ESTUDIO DE LA REMOCIÓN VÍA MICROBIANA DE Ni Y V …

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA

Y TECNOLOGÍA AVANZADA

UNIDAD QUERÉTARO

POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA

ESTUDIO DE LA REMOCIÓN VÍA MICROBIANA

DE Ni Y V PRESENTES EN CATALIZADORES GASTADOS

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA

P R E S E N T A

Q.F.B. WENDY THELMA RODRÍGUEZ LUNA

SANTIAGO DE QUERÉTARO, QRO. JUNIO 2009

AGRADECIMIENTOS

Gracias a Dios, por dar sentido a mi vida y ser mi fortaleza para lograr este reto,

Gracias mamá Thelma, gracias papá Antonio por su inmenso amor, apoyo y formación

que dirige cada uno de mis pasos, pero sobre todo por creer siempre en mí,

Gracias hermanos Flor, Omar y Marcy por ayudarme siempre con tanto cariño,

Gracias Omarcito; porque tu oportuna sonrisa alegró mi corazón como nadie,

Gracias a mi familia, tíos y primos, siempre pendientes de mí,

Gracias amigas, Griselda Rivera y Sagrario Hernández por su amistad, su tiempo y ayuda

incondicional dentro y fuera del centro,

Gracias a mis amigos y compañeros Diana Cruz, Vicente De León, Giovanna Palos, Juan

de Dios Alvarado, Carlos Saucedo, Gabriel Villeda, Ricardo Durán, Jesús Pichardo,

Ricardo Montes, Angel Figueroa entre otros; por su valiosa ayuda en cada

caprichoso momento que fue necesaria, así como la inolvidable convivencia,

Gracias a mis amigos de siempre Gamaliel, Liliana, Alberto, Paty y Sergio por animarme

y nunca cansarse de mi humilde amistad,

Gracias a todas esas personas especiales que me brindaron tanto cariño y apoyo,

Gracias a todo el personal de CICATA-QUERÉTARO, como la Maestra Paty Mendoza,

Alejandra Ramírez, Víctor Reséndiz, Juanita Nieves, Araceli Vargas, Lucina De La

Paz, Alicia Anaya, Maestro Reydezel Torres, Maestra Lourdes Valencia que, mas

allá de hacer su trabajo siempre atendieron mi causa de inmejorable manera,

Gracias a la Maestra Regina Hernández por su amable participación en este trabajo, y

Gracias Doctora Norma Rojas por su enorme paciencia al guiar este proyecto y por

compartir conmigo enseñanza y valores que me acompañarán toda la vida.

A todos ustedes, de corazón muchas gracias.

Dedicatoria

Papás, esta tesis es para ustedes.

Financiamiento

Esta tesis de maestría contó con el financiamiento de la Secretaría de Investigación y

Posgrado (SIP) del IPN, de los proyectos con clave: 20070222 y 20080294; así mismo,

con el apoyo por parte de CONCYTEG con el proyecto clave: GTO-2006-C01-27738.

Índice general

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ ii ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................... iii RESUMEN .......................................................................................................................... iv ABSTRACT ......................................................................................................................... v 1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1

1.1 ANTECEDENTES ................................................................................................ 2 1.1.1 Problemática de la contaminación por metales .............................................. 2 1.1.2 Fuentes de contaminación por metales ........................................................... 4 1.1.3 Transporte de metales en el ambiente ............................................................. 5 1.1.4 Catalizadores gastados .................................................................................... 7 1.1.5 Toxicidad de metales pesados ........................................................................ 8 1.1.6 Impacto ambiental .......................................................................................... 9 1.1.7 Tecnologías de tratamiento y reciclado de catalizadores gastados ............... 10 1.1.8 Situación actual de tratamiento de catalizadores gastados ........................... 16

1.2 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 16 1.3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 18

1.3.1 General ......................................................................................................... 18 1.3.2 Particulares ................................................................................................... 18

2 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 19 2.1 Etapa I: Caracterización de muestras ambientales ............................................... 19

2.1.1 Determinación de pH de las muestras ambientales ...................................... 20 2.1.2 Determinación de humedad de las muestras sólidas .................................... 20 2.1.3 Determinación de textura.............................................................................. 20 2.1.4 Determinación de conductividad eléctrica ................................................... 20 2.1.5 Determinación de metales ............................................................................ 20 2.1.6 Determinación de coliformes totales y fecales ............................................. 21 2.1.7 Determinación de bacterias totales ............................................................... 21 2.1.8 Determinación de hongos totales .................................................................. 21 2.1.9 Determinación de bacterias acidófilas .......................................................... 22 2.1.10 Cultivo de enriquecimiento .......................................................................... 22 2.1.11 Aislamiento de microorganismos de interés ................................................. 23 2.1.12 Características macroscópicas de los aislados obtenidos ............................. 23 2.1.13 Características microscópicas de los aislados obtenidos .............................. 23

2.2 Etapa 2: Evaluación del crecimiento de los aislados y remoción de metales en cultivo sólido .................................................................................................................. 23

2.2.1 Crecimiento de los aislados en placas de PHG-II en ausencia de metal ...... 24 2.2.2 Crecimiento de aislados en placas de PHG-II en presencia de metal ........... 24 2.2.3 Revelado de la remoción del metal alrededor de la colonia ......................... 25 2.2.4 Selección de los aislados con base en la remoción del metal ....................... 25

2.3 Etapa 3: Cinéticas de crecimiento de los aislados seleccionados ........................ 26 2.3.1 Preparación de inóculo ................................................................................. 26 2.3.2 Cinética de crecimiento de los aislados ........................................................ 26

2.4 Etapa 4: Evaluación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) ................... 27 2.5 Etapa 5: Evaluación de la remoción del metal en cultivo líquido ....................... 28

2.5.1 Determinación de proteína mediante el método Bradford............................ 28

i

Índice general

i

2.6 Etapa 6: Cinética de remoción de vanadio contenido en catalizador gastado ..... 29 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 30

3.1 Caracterización de muestras ambientales ............................................................ 30 3.1.1 Parámetros físicos y químicos de las muestras ambientales......................... 30 3.1.2 Parámetros microbiológicos de las muestras ambientales ............................ 31 3.1.3 Contenido de metales en las muestras ambientales ...................................... 32 3.1.4 Microorganismos obtenidos a partir de las muestras ambientales .............. 33 3.1.5 Características micro y macroscópicas de los aislados obtenidos ................ 34

3.2 Evaluación de crecimiento y remoción de metales por aislados en cultivo sólido 36 3.2.1 Crecimiento de aislados en medios de cultivo sin metal .............................. 36 3.2.2 Evaluación del crecimiento de los aislados a diferentes concentraciones de los metales en estudio. ................................................................................................ 37 3.2.3 Remoción de los metales alrededor de la colonia (formación de halo) ........ 39

3.3 Cinéticas de crecimiento de los aislados seleccionados ...................................... 41 3.4 Evaluación de la concentración mínima inhibitoria del V sobre el crecimiento de los aislados A1, A3 y A6 ................................................................................................ 43 3.5 Evaluación de la remoción del metal en cultivo líquido ...................................... 46 3.6 Estudio del crecimiento de los aislados y remoción de vanadio contenido en el catalizador gastado ......................................................................................................... 48

3.6.1 Cinéticas de crecimiento y determinación de proteína ................................. 48 3.6.2 Remoción de metal V en cultivo líquido ...................................................... 56

4 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 63 5 RECOMENDACIONES ............................................................................................ 65 6 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 66

Índice de figuras

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Diferentes mecanismos de transporte de metales................................................... 5 Figura 2 Distribución natural de los metales en agua, suelo y aire. ..................................... 6 Figura 3 Fotografías del catalizador gastado utilizado durante el presente estudio. ......... 19 Figura 4 Segunda etapa de desarrollo del proyecto de investigación. ................................ 24 Figura 5 Tercera etapa del desarrollo del proyecto de investigación. ................................ 26 Figura 6 Cinéticas de crecimiento de los aislados A1, A3 y A6 a 30ºC y 120 rpm. .......... 42 Figura 7 Cinética de crecimiento de los aislados A13 y A18 a 30ºC y 120 rpm................ 42 Figura 8 Determinación de la concentración mínima inhibitoria del metal V para el aislado

A1 a 30ºC y 120 rpm. .......................................................................................... 44 Figura 9 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de vanadio para el aislado

A3 a 30ºC a 120 rpm. ........................................................................................... 45 Figura 10 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de vanadio para el

aislado A6 a 30ºC a 120 rpm. ............................................................................... 45 Figura 11 Cinéticas de crecimiento del aislado A1 en medio PHG-II en ausencia y

presencia de catalizador. A) Sin catalizador, B) 194 mg catalizador/L, (17 mg V/L) y C) 388.8 mg catalizador/L (34 mg V/L). ................................................. 50

Figura 12 Cinéticas de crecimiento para el aislado A3 en ausencia y presencia de catalizador gastado. A) Sin catalizador, B) 9.7 mg V/L (111 mg catalizador/L) y C) 19.5 mg V/L (222 mg catalizador/L). .............................................................. 53

Figura 13 Cinéticas de crecimiento para el aislado A6 en ausencia y presencia de catalizador gastado. A) Sin catalizador, B) 17 mg V/L (194 mg catalizador/L) y C) 34 mg V/L (388.8 mg catalizador/L). .............................................................. 55

Figura 14 Remoción de vanadio en µg /L por el aislado A1 a: A) 194 mg/L (17 mg V/L) y B) 388.8 mg catalizador/L (34 mg V/L). .............................................................. 58

Figura 15 Remoción de vanadio en µg /L por el aislado A3 a: A) 111 mg/L (9.7 mg V/L) y B) 222 mg catalizador/L (19.5 mg V/L). .............................................................. 59

Figura 16 Remoción de vanadio en µg V/L por el aislado A6 a: A) 194 mg/L (17 mg V/L) y B) 388.8 mg/L (34 mg V/L). ............................................................................. 61

ii

Índice de tablas

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Principales vías de exposición de algunos metales. ................................................ 6 Tabla 2 Estudios reportados que involucran la participación de microorganismos y los

mecanismos de interacción empleados para la remoción de algunos metales. .... 15 Tabla 3 Composición del medio PHG-II. ........................................................................... 22 Tabla 4 Concentración de los metales en placas de PGH-II, para evaluar crecimiento y

remoción de metales. ............................................................................................ 24 Tabla 5 Concentraciones de metal del sistema de matraces para la determinación de la

concentración mínima inhibitoria. ........................................................................ 27 Tabla 6 Cantidad de catalizador gastado para la cinética de remoción. ............................. 29 Tabla 7 Parámetros físicos y químicos realizados a las muestras ambientales. ................. 30 Tabla 8 Parámetros microbiológicos de las muestras ambientales..................................... 32 Tabla 9 Contenido de metales presentes en las muestras ambientales y en el catalizador

gastado (mg/g). ..................................................................................................... 33 Tabla 10 Aislados obtenidos de las muestras ambientales, metal utilizado en el cultivo y

codificación. ......................................................................................................... 34 Tabla 11 Características micro y macroscópicas de los aislados obtenidos. ...................... 35 Tabla 12 Crecimiento de aislados en medios de cultivo en ausencia de metal. ................. 37 Tabla 13 Crecimiento de aislados a diferentes concentraciones de metal(es). ................... 38 Tabla 14 Diámetro promedio del halo (cm) formado alrededor de las colonias a diferentes

concentraciones del metal. ................................................................................... 40 Tabla 15 Acumulación de V por la biomasa de los aislados A1, A3 y A6. ....................... 47

iii

Resumen

RESUMEN

Durante las operaciones de refinación de petróleo se utiliza una gran cantidad de catalizadores, los cuales después de perder su actividad por envenenamiento con metales, principalmente níquel y vanadio, son desechados y dispuestos en sitios de confinamiento. Sin embargo, ésta disposición representa un problema ambiental debido al riesgo que implica una potencial lixiviación de estos materiales y que por consiguiente alcance aguas subterráneas y finalmente a los organismos vivos. Existen muchos ecosistemas donde coexisten metales y microorganismos, algunos de ellos naturales y otros contaminados por actividades humanas, por tanto, es de esperarse que estos microorganismos cuentan o han desarrollado las capacidades para crecer, tolerar y resistir a estos compuestos. El objetivo del presente trabajo de investigación fue realizar la búsqueda y el aislamiento de microorganismos capaces de tolerar la presencia de los metales níquel y vanadio, para posteriormente ser evaluados por su capacidad de remover a estos metales embebidos en un catalizador gastado. El presente estudio inició con el muestreo y la caracterización física, química y microbiológica de 4 muestras ambientales, 3 jales y 1 muestra de agua. A partir de estas muestras y mediante cultivos de enriquecimiento se aislaron 13 bacterias; 2 a partir del medio adicionado con Ni, 7 del medio con V y 4 del medio adicionado con la mezcla Ni/V. La selección de los microorganismos capaces de remover los metales Ni y V se evaluó en cultivo sólido, encontrando que todos los aislados fueron capaces de crecer y formar halos de remoción del metal(es), teniendo que los aislados A1, A3, A6, A13 y A18 presentaron una mayor relación halo/colonia. A éstos aislados se les evalúo su cinética de crecimiento, descartando en esta etapa a los aislados A13 y A18 por presentar un crecimiento pobre. Una vez seleccionados, a los aislados A1, A3 y A6 se les determinó la concentración mínima inhibitoria, donde se realizó la experimentación evaluando 5 concentraciones de vanadio (5, 20, 35, 50 y 100 mM) durante 72 horas. Los resultados mostraron que la concentración mínima inhibitoria para A1 y A6 correspondió a 50 mM y para A3, 35 mM. En un ensayo preliminar y con el objetivo de conocer algunos parámetros de cultivo de los aislados, se preparó una cinética de crecimiento y de remoción de vanadio por la biomasa durante 72 horas. Los resultados mostraron que el aislado A3 fue el que presentó una mayor remoción del metal con 285.5 µg/g de biomasa, seguido de A6 con 203.1 µg/g y A1 con 177 µg/g. Finalmente, los aislados A1, A3 y A6 fueron cultivados en medio líquido en ausencia y presencia del catalizador a dos concentraciones 194 mg/L (17 mg V/L) y 388 mg/L (34.2 mg V/L) para A1 y A6; y 111 mg/L (9.7 mg V/L) y 222 mg/L (19.5 mg V/L) para A3, a 30°C, 180 rpm durante 60 horas. Los resultados de este experimento demostraron que los tres aislados fueron capaces de remover vanadio del medio; teniendo que a la concentración más baja evaluada (194 mg catalizador/L), el aislado A1 fue el que removió mayor cantidad de metal V a las 36-60 horas, seguido de A6 y A3 a ese mismo tiempo. Para la concentración más alta evaluada (388 mg catalizador/L), el mismo aislado fue el que permitió la mayor remoción a las 36 horas, seguido de A6 y A3. Los resultados del presente trabajo sugieren una potencial aplicación de estos organismos en la remoción de metales, sin embargo se requiere profundizar en el estudio de los mecanismos involucrados en la remoción con el fin de encontrar los parámetros de cultivo más adecuados.

