenamiento - refrigeración. Compuesto


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Promedio (mg/g)


Ésteres

Acetato de metilo 3,E-04 1,E-05 9,E-05 9,E-05 2,E-05 4,E-06 2,E-05 5,E-06 3,E-05 8,E-06 5,E-05 5,E-05 2,E-05 2,E-05 4,E-05 5,E-06 2,E-05 6,E-06 4,E-05 1,E-05 3,E-05 6,E-06

Acetato de etilo 3,E-05 3,E-06 6,E-05 3,E-05 4,E-04 1,E-04 5,E-04 1,E-05 SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ -


Acetato de n-propilo 1,E-08 8,E-09 0,E+00 0,E+00 2,E-08 2,E-08 4,E-09 2,E-09 6,E-09 1,E-09 2,E-08 2,E-08 1,E-08 1,E-08 3,E-08 3,E-08 5,E-08 4,E-08 1,E-07 6,E-09 6,E-07 1,E-07




Acetato de butilo ND - ND - ND - 1,E-08 6,E-09 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

2-Propanoato de metilo ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - 1,E-08 2,E-09

2-Butenoato de etilo ND - ND - 5,E-09 3,E-09 3,E-08 3,E-08 9,E-08 4,E-08 5,E-07 5,E-07 6,E-08 3,E-08 5,E-08 2,E-08 3,E-08 3,E-08 6,E-08 6,E-08 1,E-07 3,E-08

Acetato de pentilo ND - 6,E-08 3,E-08 2,E-07 3,E-08 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Hexanoato de etilo ND - ND - ND - 6,E-08 3,E-08 0,E+00 0,E+00 4,E-07 3,E-07 ND - ND - ND - 3,E-07 2,E-07 4,E-08 5,E-08



2-Hexenoato de etilo 1,E-08 4,E-09 0,E+00 0,E+00 5,E-08 2,E-08 4,E-07 2,E-07 2,E-07 2,E-07 0,E+00 0,E+00 1,E-07 1,E-07 ND - ND - 6,E-08 2,E-08 7,E-08 3,E-08


Benzoato de etilo ND - ND - 4,E-06 1,E-06 2,E-05 3,E-06 3,E-05 2,E-05 2,E-05 3,E-06 7,E-05 4,E-05 3,E-05 2,E-05 1,E-05 4,E-06 1,E-05 7,E-06 3,E-06 6,E-07




Alcoholes

Etanol 1,E-08 1,E-09 1,E-08 7,E-09 5,E-08 3,E-09 4,E-04 1,E-05 SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ - SQ -

2-Metil-1-propanol ND - ND - ND - ND - ND - ND - 2,E-08 1,E-08 0,E+00 0,E+00 1,E-08 6,E-09 1,E-07 2,E-08 5,E-07 1,E-07

3-Metil-1-butanol 0,E+00 0,E+00 1,E-07 1,E-07 5,E-07 2,E-07 7,E-07 6,E-07 4,E-07 3,E-07 ND - ND - 5,E-07 3,E-07 2,E-06 1,E-06 2,E-05 3,E-06 8,E-05 1,E-05

1-Pentanol ND - ND - 4,E-09 2,E-09 7,E-09 1,E-09 6,E-09 2,E-09 7,E-09 3,E-09 1,E-08 1,E-08 2,E-08 6,E-09 4,E-08 2,E-08 6,E-08 5,E-09 5,E-08 1,E-08




1-Heptanol ND - ND - ND - 4,E-07 6,E-07 0,E+00 0,E+00 7,E-08 3,E-08 4,E-08 4,E-08 ND - ND - 2,E-08 1,E-08 1,E-08 7,E-09

2-Etil-1-hexanol 1,E-08 6,E-09 1,E-07 9,E-08 1,E-08 1,E-08 4,E-08 3,E-08 3,E-08 1,E-08 ND - ND - ND - 3,E-08 1,E-08 0,E+00 0,E+00 3,E-09 2,E-09



Nonanol ND - ND - ND - 2,E-08 1,E-08 1,E-07 2,E-07 1,E-06 2,E-06 5,E-08 4,E-08 9,E-08 1,E-07 1,E-07 2,E-07 3,E-08 2,E-08 1,E-08 2,E-08

Aldehídos


2-Metil-1-propanal ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - 3,E-09 1,E-09 2,E-08 1,E-08 7,E-08 3,E-08 2,E-07 2,E-07

Hexanal 4,E-07 3,E-07 2,E-07 4,E-08 2,E-06 8,E-07 1,E-06 2,E-07 4,E-07 1,E-07 3,E-07 1,E-07 9,E-08 3,E-08 1,E-07 1,E-07 2,E-07 7,E-08 4,E-07 4,E-08 4,E-07 6,E-08

Octanal 5,E-06 2,E-06 3,E-06 2,E-06 1,E-06 7,E-07 6,E-07 1,E-07 5,E-06 5,E-06 0,E+00 0,E+00 2,E-07 1,E-07 ND - ND - 9,E-08 5,E-08 3,E-08 3,E-08

Ácidos

Ácido acético 2,E-07 2,E-07 5,E-08 3,E-08 3,E-07 2,E-07 7,E-07 8,E-08 2,E-07 3,E-07 4,E-07 4,E-07 4,E-07 1,E-07 3,E-07 9,E-08 5,E-07 2,E-07 1,E-06 3,E-07 8,E-06 4,E-06

Ácido butanoico 3,E-07 8,E-08 3,E-07 8,E-08 3,E-06 2,E-06 4,E-06 8,E-07 3,E-06 1,E-06 2,E-06 1,E-06 1,E-06 8,E-07 2,E-06 1,E-06 2,E-06 6,E-07 1,E-06 4,E-07 3,E-06 5,E-07

Ácido (E)-2-hexenoico 1,E-08 2,E-09 2,E-08 3,E-08 5,E-08 4,E-08 3,E-07 5,E-08 8,E-08 4,E-08 1,E-07 1,E-07 9,E-08 9,E-08 7,E-08 8,E-08 1,E-07 6,E-08 1,E-07 7,E-08 3,E-07 2,E-07

Ácido octanoico 8,E-08 8,E-09 5,E-08 2,E-08 0,E+00 0,E+00 1,E-08 3,E-09 7,E-08 7,E-08 9,E-08 7,E-08 3,E-08 2,E-08 ND - ND - 5,E-08 3,E-08 0,E+00 0,E+00

Cetonas

1,7,7-Trimetilbiciclo-[2.2.1]-heptan-2-ona 3,E-06 4,E-06 7,E-07 3,E-07 ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND - ND -

Otros

N.I. 1 1,E-06 5,E-07 ND - ND - ND - ND - 8,E-09 5,E-09 9,E-09 6,E-09 4,E-09 1,E-09 ND - ND - ND -

N.I. 2 2,E-08 6,E-09 9,E-05 2,E-04 0,E+00 0,E+00 1,E-06 6,E-07 2,E-07 8,E-08 ND - ND - ND - ND - ND - ND -





99

5.2.1. Efecto de las condiciones de almacenamiento sobre la concentración de los grupos funcionales de los volátiles de S. quitoense L. El primer aspecto a resaltar en el comportamiento de los grupos funcionales durante el almacenamiento de la pulpa de S. quitoense L. es que en la mayor parte del tiempo de refrigeración se mantuvo el predominio de ésteres, condición característica de la pulpa de la fruta en madurez total, mientras que las muestras almacenadas al ambiente y después de escaldado (también almacenadas al ambiente) tuvieron una mayor concentración de alcoholes a través del experimento (Figura 26). Un referente previo en tomate (Solanum lycopersicum) señala que el uso de temperaturas diferentes de almacenamiento deriva en un cambio del perfil de volátiles, siendo los volátiles derivados de aminoácidos los principales conductores de diferenciación (Raffo et al., 2012). En todos los casos se presentaron incrementos en las concentraciones totales de ésteres y alcoholes, notorios a partir de los días 4 ó 5, mientras que hacia el final del almacenamiento los niveles totales en ambos grupos químicos estuvieron cerca de las concentraciones del día 2. Los demás grupos funcionales analizados no tuvieron variaciones notorias en sus concentraciones.

Figura 26. Concentración de los grupos funcionales en S. quitoense L. sometida a diferentes condiciones de almacenamiento.

Al analizar el promedio del porcentaje relativo (%R) de la concentración de los grupos funcionales se encontró que en todos los almacenamientos el comportamiento de los ésteres y alcoholes se encuentra relacionado, de manera que el aumento del %R en uno de estos grupos químicos implica la disminución del otro, mientras que los demás grupos no muestran variaciones influyentes

100

(Figura 27). Por otra parte, existe una diferencia clara entre la concentración de ésteres y alcoholes, para el tratamiento de ambiente en el día inicial de análisis (24 horas después de colocados los tratamientos), en comparación con el almacenamiento en las mismas condiciones después de escaldado. Se ha indicado que el tratamiento con calor inhibe temporalmente pero no destruye la habilidad de la fruta de sintetizar compuestos volátiles (Dang et al., 2008; Raffo et al., 2009; Leisso et al., 2013). Dado que el escaldado permite en cierto grado la degradación de enzimas, es factible que esta condición derivara en un retraso de la conversión de ésteres a alcoholes en el día 2. En el caso del almacenamiento en refrigeración, se observa que paulatinamente hay una disminución de ésteres concomitante con el incremento de los alcoholes desde el cuarto día de análisis.

