55TRATAMIENTOS TRMICOS Y QUMICOS PARA PREVENIR INFECCIONES POR FAGOS DE BACTERIAS LCTICASRevista Argentina de Lactologa - N22 - 2003Surez V., Quiberoni A., Binetti A., Guglielmotti D., Capra M.L. y Reinheimer J.* Trabajo recibido el 15-09-03 y aceptado para su publicacin el 26-02-04(*) Autor al cual dirigir la correspondencia (jorreinh@fiqus.unl.edu.ar)El perfeccionamiento en los mtodos para contener el nivel de bacteriofagos en plantas elaboradoras de yogur y quesos se ha tornado imprescindible, a fin de minimizar las prdidas econmicas en los procesos. Para investigar la resistencia fgica se seleccionaron temperaturas utilizadas en tratamientos trmicos empleados en la industria lctea (63C, 72C y 90C) y diferentes biocidas que comnmente se emplean en la desinfeccin de ambientes industriales y laboratorios (hipoclorito de sodio, alcoholes etlico e isoproplico y cido peractico). Estos tratamientos se aplicaron sobre suspensiones ( 106 UFP/ml) de fagos especficos de Lactobacillus helveticus, Strep-tococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus para-casei, calculndose los valores T99 (min) a partir de las cinticas de inactivacin.En general, los calentamientos a 63C y 72C no fueron eficientes para asegurar una eliminacin total de fagos. El tratamiento de 90C (5 min) inactiv las suspensiones, salvo para un fago de L.delbrueckii subsp. bulgaricus ( Ib3). El ms eficiente biocida result el cido peractico (0.15% v/v), siendo las suspensiones virales inactivadas antes de 5 min. El hipoclorito de sodio result eficaz en concentraciones de 100 - 300 ppm, salvo para el fago Ib3, que requiri 1200 ppm para una inactivacin total. El etanol result eficiente al 50 y 100% v/v. El isopropanol no produjo un efecto significativo en ninguna concentracin ensayada (10, 50 y 100% v/v).Los resultados del estudio permiten adoptar tratamientos para minimizar los riesgos de ataques de fagos, en plantas industriales argentinas de quesos y leches fermentadas, sobre las bacterias lcticas de los fermentos empleados. RESUMENPalabras clave [ bacteriofagos [ efecto viridicida[ bacterias lcticas Programa de Lactologa Industrial, Facultad de Ingeniera Qumica (Universidad Nacional del Litoral), Santiago del Estero 2829, 3000 Santa Fe, Argentina. Tel. 0342 4530302, Fax. 0342 457116256Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003Revista Argentina de Lactologa - N22 - 2003SUMMARYKey words [ bacteriophages [ viridicidal effect[ lactic acid bacteria (*) Author for correspondence (jorreinh@fiqus.unl.edu.ar)CHEMICAL AND THERMAL TREATMENTS TO AVOID PHAGE INFECTIONS ON LACTIC ACID BACTERIAPrograma de Lactologa Industrial, Facultad de Ingeniera Qumica (Universidad Nacional del Litoral), Santiago del Estero 2829, 3000 Santa Fe, Argentina. Tel. 0342 4530302, Fax. 0342 4571162. E-mail: jorreinh@fiqus.unl.edu.arSurez V., Quiberoni A., Binetti A., Guglielmotti D., Capra M.L. y Reinheimer J.* Measures to avoid bacteriophage infections in yoghurt and cheese factories are necessaries in order to diminish economic losses. Temperatures used in industrial thermal treatments (63C, 72C y 90C) and different biocides (sodium hypochlorite, isoprophylic and ethylic alcohols and peracetic acid) commonly employed in disinfections of plants environments and laboratories, were assayed. The treatments were applied on suspensions ( 106 PFU/ml) of Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus paracasei bacteriophages and T99 (min) values were calculated from inactivation kinetic curves. Treatments at 63C and 72C were not efficient to allow a total inactivation of bacteriophage suspensions. A heating of 90C-5 min inactivated the phages, except the phage Ib3 (L. delbrueckii subsp. bulgaricus). The more effective biocide was the peracetic acid (0.15%), being the viral suspensions inactivated before 5 min. The sodium hypochlorite was effective at concentrations of 100 - 300 ppm, except for phage Ib3 which required 1200 ppm for a total inactivation. Ethanol was effective at concentrations of 50 and 100 % v/v and isopropanol turned out to be less effective than ethanol.The results obtained in this work are useful to adopt effective thermal and chemical treatments for phage inactivation in dairy environments.57INTRODUCCINLa