iv

Abstract

ABSTRACT

During oil refining activities a great amount of catalysts are used, which, once their activity is degraded potential due to metal poisoning, mainly by metals such as nickel and vanadium, are removed and disposed in special confinement sites. However, this disposal represents a serious environmental problem due to the potential risk of leaching of these materials (metals), which could reach the groundwater and eventually affect live organisms. There are many ecosystems where metals and microorganisms, coexist some of them natural and others arising from human activities it is likely that microorganisms in these systems have developed the abilities to growth, tolerate, and resist these inorganic compounds. The aim of the present study was to seek search and isolate microorganisms able to tolerate the metals nickel and vanadium, to afterwards be evaluated for their ability to remove metals contained in a spent catalyst. The present study began with the sampling and the physical, chemical, and microbial characterization of environmental samples, three mining wastes and one from mining water, from these samples and by means of enrichment cultures, we succeeded in obtaining 13 bacterial strains; 2 from media added with Ni, 7 from media added with V and 4 more from media added with the metal mixture of Ni/V. Microbial growth and metal removal were evaluated in solid culture; the results showed that all isolates were able to grow and form clear removal haloes on the plates. Isolates A1, A3, A6, A13, and A18 presented the highest halo/colony diameter ratios. The growth kinetics of the isolates showed that A13 and A18 presented scarce growth; they therefore eliminated for further studies. The assay of minimum inhibitory concentration for isolates A1, A3, and A6 used five vanadium concentrations (5, 20, 35, 50, and 100 mM), during 72 hours in liquid culture. In this assay, A1 and A6 showed a minimum inhibitory concentration of 50 mM, and A3 of 35 mM. As a preliminary assay and in order to determine some culture parameters of the isolates, the kinetics of growth and of removal of vanadium by biomass was followed over 72 hours. The results were that isolate A3 showed the highest metal removal, 285.5 µg/g, followed by A6 with 203.1 µg/g and A1 with 177 µg/g. Finally, the isolates A1, A3, and A6 were cultured in liquid media in the absence and presence of the catalyst at two concentrations 194 mg/L (17 mg V/L) and 388 mg/L (34.2 mg V/L) for A1 and A6; and 111 mg/L (9.7 mg V/L) and 222 mg/L (19.5 mg V/L) for A3, at 30°C and 180 rpm during 60 hours. Results of this experimentation showed that the three isolates were able to remove vanadium from the media, that for low catalyst concentration (194 mg/L) and 36-60 hours, isolate A1 was the best vanadium remover, followed by A6 and A3, while, for high catalyst concentration (388 mg/L) isolate A1 again achieved the highest vanadium removal, but during the first 36 hours, followed by A6 and A3. The results of the present study suggest a potential application of these microorganisms in metal removal; however, more studies about the mechanisms involved in the metal removal are needed, in order to define the optimal culture parameters and to enhance even more the metal removal, even further.

v

Introducción

1 INTRODUCCIÓN

En México, la industria del petróleo tiene gran importancia debido a que permite

generar a través de diversos procesos de transformación, productos de alto valor como son

los combustibles, lubricantes, ceras, solventes y derivados petroquímicos. La venta del

petróleo representa el 11% del producto interno bruto del país así como el 40% de la

recaudación de impuestos del Gobierno Federal (Tomado de: http://www.pemex.com).

Dentro de los procesos de transformación del petróleo, la destilación es un proceso

fundamental durante la refinación del petróleo, la cual permite hacer una separación de los

hidrocarburos aprovechando sus diferentes puntos de ebullición. El primer proceso que

aparece en una refinería es la destilación atmosférica y al vacío.

Mediante la desintegración o craqueo, el petróleo se separa de manera que la distribución

inicial de componentes moleculares de petróleo se recorre a una composición con mayor

representación de moléculas pequeñas dando origen a los productos principales que se

venden en el mercado: el gas LP (utilizado en estufas domésticas), gasolina para los

automóviles, turbosina para los aviones jet, gas-avión para los helicópteros, diesel para los

vehículos pesados y combustóleo para el calentamiento en operaciones industriales.

La mayoría de los procesos químicos que participan en la industria de la refinación del

petróleo se basan en el uso de catalizadores, cuyo papel es el de acelerar las reacciones

deseadas que no serían posibles en ausencia de catalizador.

Los catalizadores tienen por finalidad modificar la velocidad de las reacciones,

permitiendo así su aplicación industrial en condiciones económicamente atractivas, y

además modifican selectivamente las velocidades de las reacciones favoreciendo la

reacción, para así asegurar una mayor conversión de los reactivos y que el rendimiento de

los productos deseados sea satisfactorio.

Durante la refinación, el crudo pasa por un proceso de hidrotratamiento, el cual tiene como

objetivo estabilizar catalíticamente los petrolíferos, además de eliminar los componentes

contaminantes que contienen, haciéndolos reaccionar con hidrógeno a temperaturas en el

1

http://www.pemex.com/

Introducción

rango de 315ºC a 430ºC, a presiones que varían de 7 a 210 kg/cm2, en presencia de

catalizadores diversos cuya composición puede estar representada por óxidos de cobalto y

molibdeno sobre alúmina (los más usados), así como el óxido o el tiomolibdato de níquel,

sulfuros de tungsteno y níquel y óxido de vanadio (Riviello). Al estar en contacto con el

crudo, los catalizadores se van ensuciando de tal manera, que su vida útil va disminuyendo

hasta saturar el catalizador de metales, dejándolos sin posibilidad de participar

activamente en el proceso de hidrotratamiento. En tales condiciones, estos catalizadores

(denominados ahora “gastados” o “agotados”), deben disponerse al ambiente, lo cual

representa un grave problema al ecosistema y un potencial riesgo a la salud de la

población en general, ya que los catalizadores tienen adheridos metales que pueden

movilizarse en el sitio y conectarse con cuerpos de agua y alcanzar a los organismos vivos.

De lo anterior, surge la necesidad de buscar alternativas de tratamiento que tengan como

finalidad reciclar estos materiales o bien darles un tratamiento para disponerse de manera

segura. Una de ellas podría ser el uso de microorganismos capaces de remover metales

presentes en los catalizadores.

1.1 ANTECEDENTES

1.1.1 Problemática de la contaminación por metales

La contaminación del suelo consiste en una degradación química que provoca la

pérdida parcial o total de la productividad del suelo como consecuencia de la acumulación

de sustancias tóxicas en concentraciones que superan el poder de amortiguamiento natural

del suelo y que modifican negativamente sus propiedades (Macías, 1993). Esta

acumulación se realiza generalmente como consecuencia de las actividades humanas y se

denomina exógena, aunque también se puede producir de forma natural o endógena

cuando los procesos de edafización (formación de suelo) liberan elementos químicos

contenidos en las rocas y los concentran en el suelo alcanzándose niveles tóxicos.

Un ejemplo de esto último lo tenemos en suelos muy evolucionados formados sobre rocas

serpentinizadas con altos contenidos en metales pesados como el Cr, Ni, Cu y Mn, entre

otros, que se concentran en los suelos a medida que la intensa edafogénesis produce el

lavado de otros constituyentes esenciales como el Ca, Mg e incluso el Si. Conforme se

2

Introducción

desarrolla esta concentración metálica residual, estos elementos, que inicialmente eran

constituyentes no asimilables de los minerales primarios, pasan a formas más activas,

solubles y biodisponibles que influyen negativamente sobre la actividad biológica

(Macías, 1993).

De acuerdo con la Unidad de Soporte Administrativo de Pemex-Refinación, durante 2005

la paraestatal contrató los servicios de las corporaciones Qmax, Quimo-Tech de México,

Ecoltec y Arquitectura del Medio Ambiente, entre otras, para que sacaran de sus

instalaciones por lo menos 10,000 toneladas de catalizadores gastados. Actualmente, las

firmas japonesas Sumitomo Corp y Koseico están interesadas en comprarle a la compañía

Ecología Laboratorios y Consultores de México (Ecolab) 24,000 toneladas que se

encuentran en la zona industrial de Irapuato, Guanajuato, por 2.5 mdd (Ortiz-Ruíz, 2006).

En México, existe además la preocupación de que a partir del 2009, el uso de catalizadores

para el proceso de hidrodesulfuración, cuando menos, se triplicará, debido a que las

normas internacionales exigirán a nuestro país una mejor calidad en los combustibles

como el diesel y las gasolinas. Para cumplir con estos compromisos internacionales,

PEMEX se verá obligado a emplear una mayor cantidad de catalizadores en los procesos

de hidrodesulfuración, en el cual se combina al azufre con hidrógeno para formar ácido

sulfhídrico y así retirarlo del hidrocarburo (Ortíz-Ruíz, 2006).

La gran cantidad de catalizadores gastados que pierden efectividad obligan a la industria a

consumir más catalizador generando un círculo vicioso de consumo y contaminación. Los

catalizadores gastados son ya un gran negocio en países como China, Estados Unidos,

Japón, Corea, Rusia y Singapur, ya que, recuperar 1 lb de catalizador gastado cuesta 2

dólares y lo pueden vender hasta en 4 dólares, así que lo pueden recuperar como materia

prima para después venderla a diversas industrias como la acerera, petroquímica y

electroquímica. Y aunque México genera estos materiales; todo parece indicar que llegará

tarde a este prometedor negocio, el cual no sólo abriría la puerta a más fuentes de empleo

sino que ayudaría a terminar con los pasivos ambientales. (Ortiz-Ruíz, 2006).

3

Introducción

1.1.2 Fuentes de contaminación por metales

Entre las fuentes más importantes de contaminación por metales se encuentran, las

cenizas y escorias de los procesos de combustión de carbón fósil o derivados del petróleo,

el aporte directo procedente de actividades agrícolas (adición de fertilizantes, pesticidas,

lodos de depuradoras, composta, etc.) y su acumulación a partir de residuos industriales,

urbanos y mineros (metalurgia, fabricación de pinturas, barnices, disolventes, baterías,

textiles, curtidos, etc.) (Ortiz-Ruiz, 2006). Una vez que el elemento llega al suelo, éste

puede seguir diversas vías en el mismo.

La exposición ambiental al níquel ocurre por la inhalación, la ingestión, y el contacto con

la piel. La población en general se expone a los niveles bajos de níquel al estar presente en

el aire, el agua, el alimento y productos de consumo. La población general toma la mayor

parte de níquel por el alimento, con un promedio de ingesta diaria en alimentos (en los

Estados Unidos) estimado de 150-168 µg. Mientras que, por agua potable y aire las

cantidades son 2 µg y 0.1-1 µg, respectivamente. En general, la población también está

expuesta al níquel en aleaciones de níquel y materiales niquelados como monedas, acero, y

la joyería, y el níquel residual puede encontrarse en jabones, grasas, y aceites (ATSDR,

1997).

Por otra parte, el vanadio se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y sistemas

biológicos y cuenta como uno de los elementos traza presentes en combustibles de tipo

fósil y su combustión representa la más importante fuente de vanadio en el ambiente,

principalmente en el agua de consumo (Rodríguez-Mercado & Altamirano-Lozano, 2006).

También se conoce su participación en la síntesis de clorofila para los organismos

fotosintéticos y es un micronutriente para diversas especies marinas y terrestres, aunque

no se ha confirmado el requerimiento de este metal para el humano, se considera que de

ser necesario, la ingesta aproximada de dicho metal sería de 15 µg por día (Langerkvist et

al., 1986; EFSA, 2004).

4

Introducción

1.1.3 Transporte de metales en el ambiente

El ingreso de metales en las cadenas tróficas puede tener lugar mediante la

absorción por las plantas o el lavado hacia las aguas freáticas en las que su solubilidad es

muy importante (Figura 1). Otra forma de abandonar el suelo es la volatilización, medio

por el cual vuelve al aire.

Figura 1 Diferentes mecanismos de transporte de metales.

Una vez solubles en el suelo, los metales pueden migrar o pueden ser retenidos. La

principal forma de contención de metales en el suelo es su fijación en forma de

compuestos complejos, ya que la mayor parte tiene un carácter catiónico; esta vía es de

doble dirección y está regulada por la concentración relativa en la solución, el tamaño del

ión, la hidratación del mismo y la carga. Una forma más activa de inmovilización es la

precipitación del metal en forma de hidróxido o de sal poco soluble, esto puede dar lugar a

la formación de minerales secundarios de menor solubilidad que las formas libres previas;

en suelos no contaminados esta formación de minerales secundarios es muy pequeña o

nula pero en suelos contaminados es importante.

En la Tabla 1 se presentan las principales vías de exposición a algunos metales, con los

cuales tiene contacto el ser humano.

5

Introducción

Tabla 1 Principales vías de exposición de algunos metales.

METAL APLICACIÓN VIA DE EXPOSICIÓN Hg Plaguicidas y baños de

disoluciones ácidas para retirar el óxido de algunas piezas.

Entra en forma de vapores inhalados, afecta al sistema nervioso.

Pb Baterías, vidrio, minería, fabricación de cables, fundiciones e imprentas.

Entra por alimentos contaminados y vía respiratoria.

Ni Presente en aleaciones, cuero, cemento, manija de puertas.