Figura 27. Porcentaje relativo de la concentración de los grupos funcionales en S. quitoense L. sometida a diferentes condiciones de almacenamiento. La reducción de ésteres durante el almacenamiento de frutas frescas procesadas ha sido previamente registrado. En un estudio realizado en cortes frescos de melones cantaloupe el almacenamiento a 4 ºC y 22 ºC causó un decrecimiento considerable en la concentración de ésteres, como reacción temprana que reflejó la pérdida de frescura de la fruta en las condiciones indicadas (Lamikanra and Richard, 2002). La reducción de la mayoría de compuestos ésteres (alrededor del 77%) también se demostró en durian (Durio zibethinus cv.) mínimamente procesado y almacenado a 4 ºC, hallazgo atribuido a la hidrólisis para formar sus correspondientes alcoholes y ácidos (Voon et al., 2007), lo que en el presente estudio explicaría el incremento de los alcoholes. Además, se ha establecido que los ésteres de cadena lineal más corta y menos ramificada (ésteres de ácido acético, metil o etil ésteres) son más susceptibles a la hidrólisis (Ducret et al., 2001). Otro aspecto a tener en cuenta, en relación al decrecimiento en las concentraciones de algunos compuestos del perfil volátil de la fruta procesada, es la limitada disponibilidad de sustratos por la detención de la actividad de algunas enzimas relacionadas, lo que principalmente ocurre con los derivados de lípidos (Saevels et al., 2004; Altisent et al., 2009; Cano-Salazar et al., 2013).

101

5.2.2. Efecto del almacenamiento en diferentes condiciones sobre los compuestos volátiles en la pulpa de S. quitoense L. 5.2.2.1. PCA aplicado a los datos de los compuestos volátiles de S. quitoense L. usando diferentes condiciones de almacenamiento. El PCA realizado se basó en la matriz de covarianza, con el propósito de resaltar los compuestos con variaciones significativas en sus concentraciones a lo largo del experimento. Al establecer las relaciones entre los días de análisis en diferentes condiciones de almacenamiento y los compuestos volátiles se obtuvo un 83.4% de la variabilidad total de los datos por parte de los dos primeros componentes (Figura 28). Se obtuvieron 7 vectores visiblemente apreciables, relacionados con los compuestos butanoato de metilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, (Z)-3-hexen-1-ol, acetato de 2-feniletilo, alcohol feniletilico, 1 hexanol, 3-metil-1-butanol. Las mayores variaciones de los ésteres butanoato de metilo y acetato de (Z)-3-hexenilo se relacionaron con los diferentes días de análisis durante la refrigeración, mientras las variaciones significativas de los restantes compuestos, en su mayoría alcoholes, se relacionaron con el almacenamiento al ambiente y en ambiente después de escaldado.

Figura 28. Primer plano factorial de los compuestos de S. quitoense L. bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Al analizar las correlaciones principales entre los compuestos y el almacenamiento suministrado se denota que las más representativas están ubicadas en el primer eje, en el cual, los compuestos con valores positivos de correlación iguales o mayores a 0.7 fueron los alcoholes 3-metil-1-butanol, 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol, alcohol feniletílico, 2-metil-1-propanol y 1-pentanol, mientras los compuestos ésteres butanoato de metilo, 2-butenoato de metilo y acetato de (Z)-3-hexenilo fueron los de valores de correlación negativos mayores a -0.70 (Tabla 15). Este comportamiento indica una variación inversa correlacionable entre la concentración de los ésteres y la de los alcoholes mencionados.

102

Tabla 15. Correlaciones entre las variables activas y los factores suministrados.

Nombre de la variable Eje 1 Eje 2 Eje 3 Eje 4 Eje 5

Acetaldehído 0,39 0,01 0,24 0,20 0,08 Acetato de metilo -0,36 0,28 0,07 0,01 0,05 2-Metil-1-propanal 0,66 -0,31 0,30 0,15 -0,08 2-Metil-1-propanol 0,75 -0,26 0,30 0,20 0,01 Ácido acético 0,23 -0,07 -0,22 -0,06 0,13 Propanoato de etilo 0,65 -0,24 0,15 -0,03 -0,19 Acetato de n-propilo 0,36 -0,01 0,07 0,00 -0,13 Butanoato de metilo -0,86 -0,49 0,14 -0,02 -0,04 3-Metil-1-butanol 0,81 -0,29 0,46 0,20 -0,04 2-Butenoato de metilo -0,80 -0,46 0,12 0,00 -0,01 1-Pentanol 0,70 -0,16 0,39 0,27 -0,06 Butanoato de etilo 0,18 0,00 -0,06 -0,57 0,05 Hexanal -0,57 -0,19 0,10 -0,04 0,06 2-Propanoato de metilo 0,45 -0,14 0,26 0,35 0,06 2-Butenoato de etilo 0,33 -0,13 0,04 -0,48 0,02 Ácido butanoico -0,34 -0,39 0,35 0,19 0,10 (E)-3-hexen-1-ol -0,20 -0,62 0,35 0,15 -0,14 (Z)-3-hexen-1-ol 0,36 -0,78 -0,47 0,16 0,07 1-Hexanol 0,47 -0,62 0,31 0,17 -0,23 1-Heptanol 0,10 -0,03 -0,01 -0,31 0,01 Hexanoato de etilo 0,61 -0,31 0,25 -0,17 0,03 Acetato de (Z)-3-hexenilo -0,73 -0,56 0,12 -0,05 0,02 Acetato de hexilo -0,16 -0,34 0,03 -0,30 0,00 Octanal -0,31 0,11 0,17 -0,09 0,16 2-Etil-1-hexanol 0,01 0,13 0,18 0,19 0,04 2-Hexenoato de etilo 0,53 -0,27 0,25 -0,06 0,18 3,7-Dimetil-1,6-octadien-3-ol 0,79 -0,37 0,02 -0,10 -0,26 Benzoato de metilo -0,01 0,35 0,05 0,04 0,07 Alcohol feniletílico 0,79 -0,39 -0,14 -0,37 -0,25 Benzoato de etilo 0,35 -0,26 -0,16 -0,62 -0,04 Acetato de octilo 0,07 -0,32 0,32 -0,19 0,16 Ácido octanoico 0,35 -0,20 0,36 0,08 -0,05 No identificado 4 -0,11 -0,44 0,39 0,02 0,23 Acetato de 2-feniletilo 0,52 -0,57 0,37 -0,39 0,34 No identificado 5 -0,04 -0,32 0,35 -0,10 0,20 Dodecanoato de etilo 0,17 0,00 -0,13 -0,12 -0,10

5.2.2.2. Comportamiento de los compuestos mayoritarios volátiles en pulpa de S. quitoense L. usando diferentes condiciones de almacenamiento. Mediante la prueba de Tukey (datos no mostrados) se pudo establecer que siete de los 44 compuestos cuantificados durante el almacenamiento pertenecían a un subconjunto con concentraciones estadísticamente mayor, siendo estos, los mismos obtenidos en el PCA del respectivo experimento (butanoato de metilo, acetato de (Z)-3-hexenilo, (Z)-3-hexen-1-ol, acetato de 2-feniletilo, alcohol feniletilico, 1 hexanol, 3-metil-1-butanol) . Posterior a la identificación de los compuestos mayoritarios, se realizó un diagrama de perfiles para caracterizar su comportamiento. El butanoato de metilo, compuesto con la segunda mayor concentración diferencial a través de las

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diferentes condiciones de almacenamiento, tuvo comportamientos similares en ambiente y escaldado, mientras que durante en la refrigeración resaltó por su mayor concentración a lo largo del experimento (figura 29). Además, el (Z)-3-hexen-1-ol mantuvo la segunda mayor concentración desde el día tres en adelante cuando la muestra fue refrigerada, mientras que en las demás condiciones de almacenamiento tuvo incrementos paulatinos y decreció hacia el final de la fase monitoreada. Por su parte, el compuesto 3-metil-1-butanol, sin incrementos notorios durante la refrigeración, tuvo aumentos relevantes entre los días cuatro y siete en las restantes condiciones de almacenamiento. De igual manera que el 3-metil-1-butanol, el alcohol feniletilico no tuvo variaciones apreciables durante la refrigeración, pero en los demás tratamientos mostró incrementos considerables desde el día 5, así como una disminución de su concentración en la etapa final del experimento. En el caso del acetato de 2-feniletilo, hubo incrementos en la etapa intermedia del experimento, que sin embargo fueron menos evidentes en las muestras refrigeradas. Finalmente, las variaciones del 1-hexanol y acetato de (Z)-3-hexenilo fueron despreciables teniendo en cuenta las barras de error.

