Estudio de la respuesta de las variedades de

Sorgo bicolor (L) Monech cultivadas en Uruguay

a la inoculación con bacterias promotoras del

crecimiento vegetal

Dr Federico Battistoni, fbattistoni@iibce.edu.uy Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas División de Microbiología Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable

Interacción planta-bacteria

Rizosféricas

Epifíticas

Endófito facultativo

Endófito obligatorio

Simbióticas

G. diazotrophicus – caña de azúcar

Azospiriullum sp. – sorgo

S. meliloti – alfalfa

A. chroococcum - arroz

Interacción planta-bacteria

P. fluorescens - alfalfa • Coevolución planta – bacteria • Grado de interacción

Endófitos bacterianos

•Bacterias que colonizan activamente los tejidos internos de las plantas y establecen asociaciones (endosimbiosis), beneficiando a las mismas (PCV) •Endófito verdadero: cuando se demuestra mediante técnicas microscópicas su localización e identidad dentro de los tejidos vegetales •Cumplir con el postulado de Koch: ser capaz de infectar nuevos hospederos

Endófitos y sus aplicaciones

(Ryan et. al., 2008)

Zona de raíces laterales

Zona de pelos radiculares

Zona de elongación celular

Pelo radicular

Córtex

Endodermis

Xilema

Interacción planta-endófito

I-

I- Colonización del rizoplano

II-

II- Infección de los tejidos

III-

III- Colonización del cortex

nifH::gusA

Mecanismos de promoción del crecimiento vegetal

a. Competencia por los nutrientes del nicho

b. Producción de metabolitos secundarios tóxicos

c. Parasitismo

d. Inducción de la resistencia sistémica

1. Control Biológico

• Indirectos: actúan sobre otros componentes del ecosistema provocando un efecto benéfico en la planta

• Directos: actúan sobre la planta

1. Fijación biológica del nitrógeno (FBN)

3. Incremento en la capacidad de absorción de minerales (Fe,P)

2. Producción de sustancias estimulantes del crecimiento

Objetivo de la línea de investigación

Aportar a la sustentabilidad de cultivos de interés agronómico mediante el empleo de bacterias endófitas promotoras del crecimiento vegetal, en sustitución a la fertilización química

Modelos exitosos Gluconacetobacer diazotrophicus PAL5- caña de azúcar (Saccharum officinarum) Herbaspirillum seropedicae SmR1 – arroz (Oryza sativa)

Klebsiella pneumoniae 342-trigo (Triticum spp.)

Modelos de estudio en el laboratorio

Festuca SFRO var. Don Tomás

Caña de azúcar (Saccharum officinarum)

Sorgo dulce var. M81E (Sorghum bicolor)

Canola (Brassica napus)

• Sorghum bicolor (sorgo dulce) pertenecen a la familia de las Poaceae • Es el quinto cultivo en importancia en el mundo • A este cultivo se lo define como multipropósito (biocombustible, alimento, energía) • Variedad utilizada en ALUR M81E, introducida de la Universidad de Kentucky USA

Sorghum bicolor (L) Monech

General

Determinar mediante estudios de interacción planta-bacteria si los probables endófitos bacterianos asociados al sorgo dulce tienen un papel significativo en promover el crecimiento vegetal de la variedad M81E

Objetivos

1. Construir una amplia colección de probables endófitos bacterianos nativos asociados a plantas adultas de la variedad M81E de interés para ALUR S.A.

2. Caracterizar bioquímica y molecularmente la colección construida e identificar aislamientos de interés.

Específicos

3. Estudiar la respuesta en ensayos de invernáculo y de campo de plantas de sorgo dulce inoculadas con bacterias promotoras del crecimiento vegetal.

4. Determinar si los aislamientos promotores del crecimiento vegetal son endófitos verdaderos.

5. Determinar el efecto de la fertilización química sobre el microbioma

Estrategia

Ensayos de campo

Caracterización (PCV y PMI)

Ensayos de PCV

Identificación y filogenia

PF1

EU672801.1| Enterobacter arachidis Ah...

AJ853891.1| Enterobacter ludwigii EN-...

PC3

DQ504305.1|Pantoea dispersa LMG2603

PL2

JT26

U80196.1|Pantoea ananatis

AJ233423.1| Pantoea agglomerans DSM 3493

EF688009.1| Pantoea eucalypti LMG 24197

AJ233426.1| Rahnella aquatica (strain...