La entrada es por contacto con la piel, puede causar cáncer de pulmón y sinusitis.

Cr En material de construcción.

Entra por vía respiratoria al organismo, puede causar malformaciones congénitas a hijos de madres expuestas.

As Presente en productos insecticidas, plaguicidas y algunos colorantes.

La entrada es por vía respiratoria y adsorción en ojos, puede causar daño en sistema nervioso y puede producir cáncer de piel.

V Como cubierta de barras radiactivas, elemento de aleación, catalizador

Irrita la piel y mucosas, es un tóxico sanguíneo (anemia), hepático y renal, causa bronquitis y neumonía.

(Modificado de: http://www.oit.org/public/spanish/protection/safework/cis/products/safetytm/introduc.htm y

http://www.fastonline.org/CD3WD_40/HDLHTML/ENVMANL/ES/VOL348.HTM#VANADIO)

En la Figura 2 se muestra cómo a partir de las emisiones de contaminantes, las cuales

pueden provenir de automóviles, industria, volcanes, etc., los metales presentes en dichas

emisiones, pueden movilizarse a la atmósfera y dirigirse hacia los sistemas terrestres que

se conectan con ríos y lagos, los cuales van a dar finalmente a los océanos.

EMISIÓN

SISTEMAS TERRESTRES (rocas-minas)

ATMÓSFERA

Figura 2 Distribución natural de los metales en agua, suelo y aire.

(Tomado de: http://www.estrucplan.com.ar/Producciones/entrega.asp?IDEntrega=883)

RÍOS LAGOS

ESTUARIOS

SEDIMENTOS

OCÉANOS

irrigación

lluvia

metal

6

http://www.oit.org/public/spanish/protection/safework/cis/products/safetytm/introduc.htm

http://www.fastonline.org/CD3WD_40/HDLHTML/ENVMANL/ES/VOL348.HTM#VANADIO

http://www.estrucplan.com.ar/Producciones/entrega.asp?IDEntrega=883

Introducción

1.1.4 Catalizadores gastados

Los catalizadores son sustancias a base de sílica-alúmina que contienen metales

como V, Ni, Mo, W, Fe, Al, Co, At y Si así como también al azufre (Aung & Ting, 2005;

Torres et al., 2001) y se emplean durante los procesos de refinación de petróleo y

petroquímica para eliminar compuestos indeseables presentes en el crudo, los cuales dañan

los sistemas de las plantas de procesamiento de petróleo con el paso del tiempo y tipo de

proceso.

Los catalizadores van saturándose de los compuestos que eliminan del crudo y van

perdiendo actividad, es entonces que reciben el nombre de catalizador gastado, por lo que

deben ser desechados y sustituidos por nuevos.

En México, el catalizador gastado es aprovechado como parte del material para

construcción en plantas cementeras (Tomado de:

http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/libros/35/tratamiento.html). Al incorporar el

catalizador al proceso en su inicio, no se altera la calidad del producto por tener la misma

composición que una de las materias primas del cemento, actuando como un material

puzolánico muy activo, capaz de combinar el hidróxido cálcico (portlandita) liberado en la

hidratación del cemento Portland y formar compuestos de carácter hidráulico, produciendo

un aumento adicional en la resistencia mecánica del mortero y del hormigón que lo

contienen (Borrachero et al., 2002).

Para la industria petrolera, el mayor problema es la presencia de los metales Ni y V, ya

que estos metales son los que se encuentran en mayor proporción en los catalizadores

gastados (Torres et al., 2001). Dichos metales causan problemas en las superficies de las

maquinarias con las que tienen contacto. Por otra parte, los metales Ni y V tienen valor

comercial en el mercado y son utilizados por una gran cantidad de industrias, como por

ejemplo la automotriz.

7

http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/libros/35/tratamiento.html

Introducción

1.1.5 Toxicidad de metales pesados

Los metales son especies químicas persistentes en el ambiente, por lo que, una vez

presentes en el ambiente sólo pueden distribuirse entre los entornos aire, agua y suelo, a

veces cambiando su estado de oxidación, o bien incorporándose a los seres vivos. Los

procesos de adsorción y la formación de complejos en medios naturales son responsables

de que la mayor parte de los vestigios de metales pesados se acumulen en los sólidos en

suspensión, incorporándose rápidamente a los sedimentos, donde se presentan los mayores

niveles de concentración de estos contaminantes.

Aunque existen metales conocidos como oligoelementos, que son necesarios para una

célula viva, el exceso de ellos resulta dañino a la misma; es entonces cuando los metales

en cantidades mayores a las habituales pasan a ser considerados como metales tóxicos.

La NOM-001-ECOL-1996 considera como metales pesados a As, Cd, Cu, Cr, Hg, Ni, Pb

y Zn, entendiendo como tal a aquellos elementos químicos que poseen un peso atómico

comprendido entre 63.55 g/mol (Cu) y 200.59 g/mol (Hg), y que presentan un peso

específico superior a 4 g/cm3. Cabe destacar que en esta categoría entran prácticamente

todos los elementos metálicos de interés económico, por tanto, de interés minero.

La toxicidad de los metales pesados es muy alta respecto a los metales en general. Su

acción directa sobre los seres vivos ocurre a través del bloqueo de las actividades

biológicas, es decir, la inactivación enzimática por la formación de enlaces entre los iones

metálicos correspondientes y los grupos –SH (sulfidrilos) de las proteínas, causando daños

irreversibles en los diferentes organismos (Vullo, 2003).

Para que los metales pesados puedan ejercer su toxicidad sobre un ser vivo, éstos deben

encontrarse disponibles para ser captados, es decir el metal debe estar biodisponible, lo

cual dependerá de las condiciones fisicoquímicas del ambiente, que determinan también la

especiación. Por ello es fundamental, al determinar el grado de contaminación por metales

pesados de un ambiente, conocer su biodisponibilidad, es decir, la concentración de metal

libre y lábil (metal libre más metal disociado de un complejo) presente en la muestra

(Vullo, 2003).

8

Introducción

En estudios ambientales, la definición de metal pesado se amplía a todos aquellos

elementos metálicos o metaloides que aparecen comúnmente asociados a problemas de

contaminación y se encuentran en el grupo de elementos de PM 63.5 a 200.6 g/mol una

distribución electrónica similar en su capa externa (Rainbow, 1993). Algunos de ellos son

esenciales para los organismos en pequeñas cantidades (ppm o trazas), como el Zn, Mn,

Cu, Co los cuales participan en activación de metaloenzimas, como proteínas de estrés,

transporte de oxígeno, actividades redox, entre otras funciones en las células en los

organismos vivos; mientras que otros como el Cd, Hg Ni, Cr, Al, As o Pb, no desempeñan

ninguna función biológica conocida y resultan altamente tóxicos según su concentración y

el tiempo de exposición (Morton, 2006). Estos elementos tienen su origen en el substrato

litológico, apareciendo tanto como elementos nativos o incorporados normalmente en las

estructuras de sulfuros, silicatos, carbonatos, óxidos e hidróxidos. Los aportes dominantes

se producen por deposición atmosférica que afectan de forma significativa los primeros

centímetros de suelo.

Las pruebas disponibles, han mostrado que el níquel metálico tiene propiedades

cancerígenas adquiridas debido a la lenta disolución del metal en el cuerpo con lo cual se

libera el níquel iónico, considerado como un genotóxico activo causante de cáncer. Sin

embargo, se desconocen los mecanismos por los cuales se ha inducido el cáncer por níquel

a animales en fases experimentales de estudio según el U.S. Department of Health and

Human Services.

Por otro lado, el vanadio en cantidades altas produce diversos efectos e incrementa la lista

de compuestos carcinógenos con propiedades mutagénicas y genotóxicas (Hartwig, 1995;

Bal & Kasprzak, 2002; IARC, 2006).

1.1.6 Impacto ambiental

En México, la industria química utiliza una cantidad importante de catalizadores,

los cuales una vez utilizados son dispuestos directamente al ambiente sobre grandes

extensiones de suelo, en el cual, por medio de diversos mecanismos puede provocar la

movilización de los metales ahí contenidos a algún acuífero o efluente y de ahí distribuirse

en los cuerpos de agua disponibles para todas las formas de vida, por lo que la inadecuada

9

Introducción

disposición de los catalizadores gastados en el ambiente resulta dañina al ambiente y al ser

humano.

Los actuales lineamientos a nivel mundial sobre la emisión de contaminantes son cada vez

más severos con lo cual se incrementa la necesidad de utilizar catalizadores, los cuales al

desactivarse; requieren ser dispuestos de manera segura o tratados para obtener los metales

contenidos en dichos catalizadores. Se pronostica un crecimiento de 3.6% anual en la

demanda de catalizadores a nivel mundial para 2010 (Wierauch, 2007). Tan sólo se tiene

la cifra de 80 000 toneladas por año de catalizador gastado que es tratado para la

recuperación de metales a partir de catalizadores gastados de hidrotratamiento en plantas

instaladas y establecidas como lo son GCMC en Freeport, Texas (EUA), CRI-MET en

Braithwaite, Louisiana (EUA), Taiyo Koko en Japón y Full Yield Inc. en Taiwan (Alonso

et al., 2004).

1.1.7 Tecnologías de tratamiento y reciclado de catalizadores gastados

A nivel internacional existen varias tecnologías para el tratamiento y reciclado de

los catalizadores gastados, las cuales pueden separarse, de acuerdo al agente causante de la

remoción del metal de interés, en químicos y biológicos. A continuación se mencionan

algunas de sus características.

1.1.7.1 Tratamientos químicos

En cuanto a los métodos químicos empleados para recuperar metales de

catalizadores gastados que provienen de la industria petroquímica se encuentra el uso de

C6H6, CS2, etanol, benceno y NaOH, descritos por Torres et al., (2001). En estos

tratamientos existe una gran variación en los porcentajes de recuperación de metales y los

costos de operación y solventes son altos; además, estos tratamientos conllevan un elevado

costo ambiental, por lo que son metodologías poco viables para la resolución del problema

de los catalizadores gastados.

En la búsqueda por reciclar los catalizadores gastados que provienen de las fases de

hidrodesulfuración del crudo, Torres et al., (2001) desarrollaron un método efectivo para

10

Introducción

recuperar vanadio y molibdeno de los catalizadores gastados. Este método consiste en un

ajuste del sistema a pH 8 con NaOH como condición conducente a la lixiviación, este

método logró extraer vanadio en un 88% y molibdeno en un 92%. A pesar de ser esta

investigación una gran contribución en la extracción de metales, el proceso implica la

utilización de cantidades importantes de NaOH con lo cual se agrega costo al proceso así

como más contaminación al desechar el solvente.

Actualmente, Egipto se considera un país líder en materia de petróleo y para la limpieza

del mismo utiliza grandes cantidades de catalizador. Entre los métodos más utilizados en

aquel país para el rejuvenecimiento de los catalizadores agotados así como para la

recuperación de metales se encuentra la reactivación del catalizador Mo-Ni/Al2O3 gastado

empleando hidrógeno también utilizado en el restablecimiento de los residuos generados

del refinado de aceites lubricantes de la “Alexandria Petroleum Company”. Para el uso del

catalizador en otras reacciones o la recuperación de metales se llevan a cabo tratamientos a

base de lixiviaciones selectivas con ácido oxálico al 4% junto con H2O2 al 5%, esto hace

más eficiente la lixiviación al facilitar la disolución y extracción de metales como Mo, Ni

y Al (Menoufy & Ahmed, 2008).

1.1.7.2 Tratamientos biológicos

Todas las interacciones entre los microorganismos y los metales u otros elementos

como C, N, S y P son componentes fundamentales de los ciclos biogeoquímicos. El

conocimiento de estas interacciones puede ser aprovechado para planear estrategias con el

objeto de remover diversos metales presentes en algunos materiales.

A continuación se describen los mecanismos involucrados en la movilización e

inmovilización microbiana de metales:

1.1.7.3 Mecanismo de movilización de metales

En la industria minera, la movilización de metales es el mecanismo que se utiliza

ampliamente para solubilizar los metales presentes en las rocas por medio de la acción

microbiana. Dicha movilización se denomina biolixiviación.

11

Introducción

Biolixiviación. Mediante biolixiviación los metales presentes en los minerales son

extraídos en fase acuosa, con ello se recuperan los metales a partir de materiales sólidos

contaminados como suelos, cenizas resultantes de la quema de desechos, sedimentos

acuáticos, etc. Puede llevarse a cabo en condiciones aerobias o anaerobias, así como en

ambientes ácidos o alcalinos (Vullo, 2003). Un ejemplo de este mecanismo son la

biolixiviación de los metales Co, Ni, Zn y Cd por la oxidación de las menas de Cu2S

(calcocita) a CuSO4 por medio las bacterias Thiobacillus ferrooxidans oxidantes de hierro

y Thiobacillus thiooxidans oxidantes de sulfuros (Brombacher et al., 1998).

1.1.7.4 Mecanismos de inmovilización de metales

Dentro de la diversidad microbiana, existen microorganismos resistentes y

tolerantes a metales. Los resistentes se caracterizan por poseer mecanismos de

detoxificación codificados genéticamente, inducidos por la presencia del metal. En

cambio, los microorganismos tolerantes son indiferentes a la presencia o ausencia del

metal.

Las interacciones entre las bacterias y los metales son conocidas y pueden ocurrir a nivel

extracelular, en la superficie o en el interior de la célula.

A nivel extracelular, se ha estudiado: a) el papel de los microorganismos en la

movilización e inmovilización de los metales (Chen et al., 1995; Ford & Ryan, 1995); y b)

la secreción de compuestos orgánicos (sideróforos) de bajo peso molecular (Schwyn &

Neilands, 1987; Lindsay & Riley, 1994).