Figura 29. Concentración de los compuestos mayoritarios en la pulpa de S. quitoense L. bajo diferentes condiciones de almacenamiento. En el presente estudio se evidenció un incremento de etanol y acetato de etilo hasta niveles que imposibilitaron su cuantificación, desde el día seis en las muestras sometidas a refrigeración y desde el día cuatro en las restantes. El etanol en las frutas se forma a partir del acetaldehído por acción de la enzima ADH (Imahori et al., 2004; Pesis, 2005; Beltrán et al., 2015). Dado que el acetaldehído se encontró en S. quitoense L. en concentraciones limitadas, los altos niveles de etanol tendrían como origen el metabolismo anaerobio de la pulpa en los diferentes tratamientos. Además, se conoce que el etanol es uno de los principales precursores de los ésteres de etilo como el acetato de etilo (Bai et al.,

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1990; Beltrán et al., 2015), de ahí su presencia en altas concentraciones desde los días iniciales de almacenamiento de la pulpa de lulo. Previamente se ha relacionado la presencia concomitante de etanol y acetato de etilo en alto contenido con el metabolismo anaerobio en otras frutas integras (Toivonen, 1997; D'Aquino et al., 1998; López et al., 1998; Imahori et al., 2013) así como en recién cortadas almacenadas (Dea et al., 2010; Zhang et al., 2013). La abundancia superior de etanol como indicador de deterioro del perfil volátil también ha sido reportada en piña (Ananas comosus) recién cortada durante la refrigeración (Montero-Calderón et al., 2010) y en fresa (Fragaria x ananassa), con una fuerte elevación desde el cuarto día de almacenamiento (Almenar et al., 2009). Tanto el etanol como el acetato de etilo tuvieron marcadas abundancias en peras (Prunus persica L.) durante el almacenamiento en frío, destacándose el fuerte incremento de etanol después de una semana de refrigeración (Rizzolo et al., 2013). Además, el acetato de etilo mantuvo altos niveles en durian (Durio zibethinus cv. D24) mínimamente procesado durante la refrigeración y su posterior decrecimiento fue el más tardío entre los ésteres (Voon et al., 2007). En pera china también hubo aumento de acetato de etilo después de procesamiento mediante ultrapasteurización con alta presión (Kou et al., 2012) y en piña recién cortada su presencia fue asociada con la fermentación microbiana (Spanier et al., 1998). Este compuesto es considerado responsable de off-flavor en frutas (Imahori et al., 2002). En el caso de los alcoholes, 1-hexanol y (Z)-3-hexen-1-ol también se encontraron en altas concentraciones en fresas (Fragaria x ananassa) (Almenar et al., 2009). En pera china sometida a ultrapasteurización con alta presión se evidenció el incremento del 1-hexanol durante el almacenamiento a temperatura ambiente (Kou et al., 2012). Se ha demostrado en manzanas “fuji” sometida a periodo extra en aire frío, que el incremento en las concentraciones de 1-hexanol está relacionado con la hidrólisis de ésteres de hexilo, formados originalmente en la maduración por intervención de enzimas como LOX y HPL (Altisent et al., 2009). Además, se han encontrado altas concentraciones de (Z)-3-hexen-1-ol en tomate almacenado a 5 ºC (Maul et al., 2000). El alcohol feniletilico fue encontrado en tomate común (Lycopersicon esculentum var. commune) durante el almacenamiento (Zhang et al., 2008) y el 3-metil-1-butanol se encontró en altas concentraciones en piñas (Ananas sp.) recién cortadas, decreciendo durante el almacenamiento (Spanier et al., 1998). Un aspecto a considerar es que los compuestos acetato de 2-feniletilo y alcohol feniletilico, establecidos como mayoritarios en la pulpa almacenada, no estuvieron presente en el lulo durante su maduración y senescencia. Un referente en melón cantaloupe indicó la existencia de nuevos compuestos, cuya presencia no tuvo relación directa con la des-esterificación que ocurrió durante el almacenamiento de los cortes frescos de la fruta (Lamikanra and Richard, 2002). Consecuentemente, es posible que otros componentes de la pulpa, como los aminoácidos hallan podido actuar como precursores de nuevos volátiles, formados subsecuentemente mediante enzimas de origen microbiano.

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El alcohol feniletilico, alcohol primario aromático simple, es uno de los principales alcoholes producidos por levaduras como Hanseniaspora osmophila y Saccharomyces cerevisiae en frutas (Viana et al., 2009), es utilizado como componente alimentario con una demanda mundial de 700000 kg y tiene acción antimicrobiana en fresas contaminadas con Botrytis cinerea (Mo and Sung, 2007). Además, por sus características sensoriales permite diferenciar entre variedades en uva (Rosillo et al., 1999). Por su parte, El acetato de 2-feniletilo, componente esencial para la industria cosmética y de alimentos, es responsable de un afrutado aroma de vino (Białecka-Florjanczyk et al., 2012) y es producido en vinos por diferentes levaduras como Torulaspora delbrueckii H. osmophila y S. cerevisiae (Viana et al., 2009; Pino and Queris, 2010; Loira et al., 2014). Además, es un indicador de baja calidad en café, relacionado con defectos de semilla agría (Toci et al., 2014). La producción de acetato de 2-feniletilo en lulo podría relacionarse con la presencia del alcohol feniletílico, puesto que algunas levaduras como Yarrowia lipolytica, utilizando como sustratos al alcohol feniletilico y el acetato de etilo, producen acetato de 2-feniletilo y etanol (Białecka-Florjanczyk et al., 2012).

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CONCLUSIONES

Se presentó dependencia entre el %R de la concentración de ésteres y alcoholes en todos los almacenamientos, de manera que el aumento del %R en uno implica la disminución del otro. Esta dependencia tenia como origen principal la correlaciones positivas y negativas de algunos alcoholes y ésteres teniendo en cuenta los factores suministrados. Los volátiles relacionados con el metabolismo anaerobio microbiano etanol y acetato de etilo estuvieron por encima de los niveles de cuantificación desde etapas tempranas del experimento, indicando el deterioro de la fracción volátil original de S. quitoense L. Los compuestos con variaciones significativas de concentración en los diferentes tratamientos fueron los mismos determinados como mayoritarios: butanoato de metilo y acetato de (Z)-3-hexenilo fueron afines con los diferentes días de análisis durante la refrigeración, mientras (Z)-3-hexen-1-ol, acetato de 2-feniletilo, alcohol feniletilico, 1 hexanol y 3-metil-1-butanol se relacionaron con el almacenamiento al ambiente y en ambiente después de escaldado.

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CAPÍTULO VI. PASANTÍA: EFECTO DE UN EMPAQUE BIOACTIVO CON CANELA EO SOBRE EL RECUENTO DE MOHOS EN CORONA Y LA

COMPOSICIÓN VOLÁTIL EN PULPA DE PLÁTANO - Resumen. Se evaluó el efecto del empaque bioactivo sobre la concentración de varios metabolitos volátiles en pulpa de plátano y sobre el recuento de mohos en corona de plátano durante la maduración. El análisis de volátiles se llevó a cabo por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), y GC-MS-olfatometría (GC-O-MS) usando la frecuencia modificada (MF) de estos compuestos en cada estadio. El papel impregnado con EO permitió un recuento promedio de mohos menor al de la corona con empaque sin bioactivo desde el segundo día; sin embargo, las diferencias entre los tratamientos no fueron estadísticamente significativas (P= 0.277). El PCA mostró una asociación del aumento de los ésteres con la maduración total, mientras los cambios en 1-hexanol y hexanal se relacionaron con el estadio inicial de maduración. Los compuestos con mayor MF en la maduración total fueron: acetato de 2-pentanol, acetato de isoamilo, butirato de isoamilo, isobutirato de isoamilo, isovalerato de isoamilo y butirato de hexilo. Palabras claves. Canela EO, Compuestos volátiles, Empaque bioactivo, Olfatometría, Pudrición de corona. - Abstract. The effect of the bioactive packaging on the concentration of several volatile metabolites in the banana flesh and on the mould count in banana crown during ripening was evaluated. The analyses of the volatiles were carried out by gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS), and by GC-MS-olfactometry (GC-O-MS) using the modified frequency (MF) of the compounds in each stage. The impregnated paper with cinnamon EO gave a mean count of moulds lower than the crown with no bioactive packaging from the second day; nevertheless, differences were not statistically significant (P= 0.277). PCA showed an association of the increases of esters with the total ripening, while the changes in 1-hexanol y hexanal were related with the initial stage of ripening. 2-pentanol acetate, isoamyl acetate, isoamyl butyrate, isoamyl isobutyrate, isoamyl isovalerate, and hexyl butyrate were the compounds with greater MF at the total ripening. Keywords. Bioactive packaging, Cinnamon EO, Crown rot, Olfactometry, Volatile compounds. - Introducción. El plátano es una de las frutas de mayor consumo y su cultivo se da a nivel mundial, con una producción concentrada principalmente en China, Filipinas, India, Brasil y Ecuador (Pontes et al., 2012). Esta fruta pertenece al género Musa de la familia Musaceae y posee alto valor nutricional, representado en carbohidratos, minerales y vitaminas A, B1, B2 y C, así como un alto valor energético (Cano et al., 1997; Vermeir et al., 2009). Después de cosechado, el plátano se consume fresco en corto tiempo porque sus cualidades (color, firmeza y aroma) se deterioran rápidamente debido a su pico respiratorio (Boudhrioua et al., 2003; Wang et al., 2011), que demanda 100-180 ml de O2/kg/hora (Miranda et al., 2001).