LT5

LT8

AF143245.1| Pseudomonas stutzeri

X06684.1| Pseudomonas aeruginosa ATCC...

JA5

EU184082.1| Pseudomonas lutea PSB2

D84020.1| Pseudomonas putida ATCC 12633

LF13

DQ095904.1| Pseudomonas fluorescens S16

JF5

JF1

D84013.1|Pseudomonas fluorescens ATCC...

X81665.1|Acinetobacter lwoffii(DSM2403)

JT25

X81660.1|Acinetobacter baumannii(DSM3...

AB166885.1| Stenotrophomonas koreensis

AM403589.2|Stenotrophomonas terrae st...

JF6

EU573216.1| Stenotrophomonas chelatip...

FJ404810.1| Stenotrophomonas sp. DNPA8

FJ748683.2| Stenotrophomonas pavanii ...

JL9

PL12

JC2

X95923.1|Stenotrophomonas maltophilia...

JT9

JA15

LA2

HQ536002.1| Bacillus subtilis DP14

91

100

97

100

100

100

54

43

51

97

47

57

94

100

100

71

72

87

71

37

89

78

100

40

91

71

100

61

78

93

89

87

97

0.02

Construcción de una colección Semillas, raíces y tallos

Mareque et.al., 2014; Heijo 2015

Productores de proteasas

Formadores de biopelículas

Productores de celulasas y hemicelulasas

29

5/3

41

PM

I Caracterización de la colección Colección: 369 aislamientos

Solubilizadores de fosfatos (P)

Productores sideróforos (Fe)

Diazótrofos (N) (nifH+/película de crecimiento)

Productores AIA (ácido indol acético) 66

146

22

25

PC

V

Alto potencial biotecnológico

Identificación y filogenia

Árbol filogenético basado en las secuencias de gen 16S ARNr de los aislamientos asociados a sorgo dulce

• Gran diversidad bacteriana

• Géneros nuevos reportados como asociados a sorgo dulce

Mareque et.al., 2014; Heijo 2015

Ensayos de promoción del crecimiento vegetal en invernáculo

Aislamiento Altura Tallo

(cm)

Diámetro Tallo

(mm)

Peso seco (g planta-1)

Raíz Aéreo

Control Negativoa 13,50 a 4,84 a 0,74 a 0,86 a

Rhizobium sp. UYSB12 14,44 ab 4,90 a 1,05 c 0,95 abc

Rhizobium sp. UYSB13 16,00 b 4,44 a 1,09 c 1,07 cd

Enterobacter sp. UYSB34 14,95 ab 4,73 a 0,93 abc 1,02 bcd

Pantoea sp. UYSB45 16,25 b 4,79 a 1,01 bc 1,15 d

Azospirillum brasilense Sp7 14,30 ab 4,90 a 0,77 ab 0,94 ab

Variedad de sorgo dulce M81E

Rhizobium sp. UYSB13 y Pantoea sp. UYSB45 son endófitos verdaderos

Pantoea sp. UYSB45::gfp

A: raíces (630X) y B: cofa de la raíz principal.

Rhizobium sp. UYSB13

Efecto de la fertilización química nitrogenada sobre la comunidad endofítica y diazotrófica

Mareque et.al., enviado

+N#(200#KgN/há)#

Raíz%Tallo%

inferior%Tallo%

superior%

-N#(0#KgN/há)##

Raíz%Tallo%

inferior%Tallo%

superior%

+N

-N

200 kgN/ha

0 kgN/ha

Campo Extracción

de ADN endofítico

Análisis por DGGE de la estructura y diversidad de la comunidad endofítica y diazotrófica

80.9

81.0

76.4

75.7

71.5

87.8

88.4

78.5

71.6

61.3

88.9

76.1

85.7

66.4

50.7

DGGE 16S

100

80

60

DGGE 16S

Tallo Inferior 3 +N

Tallo Superior 1 +N

Tallo Inferior 1 +N

Tallo Inferior 2 +N

Tallo Superior 3 +N

Tallo Superior 2 +N

Tallo Inferior 1 -N

Tallo Inferior 3 -N

Tallo Superior 1 -N

Tallo Superior 2 -N

Tallo Superior 3 -N

Raíz 1 -N

Raíz 2 -N

Raíz 3 -N

Raíz 1 +N

Raíz 2 +N

Raíz 3 +N

0.0% 16.7% 33.3% 50.0% 66.7% 83.3% 100%

Las comunidades se agrupan según los órganos

Tallo

R

aíz

Dentro de cada órgano: las comunidades se agrupan según el tratamiento +/-N

+N

+N

-N

-N

Tallo

R

aíz

Estructura de la comunidad endofítica (16S ADNr)