Tanto los microorganismos resistentes como los tolerantes son de interés como captores de

metales en sitios contaminados, debido a que ambos pueden extraer los contaminantes, lo

cual es posible debido a la acción de diferentes mecanismos: biosorción, bioacumulación,

biomineralización, biotransformación y quimiosorción mediada por microorganismos. A

continuación se presenta una breve descripción de estos mecanismos:

Biosorción. Los microorganismos utilizados como biosorbentes, aislados a partir de

ecosistemas contaminados, retienen los metales pesados a intervalos de tiempo

12

Introducción

relativamente cortos al entrar en contacto con soluciones de dichos metales. Este

mecanismo se caracteriza por la retención del metal mediante una interacción

fisicoquímica del metal con ligandos pertenecientes a la superficie celular.

En términos generales, la biosorción de los metales a distintas partes de la célula

microbiana puede ocurrir por uno o más de los siguientes procesos: complejación,

coordinación, intercambio iónico, adsorción y micro precipitación de sales inorgánicas o

metales (Cotoras, 1995). Almaguer et al., (2006) reportaron la biosorción de Pb2+ por la

biomasa inmovilizada del alga Chlorella sp. en una columna empacada.

Bioacumulación. Este mecanismo involucra un sistema de transporte de membrana que

internaliza al metal presente en el entorno celular implicando un gasto de energía, a través

del sistema H+-ATPasa. Una vez incorporado el metal al citoplasma, es secuestrado por

metalotioninas o compartamentalizado dentro de vacuolas. Hernández et al., (1998)

reportaron que Anabaena cylindrica es una alga que puede bioacumular Ni.

Biomineralización. Los microorganismos son capaces de precipitar metales en forma de

carbonatos e hidróxidos, mediante un mecanismo de resistencia codificado en plásmidos.

Este mecanismo obedece al funcionamiento de una bomba que expulsa el metal tóxico,

presente en el citoplasma, hacía el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+

hacia el interior celular, lo cual produce una alcalinización localizada sobre la superficie

celular externa y por lo tanto la precipitación del metal. Un ejemplo de este mecanismo ha

sido reportado para la precipitación de V por Geobacter metallireducens (Ortíz-Bernard

et al., 2004).

Biotransformación. Este proceso involucra un cambio químico en el metal pesado, por

ejemplo en el estado de oxidación o metilación, por enzimas microbianas, que producen

compuestos insolubles en agua o volátiles. El ejemplo más claro en la naturaleza es el

ciclo del mercurio, donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el catión

Hg2+ a Hg0 (Vullo, 2003).

Quimiosorción mediada por microorganismos. Dentro de este término se describen

aquella clase de reacciones en donde los microorganismos biomineralizan un metal,

formando un depósito primario, que funciona como núcleo de cristalización con la

13

Introducción

14

subsecuente deposición del metal de interés, promoviendo y acelerando así el mecanismo

de mineralización.

En la tabla 2 se resumen algunos de los estudios realizados en esta área del conocimiento,

donde se muestran los mecanismos de interacción entre microorganismos y metales.

Introducción

Tabla 2 Estudios reportados que involucran la participación de microorganismos y los mecanismos de interacción empleados para la remoción de

algunos metales.

MICROORGANISMO

METAL MECANISMO FUENTE

Bacillus sp. Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, U, Zn Biosorción Cañizares-Villanueva, 2001

Desulfotomaculum sp Zn, Cd, Cu, Fe Biomineralización Cañizares-Villanueva, 2001 Pseudomonas aeruginosa Pb, Cu - Cañizares-Villanueva, 2001 Rhizopus arrhizus Pb, Cu - Cañizares-Villanueva, 2001 Aspergillus niger Ni, V, Al, Sb, Fe Biolixiviación Aung & Ting, 2005

Thiobacillus caldus Ni, Cu, Zn Biolixiviación Semenza et al., 2000

Geobacter metallireducens V, U Biomineralización Ortíz-Bernard et al., 2004

Escherichia hermanii V - Hernández et al., 1998 Enterobacter cloacae V - Hernández et al., 1998 Anabaena cylindrica Ni Bioacumulación Hernández et al., 1998 Thiobacillus ferrooxidans Fe Biolixiviación Bacelar-Nicolau & Johnson, 1999 Thiobacillus ferroxidans y Cu Biolixiviación Madigan et al., 2000 Thiobacillus thiooxidans Thiobacillus ferroxidans y Cu, Ni, Zn, Cd Biolixiviación Brombacher et al., 1998 Thiobacillus thiooxidans

Trichoderma harzianum MnO2, Fe2O3 y Zn metálico, sulfatos metálicos

Biolixiviación y quimiosorción en el caso del sulfato Clarke et al., 1987

15

Introducción

1.1.8 Situación actual de tratamiento de catalizadores gastados

Actualmente el tratamiento de diversos materiales con alto contenido metálico o

que presentan contaminación por metales es limitado. Aunque existe literatura que hace

mención sobre el uso potencial de bacterias, hongos y especies vegetales para la

recuperación de metales a partir de dichos materiales existe muy poca información al

respecto.

En la literatura se encontró una patente que hace referencia al uso de una bacteria

desnitrificante capaz de liberar metales (Mo y Ni) a partir de catalizadores gastados

(USP5250483). Otros reportes y quizá los más, hacen mención sobre el uso de ácidos

orgánicos de hongos para el tratamiento de dichos materiales. Santhiya & Ting (2005)

aprovecharon la producción del ácido oxálico excretado por Aspergillus niger (1%

peso/volumen de densidad de biomasa) durante 60 días para remover Al, Ni y Mo en

54.5%, 58.2% y 82.3% respectivamente. Aung & Ting (2005), lograron una mejor

lixiviación de metales (Al, Ni, V, Sb y Fe) presentes en catalizador al utilizar los ácidos

orgánicos (cítrico, oxálico y glucónico) producidos por Aspergillus niger que cuando se

utilizaron los ácidos alílico, cítrico, glucónico, nítrico y sulfúrico.

Con base en la literatura disponible y considerando la capacidad metabólica que han

desarrollado ciertos microorganismos por estar presentes en sitios contaminados con

especies metálicas es que se propone el presente estudio, a fin de dar una alternativa al

tratamiento de dichos materiales.

1.2 JUSTIFICACIÓN

La industria petrolera genera grandes cantidades de desechos, provenientes de los

procesos catalíticos que se utilizan en la refinación del petróleo. En nuestro país, el

consumo de los catalizadores para este giro es cercano a 243 mil toneladas por año (Torres

et al., 2001).

16

Introducción

Durante los procesos de refinación, los catalizadores se van saturando de compuestos e

iones metálicos reduciendo así su eficiencia. En algunos casos, los catalizadores son

tratados químicamente con detergentes y solventes para disminuir la cantidad de

sustancias adheridas a su superficie, para posteriormente ser dispuestos al ambiente.

PEMEX reportó en su inventario anual 2001, la generación de 90 668 toneladas de

residuos peligrosos, donde tan sólo la refinería de Tula generó 4 342 toneladas de

catalizadores gastados (PEMEX, 2001).

A nivel internacional existen muy pocos reportes con respecto al tratamiento de los

catalizadores gastados, debido probablemente a que el tema sólo ahora comienza a tomar

importancia por cuestiones ambientales.

El peligro que representan los catalizadores gastados para la salud, radica en su alto

contenido de metales, los cuales pueden ser altamente tóxicos para los seres vivos. Si éstos

no son dispuestos o tratados de manera adecuada se corre el riesgo de que los metales se

dispersen y contaminen cualquier ecosistema.

Los estudios sobre remoción de metales en el ambiente son de gran importancia en

términos de contaminación debido a sus efectos tóxicos sobre los organismos vivos.

Específicamente, las bacterias han sido objeto de numerosos estudios por su participación

en los ciclos biogeoquímicos de los elementos esenciales para la vida (C, N, P y S) y por

su capacidad de transformar compuestos no esenciales, que eventualmente pueden

representar una amenaza para el ambiente. También se han estudiado a los hongos como

activos agentes lixiviantes frente a diversos metales, sin embargo los estudios referentes a

la remoción de Ni y V presentes en catalizadores tanto con bacterias y hongos son muy

escasos (Aung & Ting, 2005; Santhiya & Ting, 2005).

En nuestro país no existen empresas que cuenten con la tecnología para llevar a cabo

procesos de reutilización de esta basura y de recuperación de metales, los cuales han

tenido un incremento considerable en su precio en el mercado internacional.

17

Introducción

18

Con base en lo antes expuesto, es necesaria la búsqueda de soluciones de bajo impacto

ambiental para que los catalizadores gastados puedan ser tratados, reutilizados o bien

pueda realizarse una disposición segura.

HIPÓTESIS

Si en el ambiente existen microorganismos resistentes a metales, entonces estos

microorganismos pueden emplearse en el tratamiento a catalizadores gastados.

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 General

Obtener microorganismos que sean capaces de remover Ni y V presentes en catalizadores

gastados.

1.3.2 Particulares

• Caracterización físico-química de las muestras ambientales y del catalizador

gastado.

• Aislamiento de microorganismos provenientes de muestras ambientales en medios

selectivos.

• Selección de microorganismos que presenten la mayor capacidad de tolerancia y

resistencia a diferentes concentraciones de Ni, V o Ni-V en cultivo líquido y

sólido.

• Evaluación de la cinética de crecimiento y de remoción de metales de los

microorganismos seleccionados.

• Evaluación del crecimiento y remoción de metales de interés, por los aislados

seleccionados, en presencia del catalizador gastado.

Materiales y métodos

2 MATERIALES Y MÉTODOS

En este capítulo se presentan los métodos por medio de los cuales se realizaron las

determinaciones y experimentos del presente estudio, así como los materiales utilizados

para la realización del mismo.

En la Figura 3 se muestran dos fotografías del catalizador gastado, el cual fue

proporcionado por el Dr. Jorge Ancheyta del Instituto Mexicano del Petróleo.

Nota: La escala está dada en centímetros.

Figura 3 Fotografías del catalizador gastado utilizado durante el presente estudio.

2.1 Etapa I: Caracterización de muestras ambientales

La primera etapa consistió en la caracterización física, química y microbiológica de

las muestras ambientales, así como el aislamiento de la biota nativa presente. Las muestras

ambientales fueron obtenidas de zonas mineras, localizadas en la ciudad de Guanajuato,

Gto., México. Las muestras fueron codificadas como W1, W2, W3 y W4.

La muestra sólida W1 se tomó de residuos de excavación de mina, conocidos como jales

mineros de la mina La Valenciana, las muestras sólidas W2 y W3 fueron tomadas de dos

diferentes puntos del jale de la mina de San Felipe. La muestra líquida W4, se obtuvo del

Río Guanajuato (el manantial del río), efluente en el cual descargan minas cercanas.

Dependiendo de su naturaleza las muestras fueron sometidas a todos o algunos de los

siguientes análisis.

19


2.1.1 Determinación de pH de las muestras ambientales

El pH de cada muestra de jale fue medido en una suspensión de 5 g de muestra

sólida en 10 mL de agua destilada a 25ºC, utilizando un potenciómetro. El pH de la

muestra líquida se midió inmediatamente con el potenciómetro utilizando un volumen de

10 mL.

2.1.2 Determinación de humedad de las muestras sólidas

Esta determinación se llevó a cabo mediante el método gravimétrico secando en

horno a una temperatura de 100ºC utilizando 1 g de la muestra sólida.

2.1.3 Determinación de textura

Esta determinación solamente se realizó a la muestra W1, perteneciente a la mina

La Valenciana, debido a su aspecto semejante a un suelo. Se utilizaron 100 g de muestra

sólida y el método empleado fue el de la pipeta según NOM-021-SEMARNAT-2000.

2.1.4 Determinación de conductividad eléctrica

La conductividad eléctrica de cada muestra de jale se midió en una suspensión de

40 g de muestra sólida adicionada con 30 mL de agua a 24ºC, después de pasadas 24 horas

de la muestra, esta suspensión se leyó con ayuda de un equipo marca CONDUCTRONIC

modelo pH120. INDICAR TIEMPOS

2.1.5 Determinación de metales

La determinación de metales tanto de las muestras ambientales como del

catalizador gastado, se realizó por espectrometría (ICP-OES) en un equipo marca Varian,

modelo 730-ES, para lo cual se requirió la preparación de la muestras, las cuales fueron

digeridas en medio ácido, siguiendo el método EPA 3050B. Se utilizó 1 g y/o 1 mL de

muestra en la digestión con ácido nítrico (10%) y clorhídrico concentrado. El método se

20


basa en una disolución en ácido fuerte, que disuelve casi todos los materiales presentes en

la muestra. En cada una de las muestras se analizaron los siguientes materiales As, Ca,

Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Li, Mg, Mn, Mo, Ni, Pb, Sb, Se, Sr, Ti, Tl, U, V y Zn. Cabe

mencionar que en el presente trabajo, dicho método sirvió para lograr la disolución

completa de los metales.

2.1.6 Determinación de coliformes totales y fecales

Esta determinación se realizó por el método del número más probable (NMP) a la

muestra de agua, utilizando tubos adicionados con 0.1, 1 y 10 ml de muestra en caldo

lactosado (peptona de gelatina 5 g/L, extracto de carne 3 g/L y lactosa 5g/L) e incubando a

37ºC de 24 a 48 horas. La turbidez en el tubo fue indicativo de prueba positiva,

posteriormente los tubos positivos se tomaron para inocular los siguientes tubos

conteniendo caldo verde bilis brillante con una campana Durham y se incubaron dejando

un ejemplar a 37ºC y el duplicado a 44ºC; la prueba positiva fue la formación de burbujas

dentro de la campana.

2.1.7 Determinación de bacterias totales

La determinación de bacterias totales se realizó por el método de dilución en placa.

Se agregó un gramo de suelo (ó 1 mL de muestra líquida) a un matraz con solución salina

0.85%, se tomó 1 mL y se agregó a un tubo con 9 ml de solución salina el cual se agitó en

vórtex y se continuaron las diluciones seriadas hasta 1X10-6. De cada tubo se tomó una

alícuota de 0.1 mL para inocular en caja de agar nutritivo, por duplicado. El procedimiento

se realizó en campana de flujo laminar. Las condiciones de incubación fueron 30ºC por 24

por 48 horas.

2.1.8 Determinación de hongos totales

La determinación de hongos totales se realizó por el método de dilución en placa

utilizando agar papa dextrosa como medio de cultivo, al cual se le adicionó estreptomicina

y se ajustó el pH del mismo a 4.9 (con HCl diluido) con un potenciómetro.