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La pudrición de corona, principal enfermedad de poscosecha en banana, es provocada por patógenos que puede incluir, dependiendo de las condiciones geográficas y climáticas del cultivo (Bastiaanse et al., 2010), hongos como Colletotrichum musae, Lasiodiplodia theobromae, Thielaviopsis paradoxa, Botryodiplodia theobromae, Nigrospora sphaerica, Cladosporium sp. Cefalosporium sp. y el complejo de Fusarium sp. (Alvindia, 2012). La severidad del deterioro es influenciada por los tipos de hongos presentes (Lassois et al., 2008). Además, la susceptibilidad es inherente a la especie de banana (Cano et al., 1997). La enfermedad inicia en el área de corte de la corona y disemina al tejido, provocando ennegrecimiento y ablandamiento (Bastiaanse et al., 2010), signos que derivan en una apreciación sensorial negativa por parte del consumidor. Para el control de pudrición de corona se han utilizado estrategias como el suministro de agua caliente, alternativo al tratamiento químico (Alvindia et al., 2012), empaques fabricados en polietileno de diferentes densidades (Hailu et al., 2014) uso de antagonistas, entre ellos Candida oleophila (Bastiaanse et al., 2010) y Pichia anomala (Lassois et al., 2008), extractos de semillas de cítricos (Demerutis et al., 2008) y compuestos bioactivos, son sustancias de plantas con denominación GRAS que ayudan a prevenir el crecimiento de microorganismos sobre el alimento (Almenar et al., 2009). La capacidad inhibitoria del cinamaldehído se ha evaluado en estado puro frente a diferentes mohos (Serrano et al., 2005; Gutiérrez et al., 2009; Manso et al., 2011; Manso et al., 2013; Balaguer et al., 2013; Manso et al., 2014; Xing et al., 2014; Echegoyen, and Nerín, 2015), o como compuesto activo presente en el aceite esencial de la canela (Ranasinghe et al., 2002; Soliman and Badeaa 2002; Kyu et al., 2007; López et al., 2007; Rodríguez et al., 2007; Rodríguez et al., 2008; Rodríguez et al., 2010; Montero-Prado et al., 2011; Manso et al., 2015). Su principal ventaja es que no precisa del contacto directo para su actividad de inhibición microbiana (Balaguer et al., 2013). Los volátiles se forman en las frutas durante la maduración, cosecha, postcosecha y almacenamiento, influenciados por factores ligados a la variedad y condiciones de cultivo (Ibáñez et al., 1998). El aroma generado es un atributo relevante en términos de calidad sensorial y guarda relación con la aceptabilidad del consumidor (Wang et al., 2011; Brattoli et al., 2013; Du and Rouseff, 2014). Para la detección de compuestos aroma-activos comúnmente se emplea la separación por GC-O-MS, que involucra dos medidas, el tiempo de retención cromatográfica y la percepción del olor (Nuzzi et al., 2008; Vera et al., 2014). El efluente cromatográficos es transportado a través de la columna usando alto flujo hacia el puerto de olfateo (Chin and Marriott, 2015). Todos los compuestos no son percibidos por el olfato y cada metabolito posee un umbral diferente (Nuzzi et al., 2008), por lo cual, algunos volátiles en bajas concentraciones pueden tener un impacto sensorial superior comparados con compuestos con mayores cantidades (Jordán et al., 2003).

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El objetivo de este estudio fue evaluar la inhibición del recuento de mohos en corona de plátano usando un material de empaque bioactivo que contenía canela EO. Además, una serie de compuestos volátiles fueron cuantificados para establecer el efecto del empaque bioactivo sobre la concentración de estos metabolitos en la pulpa durante la maduración de la fruta y se determinó por olfatometría la frecuencia modificada (MF) de estos compuestos durante cada estadio. 6.1. MATERIALES Y MÉTODO 6.1.1. Selección de la fruta. Los plátanos utilizados (M. acuminata cv. Cavendish), eran uniformes (cáscara verde, peso cercano a los 145 g, medidas de 17-19 cm de longitud y 35-38 mm de diámetro) y fueron comprados en un supermercado de Zaragoza (España). Además se seleccionaron unidades experimentales con integridad en la cáscara (ausencia de heridas o agujeros), para mantener su homogeneidad durante la maduración. 6.1.2. Evaluación del papel bioactivo sobre los mohos en corona de plátano. 6.1.2.1. Medios utilizados. Se empleó como diluyente agua peptonada de la casa comercial Scharlau (Lot 104471, España). El medio usado fue el agar dextrosa sabouraud + cloranfenicol suministrado por Laboratorios Conda (Madrid, España). 6.1.2.2. Experimento en corona de plátano. Manojos de tres unidades de plátanos en estadio verde unidos por la corona se almacenaron en cajas de cartón con la corona hacia abajo teniendo contacto con un área de 10 cm2 del papel parafinado, que según el tratamiento, contenía o no el compuesto bioactivo. Los tratamientos se incubaron a 25 ºC y se seleccionaron tres réplicas en ambos tratamientos para llevar a cabo el análisis de mohos en diferentes días (0,2,4,6 y 8). Se aplicó un diseño de una vía con dos tratamientos (corona empacada con y sin bioactivo) para establecer el efecto del bioactivo sobre el recuento de mohos (nivel de significancia P< 0.05), usando el software SPSS® versión 18. Cada tratamiento fue llevado a cabo por triplicado. 6.1.2.3. Procedimiento analítico para el recuento mohos en corona de plátano. Se pesaron 0.5 g en condiciones de esterilidad, utilizando una cabina de seguridad microbiológica clase II (MSC 1.2) de Thermo Scientific (España), los cuales se adicionaron en tubos Falcon que contenían 4.5 ml de agua peptonada estéril y se realizó una homogenización por agitación a 300 rpm durante 3 minutos. A partir de esta dilución se realizaron diluciones sucesivas adicionando 25 µl en viales eppendorf que contenían 225 µl de agua peptonada estéril. De cada dilución se adicionaron 100 µl a un medio con agar Sabouraud y se realizó la extensión homogénea del inóculo en el agar. Las cajas se incubaron 5 días a 25 ºC, y luego se realizó el recuento de colonias de mohos. El cálculo del recuento de mohos por gramo de corona se efectuó a partir de la siguiente ecuación:

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RM = (NC * ID) / VS Ecuación 1 Donde RM es el recuento total de mohos, NC corresponde al número de colonias enumeradas, ID atañe al inverso de la dilución a partir de la cual se realizó el recuento y VS es el volumen sembrado en la superficie del medio de cultivo. 6.1.3. Extracción y Análisis de volátiles por GC-MS y GC-O-MS en pulpa 6.1.3.1. Tipo de fibra y estándares utilizados. La fibra de SPME estaba compuesta por Divinilbenceno/Carboxen/Polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS, 50/30 μm), con referencia 57298-U de Supelco® (Bellefonte, PA, USA). Antes de su uso, fue acondicionada teniendo en cuenta las indicaciones del fabricante (250 ºC durante 60 min) para favorecer la activación de los grupos funcionales en su superficie. Esta fibra fue considerada por su eficiencia de extracción demostrada en un estudio previo en banana (M. spp. grupo AAA, cv. Giant Cavendish) (Pino y Febles, 2013). Los estándares utilizados, acetato de isoamilo (123-92-2), butirato de isoamilo (106-27-4), acetato de 2-pentanol (53496-15-4), (E)-2-hexenal (6728-26-3), (E)-cinamaldehído (104-55-2), 1-hexanol (73117), ciclohexanol (108-93-0), butirato de butilo (109-21-7), butanoato de hexilo (2639-63-6) y nonanal (124-19-6) fueron adquiridos en Sigma–Aldrich Química S.A. El estándar de ciclohexanol fue utilizado para cuantificar 3-metil-ciclohexanol, mientras el de nonanal permitió hallar la concentración de hexanal en la pulpa. Además, el compuesto 2-hexen-1-ol fue cuantificado con ayuda del estándar de 1-hexanol, el butirato de isoamilo fue utilizado para la cuantificación de isobutirato de isoamilo e isovalerato de isoamilo. Para calcular los índices de Kovats se usó un estándar de alcanos C7-C40 de Sigma–Aldrich, preparado en metanol, con una concentración de 73 ppm. 6.1.3.2. Disposición de los tratamientos en pulpa de plátano. El análisis de las concentraciones de volátiles y olfatometría se realizó en diferentes estadios del plátano, teniendo en cuenta el índice de color de la cáscara, de acuerdo a Boudhrioua (et al., 2003): verde, más verde que amarillo, más amarillo que verde, amarillo con cuello verde y completamente amarillo. Cada plátano en estadio inicial de maduración fue cubierto en el área de la corona con un fragmento de papel con o sin bioactivo, de 10 cm2, de manera que pudiese rodearla completamente. Las frutas fueron ubicadas en incubadora a 25 ºC durante el tiempo de análisis del experimento, y luego, se tomaron unidades de muestra para el análisis en pulpa de la concentración de los metabolitos volátiles por HS-SPME-GC-MS y análisis por HS-SPME/GC-O-MS. Además, a cada fruta se le realizaron cinco pruebas de penetrometría, utilizando un penetrómetro de presión de fruta modelo FT 327, diseñado por la empresa TR Turoni srl®, para comparar los valores obtenidos con el índice de color en cada estadio. Para el análisis estadístico se utilizó el software SPSS® version 22, con un diseño a dos vías, donde el primer factor fue el tipo de empaque y el segundo, el estadio de maduración (nivel de significancia P< 0.05). Además se llevó a cabo un análisis de comparaciones múltiples de Tukey para diferenciar la concentración de los compuestos volátiles entre estadios, y el análisis de componentes principales (PCA) usando el software Minitab 17®, para establecer correlaciones entre las