94.1

64.1

83.3

80.9

47.5

37.8

95.2

73.5

71.0

66.6

94.1

90.8

51.2

34.7

nifH

10

0

80

60

40

nifH

Tallo Inferior 1 -N

Tallo Inferior 2 -N

Tallo Inferior 3 -N

Tallo Superior 1 -N

Tallo Superior 2 -N

Tallo Superior 3 -N

Raíz 1 -N

Raíz 3 -N

Tallo Superior 1 +N

Tallo Superior 2 +N

Tallo Inferior 3 +N

Tallo Superior 3 +N

Tallo Inferior 1 +N

Raíz 1 +N

Raíz 2 +N

Raíz 3 +N

0.0% 16.7% 33.3% 50.0% 66.7% 83.3% 100%

Estructura de la comunidad endofítica-diazotrófica (nifH)

+N

Tallo

Tallo

Raíz

Raíz

En cada tratamiento (+/-N): las comunidades se agrupan según los órganos (51,2 y 37,8%)

-N

Tallo

inferio

r Tallo

su

perio

r

Parcela –N: las comunidades se agrupan de acuerdo al tallo inferior/superior

-N

Las comunidades se agrupan según el tratamiento +/-N

+N

-N

Se debe considerar la fertilización química a la hora de modular el microbioma asociado con el fin de

obtener el efecto benéfico a través de la inoculación bacteriana

Perspectivas

• Profundizar en los ensayos de promoción del crecimiento vegetal:

• en diferentes sistemas (invernáculo, campo) • evaluar un amplio número de bacterias (diazótrofas) • estudiar la estabiliadad del inóculo a lo largo del tiempo • determinar cual es el mecanismo PCV

• Evaluar el efecto de la fertilización química nitrogenada:

• en la promoción del crecimiento vegetal • en microbioma asociado a sorgo dulce • en la expresión de genes específicos (funcionalidad)

Taulé-Barlocco et.al., en preparación

Formación de recursos humanos

Producción científica

• Mareque, C., C. Taulé, M. Beracochea and F. Battistoni. 2014. Isolation, characterization and plant growth promotion effects of putative bacterial endophytes associated with sweet sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench). Annals of Microbiology. DOI 10.1007/s13213-014-0951-7.

• Mareque,C. Freitas,T., Estebanez Vollú,R., Seldin,L., Beracochea, M. and F. Battistoni. The chemical N-fertilization affects the structure and the composition of the endophytic-bacterial community associated with sweet sorghum (Sorghum bicolor), under field conditions. En evaluación.

• Congresos nacionales (7) • Congresos internacionales (3)

• 2011-2014: Cintia Mareque. Tesis de Maestría en Ciencias Biológicas, PEDECIBA. Apoyo ANII. “Producción sustentable en el cultivo de sorgo dulce: búsqueda de bacterias promotoras del crecimiento vegetal asociadas a Sorghum bicolor (L) Monech para su futura aplicación biotecnológica”.

• 2013-2014: Gabriela Heijo. Tesina de Grado. Facultad de Ciencias-UdelaR. Apoyo ANII. “Construcción y caracterización de una colección de probables endófitos diazótrofos nativos asociada a la variedad M81E de sorgo dulce (Sorghum bicolor)”

Cecilia Taulé: Estudiante de Doctorado Cintia Mareque: Estudiante de Doctorado Martín Beracochea: Estudiante de Maestría Gabriela Heijo: Estudiante de Maestria María Cecilia de los Santos: Estudiante de Grado Enzo Ferrari: Estudiante de Grado Margarita Sicardi (Facultad de Ciencias) Fernando Hackembruch (ALUR) Darío Rodriguez (ALUR) Alicia Castillo (INIA) Claudia Barlocco (INIA) Verónica Reis (EMBRAPA-Agrobiología, BR) Fabio Olivares (UENF-LBCT, BR) Euan James (The James Hutton Institute. UK) Lucy Seldin (Instituto de Microbiología, UFRJ, BR)