21


2.1.9 Determinación de bacterias acidófilas

La determinación se realizó utilizando agar nutritivo adicionado con rojo de metilo

(0.5%) como indicador de pH e inoculando 1 mL de la dilución 10-2 de cada muestra. Las

placas se incubaron a 30ºC por 24 horas. La prueba positiva fue la observación de un

cambio en el pH de básico a ácido en el medio, lo anterior se observa con un cambio en la

coloración del medio de cultivo de amarillo a rojo.

2.1.10 Cultivo de enriquecimiento

Se prepararon 4 cultivos de enriquecimiento, tres a partir de las muestras de jale y

una más a partir de la muestra de agua. Cada cultivo de enriquecimiento se preparó

utilizando tres diferentes concentraciones de metales; 3 mM de Ni, 1 mM de V y 3/1 mM

de Ni/V, teniendo así un total de 12 sistemas (cultivos de enriquecimiento). Se utilizaron

las sales metálicas metavanadato de sodio (NaVO3) y nitrato de níquel (Ni(NO3)2).

Los cultivos de enriquecimiento se prepararon en matraces de 125 mL con 40 mL de

medio PHG-II (cuya composición se describe en la Tabla 3) y solución patrón de los

metales de interés, a las concentraciones antes mencionadas. Cabe indicar que los

matraces con el medio de cultivo fueron esterilizados a 15 lb/in2, 15 minutos. Las

soluciones metálicas se esterilizaron por filtración con una membrana de 0.2 µm. Cada

uno de los matraces fue inoculado con una de las 4 muestras ambientales utilizando 1 g y

1 mL de muestra como inóculo. Cada 4-6 días se realizaron pases de cada uno de los

cultivos de enriquecimiento (1 mL) a medios frescos cuya preparación y composición fue

igual al medio anterior.

Tabla 3 Composición del medio PHG-II.

COMPONENTE g/L

Peptona de caseína 4

Glucosa 2

Extracto de levadura 1

Agar (en el caso de cultivo sólido) 17

22


2.1.11 Aislamiento de microorganismos de interés

A partir de los cultivos de enriquecimiento, se tomaron muestras (100 µL) y se

inocularon en placas de Petri conteniendo medio PHG-II sólido conteniendo el metal o

metales de origen del cultivo e incubando por 24 horas a 30°C. A partir de colonias bien

separadas y de morfología diferente se procedió a realizar el aislamiento mediante estría

cruzada en placa.

2.1.12 Características macroscópicas de los aislados obtenidos

Se preparó medio de cultivo PHG-II sólido con la misma concentración de metal

de origen, cada uno de los aislados obtenidos se inoculó en las placas y se incubó a 30°C

por 24 horas. Después de este periodo se realizó la observación de las características

morfológicas como color, textura, borde, diámetro.

2.1.13 Características microscópicas de los aislados obtenidos

A partir de las mismas cajas preparadas para la observación de las características

macroscópicas, se prepararon tinciones Gram para cada uno de los aislados y se realizó la

observación de las características morfológicas y de tinción en microscopio utilizando el

objetivo 100x.

2.2 Etapa 2: Evaluación del crecimiento de los aislados y remoción de metales en

cultivo sólido

La segunda etapa consistió en evaluar el crecimiento de los microorganismos

aislados en presencia de los metales en estudio, para posteriormente evidenciar la

remoción de metales mediante una técnica de revelado en placa. Este experimento se

realizó evaluando 3 concentraciones de metales. En la Figura 4 se esquematizan las

actividades consideradas en esta etapa.

23


Figura 4 Segunda etapa de desarrollo del proyecto de investigación.

A continuación se detalla cada uno de las actividades realizadas en esta etapa.

2.2.1 Crecimiento de los aislados en placas de PHG-II en ausencia de metal

Se prepararon placas de medio PHG-II en ausencia de metal, las cuales fueron

inoculadas con cada uno de los aislados por punción y por triplicado, para posteriormente

incubarlas a 30°C por 24 horas. Pasado este tiempo, se midió el diámetro (en cm) de

crecimiento de las colonias.

El crecimiento de los aislados en ausencia del metal(es) se consideró como sistema

control.

2.2.2 Crecimiento de aislados en placas de PHG-II en presencia de metal

Se prepararon placas de PHG-II adicionadas con metal(es) a tres diferentes

concentraciones, como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4 Concentración de los metales en placas de PGH-II, para evaluar crecimiento y

remoción de metales.

CONCENTRACIÓN

METAL(ES) mM (mg/L)

Ni V Ni/V

Baja 3 mM (176) 1 mM (50.9) 3/1 mM (176/50.9)

Media 5 mM (293) 3 mM (152.7) 5/3 mM (293/152.7)

Alta 7 mM (410) 5 mM (254.5) 7/5 mM (410/254.5)

Revelado de la ausencia de

metales alrededor de la colonia

Selección de aislados de acuerdo a su crecimiento y halo de remoción

Crecimiento de aislados en

placas de medio PHG-II

con metal

24


Cada una de las placas con medio de cultivo PHG-II se inoculó por punción con el aislado

a evaluar, posteriormente las placas se incubaron a 30ºC por 24 horas y posteriormente se

midió el diámetro (cm) de las colonias.

2.2.3 Revelado de la remoción del metal alrededor de la colonia

Esta determinación se realizó utilizando las placas con crecimiento obtenidas en la

sección inmediata anterior (sección 2.2.2).

Para realizar la prueba del revelado, se prepararon dos soluciones, una de HCl al 5% y la

otra de Na2S al 5% (Pümpel et al., 1995). Bajo campana de extracción se colocaron las

placas de PHG-II obtenidas en el apartado 2.2.2 y sobre la tapa de la placa invertida, se

colocaron 2 mL de la solución preparada de HCl, enseguida 2 mL de la solución preparada

de Na2S. Los reactivos se pusieron en contacto con movimientos orbitales suaves sobre el

firme de la campana, inmediatamente se colocaron por encima las placas que contenían el

medio PHG-II con crecimiento y se dejó reposar dando el tiempo necesario a la reacción

(15 a 120 minutos), hasta observar la formación de un halo alrededor de la colonia

(remoción del metal), posteriormente se procedió a medir el halo transparente formado

(cm) alrededor de las colonias, lo cual es indicativo de la ausencia del metal. Cabe señalar

que el resto del medio se tornó obscuro, lo cual es indicativo de la precipitación de la sal

metálica formada.

2.2.4 Selección de los aislados con base en la remoción del metal

Con la finalidad de continuar solamente con aquellos aislados capaces de remover

el metal, observado como formación de halo (prueba presuntiva de remoción de metal), se

consideraron los siguientes parámetros: diámetro de la colonia (crecimiento), diámetro del

halo formado alrededor de la misma después del revelado y tiempo de crecimiento de los

aislados en el medio PHG-II en presencia del metal a las diferentes concentraciones

evaluadas.

Una vez seleccionados los aislados, se procedió a evaluar su cinética de crecimiento.

25


2.3 Etapa 3: Cinéticas de crecimiento de los aislados seleccionados

Habiendo seleccionado los aislados, se procedió a conocer su curva de crecimiento;

en la Figura 5 se resumen los pasos de esta etapa.

Figura 5 Tercera etapa del desarrollo del proyecto de investigación.

Sistema de matraces para determinar su crecimiento

Preparación del inóculo o

matraz semilla

Lectura de densidad óptica

de muestras

A continuación se detalla cada uno de los pasos de la etapa.

2.3.1 Preparación de inóculo

Se prepararon placas de medio PHG-II con la concentración de metal

correspondiente y se inoculó el aislado por estría en placa, ésta se incubó a 30°C por 24

horas. De este cultivo se tomó una asada de la colonia y se depositó en un tubo

conteniendo 10 mL de solución salina (NaCl a 0.85%). Esta solución fue comparada con

el estándar de Mc Farland.

A partir del tubo de inóculo, se tomaron 100 µL y se colocaron en el “matraz semilla” de

125 mL de capacidad, conteniendo 40 mL de medio PHG-II y 1 mM de V (metavanadato

de sodio). Dicho matraz se mantuvo en incubación en un baño con agitación orbital a 30°C

por 24 horas.

2.3.2 Cinética de crecimiento de los aislados

A partir del matraz semilla, se tomaron 100 µL del cultivo para inocular cada uno de

los matraces de la cinética de crecimiento. Se prepararon 2 series experimentales por cada

uno de los aislados evaluados, a) matraces preparados con medio de cultivo y metal V sin

inóculo y b) matraces con medio de cultivo con metal V más inóculo. Todos los matraces

tienen una capacidad de 125 mL y fueron adicionados con 40 mL de PHG-II líquido

estéril.

26


A partir de la inoculación, los matraces se incubaron en un baño con agitación orbital, a

30°C por 72 horas, tomando muestras (100 µL) cada 6 horas para realizar la evaluación de

crecimiento por absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro Perkin Elmer. En algunos

casos fue necesario completar el volumen con medio PHG-II estéril, sin metal.

Cabe mencionar que siempre se siguió el mismo orden de lectura de las muestras para

evitar que el factor tiempo afectara las mismas.

2.4 Etapa 4: Evaluación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Partiendo de la información obtenida de las cinéticas de crecimiento, se procedió a

determinar la concentración mínima inhibitoria de los aislados seleccionados para el

metal V. Este experimento tuvo como finalidad evaluar el efecto de la concentración del

metal(es) sobre el crecimiento y así poder continuar con el estudio de remoción de metales

en cultivo líquido.

De acuerdo al punto 2.3.1, se realizó nuevamente la preparación del “matraz semilla” de

cada aislado para inocular el sistema de matraces cuyas concentraciones de metal se

observan en la Tabla 5.

Tabla 5 Concentraciones de metal del sistema de matraces para la determinación de la

concentración mínima inhibitoria.

AISLADO CONCENTRACIÓN DE V mM (mg V/L)

A1 0 5 (254.5) 20 (1018) 35 (1781) 50 (2545) 100 (5090)

A3 0 5 (254.5) 20 (1018) 35 (1781 ) 50 (2545) 100 (5090)

A6 0 5 (254.5) 20 (1018) 35 (1781) 50 (2545) 100 (5090)

NOTA. Las concentraciones consideradas en la Tabla 5 fueron seleccionadas de acuerdo con reportes de la

literatura.

Cabe mencionar que cada experimento se realizó por duplicado. Se prepararon blancos

(medio PHG-II sin inóculo) para cada una de las concentraciones de metal. Las lecturas de

crecimiento de los aislados se realizaron de acuerdo al punto 2.3.2.

27


2.5 Etapa 5: Evaluación de la remoción del metal en cultivo líquido

Para esta prueba preliminar de remoción del metal y para cada uno de los aislados,

se preparó material semejante a la cinética de crecimiento descrita en el punto 2.3.2. Se

establecieron sistemas experimentales que comprendieron la preparación de un blanco

para lectura conteniendo únicamente el caldo PHG-II estéril, controles de caldo PHG-II

adicionados con metal, a las concentraciones de 20 y 35 mM. Con estas mismas

concentraciones se prepararon, por duplicado, matraces de 125 mL con 40 mL de caldo

PHG-II, de los cuales se sacrificaron matraces al tiempo cero (0 horas) y tiempo final (72

horas) para cada aislado; separando sobrenadante y biomasa para posteriormente realizar

una digestión ácida de esta última. Posteriormente el digerido se analizó por ICP-EOS (ver

punto 2.1.5) para conocer la concentración del metal en la biomasa. Tanto la cinética de

crecimiento se monitoreó por turbidez como fue descrito en el punto 2.3.2, así como por el

método de Bradford para la determinación de proteína (Bradford, 1976).

2.5.1 Determinación de proteína mediante el método Bradford

El crecimiento de cada uno de los aislados fue evaluado tanto por turbidez o

densidad óptica a 600 nm como mediante la medición de proteína siguiendo el método de

Bradford (1976) para lo cual se utilizaron el Reactivo de Bradford (Sigma) y Albúmina de

suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich) como estándar.

Este método consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul

entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul Coomasie.

La luz absorbe a 595 nm, longitud a la cual se realizaron las lecturas y la intensidad de

absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos. Los valores de

absorbancia se graficaron con respecto al tiempo. La curva estándar se preparó como el

ensayo estándar, de 0-1.4 mg/mL de BSA (siglas en inglés de Albúmina de Suero Bovino)

y para las lecturas se utilizaron 100 µL de muestra diluyendo en caldo PHG-II estéril.

28


29

2.6 Etapa 6: Cinética de remoción de vanadio contenido en catalizador gastado

La preparación de material para los aislados A1, A3 y A6 consistió en inocular cada

uno de ellos en cajas de Petri conteniendo medio de agar PHG-II y la sal de V (1 mM) e

incubando a 30ºC durante 24 horas. De este cultivo, se tomó una asada para disolverla en

un tubo de solución salina (0.85% NaCl) hasta igualarla visualmente, en cuanto a turbidez

con el estándar de 0.5 de Mc Farland. A partir de esta suspensión, se tomó una alícuota de

100 µL, la cual se inoculó en frascos de 60 mL conteniendo 18 mL de caldo PHG-II

adicionado con la cantidad de catalizador gastado (ver Tabla 6). Esto es, se prepararon 3

series experimentales para cada uno de los aislados por duplicado. Después de la

inoculación, los frascos se llevaron a incubar en un baño de agitación a 30ºC y 120 rpm.

Tabla 6 Cantidad de catalizador gastado para la cinética de remoción.

AISLADO CONCENTRACIÓN

mg catalizador/L (mg V/L)

A1 0 194 (17.072) 388 (34.144)

A3 0 111 (9.768) 222 (19.536)

A6 0 194 (17.072) 388 (34.144)

Cada 12 horas se sacrificaron matraces para realizar las determinaciones de crecimiento

(turbidez y proteína) y metales, las cuales fueron descritas en los apartados 2.3.2 y 2.5.1.