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concentraciones de los compuestos y los estadios. En cuanto a los datos de olfatometría, se realizó un análisis descriptivo de los cambios en la frecuencia modificada de los compuestos durante la maduración de la fruta. 6.1.3.3. Procedimiento de extracción por HS-SPME. Se retiró la cáscara del plátano y se maceró una porción de pulpa en un mortero para proceder a pesar 5 g de la muestra en un vial con capacidad de 20 ml. Este contenedor fue sellado con un septo de goma y colocado en ultrasonido cinco minutos para favorecer la homogenización de la muestra. Para la extracción de volátiles estuvo disponible un sistema automuestreador CTC (Combipal) acoplado al GC-MS y diseñado por Agilent Technologies® (Madrid, España), mediante el cual, la fibra de SPME fue insertada automáticamente en el vial contenedor de la pulpa con una penetración de 45 mm y la adsorción se llevó a cabo a 40 ºC durante 15 minutos bajo agitación a 750 rpm. Con las muestras para olfatometría, la fibra fue insertada de manera manual a una distancia aproximada de 2 cm, utilizando el mismo tiempo y temperatura de adsorción del análisis por GC-MS, pero sin agitación. En ambos casos la desorción térmica de los compuestos se realizó durante 2 minutos a 250 ºC. El sistema de muestreo fue programado posterior a cada desorción para limpiar la fibra de SPME a 300 ºC por 2 min. De manera periódica se realizaron desorciones térmicas de la fibra sin adsorción previa, para asegurar la ausencia de compuestos que pudiesen afectar el análisis posterior (efectos de memoria). 6.1.3.4. Separación e identificación de compuestos volátiles. Se utilizó un cromatógrafo de gases Agilent Technologies, Inc. G1530A equipado con un inyector split/splitless, y acoplado a un detector selectivo de masas de la serie 5973. La temperatura del puerto de inyección fue 250 ºC, y la desorción se llevó a cabo en modo splitless, a través de un liner de 0.75 mm I.D producido por Supelco®. El helio fue el gas de arrastre con flujo de 1 mL/min y la separación se efectuó en una columna capilar polar BP20 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) modelo 054427 manufacturada por SGE Analytical Science. Se tuvo una presión de entrada de 48.7 kPa, con flujo de purga de 40 ml/min y tiempo de equilibrio de 0.5 min. El programa de temperatura del horno fue el siguiente: la temperatura inicial empleada fue de 40 ºC durante 5 minutos, tiempo después del cual se incrementó en 10 ºC/min hasta 220 ºC, permaneciendo en este nivel 10 minutos. La ionización fue de impacto electrónico a 70 eV, con detección entre 50 y 400 Da en modo Scan. El tiempo de análisis fue de 33 min. La identificación de los compuestos se realizó por comparación del tiempo de retención obtenido cuando se analizaron los estándares, la comparación de los espectros de masas de los compuestos versus los de la biblioteca NIST® versión 05, y la verificación de los índices de Kovats a partir del análisis de una mezcla de alcanos (C7-C40), procesados bajo las mismas condiciones de la muestra. La adquisición de datos y control del sistema se alcanzó mediante el software MSD ChemStation E.02.00.493 (Agilent Technologies, Inc). 6.1.3.5. Análisis por GC-O-MS. Se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases Varian CP-3800, acoplado a un detector de trampa de iones Saturn 2200, y provisto de un puerto de olfateo ODO I de la empresa SGE Analytical Science. La

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inyección se realizó en modo splitless a través de un liner (Varian, 0.80 mm I.D) y con ayuda del gas de arrastre helio, a flujo constante de 1 ml/min, se hizo transitar a través de una columna polar BP-20 (30 m x 0.25 mm x 0.25 μm), suministrada por SGE Analytical Science. El flujo total fue de 20 ml/min y la velocidad lineal de 35.8 cm/seg. Las condiciones de la rampa térmica utilizada fueron idénticas a las utilizadas en el análisis de los compuestos por GC-MS. La ionización fue impacto electrónico en modo SCAN a una temperatura de 200 ºC y el detector fue una trampa de iones. El rango de masas del detector fue de 40-350 Da y cada análisis cromatográfico tardó 33 min. 6.1.3.6. Cuantificación de los compuestos volátiles. En viales sin muestra se adicionaron 10 µl de cada una de las soluciones estándar preparadas en metanol que contenían los estándares en diversas concentraciones, y se obtuvieron la rectas de calibrado de cada compuesto objetivo. Posterior a ello, se analizó la pulpa de los diferentes tratamientos y se halló la concentración de cada compuesto por interpolación del área obtenida sobre el punto de contacto en la recta elaborada. Para la cuantificación se tuvo en cuenta la siguiente ecuación:

C= [(A - I ) / P)] / p Ecuación 2

Donde C representa la concentración del compuesto en µg/g, A es el área del compuesto, I y P indican respectivamente el valor del intercepto y la pendiente en la recta de calibración del compuesto, y p es el peso en gramos de la pulpa. Los límites de detección y cuantificación se obtuvieron a partir de la menor respuesta de la solución estándar, aplicando las siguientes ecuaciones:

LOD = 3 * Hr * C1 / Hm - Hb Ecuación 3 LOQ= 10 * Hr * C1 / Hm - Hb Ecuación 4

Donde LOD y LOQ son respectivamente los límites de detección y cuantificación, Hr indica la altura del pico adyacente al compuesto a cuantificar, C1 es la concentración más baja del estándar, Hm representa la altura del pico de la muestra en la menor concentración detectada del estándar y Hb corresponde a la altura del blanco (obtenido en el mismo tiempo de retención sin adición del estándar). Para la determinación por olfatometría los metabolitos fueron detectados separadamente a través del puerto de olfateo, por dos panelistas previamente entrenados, quienes analizaron dos veces las muestras, registrando el tiempo de retención en el cual olieron el compuesto, la intensidad del metabolito en escala de 1 a 3 (1= leve, 2= moderado, 3= intenso) y la nota sensorial del olor. Con esta información se obtuvo la MF de los compuestos olidos, usando la siguiente ecuación:

MF(%)=[F(%) × I(%)]0.5 Ecuación 5

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Donde F (%) es la frecuencia de detección del compuesto en cada día de análisis expresada como porcentaje, e I(%) fue calculada como el promedio de intensidad indicada por los panelistas en las cuatro repeticiones dividida por tres. Los valores de MF superiores a 50 fueron considerados relevantes para el aroma de la fruta. 6.1.4. Extracción y análisis de canela EO presente en el papel bioactivo. Para conocer el comportamiento de la concentración de la canela EO en el papel bioactivo, se cortaron segmentos de 10 cm2 los cuales fueron dispuestos en idénticas condiciones a las que permanecieron en los tratamientos destinados al recuento de mohos. Diariamente, el papel con canela EO fue analizado mediante HS-SPME-GC-MS usando el procedimiento de extracción y análisis empleado para la extracción y análisis de volátiles. Los análisis se realizaron desde el día 1, que correspondió a las 48 horas de colocado el papel, hasta el día 7. Se realizaron cinco repeticiones por cada día en que se monitoreó el bioactivo impregnado en el papel. La concentración del bioactivo se obtuvo usando la siguiente ecuación:

C= [(A - I ) / P] / pp Ecuación 6

Donde C representa la concentración del bioactivo en µg/g de papel, A es el área obtenida del compuesto, I y P corresponden respectivamente al intercepto y la pendiente obtenidos en la recta de calibración del compuesto y pp indica el peso en gramos del fragmento de papel analizado. 6.2. RESULTADOS 6.2.1. Comportamiento del recuento mohos en corona de plátano. 6.2.1.1. Comportamiento del recuento mohos en corona de plátano. Inicialmente, se comprobaron los supuestos estadísticos en los datos obtenidos, comenzando con la prueba de Shapiro-Wilk con valores P mayores a 0.05 en los tratamientos de cada día de análisis (0.98 en el día inicial, 0.57 en el día dos, 0.82 en el día cuatro, 0.97 en el día seis y 0.93 en el día ocho), que indican la normalidad en los datos residuales de los recuentos de mohos. En cuanto al estadístico de Levene, los datos tuvieron varianzas homogéneas, con un valor P de 0.088. Por la dificultad de apreciar los recuentos en los días 0 y 2 con la escala utilizada, se realizó un gráfico de su raíz cuadrada (Figura 30). Inicialmente, se presentaron recuentos entre 27x103 y 57x103 UFC/g en ambos tratamientos. A partir del cuarto día, los conteos obtenidos fueron superiores a 1x107 UFC/g. Otro aspecto a considerar es que desde el cuarto día en adelante, la corona empacada en papel con bioactivo tuvo valores medios menores, en comparación con la corona no expuesta a canela EO, no obstante el respectivo ANOVA de una vía indicó que no habían diferencias significativas entre los tratamientos (P= 0.277).