infeccin fgica de bacterias lcticas (BAL) usadas como cultivos iniciadores en la industria lctea fermentativa, es una de las causas principales de fallas en su capacidad acidificante (1, 2). Este hecho determina una menor velocidad o, en casos extremos, la detencin del proceso fermentativo, lo que deriva en severas consecuencias tecnolgicas y comerciales (3). Una vez ingresados los fagos a las plantas, el control de este problema no es sencillo, ya que la diseminacin de estas partculas virales en el ambiente industrial es muy rpida (4).EnArgentina,elestudiodeestaproblemticasehaprofundizadoenlos ltimosaos,apartirdelaimplementacindecambiosenelmanejodelos fermentos utilizados en quesera. El reemplazo de fermentos naturales por fer-mentos seleccionados importados con alta sensibilidad fgica, principalmente para quesos blandos y semiblandos, puso en evidencia la presencia fgica en las plantas industriales (5).En nuestro pas, la BAL de mayor importancia tecnolgica es Streptococcus thermophilus, especie usada en la elaboracin de yogur y una gran variedad de quesos de pasta blanda (Cremoso, Cuartirolo, Port Salut, Fresco) y semiblanda (Holanda, Fontina, Colonia, Edam y Pategrs)(6). Este hecho hizo necesario fo-calizar el estudio de la metodologa de control fundamentalmente sobre fagos de esta especie bacteriana. No obstante, actualmente existe una tendencia a utilizarfermentosmixtosquecombinanBALtermfilas(S.thermophilus)con BAL mesfilas (pertenecientes al gnero Lactococcus). El aislamiento de fagos argentinos especficos de Lactococcus lactis (de elaboraciones defectuosas de quesos) y de Lactobacillus delbreckii subsp. bulgaricus (de procesos de yogur), permitirealizarenelProgramadeLactologaIndustrial(FIQ-UNL)estudios sobre fagos autctonos y relacionar los resultados obtenidos con los de trabajos previos, realizados en otros pases. En particular, no existen datos sobre la resistencia al calor y biocidas de los fagos autctonos argentinos, informacin que resulta muy importantea los fines prcticos. El objetivo de este trabajo fue investigar la termo y quimio resistencia de fagos especficos de distintas especies de bacterias lcticas, autctonos y de coleccin, y establecer bases para disear tratamientos eficientes que minimicen su incidencia en procesos industriales.MATERIALES Y MTODOSBacteriofagos, cepas sensibles y condiciones de cultivoLa Tabla 1 muestra los fagos utilizados en este trabajo y sus cepas hospeda-doras. Los medios de cultivo usados para activar y desarrollar las cepas fueron Caldo M17 (Biokar, Beauvois, France) para cocos y Caldo MRS (Biokar, Beauvois, France)paralactobacilos.Losstocksdebacteriofagosseprepararonsegn Neviani y col. (7) y almacenaron a 4C y 80C en presencia de 15% (vol/vol) de glicerol. El recuento de fagos, expresado en unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/ml), se realiz usando el mtodo de la doble capa agarizada (8). Las placas fueron incubadas a la tempe-ratura ptima de desarrollo de las cepas sensibles: 30C (L. lactis), 37C (Lactobacillus paracasei) y 42C (S. thermophilus, L. helveticus y L. delbrueckii).58Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003TABLA 1:Fagos y cepas bacterianas utilizadas en este estudioESPECIEStreptococcusthermophilusLactococcuslactisLactobacillushelveticusLactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricusLactobacillusdelbrueckii subsp.lactisLactobacillusparacaseiFAGO 021-4 a021-5 a0BJ a031-D aCYM a001 a046 aQF12 aQP4 ahvATCC 15807-B1CNRZ 832-B1CNRZ 0241BYM aYAB aIb3 aLL-HATCC 27092-B1 (PL-1)ATCC 27139-B1 (J.1)CEPA SENSIBLEST12-4ST12-5STBJST12-5STYSD10ClM913-3M1215-1ATCC 15807ATCC 15807CNRZ 892CNRZ 892YSD VAb1Lb-Ib3CNRZ 700ATCC 27092ATCC 27139a : Fagos aislados en Argentina59Tratamientos trmicosSe ensayaron tres temperaturas (63C, 72C y 90C) correspondientes a trata-mientos trmicos utilizados a nivel industrial. El medio de suspensin fue Leche Descremada Reconstituida (10%p/v) estril (LDR).Las suspensiones fgicas (aproximadamente 106 UFP/ml) en LDR se incuba-ron a las temperaturas mencionadas, luego de distribuirlas en tubos Eppendorf (alcuotasde1ml).Aintervalospredeterminadosserealizunrecuentode partculas fgicas. Los resultados se expresaron como concentracin (UFP/ml) departculasfgicasviablesysegraficaronenfuncindeltiempo.Eltiempo (min) necesario para inactivar el 99% de los fagos presentes (T99) se calcul a partir de las cinticas de inactivacin. Tratamientos qumicosLos biocidas utilizados fueron: hipoclorito de sodio, etanol (Cicarelli, Buenos Aires, Argentina) (10, 25, 50 y 100% v/v), isopropanol (Cicarelli, Buenos Aires, Argen-tina) (10, 50 y 100% v/v) y cido peractico (Proxitane 1512, Qumica General, Santa Fe, Argentina) (0.15% v/v). El hipoclorito de sodio se diluy en buffer fosfato (Cicarelli, Buenos Aires, Argentina) (pH= 7, 0.1 M). Los alcoholes se diluyeron en medio de cultivo y el cido peractico en agua destilada (pH final= 2.7). Los ensayos se realizaron a 25C, excepto para el cido peractico que se utiliz a 40C (9). Estos biocidas se seleccionaron por su uso comn para desinfeccin en plantas industriales y laboratorios.Cada suspensin fgica se mezcl con las soluciones de biocidas y se incub alastemperaturasmencionadasanteriormente,luegodedistribuirlamezcla (aproximadamente 106 UFP/ml) en tubos Eppendorf (1 ml como volumen final). A intervalos predeterminados se realiz un recuento de partculas fgicas. Los resultadosseexpresaroncomoconcentracin(UFP/ml)departculasfgicas viables y se graficaron en funcin del tiempo, calculndose los valores de T99. RESULTADOS Y DISCUSINTratamientos trmicos En la Tabla 2 se muestran los valores de T99 para los fagos estudiados de dis-tintos gneros y especies de BAL, a temperaturas de pasteurizacin y utilizando leche descremada como medio de suspensin.Surez y col. - Pgs. 55 a 7660Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003El calentamiento de 63C, en general, no result suficiente para la inactivacin de partculas virales. Para fagos de S. thermophilus, un calentamiento de 63C 30 min no fue un tratamiento suficiente para eliminar el 99% de partculas fgicas presentes para 3 de los 5 fagos estudiados. Para los dos fagos restantes (021-5 y 031-D), 45 min de tratamiento no aseguraron la eliminacin total de partculasfgicas(Fig.1).Losresultadosobtenidosparafagosdelactococos fueron variables. Los fagos 001 y QP4 demostraron elevada resistencia (T99>45 min). Por el contrario, los fagos 046 y QF12 resultaron ms sensibles (T99=16.7 min y T99=2.7 min, respectivamente). La destruccin total de partculas virales se logr solamente para el fago QF12, a los 15 min de tratamiento (Fig. 1). Los fagos de L. helveticus utilizados mostraron resultados tambin variables. Los fagos hv y ATCC 15807-B1 mostraron una baja resistencia trmica (T99 4530.0> 4512.0> 45> 4516.72.7> 452.212.8> 4545.0> 45> 45> 4515.82.53.172C3.5< 2.012.0< 2.012.020.02.2< 2.04.3< 2.0< 2.021.18.92.3< 2.02.9< 2.0< 2.0< 2.0TEMPERATURA61los fagos pertenecientes a la Coleccin CNRZ (0241 y 832-B1) mostraron una elevada termorresistencia (T9945 min). Para fagos de L. delbrueckii, el fago LL-H result el ms sensible a la temperatura. Los fagos autctonos mostraron valores de T99>45 min, mientras que para el fago LL-H, este valor fue de 15.8 min, a pesardelocualnoselograroneliminartodaslaspartculasviralespresentes con 45 min de calentamiento (Fig. 1). Los dos bacteriofagos especficos de L. paracasei mostraron ser poco resistentes a la temperatura, como lo muestran los valores de T99 hallados en cada caso (Tabla 2). Una suspensin de alto ttulo del fago PL-1 en leche se inactiv a los 45 min de tratamiento (Fig.1). FIGURA 1:Cinticas de inactivacin trmica (63C) de fagos de distintas especies de bacterias lcti-cas, en leche descremada. Los valores representan el promedio de tres determinaciones.Surez y col. - Pgs. 55 a 7662Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003A partir de estos resultados se puede inferir que la pasteurizacin de leche de baja temperatura (63C 30 min) pudo ser resistida por la mayora de los fagos estudiados, no resultando efectivo como mtodo de inactivacin fgica segura en procesos de quesera.El calentamiento a 72C result ms eficiente que el de 63C, aunque no lo suficiente en todos los casos estudiados para lograr una eliminacin completa de los fagos presentes (Tabla 2). Para fagos de S. thermophilus, los ms sensibles resultaron el 021-5 y el 031-D (T99