Las lecturas de absorbancia (crecimiento) se realizaron en el espectrofotómetro a 600 nm,

tomando una alícuota de 100 µL y diluyendo en 900 µL de caldo PHG-II estéril,

trabajando bajo campana de flujo laminar. Las muestras se retiraron de incubación y se

conservaron a 4°C, posteriormente se separó la biomasa del sobrenadante por

centrifugación a 8000 rpm durante 15 minutos. La pastilla obtenida fue lavada y

centrifugada tres veces con agua desionizada para eliminar el exceso de medio de cultivo.

Finalmente, la pastilla o biomasa fue sometida a digestión para la determinación del

vanadio por ICP-EOS como se describe en la sección 2.1.5.

Resultados y discusión

3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Caracterización de muestras ambientales

3.1.1 Parámetros físicos y químicos de las muestras ambientales

Como se mencionó anteriormente se colectaron un total de 4 muestras, 3

provenientes de jales mineros (W1, W2 y W3) y 1 de agua de río (W4), a partir de estas

muestras se obtuvieron los microorganismos de interés. Dichas muestras fueron sometidas

a diferentes análisis para conocer las características nutricionales y/o ambientales de las

mismas. La Tabla 7 muestra los resultados de la caracterización.

Tabla 7 Parámetros físicos y químicos realizados a las muestras ambientales.

PARÁMETRO MUESTRA

W1 W2 W3 W4

pH 7.6 7.6 7.3 6.2

Humedad (%) 6.6 13.7 17.3 NA

Conductividad eléctrica (dS) 2.7 2.9 3.0 4.2

Carbono total (mg/g) 31.9 38.8 1.2 N.A.

Textura Franco arenoso N.A. N.A. N.A.

N.A. no aplica

Las muestras sólidas provenientes de jales mineros presentaron un pH cercano a la

neutralidad, valor que puede considerarse común para dichos sitios (Juárez, 2004). Por

otro lado, el pH de la muestra líquida es ligeramente ácido. Con base en este parámetro

era posible pensar que se podrían obtener un número importante de microorganismos a

partir de estas muestras debido a que el pH ligeramente ácido permite el crecimiento de la

mayoría de los grupos bacterianos.

El contenido de humedad en las muestras de jales fue muy variable (6.6 a 17.3%), lo cual

se puede deber a las diferentes condiciones ambientales que imperan en un mismo sitio. El

contenido de humedad ideal, para el crecimiento microbiano, de un suelo (muestra sólida)

30


se encuentra alrededor del 20%. Esto se puede relacionar con las muestras W1 y W2, de

las cuales presentaron mayor cantidad de humedad, así como una mayor cantidad de

bacterias totales.

Otro de los parámetros evaluados fue la conductividad específica, cuyo resultado indicó

que las muestras sólidas presentan en promedio un valor de 3.4 dS/cm, siendo que un

suelo sano generalmente presenta alrededor de 0.025 dS/cm, se considera que las muestras

presentan una salinidad elevada ocasionada muy probablemente por el origen de las

mismas (minas) (Rodríguez et al., 2006).

El contenido de carbono total correlaciona con las cuentas bacterianas, ya que las muestras

con mayor contenido de carbono fueron en las que se obtuvo mayor cantidad de bacterias,

pudiendo deberse a que el carbono es un componente básico para la nutrición de los

microorganismos de cualquier ecosistema. El ensayo de textura se realizó únicamente para

la muestra sólida proveniente del jale (W1), el cual presentaba características semejantes a

las de un suelo, el resultado de la prueba indicó que se trata de un suelo franco arenoso.

3.1.2 Parámetros microbiológicos de las muestras ambientales

Para un suelo sano, el conteo microbiano se encuentra alrededor de 8 x108

UFC/gms (gramos de materia seca), así que los valores obtenidos en este estudio y

mostrados en la Tabla 8 resultan satisfactorios sabiendo que el origen y la naturaleza de

las muestras pueden resultar muy estresantes para la gran mayoría de los

microorganismos.

El análisis de coliformes sólo se realizó para la muestra W4; los resultados indicaron que

la cuenta total de coliformes totales fue de ≥ 2400 NMP/100 mL de muestra, lo cual

representa una carga microbiana alta, situación que era de esperarse debido a que el

afluente es un vertedero de desechos de la zona minera; sin embargo, la cuenta de

coliformes fecales, <3 NMP/100 mL, indicó que este sitio no presenta contaminación con

desechos humanos o animales.

31


Tabla 8 Parámetros microbiológicos de las muestras ambientales.

PARÁMETROS MUESTRA

W1 W2 W3 W4

Coliformes totales (NMP/100 mL) N.D. N.D. N.D. ≥ 2400

Coliformes fecales (NMP/100 mL) N.D. N.D. N.D. < 3

Bacterias totales (UFC/gms) 3.06x105 2.8x105 9x104 4.8x107

Bacterias acidófilas (UFC/gms) 2x106 N.D. N.D. N.D.

Hongos totales (UFC/gms) 2x102 5x102 10x102 2x102

N.D. no determinado, gms = gramos de materia seca

Cabe resaltar que el mayor conteo de bacterias totales correspondió a la muestra W4, lo

cual pudiera deberse a que la muestra es acuosa y dicha condición es más propicia para el

desarrollo bacteriano.

Así también, de las muestras sólidas, las muestras W1 y W2 presentaron las cuentas más

altas de bacterias totales con un promedio de 3x105 UFC/gms, lo cual, coincide con los

valores elevados de carbono total presente en estas muestras. La cuenta de bacterias

acidófilas para la muestra W1 es cercana a la de un suelo sano, lo que indica que las

condiciones de dicha muestra son favorables para su desarrollo. Este tipo de bacterias se

reconocen por su capacidad de lixiviar algunos metales, condición que no fue evaluada en

este trabajo.

La cuenta de hongos totales fue baja para todas las muestras lo cual pudiera deberse a que

los hongos demandan mejores condiciones en el ambiente para desarrollarse y por lo tanto

encuentran limitaciones en estos sitios que podrían impedir su sobrevivencia.

3.1.3 Contenido de metales en las muestras ambientales

El contenido de metales para las muestras ambientales (W1, W2, W3 y W4) y la

muestra de catalizador gastado (W5), se resume en la Tabla 9. Es de resaltar la presencia

de los metales Ni y V en la mayoría de las muestras, con excepción de la muestra W4. Lo

anterior es un resultado importante, debido a que los organismos a obtener estaban en

presencia de dichos metales.

32


Por otro lado, se observa que las concentraciones de los metales en la muestra W5

(catalizador gastado) fueron 21.7 mg de Ni/g muestra y 88 mg de V/g muestra. El

resultado anterior era de esperarse porque dichos metales son los responsables de la

desactivación o envenenamiento del catalizador.

Tabla 9 Contenido de metales presentes en las muestras ambientales y en el catalizador

gastado (mg/g).

METAL W1 W2 W3 W4* W5 Co N.D. N.D. N.D. 0 0 Cr 25.30 4.90 6.10 0 0 Cu 6.70 4.40 0.60 0 0 Ca 0 0 0 97.21 0 Fe 0.40 0.20 0.60 0 2.40 Li 5.90 15.00 9.50 0 0 Mg N.D. N.D. N.D. 35.35 0.70 Mn N.D. N.D. N.D. 0 0 Mo N.D. N.D. N.D. 0 23.60 Ni 11.90 1.90 2.20 0 21.70 Pb 2.70 4.90 1.20 0 0 Sb 0.50 2.40 1.10 0 0 Se 0.10 0.10 0.10 0 0 Sr N.D. N.D. N.D. 0.55 0 Ti N.D. N.D. N.D. 0 0 Tl N.D. N.D. N.D. 0 0 V 21.80 6.60 13.50 0 88.00 Zn 14.40 7.20 5.80 0 0 As 0.20 0.20 0.30 0 N.D. Cd 0.10 0 0 0 N.D. U 0.10 0 0.10 0 N.D.

N.D. no determinado *Unidades para la muestra W4 (mg/mL)

3.1.4 Microorganismos obtenidos a partir de las muestras ambientales

A partir de las muestras ambientales, tanto de las sólidas como de la muestra

líquida, se lograron obtener los aislados que se listan en la Tabla 10, donde se presenta

también el número de aislados obtenidos a partir de los diferentes cultivos de

enriquecimiento, los cuales fueron preparados con las sales de V, Ni y la mezcla Ni/V.

Como se observa en la Tabla 10, el cultivo de enriquecimiento adicionado con Ni (3 mM)

permitió la obtención de dos aislados, correspondientes a las muestras W2 y W4; mientras

33


que el cultivo en presencia de V (1 mM) permitió la obtención de 7 aislados, provenientes

de todas las muestras. Del cultivo adicionado con la mezcla de los metales Ni y V (3/1

mM respectivamente) se obtuvieron cuatro aislados, resultado importante debido a que el

mayor interés del presente trabajo era obtener aislados capaces de crecer en presencia de

ambos metales, condición deseable para crecer en presencia del catalizador agotado.

Tabla 10 Aislados obtenidos de las muestras ambientales, metal utilizado en el cultivo y

codificación.

MUESTRA DE

PROCEDENCIA

METAL*

(concentración mM)

CÓDIGO DEL

AISLADO

W1

Ni (3 mM) -

V (1 mM) A1, A2, A3

Ni/V (3/1 mM) A13

W2

Ni (3 mM) A11

V (1 mM) A4, A5

Ni/V (3/1 mM) A16

W3

Ni (3 mM) -

V (1 mM) A6

Ni/V (3/1 mM) A17, A18

W4

Ni (3 mM) A12

V (1 mM) A8

Ni/V (3/1 mM) -

*Se refiere a los diferentes cultivos de enriquecimiento que fueron adicionados con el metal(es), esto es, Ni

(3 mM) significa que los aislados provienen del cultivo de enriquecimiento adicionado con Ni al 3 mM.

(-) no se obtuvo ningún microorganismo.

En el presente trabajo se obtuvo un mayor número de aislados a partir del cultivo de

enriquecimiento adicionado con V, siete en total, y un menor número para la mezcla Ni/V

y Ni.

3.1.5 Características micro y macroscópicas de los aislados obtenidos

De acuerdo a la morfología microscópica observada y la cual se presenta en la

Tabla 11, se puede resumir que todos los aislados encontrados fueron bacilos Gram (-), lo

34


cual correlaciona con otros reportes. Gallego et al., (2003) mencionan una mayor

frecuencia de bacilos Gram (-) en ambientes contaminados con metales, predominando los

géneros de Pseudomonas, Alcalígenes y Agrobacterium. Sin embargo, algunos otros

reportes mencionan a ciertos microorganismos Gram (+) como habitantes comunes de

estos ambientes, entre los que sobresalen los pertenecientes a los géneros

Corynebacterium y Arthrobacter (Marguesin & Schinner, 1997). Lo anterior permite

concluir que ambas morfologías pueden encontrarse en ambientes contaminados con

metales, dominando en nuestro estudio los Gram (-).

Tabla 11 Características micro y macroscópicas de los aislados obtenidos.

AISLADO DESCRIPCIÓN MORFOLOGÍA COLONIAL

A1 bacilo G (-) Blanca, mucosa, bordes lisos, Ө 0.2 cm.

A2 bacilo G (-) Blanca, mucosa, translúcida, Ө 0.4 cm.

A3 bacilo G (-) Blanca, cremosa, puntiforme, Ө 0.15 cm.

A4 bacilo G (-) Blanca, cremosa, brillante, bordes lisos, Ө 0.15 cm.

A5 bacilo G (-) Blanca, opaca, húmeda, extendida, bordes

irregulares. Ө 0.4 cm.

A6 bacilo G (-) Ámbar, transparente, mucosa, extendida, bordes

irregulares, Ө 0.6 cm.

A8 bacilo G (-) Amarilla, mucosa, húmeda, bordes lisos, Ө 0.5 cm.

A11 bacilo G (-) Rosa, opaca, cremosa, bordes lisos, Ө 0.3 cm.

A12 bacilo G (-) Blanca, cremosa, puntiforme, Ө 0.1 cm.

A13 bacilo G (-) Amarilla pálido, húmeda, bordes lisos, Ө 0.3 cm.

A16 bacilo G (-) Amarilla, cremosa, bordes lisos, Ө 0.5 cm.

A17 bacilo G (-) Blanca/amarilla, cremosa, húmeda, bordes lisos,

Ө 0.5 cm.

A18 bacilo G (-) Amarilla, opaca, cremosa, bordes lisos, Ө 1.0 cm.

Adicionalmente, se puede decir que la morfología colonial observada en los aislados

obtenidos evidencía una gran diversidad en las características de las colonias, lo cual

permite sugerir que se trata de microorganismos distintos.

35


36

3.2 Evaluación de crecimiento y remoción de metales por aislados en cultivo sólido

3.2.1 Crecimiento de aislados en medios de cultivo sin metal

En la Tabla 12, se observan los datos de crecimiento (cm) de los aislados en dos

medios de cultivo; agar nutritivo y PHG-II sólido, ambos sin adición del metal.

Como se puede observar en la Tabla 12, el crecimiento de los diferentes aislados fue

mayor en agar nutritivo que el crecimiento observado en el medio PHG-II. Siendo A2 (5

veces mayor) y A4 (3 veces mayor). En general, se observa que el crecimiento de los

microorganismos se ve favorecido en el agar nutritivo, especialmente las cepas A2 y A5

presentan el mayor crecimiento (1.06 y 1.53 respectivamente) que el resto de los aislados.

La excepción fue el aislado A16 a quien favoreció el medio PHG-II. A pesar de los

resultados obtenidos, no se encontró una relación entre crecimiento y medio de cultivo,

por lo cual se considera que el crecimiento observado en los medios de cultivo evaluados

depende fuertemente del microorganismo.

Cabe mencionar que a pesar de los resultados observados en la Tabla 12, el medio PHG-II

fue seleccionado para continuar con los estudios, debido a la necesidad de comparar

nuestros resultados con la literatura disponible, aunque es importante señalar que en este

ensayo no se adicionó metal, por lo que pudiéramos estar hablando de sistemas o

condiciones de crecimiento completamente diferentes.


Tabla 12 Crecimiento de aislados en medios de cultivo en ausencia de metal.