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Figura 30. Raíz cuadrada del recuento de mohos en corona de plátano. 6.2.1.2. Comportamiento de la canela EO en el papel bioactivo. El compuesto bioactivo fue separado con un tiempo de retención promedio de 19.611 min y su índice de retención fue 2044, comparable con el índice de Kovats referenciado por el NIST (2043). La recta de calibración tuvo un coeficiente de correlación de 0.9944 y arrojó la ecuación: y= 777014x - 1E+06. Los promedios en la concentración estuvieron entre 870 y 1246 µg/g hasta el día cinco, pero en los últimos dos días analizados la media fue de 498 y 283 µg/g respectivamente (Figura 31). Además se presentaron coeficientes de variación entre 7 y 40%, debido a la heterogeneidad de la concentración del bioactivo en el papel.

Figura 31. Concentración del bioactivo en el papel durante diferentes tiempos de análisis. Cuando se evaluó el supuesto de homocedasticidad, se encontró que los datos tenían varianzas heterogéneas (P= 0.137 para la prueba de Levene), debido a la variabilidad diferente en las concentraciones del aceite de canela en cada día analizado, por lo que se realizó una transformación, mediante su logaritmo natural (Ln). Posterior a la verificación en el cumplimiento del supuesto de homogeneidad de varianzas (P= 0.137 para la prueba de Levene) y su normalidad mediante el estadístico de Shapiro-Wilk (P> 0.05 en todos los grupos), se realizó un ANOVA

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de un factor aplicado al Ln de la concentración del bioactivo en cada tiempo analizado, obteniéndose diferencias estadísticas (P< 0.05). Finalmente, la prueba de Tukey mostró que en los días de análisis 6 y 7, el compuesto bioactivo tenía una concentración menor en el papel (tabla no mostrada). Algunos estudios han evidenciado el efecto del compuesto activo presente en canela EO sobre diferentes mohos, principalmente a nivel in vitro (Soliman and Badeaa, 2002; López et al., 2007; Kyu et al., 2007; Montero-Prado et al., 2011; Balaguer et al., 2013; Manso et al., 2015). En el presente estudio, la concentración del bioactivo en el papel parafinado fue insuficiente para inhibir los mohos en la corona. De manera similar, se ha reportado que concentraciones de cinamaldehído menores a 20 µl/l no ejercieron limitaciones significativas sobre el crecimiento de Fusarium verticillioides (Xing et al., 2014), mientras que bajas concentraciones (0.03-0.11%, v/v) de Cinnamomum zeylanicum y Syzygium aromaticum, son ineficientes contra patógenos de banana (M. acuminata) (Ranasinghe et al., 2002). Es pertinente tener en cuenta que en fase de vapor se necesita una mayor concentración del aceite esencial para obtener una reducción significativa en el crecimiento de mohos (Bluma and Etcheverry, 2008), fundamentalmente si se pretende la inhibición de diferentes especies de mohos en una superficie irregular como la corona del plátano y sin barreras externas que suponen una acumulación del bioactivo, como ocurre en el microambiente de las pruebas in vitro. Existen evidencias acerca de los signos y el mecanismo de acción de los aceites esenciales sobre los hongos. El desarrollo del micelio de A. niger expuesto al aceite esencial de Cymbopogon citratus fue observado con los microscopios electrónicos de barrido (SEM) y de transmisión (TEM), notándose una reducción del grosor de la pared y del diámetro de las hifas, así como la desorganización estructural de las mitocondrias (Helal et al., 2006; Rodríguez-Lafuente et al., 2007; Rodríguez-Lafuente et al., 2009; Rodríguez-Lafuente et al., 2010; Manso et al., 2013). Así mismo, el SEM y TEM han permitido mostrar alteraciones en F. verticillioides como la reducción del contenido citoplásmico por ósmosis, destrucción mitocondrial, modificaciones en la regiones apicales y pérdida de la rigidez e integridad de la pared celular por exposición al aceite de canela (Xing et al., 2014). También con ayuda del TEM se ha observado el deterioro de la pared celular, membrana celular y organelos de A. niger por exposición a la concentración mínima inhibitoria de los aceites esenciales de T. eriocalyx and T. x-porlock (Rasooli et al., 2006). Igualmente, el cinamaldehído, por su actividad lipolítica, inhibe las enzimas β-(1,3)-glucano sintetasa y quitina sintetasa 1, relacionadas con actividades de síntesis de la pared celular de los mohos (Bang et al., 2000). También se han establecido alteraciones como las pérdidas de Ca+2, K+ y Mg+2 y reducción de lípidos (Helal et al., 2006). La resistencia bacteriana al aceite esencial de canela también ha sido estudiada (Becerril et al., 2012).

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6.2.2. Comportamiento de los compuestos volátiles en pulpa de plátano. 6.2.2.1. Valores de penetrometría obtenidos durante la maduración. Durante la maduración se realizaron mediciones de penetrometría al plátano para denotar variaciones por efecto del compuesto bioactivo en el empaque (Figura 32). La fruta integra presentó reducciones progresivas en su rigidez y no hubo indicios de aceleración del proceso de maduración por exposición al bioactivo, con respecto al tratamiento control.

Figura 32. Valores de penetrometría en plátano durante la maduración. 6.2.2.2. Separación cromatográfica de los compuestos volátiles analizados. Los compuestos volátiles fueron separados y analizados por GC-MS mediante las condiciones cromatográficas utilizadas (Tabla 16). Estos compuestos tuvieron tiempos de retención promedio, ubicados entre los seis y catorce minutos. Al obtener los índices de retención promedio de los compuestos, a partir del estándar de alcanos, se verificó su similaridad con los respectivos valores del índice de Kovats reportados por el NIST. Tabla 16. Separación cromatográfica e índices de retención de los compuestos presentes en plátano.

Compuesto RT promedio RI

promedio KI

Estándar de cuantificación

Acetato de 2-pentanol 6.272 1079 1068 Acetato de 2-pentanol Hexanal 6.407 1085 1084 Nonanal Acetato de isoamilo 7.514 1133 1120 Acetato de isoamilo Butirato de butilo 8.528 1178 1162 Butirato de butilo (E)-2-hexenal 9.470 1224 1220 (E)-2-hexenal Isobutirato de isoamilo 9.798 1242 1234 Butirato de isoamilo Butirato de isoamilo 10.735 1293 1259 Butirato de isoamilo Isovalerato de isoamilo 11.361 1332 1304 Butirato de isoamilo 1-hexanol 11.747 1356 1321 1-hexanol 2-hexen-1-ol 12.510 1405 1406 1-hexanol Butanoato de hexilo 13.137 1450 1414 Butanoato de hexilo 3-metil-ciclohexanol 13.563 1480 1463 Ciclohexanol

RT: Tiempo de retención. RI: Índice de retención. KI: Índice de Kovats.

6.2.2.3. Parámetros de cuantificación para hallar la concentración de los compuestos volátiles durante la maduración. Como se puede observar en la

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tabla 17, los valores de R2 obtenidos para cada compuesto usando la calibración convencional indican un apropiado ajuste a la recta de regresión, principalmente acetato de 2-pentanol y butirato de isoamilo. Los compuestos acetato de 2-pentanol, 1-hexanol, nonanal y ciclohexanol tuvieron los menores LOD y LOQ, mientras los ésteres acetato de isoamilo y butirato de butilo, y el aldehído (E)-2-hexenal presentaron los más altos límites. Tabla 17. Parámetros de regresión y cuantificación para los principales compuestos volátiles obtenidos en plátano.

Compuesto R2 para CC Ecuación lineal para CC LOD (μg/g) LOQ (μg/g)

Acetato de 2-pentanol 0.999 y = 2859,2x + 6651,8 0.22 0.73 Acetato de isoamilo 0.992 y = 7257,4x + 103018 3.53 11.77

Butirato de butilo 0.997 y = 19707x + 114462 3.43 11.44 Butirato de isoamilo 0.999 y = 40530x + 501077 2.58 8.61 Butirato de hexilo 0.992 y = 75479x + 3E+06 2.69 8.97

1-hexanol 0.993 y = 14185x + 30584 0.24 0.79 (E)-2-hexenal 0.992 y = 9997,7x - 115346 4.56 15.20

Nonanal 0.994 y = 40043x + 248554 0.69 2.30 Ciclohexanol 0.996 y = 15074x + 143427 0.33 1.10

CC: Calibración convencional; LOD: Límite de detección; LOQ: Límite de cuantificación.