4510>45>4545>45>45>45>45>45>45>45>4514.7>45>45>45>45>45>45>45BIOCIDA5018.045.03.52.145.0>45>45>45>457.22.245>45>45>45>457545>45>45>45>45>45>45>45>45>45>45>455032.05.08.23.0>4545.0>45>45>455.05.045>45>45>45>451003.511.045>45>45352.845>45>45>45>45ISOPROPANOL (% v/v)69FIGURA 4:Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 021-4 (A), 021-5 (B), OBJ (C), 031-D (D) y CYM (E) (Streptococcus thermophilus), con 10 (), 50 (), 75 () y 100 () % (v/v) de etanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones.70Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003FIGURA 5:Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 001 (A), QP4 (B), QF12 (C) y 046 (D) (Lactococcus lactis), con 10 (), 50 (), 75 () y 100 () % (v/v) de etanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones71El alcohol isoproplico se ensay como biocida en concentraciones del 10, 50 y 100%. Un 10% del alcohol no produjo un efecto apreciable sobre la inactivacin viral (T99>45 min, Tabla 3). Las concentraciones del 50 y 100% fueron efectivas en el caso de fagos de L. helveticus. Para el fago hv fue ms eficiente la concen-tracin del 50% (T99= 5 min), mientras que para el fago ATCC 15807-B1 lo fue el 100% (T99= 2.8 min). Para este ltimo, se logr una inactivacin total a los 45 min de tratamiento (Fig. 6). Para los fagos de la coleccin CNRZ (832-B1 y 0241)lasdosconcentracionesresultaronigualmenteeficaces(T9945 min) (Tabla 3). FIGURA 5:Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 001 (A), QP4 (B), QF12 (C) y 046 (D) (Lactococcus lactis), con 10 (), 50 (), 75 () y 100 () % (v/v) de etanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones72Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003FIGURA 6:Cinticas de inactivacin qumica de los fagos hv (A), ATCC 15807-B1 (B), CNRZ 832-B1 (C) y CNRZ 0241(D) (Lactobacillus helveticus), con 10 (), 50 () y 100 () % (v/v) de isopropanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones73FIGURA 6:Cinticas de inactivacin qumica de los fagos hv (A), ATCC 15807-B1 (B), CNRZ 832-B1 (C) y CNRZ 0241(D) (Lactobacillus helveticus), con 10 (), 50 () y 100 () % (v/v) de isopropanol. Los valores representan el promedio de tres determinacionesFIGURA 7:Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 021-4 (A), 021-5 (B), OBJ (C), 031-D (D) y CYM (E) (Streptococcus thermophilus), con 10 (), 50 () y 100 () % (v/v) de isopropanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones74Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003El cido peractico al 0.15%, produjo una rpida destruccin viral en todos los casos, ya que suspensiones fgicas fueron completamente inactivadas antes de los 5 min de tratamiento (datos no mostrados).Basndose en los resultados obtenidos, se puede asegurar que el cido pe-ractico fue el mejor agente viridicida. Trabajos previos (20, 21) demostraron que este compuesto, al 1%, modifica la estructura del ADN del bacteriofago F116 (especficodePseudomonasaeruginosa)yqueunaconcentracinde0.1% logra la reduccin del 99.99% de las partculas virales presentes en 10 min de contacto. El hipoclorito de sodio fue eficiente en concentraciones de 100 300 ppm, salvo para un fago de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Ib3), para el que se necesit una concentracin de 1200 ppm para inactivar completamente sus suspensiones. Bennet y Nelson (22), y Hunter y Whitehead (23) demostraron que concentraciones mayores a 500 ppm fueron necesarias para inactivar fagos de L. lactis subsp. lactis, pero utilizando leche y suero como medio de suspensin. Otro estudio reciente (24) sobre fagos de L. lactis demostr la necesidad de utilizar concentraciones entre 1000 1200 ppm de hipoclorito de sodio cuando se rea-lizaba el ensayo en leche, y 100 300 ppm cuando el medio de suspensin era Caldo M17. Segn Maillard y col. (25), el fago F116, activo sobre P. aeruginosa PAO1, fue altamente sensible a bajas concentraciones (5 y 75 ppm) de hipoclorito de sodio, logrando reducciones del ttulo de al menos 4 rdenes logartmicos en 30 seg. Sobre este fago, tratamientos con etanol 70% y 100% durante 30 min produjeron alteraciones en la cpside viral, pero no en el ADN del fago (20). CONCLUSIONES- Los tratamientos de pasteurizacin (63C y 72C) no aseguran la eliminacin completa de fagos de bacterias lcticas en leche. Slo tratamientos de 90C (