AISLADOS

Diámetro promedio de la colonia (cm)

Medios de cultivo evaluados

PHG-II AGAR NUTRITIVO

A1 0.25 ± 0.00 0.46 ± 0.06

A2 0.20 ± 0.00 1.06 ± 0.06 A3 0.43 ± 0.03 0.53 ± 0.06

A4 0.33 ± 0.03 0.86 ± 0.06

A5 0.70 ± 0.00 1.53 ± 0.03

A6 0.36 ± 0.03 0.45 ± 0.00

A8 0.30 ± 0.00 0.50 ± 0.00

A11 0.26 ± 0.03 0.43 ± 0.03

A12 0.25 ± 0.00 0.45 ± 0.00

A13 0.38 ± 0.03 0.43 ± 0.03

A16 0.48 ± 0.03 0.41 ± 0.03

A17 0.30 ± 0.00 0.38 ± 0.03

A18 0.20 ± 0.00 0.50 ± 0.00

NOTA: Cada valor es el promedio ± DS del ensayo realizado por triplicado.

3.2.2 Evaluación del crecimiento de los aislados a diferentes concentraciones de los

metales en estudio.

El objetivo del presente ensayo fue obtener una evaluación del crecimiento, en

centímetros, de las colonias desarrolladas por los aislados a las diferentes concentraciones

de metal(es). En la Tabla 13 se presentan los resultados obtenidos. Cabe indicar que los

aislados fueron evaluados únicamente con el metal con el cual fueron seleccionados y

aislados (ver Tabla 10).

37


Tabla 13 Crecimiento de aislados a diferentes concentraciones de metal(es).

METAL AISLADO Diámetro promedio de colonia (cm)

Concentraciones de metal evaluadas

V

1 mM 3 mM 5 mM

A1 0.65±0.05 0.62 ±0.03 0.55 ±0.05

A2 0.92 ±0.10 0.70 ±0.05 0.55 ±0.05

A3 0.45 ±0.00 0.47 ±0.03 0.50 ±0.00

A4 0.63 ±0.03 0.57 ±0.06 0.57 ±0.03

A5 1.30 ±0.00 1.30 ±0.00 1.00 ±0.00

A6 0.48 ±0.10 0.50 ±0.00 0.48 ±0.03

A8 0.42 ±0.03 0.45 ±0.00 0.40 ±0.00

3 mM 5 mM 7 mM

Ni A11 0.47 ±0.03 - -

A12 0.40 ±0.00 - -

3/1 mM 5/3 mM 7/5 mM

Ni/V

A13 0.53 ±0.06 0.33 ±0.06 0.38 ±0.13

A16 0.30 ±0.03 - -

A17 0.32 ±0.03 0.30 ±0.00 0.20 ±0.00

A18 0.68 ±0.03 0.47 ±0.06 0.47 ±0.03

NOTA: Cada valor es el promedio ± DS del ensayo realizado por triplicado. (-) no hubo crecimiento

Para el grupo de V (microorganismos seleccionados y aislados con la sal de vanadio), se

observó que el mayor crecimiento correspondió a los aislados A2 y A5, con el

inconveniente de comenzar a partir de las 16 horas de la inoculación, siendo que el resto

de los aislados iniciaron su crecimiento a partir de las 8 horas. El crecimiento de los

aislados A1, A2, A4, A13, A16, A17 y A18 fue mayor en 1 mM de V que en las

concentraciones 3 y 5 mM.

Para el grupo de Ni, los resultados mostraron que la sal de Ni fue más tóxica para los

microorganismos ya que como se puede observar en la Tabla 13, las cepas A11 y A12 sólo

crecieron a la concentración más baja evaluada, esto es, 3 mM.

38


Finalmente, los microorganismos del grupo Ni/V fueron capaces de crecer en el medio,

principalmente en la concentración 3/1 mM; los aislados A13, A17 y A18 crecieron a

concentraciones más altas; sin embargo el crecimiento observado fue menor. La cepa A16

sólo creció a 3/1 mM de Ni/V.

Con base en los resultados obtenidos, se puede resumir que en ausencia del metal(es) en el

medio PHG-II, los aislados presentan un mayor crecimiento que en presencia del mismo,

lo anterior pudiera deberse a que los metales representan un factor de presión o limitante

para su desarrollo. Sin embargo, y es importante recalcar que la velocidad de crecimiento

de los microorganismos evaluados en los medios ricos (agar nutritivo y PHG-II) fue más

lenta que en la presencia del metal, es decir, que la observación de colonias comenzó a

partir de las 16 horas de la inoculación, lo que pudiera deberse a que el microorganismos

requiere un periodo de adaptación ya que provenía de un ambiente estresante (presencia de

metales).

3.2.3 Remoción de los metales alrededor de la colonia (formación de halo)

La formación de halo alrededor de la colonia fue medida en cm, los resultados se

presentan en la Tabla 14. Para los microorganismos del grupo V, se puede observar que

los aislados A1, A3 y A4 no muestran diferencias importantes en la formación del halo

respecto a las tres concentraciones evaluadas, situación semejante para el aislado A5,

aunque este último no fue capaz de formar halo a la concentración 5 mM, lo que puede

sugerir que a esta concentración de metal, el aislado sólo puede tolerar su presencia y no

tuvo la capacidad de removerlo del medio.

El aislado A6 no creció a la menor concentración evaluada, lo cual pudiera deberse a que

el microorganismo pudiera requerir de la presencia del metal para crecer, ya que proviene

de un medio con dicho factor de presión y por ello, la concentración óptima de formación

de halo correspondió a 3 mM.

Por otra parte, el aislado A8 no fue capaz de formar halo a ninguna de las concentraciones

evaluadas, pero sí presentó crecimiento en presencia del metal, lo que pudiera indicar que

puede tolerar al metal presente mas no removerlo del medio.

39


Para el grupo de Ni, se observó los aislados A11 y A12 fueron capaces de remover el

metal de su alrededor (formando halo) a la concentración de 5 y 7 mM.

Tabla 14 Diámetro promedio del halo (cm) formado alrededor de las colonias a diferentes concentraciones del metal.

NOTA: El diámetro del inóculo es de 0.2 cm, (-) no hubo formación de halo por no haber presentado

crecimiento. Medidas promedio (cm) del ensayo realizado por triplicado.

NIVEL AISLADO Diámetro promedio del halo (cm)

Concentraciones de metal evaluadas

V

1 mM 3 mM 5 mM

A1 0.73 ±0.06 0.88 ±0.13 0.73 ±0.06

A2 1.17 ±0.06 0.95 ±0.13 0.80 ±0.00

A3 0.52 ±0.03 0.65 ±0.05 0.67 ±0.03

A4 0.73 ±0.06 0.82 ±0.03 0.77 ±0.06

A5 1.33 ±0.06 1.33 ±0.06 -

A6 - 2.13 ±0.06 1.67 ±0.06

A8 - - -

3 mM 5 mM 7 mM

Ni A11 1.00 ±0.00 - -

A12 - - -

3/1 mM 5/3 mM 7/5 mM

Ni/V

A13 0.93 ±0.06 0.78 ±0.19 0.63 ±0.13

A16 0.53 ±0.06 - -

A17 0.70 ±0.05 0.40 ±0.00 -

A18 1.37 ±0.06 0.82 ±0.19 0.73 ±0.15

Para el grupo de microorganismos seleccionados con Ni/V, los resultados mostraron que

los aislados A13 y A18 fueron capaces de formar halo en las tres relaciones de

concentración de metal evaluadas; observando que el diámetro de dicho halo disminuía

conforme aumentaba la concentración de los metales.

Y ya que una de las intenciones era encontrar aislados que lograran no sólo crecer sino

también remover metal en presencia de la mezcla de los metales, es importante que para la

relación de concentración 7/5 mM se obtuvieran halos de 0.63 y 0.73 cm, respectivamente;

40


los cuales fueron cercanos al promedio de valores obtenido para todos los aislados (0.85

cm) en esta concentración; es por ello que estos aislados fueron seleccionados para

ensayos posteriores.

Estudios de acumulación del metal V por microorganismos (Bell et al., 2004) refieren

como 3 horas el tiempo de formación de halo, encontrando que la máxima concentración

de metal tolerada por los microorganismos correspondió a 8 mM, se observó que el metal

es acumulado en un inicio y aparentemente expulsado en un periodo de 48 horas. Este

comportamiento es semejante al observado en los aislados de este trabajo, como se

mostrará en los ensayos realizados en presencia del catalizador gastado.

3.3 Cinéticas de crecimiento de los aislados seleccionados

Con base en los resultados obtenidos se decidió únicamente continuar el estudio con

los aislados A1, A3, A6 (los tres aislados a 1 mM de V) y A13 y A18 (ambos aislados a

3/1 mM de Ni y V respectivamente), razón por la cual se evaluó su cinética de

crecimiento.

A continuación se presentan las gráficas de las curvas de crecimiento de los aislados.

En la Figura 6 se presenta la curva de crecimiento de los aislados A1, A3 y A6. Se observa

que los aislados A1 y A3 alcanzan su fase exponencial tardía aproximadamente a las 18

horas de incubación, mientras que el aislado A6 se retrasa ligeramente, alcanzando esta

fase a las 22 horas aproximadamente. El conocimiento de estas curvas de crecimiento

permite establecer las fases de crecimiento de los organismos en estudio.

41


Figura 6 Cinéticas de crecimiento de los aislados A1, A3 y A6 a 30ºC y 120 rpm.

0.000.200.400.600.801.001.201.40

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Abs

600

nm

Tiempo (h)A1 A3 A6

En cuanto a las constantes de velocidad de crecimiento (µ), una mayor velocidad de

crecimiento es indicativo de que el microorganismo cuenta con una mayor capacidad

metabólica para tolerar la presencia de un metal(es), como es el caso del aislado A1 con

un valor de 0.079 h-1, mientras que los aislados A3 y A6 (con valores de 0.033 y 0.051

respectivamente). Respecto a los valores de velocidad de crecimiento, Cruz (2008) reportó

valores entre 0.0945-0.1611 (h-1) para bacterias del género Bacillus aisladas de un lago de

brea que presentaron capacidad de retener a los metales Ni, Mn, Se y V. Lo anterior

sugiere que los microorganismos en estudio tienen una menor capacidad de tolerar los

metales Ni y V y por tanto su velocidad de crecimiento en presencia de los mismos es

menor a la observada por Cruz (2008). Sin embargo cabe indicar que los estudios se

realizaron en medios de cultivo diferentes.

En la Figura 7 se presentan las curvas de crecimiento de los aislados A13 y A18.

Figura 7 Cinética de crecimiento de los aislados A13 y A18 a 30ºC y 120 rpm.

42


El hecho de que los aislados A13 y A18 no hayan logrado un mayor crecimiento puede

deberse a que la presencia de ambos metales (Ni y V) en el medio resultaron ser

demasiado tóxicos para ellos impidiendo su crecimiento y acelerando la muerte celular.

El efecto genotóxico y mutagénico de los compuestos de VIV y VV son ambiguos

(Rodríguez-Mercado & Altamirano-Lozano, 2006). En cepas de Bacillus subtilis,

Salmonella typhimurium y Escherichia coli se ha observado, en algunos casos, una ligera

actividad mutagénica de este metal a concentraciones de 0.3 a 0.5 M (Kanematsu & Kada,

1978; Kanematsu et al., 1980; Kada et al., 1980).

En el estudio de Bellenger et al., (2008) se demostró que el V es también un metal

indispensable para la bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacter vinelandii, la cual expresa

la molécula V-nitrogenasa donde el metal actúa como un cofactor, lo cual apoya la idea

del porqué el metal V ambiental puede ser más fácilmente tolerado por los

microorganismos que el Ni. Motivo por el cual muy probablemente se obtuvieron un

mayor número de microorganismos tolerantes a V. Con base en los resultados anteriores,

los aislados A13 y A18 fueron descartados para estudios posteriores.

3.4 Evaluación de la concentración mínima inhibitoria del V sobre el crecimiento

de los aislados A1, A3 y A6

Como se había mencionado anteriormente, la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) proporciona información sobre aquella concentración de metal a partir de la cual el

crecimiento de un microorganismo se ve inhibido, por lo tanto, la concentración inmediata

anterior resulta de utilidad pues permite conocer la concentración máxima de metal que le

es posible tolerar a un microorganismo y que no afecte tanto su crecimiento como la

remoción del metal en estudio.

En las Figuras 8, 9 y 10 se presentan los resultados obtenidos para los aislados A1, A3 y

A6 respectivamente. En la Figura 8 se observa que a las concentraciones 5, 20 y 35 mM

de metal V, el crecimiento del aislado A1 es favorecido ya con mayor tiempo de

incubación con respecto a las concentraciones de 50 y 100 mM, incluyendo a aquellos

sistemas donde no se encuentra el metal presente, lo que sugiere un requerimiento del

metal V por el microorganismo.

43


Figura 8 Determinación de la concentración mínima inhibitoria del metal V para el aislado

A1 a 30ºC y 120 rpm.

En la Figura 9, se presentan los resultados del crecimiento del aislado A3 a diferentes

concentraciones de V; se observa que conforme transcurre el tiempo de incubación, el

aislado va creciendo, la tolerancia al metal o perfil de crecimiento va cambiando. Esto es,

al ir incrementando la concentración de 0 hasta 20 mM, el crecimiento o absorbancia va en

aumento, sin embargo, a las 48 horas y a una concentración de 35 mM, el crecimiento del

aislado A3 cae notablemente y continúa con esa tendencia hasta la concentración de 100

mM. Sin embargo es importante resaltar que el microorganismo sí presenta crecimiento a

lo largo de toda la determinación y en todas las concentraciones evaluadas.

0 5 20 35 50 100 024 48 72

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

Abs

a 6

00 n

m

Concentración de metal V (mM) Tiempo (h)

44


Figura 9 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de vanadio para el aislado

A3 a 30ºC a 120 rpm.

En la Figura 10, se observa que el aislado A6 presenta crecimiento en todas las

concentraciones de metal que fueron evaluadas. A las 72 horas, se observa claramente que

el mayor crecimiento para este aislado ocurrió a las concentraciones de 20 - 35 mM de V.