6.2.2.4. Concentración de los compuestos volátiles durante la maduración. La concentración promedio de los compuestos volátiles fue similar al comparar entre ambos tratamientos a través de los estadios de maduración de la fruta (Figura 33). Los compuestos con mayores concentraciones en los dos últimos estadios fueron acetato de 2-pentanol, (E)-2-hexenal, isobutirato de isoamilo y butirato de isoamilo, mientras los alcoholes (con excepción del 3-metil-ciclohexanol) tuvieron altas concentraciones en el estadio inicial. El hexanal mostró mayores concentraciones en las etapas inmaduras de la fruta, mientras el (E)-2-hexenal decreció hacia el estadio intermedio y posteriormente se incrementó, mostrando además una variabilidad apreciable a lo largo del experimento.

Figura 33. Concentración de volátiles en pulpa de plátano durante la maduración.

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Debido a que las varianzas de las concentraciones de los compuestos volátiles eran heterogéneas, se procedió a realizar una transformación de datos mediante la raíz cuadrada y se verificó su normalidad a través de la prueba de Shapiro-Wilk (P> 0.05 para todos los compuestos), y homocedasticidad mediante el estadístico de Levene (P> 0.05 para todos los compuestos). No se presentaron diferencias entre los tratamientos (P= 0.637). Según la prueba de Tukey, acetato de 2-pentanol, acetato de isoamilo, isobutirato de isoamilo, butirato de isoamilo, isovalerato de isoamilo y 3-metil-ciclohexanol tuvieron concentraciones estadísticamente mayores en los dos últimos estadios (Tabla 18). Además, los volátiles C6 hexanal, hexanol y 2-hexen-1-ol tuvieron concentraciones significativamente mayores en los estadios iniciales, siendo indicadores de inmadurez en la fruta. Entre todos los volátiles analizados, el isobutirato de isoamilo fue el único que tuvo concentraciones estadísticamente diferentes en todos los estadios de maduración. Tabla 18. Prueba de Tukey aplicada a la raíz cuadrada de las concentraciones de los volátiles en pulpa de plátano en diferentes estadios de maduración.

Compuesto

Subconjuntos

Verde

Más verde que

amarillo

Más amarillo

que verde

Amarillo con cuello

verde

Completamente

amarillo Acetato de 2-pentanol

1 0.0 0.0 0.0

2 13.59

3 25.44

Hexanal

0.0 0.0 0.0

2 9.19

3 11.47

Acetato de isoamilo

1 0.0 0.0 0.0

2 10.97 11.48

Butirato de isobutilo

1 0.0 0.0 0.0 0.0

2 7.49

(E)-2-hexenal

1 11.56 15.81

2 22.44 15.81

3 24.72 22.44 28.17

Isobutirato de isoamilo

1 0.0

2 8.79

3 12.53

4 14.87

5 20.18

Butirato de isoamilo

1 9.08 9.71 10.14

2 14.09

3 20.35

Isovalerato de isoamilo

1 0.0 0.0 0.0

2 6.31

3 7.71

Hexanol

1 9.52 11.26

2 17.11 14.77 15.49

2-hexen-1-ol

1 3.92 5.71

2 5.71 7.58

3 9.20 7.58

4 11.00 9.20

Butanoato de hexilo

1 1.59

2 4.30 4.71 3.42

3 6.49

3-metil-ciclohexanol

1 0.0

2 6.75 6.70

3 11.09

4 15.31

123

6.2.2.5. PCA a partir de las concentraciones de los compuestos en plátano durante la maduración. El PCA aplicado a los compuestos químicos encontrados en la senescencia indica que el componente 1 alberga una variabilidad de los datos del 68.8%, y junto con el componente 2 representan una varianza acumulada del 91.4%. Este resultado indica un alto porcentaje de explicación de los cambios sucedidos durante la maduración del plátano. El primer plano factorial de los metabolitos analizados muestra que la variación de todos los ésteres es esencialmente explicada por el aumento en la concentración de estos compuestos al pasar al estadio “completamente amarillo”, donde la fruta ha alcanzado su madurez de consumo (Figura 34). Además, los compuestos 1-hexanol y hexanal se correlacionaron con los estadios iniciales, mientras que no hubo compuestos correlacionados con el estadio intermedio de maduración.

Figura 34. PCA de la concentración de volátiles en plátano durante la maduración. Los ésteres analizados se han encontrado predominantes en previas investigaciones. En diferentes variedades de banana y plátano (M. acuminate L.) se hallaron el acetato de 2-pentanol, acetato de isoamilo, butirato de isoamilo y butanoato de hexilo, siendo butirato de isoamilo el más abundante en bananas de variedad Dwarf Cavendish, Ouro, Prata y Maçã, mientras el acetato de isoamilo fue el metabolito principal en plátano (Pontes et al., 2012). Otro estudio mostró que en las variedades “Dwarf Cavendish”, “Giant Cavendish”, “Robusta” y “Williams” existía predominio de la concentración de butirato de isoamilo, seguido de butanoato de butilo, acetato de isoamilo, isobutirato de isoamilo, isovalerato de isoamilo y acetato de 2-pentanol (Nogueira et al., 2003). En puré de banana madura (Musa AAA group, CV. Brazil), butirato de isoamilo y acetato de isoamilo fueron los principales compuestos, con abundancias relativas del 21% y 8.4% respectivamente, y mantuvieron su predominio después del procesamiento para la obtención de jugo (Wang et al., 2011). El acetato de 2-pentanol permitió distinguir entre la variedad Cavendish y otras dos variedades en las que no fue detectado (Aurore et al., 2011). En el estudio de Ibáñez (et al., 1998), los principales

124

compuestos de la fruta madura fueron el butirato de isoamilo, isovalerato de isoamilo, acetato de isoamilo y el butanoato de hexilo. Igualmente, el acetato de isoamilo, butirato de isobutilo, butirato de isoamilo e isovalerato de isoamilo estuvieron entre los cinco compuestos mayoritarios en banana fresca y después del secado encontrados por Thuwapanichayanan (et al., 2011), quienes además indicaron en otro estudio que el butirato de isoamilo era el compuesto predominante en la fruta fresca y después de tratamientos de secado en los que se utilizaron diferentes espumantes Thuwapanichayanan (et al., 2012). De Vasconcelos (et al., 2012) analizó diferentes variedades de la fruta con abundancias mayores de acetato de 2-pentanol, acetato de isoamilo, butirato de isobutilo y butirato de isoamilo durante la maduración de la fruta. Igualmente, los compuestos acetato de isoamilo, isovalerato de isoamilo, butanoato de hexilo y butirato de isoamilo se determinaron en bananas sometidas a diferentes tratamientos de secado, con niveles mayores de acetato de isoamilo y butirato de isoamilo (Wang et al., 2007). Además, en muestras de banana tratadas o no con etileno, procedentes de Panamá, Costa Rica y Colombia, hubo concentraciones significativas de acetato de isoamilo, isobutirato de isoamilo, butirato de isobutilo e isovalerato de isoamilo, incrementadas al transcurrir la maduración (Vermeir et al., 2009). También durante la maduración, se estudiaron bananas procedentes de Martinica, con aumento de ésteres, donde las mayores áreas correspondieron al acetato de isoamilo y al acetato de butilo (Boudhrioua et al., 2003). Al comparar con el presente estudio, las exploraciones anteriores muestran comportamiento similar de 1-hexanol, y disparidad respecto al hexanal y (E)-2-hexenal. Un referente previo indicó concentraciones superiores de 1-hexanol, hexanal y (E)-2-hexenal en pulpa de diferentes especies de banana verde en comparación con niveles reducidos en su madurez plena, donde además del incremento de ésteres, se presentó una elevación de los alcoholes metilados (De Vasconcelos et al., 2012), tal como ocurrió con el 3-metil-ciclohexanol en el plátano de canarias analizado. Otra investigación en pulpa de banana (M. spp. cv. Gran Enano) reveló niveles importantes de hexanal, (E)-2-hexenal y 1-hexanol al inicio de la maduración y abundancias limitadas cuando la fruta se encontró totalmente madura (Vermeir et al., 2009). En banana taiwanesa (M. sapientum L. cv. Pei-Chiao) también hubo decrecimiento de hexanal durante la maduración (Liu and Yang, 2002). Además, un estudio comparativo mostró que la variedades de banana Cavendish, Frayssinette y el plátano destacaban por sus altos niveles de Hexanal y (E)-2-hexenal (Frayssinette, Cavendish y plátano), y baja concentración de 1-hexanol, en comparación con los aldehídos arriba mencionados (Aurore et al., 2011). Igualmente, Jordán (et al., 2001) y Nogueira (et al., 2003) encontraron altas concentraciones de (E)-2-hexenal en la pulpa de banana madura de diferentes variedades. Se ha sugerido que el incremento de ésteres se debe a una mayor actividad en su biosíntesis a partir de aminoácidos como valina y leucina, además de la degradación de ácidos grasos por β-oxidación (Boudhrioua et al., 2003). La alcohol acil transferas (AAT) cataliza la última etapa en la formación de ésteres por transacilación de una acil-CoA a un alcohol (Pontes et al., 2012). Los compuestos

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acetato de isoamilo, acetato de 2-pentanol y butirato de isoamilo, con concentraciones crecientes durante la maduración, se encuentran relacionados en cuanto a que un mismo gen (BanAAT) codifica la formación de un tipo de AAT que posibilita su síntesis, teniendo como predilección, a diferencia de otras AAT, el uso de los sustratos alcohólicos geraniol y octanol (Beekwilder et al., 2004). Se ha demostrado sin embargo, que esta enzima no es altamente selectiva para sustratos alcohólicos específicos (Wyllie et al., 2000), pudiendo utilizar alcoholes como los encontrados (1-hexanol y 2-hexen-1-ol). En cuanto a los compuestos C6 1-hexanol, hexanal y (E)-2-hexenal, su origen es atribuido a la ruta de LOX (Lipoxigenasa), mediante la degradación oxidativa de lípidos (Aurore et al., 2011). 6.2.3. Análisis de la pulpa de plátano mediante olfatometría. El acetato de isoamilo fue el único compuesto con una MF superior al 50% en todos los estadios de maduración, mientras acetato de 2-pentanol, butanoato de hexilo e isovalerato de isoamilo tuvieron valores iguales o mayores al 50% desde el estadio donde la fruta se encontraba más amarilla que verde (Tabla 19). En contraste, con excepción del 1-hexanol en el estadio verde, los alcoholes mantuvieron valores menores al 40% durante las fases monitoreadas y en la madurez plena del plátano tuvieron una MF menor al 20%, aspecto que se correlaciona con las menores concentraciones obtenidas de estos compuestos por HS-SPME-GC-MS. Los ésteres acetato de 2-pentanol, acetato de isoamilo, isobutirato de isoamilo, isovalerato de isoamilo y butanoato de hexilo, y el aldehído (E)-2-hexenal tuvieron una MF igual o mayor al 50% en el estadio final de maduración, siendo responsables del impacto sensorial en el plátano, al alcanzar su madurez total. Tabla 19. Frecuencia modificada (%) de los compuestos volátiles percibidos en el análisis por olfatometría durante la maduración del plátano.

Compuestos Índice de retención promedio

Etapas de maduración

Verde Más verde

que amarillo

Más amarillo

que verde

Amarillo con cuello

verde

Completamente

amarillo

Descriptor de aroma

Acetato de 2-pentanol 1088 0.0 63.7 95.7 70.7 95.7 Frutal, floral, dulce Hexanal 1097 84.2 46.8 14.4 28.9 0.0 Verde, frutal Acetato de isoamilo 1136 70.7 100 100 98 100 Banano, dulce, chicle Butirato de isobutilo 1168 0.0 40.8 14.4 14.4 20.4 Frutal, dulce (E)-2-hexenal 1179 40.8 17.7 0.0 0.0 50.0 Verde, herbal Isobutirato de isoamilo 1224 66.1 40.8 28.9 38.2 55.9 Frutal, dulce Butirato de isoamilo 1255 86.6 81.6 66.1 53.0 61.2 Banano, dulce Isovalerato de isoamilo 1315 25.0 25.0 70.7 64.5 70.7 Banano, dulce, chicle 1-hexanol 1360 66.1 20.4 0.0 0.0 0.0 Floral, químico 2-hexen-1-ol 1393 0.0 14.4 14.4 0.0 14.4 Verde, herbal Butanoato de hexilo 1420 0.0 64.5 50.0 55.9 64.5 Frutal, floral 3-metil-ciclohexanol 1466 35.4 0.0 14.4 0.0 0.0 Químico

Entre los compuestos percibidos se encuentran hexanal y (E)-2-hexenal, los aldehídos más comúnmente encontrados en otros estudios de olfatometría en frutas, incluyendo plátano y banana. Estos compuestos fueron descritos principalmente como verdes y herbáceos en plátano (Musa. spp.) (Mayr et al., 2003) (M. sapientum L. var. Cavendish) (Jordán et al., 2001), banano (M. spp. cv. Giant Cavendish) (Pino y Febles, 2013), y otras frutas como fresa (Fragaria spp.)

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(Schulbach et al., 2004), fresa china (Myrica rubra Sieb. et Zucc.) (Kang et al., 2012), naranja (Citrus sinensis (L.) Osbeck) (Qiao et al., 2008), caqui (Diospyros kaki L., var. Triumph) (Wang et al., 2012), litchi (Litchi chinesis Sonn.) (Ong and Acree, 1998), guayaba (Psidium guajava L.) (Pino et al., 2012), arándano (Vaccinium spp) (Du and Rouseff, 2014), lulo (Solanum quitoense L.) (Brunke et al., 1989; Forero et al., 2015), albaricoque (Prunus spp.) (Guillot et al., 2006), Kiwi (Actinidia deliciosa Var. deliciosa cv. Hayward) (Jordán et al., 2002a), tomate (‘Tasti-Lee’ and ‘FL 47’) (Du et al., 2015) y tomate cherry (Lycopersicum esculentum) (Selli et al., 2014). En el caso de los alcoholes, el hexanol se relacionó con los descriptores frutal, verde y floral en melón (Cucumis melo L.) (Lignou et al., 2014), manzana (Syzygium jambos Alston) (Guedes et al., 2004), fresa (Fragaria spp. var. ‘Darselect’ y VR4) (Nuzzi et al., 2008), naranja (Citrus sp. Naveline, Spain) (Rega et al., 2003), guayaba (Psidium guajava L.) (Jordán et al., 2003; Pino et al., 2012), curuba (Passiflora mollissima (Kunth) L. H. Bailey) (Conde-Martínez et al., 2014), cempedak (Artocarpus integer Merr.) (Buttara et al., 2014), maracuyá amarilla (P. edulis Sims f. flavicarpa Deg.) (Janzantti et al., 2012), granada (Punica granatum L.) (Tripathi et al., 2014) y piña (Ananas sp.) (Spainer et al., 1998), mientras el aroma del 2-hexen-1-ol fue designado como verde y frutal en diferentes variedades de naranja (Qiao et al., 2008; Rega et al., 2003), y medicinal en fresa (Fragaria spp. var. ‘Darselect’ y VR4) (Nuzzi et al., 2008) y Kiwi (Actinidia deliciosa Var. deliciosa cv. Hayward) (Jordán et al., 2002a). Los ésteres distinguidos durante la maduración del plátano se han encontrado en algunas investigaciones de olfatometría realizadas en esta y otras frutas, con menor regularidad respecto a los aldehídos y el alcohol previamente referenciados. Un estudio realizado en banana (M. spp. cv. Giant Cavendish) mostró resultados similares al de la presente investigación, puesto que se detectaron el acetato de isoamilo, acetato de 2-pentanol, butirato de isoamilo e isovalerato de isoamilo con notas características de la fruta, además del butirato de isobutilo, reseñado como frutal y la mayoría de estos compuestos tuvieron alta frecuencia de detección (Pino y Febles, 2013). Un referente adicional es el análisis olfatométrico en plátano (M. sapientum L. var. Cavendish) (Jordán et al., 2001), donde se detectaron el acetato de isoamilo y el acetato de 2-pentanol, con pautas sensoriales de banana y frutal respectivamente. Además, el acetato de isoamilo se encontró entre cuatro compuestos principales del aroma de banana no procesada de la variedad Cavendish con notas frutales y de banana fresca (Boudhrioua et al 2003). Con respecto a otras frutas, el acetato de isoamilo se reportó en litchi (Litchi chinesis Sonn.) (Ong and Acree, 1998) donde se caracterizó como frutal, mientras el acetato de 2-pentanol fue descrito como frutal en melón (Cucumis melo L.) (Lignou et al., 2013), pero también se percibió como un aroma herbal en fresa (Fragaria spp. var. ‘Darselect’ y VR4) (Nuzzi et al., 2008), y el butanoato de hexilo hizo parte del perfil aromático del maracuyá con notas frescas (Passiflora edulis Sims F. Flavicarpa) (Jordán et al., 2002b) y frutales en fresa (Fragaria spp. var. ‘Darselect’ y VR4) (Nuzzi et al., 2008).

127

CONCLUSIONES

A pesar de encontrarse un recuento promedio de mohos menor en el tratamiento con el empaque bioactivo, las diferencias no fueron estadísticamente significativas, indicando que el empaque bajo estudio no fue eficiente para controlar el crecimiento de los mohos desarrollados en la corona de la fruta. La concentración del bioactivo en el empaque fue heterogénea y estadísticamente menor a partir del día seis, factores susceptible de contribuir a su deficiente eficiencia para controlar el recuentos de mohos. La concentración del bioactivo liberado a partir del empaque es crítica para la inhibición de los mohos, especialmente en casos como la corona del plátano. La presencia del compuesto bioactivo en el empaque no afectó la concentración de los volátiles del plátano durante la maduración, caracterizada por un aumento de los ésteres cuando la fruta estuvo completamente amarilla, y fuerte correlación entre los compuestos hexanal y 1-hexanol y los estadios iniciales. Los compuestos con mayor impacto sensorial en términos de MF al final de la maduración del plátano de canarias fueron acetato de 2-pentanol, acetato de isoamilo, butirato de isoamilo, isobutirato de isoamilo, isovalerato de isoamilo y butirato de hexilo.

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ESTUDIO METABOLÓMICO DE LA MADURACIÓN DEL … · funcionales obtenidos por SDE/GC-MS con...

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