0 5 20 35 50 100 024 48 72

0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0

Abs

600

nm

Concentración (mM) Tiempo (h)Concentración V

Figura 10 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de vanadio para el

aislado A6 a 30ºC a 120 rpm.

Es un hecho de que cuando el crecimiento de un microorganismo va en aumento es porque

las condiciones son propicias para su desarrollo, sin embargo cuando su crecimiento se

45


detiene o disminuye puede atribuirse a diversos factores; en este caso en particular puede

atribuirse a la presencia del metal V a concentraciones por arriba de 20 mM para el

aislado A3 y por arriba de 35 mM para los aislados A1 y A6. Fisiológicamente, lo anterior

pudiera deberse a que las concentraciones antes mencionadas provocan un daño celular, lo

cual depende también del organismo en estudio (Rodríguez-Mercado & Altamirano-

Lozano, 2006).

En la literatura hay estudios donde se dan a conocer los valores de CMI los metales Ni y V

para diversos microorganismos. Se encontraron, por ejemplo, bacilos acidófilos (especies

no identificadas) con valores CMI de 1, 5 y 10 mM del metal Ni (Castro-Silva et al.,

2003), Bacillus circulans de 2 y 10 mM del metal Ni (Yilmaz, 2003), Enterobacter

cloacae con valores de CMI de 21 y 6 mM para los metales Ni y V respectivamente, y

Enterobacter hermanii con una CMI de 10-21 mM para el metal Ni y de 4-6 mM para el

metal V. Lo anterior fue evaluado a diferentes condiciones de cultivo (Hernández et al.,

1998).

Otro estudio (Bell et al., 2004) hace mención a las CMIs para diversos microorganismos

frente a la misma especie metálica; metavanadato, la misma que se utilizó en el presente

estudio. Se encontró que, por ejemplo Escherichia coli tiene una CMI de 50 mM de metal

V; valores menores de CMI fueron reportados para Streptococcus pyogenes (0.78 mM)

así como para Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas putida (12.5 mM). Sin embargo, se

encontraron también microorganismos como Bacillus subtilis, Rhodococcus opacus y

Ralstonia solanacearum con una CMI mayor de 100 mM, lo anterior indica que los

aislados obtenidos en el presente estudio se encuentran aproximadamente todos dentro del

intervalo de los valores de CMI del metal V reportados en la literatura.

3.5 Evaluación de la remoción del metal en cultivo líquido

Como un ensayo preliminar se evaluó la remoción del metal V en cultivo líquido,

tomando muestras al tiempo inicial y final (72 horas) e inoculando con los tres aislados en

estudio. Los resultados del análisis de metales se presentan a continuación y corresponden

a la cuantificación de V en la biomasa de los aislados (bioabsorción).

46


Como se observa en la Tabla 15, para todos los aislados la biomasa presenta una mayor

concentración de metal al final del tratamiento que al inicio del mismo, lo que indica la

existencia de un mecanismo de acumulación del metal o retención del mismo por los

microorganismos evaluados.

Tabla 15 Acumulación de V por la biomasa de los aislados A1, A3 y A6.

Tiempo V en biomasa (µg/g)

A1 A3 A6

To (0 horas) 0 0 0

Tf (72 horas) 177 285.5 203.1

NOTA: valores promedio para el ensayo realizado por duplicado.

Con base en los resultados de esta tabla, se observa que la biomasa de cada uno de los tres

aislados acumuló metal V en diferente proporción, lo que indica que dichos

microorganismos cuentan con la capacidad de remover el metal del medio, sin embargo el

mecanismo no fue elucidado en el presente estudio. La biomasa del aislado A3 es la que

remueve una mayor cantidad de metal del medio, teniendo así una remoción de 285.5

µg/g, sin embargo el aislado A6 presenta una mayor capacidad en cuanto a tolerancia a

vanadio pues fue capaz de remover 203.1 µg/g a una concentración de 1781 mg V/L a

diferencia del aislado A3 quien removió 285.5 µg V/g de biomasa en un medio cuya

concentración de metal fue de 1018 mg V/L.

En algunos estudios no se ha podido distinguir entre el fenómeno de acumulación y

bioabsorción, como es el caso del estudio reportado por Pümpel et al., (1995) quienes

evaluaron la capacidad de ciertos microorganismos para absorber plata a una

concentración de 1 mM.

Hernández et al., (1998) reportaron el aislamiento de 3 bacterias de suelos contaminados

provenientes de una refinería (dos cepas; Escherichia hermanii y una cepa; Enterobacter

cloacae), los cuales fueron evaluados por su capacidad de acumular Ni, V o ambos

metales. Los resultados mostraron que las tres bacterias fueron capaces de acumular

35.031 ± 1.5 mg V y 7.66 ± 0.223 mg Ni por g de biomasa, 46.76 ± 2.96 mg V y 10.28 ±

0.26 mg Ni por g y 34.18 ± 0.66 mg V por g y 6.87 ± 0.16 mg Ni por g de biomasa,

47


respectivamente. Los aislados estudiados en el presente trabajo presentaron valores de

remoción por biomasa entre 177 y 285.5 µg V, valores que se encuentran por debajo de los

reportados por otros autores, sin embargo las remociones obtenidas son significativas,

sobre todo si consideramos que estos aislados pueden además crecer en presencia de otros

metales.

La mayor parte de los reportes encontrados en la literatura se enfocan al estudio de

metales como Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Ag, Cd, Hg, Pb y U en muy diversas condiciones de

cultivo. Sobre el metal V, la información que generalmente se encuentra es para

condiciones y factores muy diferentes a las evaluadas en el presente estudio, como por

ejemplo el origen de los microorganismos, ya que normalmente provienen de algún

efluente acuoso como es el caso del trabajo de Shirdam et al., (2006), quienes aislaron

bacterias marinas, encontrando que la cepa de Pseudomonas pseudoalcaligenes PTCC

1666 es una bacteria acumuladora de metales en las siguientes proporciones: Ni (5-6 % en

una solución de metal de 100 mg/L), Cd (40-50%, de una solución de 80 mg/L) y V (10-

12% de una solución metálica de 40 mg/L) siendo estos porcentajes por gramo de

biomasa.

Con base en la información previa y los resultados obtenidos en este ensayo, este estudio

permite sentar las bases y ampliar nuestro conocimiento sobre estudios de remoción de

vanadio por microorganismos provenientes de ambientes contaminados con metales.

3.6 Estudio del crecimiento de los aislados y remoción de vanadio contenido en el

catalizador gastado

3.6.1 Cinéticas de crecimiento y determinación de proteína

Las figuras 11, 12 y 13 muestran las cinéticas de crecimiento de los aislados (A1,

A3 y A6 respectivamente) medido por turbidez (absorbancia a 600 nm) y por

determinación de proteína, ensayo de Bradford, evaluado a 595 nm.

En la Figura 11 se observa que el aislado A1 presenta un crecimiento semejante tanto en

ausencia (Figura 11A) como en presencia del catalizador (Figura 11B y 11C). Como se

48


mencionó anteriormente, el crecimiento fue medido en dos parámetros, densidad óptica y

proteína por el método de Bradford.

En particular, la Figura 11A muestra el crecimiento del aislado A1 en el medio PHG-II, en

ausencia del catalizador; se observa que ambos parámetros muestran una correlación

positiva pues presentan una curva semejante hasta las 48 horas, con excepción del valor de

proteína a las 36 horas, el cual puede considerarse un error experimental debido a que los

valores de los puntos siguientes, son mayores. En la misma figura se observa que a las 60

horas el crecimiento medido como absorbancia presenta una ligera caída, sin embargo la

proteína tiene un comportamiento diferente pues sus valores se incrementan. Una posible

explicación a la situación anterior pudiera sugerir la interferencia de sustancias coloridas

producidas en el cultivo (datos observados pero no mostrados), las cuales interfieren con

el método Bradford, el cual mide el contenido proteico de la muestra en absorbancia a 595

nm (Bradford, 1976).

49


A

B

C

Figura 11 Cinéticas de crecimiento del aislado A1 en medio PHG-II en ausencia y

presencia de catalizador. A) Sin catalizador, B) 194 mg catalizador/L, (17 mg V/L) y C)

388.8 mg catalizador/L (34 mg V/L).

50


Sin embargo, se requiere profundizar en el estudio para evaluar y cuantificar la producción

de estas sustancias.

La cinética de crecimiento observada para el aislado A1 en la concentración menor

evaluada del catalizador (194 mg/L) se muestra en la Figura 11B. Las curvas de los dos

parámetros medidos presentan comportamientos muy semejantes a lo largo de todo el

estudio, lo que indica que en presencia del catalizador a esta concentración y conteniendo

17 mg V/L, el aislado no se ve afectado en forma negativa por la presencia del catalizador,

iniciando su fase estacionaria después de las 24 horas y manteniendo ésta a lo largo del

periodo de incubación, es importante señalar que aún después de las 48 horas, el aislado

presenta un ligero incremento en crecimiento, esto es, no alcanza la fase de muerte durante

el periodo evaluado.

La Figura 11C presenta la cinética de crecimiento del aislado A1 en medio PHG-II

adicionado con catalizador a una concentración de 388 mg/L, correspondiendo a un

contenido de vanadio de 34 mg V/L. Se observa nuevamente, que el aislado inicia su fase

estacionaria de crecimiento a las 24 horas (absorbancia), sin embargo en el caso de

proteína esta fase no se observa, al contrario, se observa un incremento exponencial en la

misma durante todo el periodo de incubación. Con base en los resultados previos,

aparentemente el microorganismo sigue una curva de crecimiento similar a las mostradas

en las Figs. 11A y 11B, y este comportamiento en proteína obedece a la producción de

sustancias coloridas posiblemente producidas por el microorganismo y que fueron

detectadas por el método de Bradford. Lo anterior podría ser corroborado con estudios

adicionales que no presenten interferencias con este tipo de sustancias, sin embargo esta

actividad está fuera del alcance del presente proyecto.

En resumen, la Figura 11 muestra las cinéticas de crecimiento del aislado A1, donde se

muestra que no hay un efecto significativo sobre el crecimiento en presencia y ausencia

del catalizador; tampoco se observó efecto de la concentración del catalizador en el

crecimiento de este aislado. Siendo que el catalizador gastado contiene varios metales (ver

tabla 9), se hubiera esperado que: a) la presencia del catalizador afectara el crecimiento y

b) éste fuera afectado adicionalmente al aumentar la concentración del mismo. Con base

en estos resultados, se puede resumir que el aislado puede crecer en presencia de

catalizador gastado, situación que pudiera resultar ventajosa para la aplicación en cuestión.

51


En cuanto a las cinéticas de crecimiento del aislado A3 (Figura 12), tenemos que el aislado

mostró un comportamiento semejante al aislado A1, principalmente referido a los perfiles

de las curvas obtenidas.

En la Figura 12A se observa que los parámetros medidos (absorbancia y proteína)

correlacionan en forma positiva, esto es, ambos van incrementando a lo largo del periodo

de incubación sin catalizador. Es de notar y con base en ambos parámetros, que A3

alcanza su fase estacionaria a partir de las 24 horas, manteniendo esta durante el resto del

periodo de incubación (60 horas). Se obtuvo una máxima producción de proteína (1.473

mg proteína/L) y un valor de absorbancia de 0.580 a las 36 horas de incubación.

Un comportamiento similar al mostrado anteriormente se pudo observar para el aislado A3

a la menor concentración evaluada del catalizador (111 mg/L, Figura 12B), la cual

corresponde a una concentración de vanadio de 9.7 mg/L. El comportamiento obtenido

muestra que el aislado inicia su fase estacionaria a partir de las 24 horas y mantiene ésta a

lo largo del periodo de incubación, además se observa que el aislado no presentó ningún

efecto por la presencia del catalizador, en cuanto a los parámetros medidos (absorbancia y

proteína).

Un comportamiento diferente en las curvas de crecimiento del aislado A3, se observa en la

Figura 12C, donde se puede observar y considerando únicamente la absorbancia, la fase

estacionaria de crecimiento inicia a partir de las 36 horas de incubación, esto es, 12 horas

después de la observada para el aislado en ausencia (Fig. 12A) y en la menor

concentración de catalizador evaluada (Fig. 12B), esto es, el aislado presenta un

crecimiento más lento, lo cual pudiera atribuirse a que en este caso se encuentra en

presencia de una mayor concentración de catalizador (222 mg/L) o lo que es lo mismo una

mayor concentración de metales incluido el vanadio (19.5 mg/L). Como se puede observar

el crecimiento medido como absorbancia a las 24 horas, fue menor (de 0.5) a esta

concentración si se compara con el observado a 111 mg catalizador/L y en ausencia de

catalizador. A partir de este tiempo, el crecimiento (absorbancia) alcanza valores similares

y aún cuando se observa un ligero incremento en la curva, éste no resultó significativo.

52


Figura 12 Cinéticas de crecimiento para el aislado A3 en ausencia y presencia de

catalizador gastado. A) Sin catalizador, B) 9.7 mg V/L (111 mg catalizador/L) y C) 19.5

mg V/L (222 mg catalizador/L).

53


En cuanto a la proteína se puede decir que ésta alcanzó un valor máximo a las 60 horas

(1.763 mg/L), y es de recalcar que los valores de ésta fueron mayores a los observados

para el aislado en ausencia y en la menor concentración del catalizador evaluada, sin

embargo será necesario verificar dicho resultado dadas las condiciones de interferencia del

método empleado.

En resumen, la Figura 12 muestra las cinéticas de crecimiento del aislado A3 en ausencia

y presencia del catalizador gastado, donde se muestra que, sí se observó un efecto por la

presencia del catalizador siendo éste más evidente en la concentración de 222 mg/L (Fig.

12C), debido a que provocó un crecimiento más lento del aislado (retardo de la fase

estacionaria). En cuanto a la proteína se observó un efecto positivo, esto es, al incrementar

la concentración del catalizador ésta se ve incrementada, sin embargo y como se mencionó

en párrafos anteriores, los resultados obtenidos pudieran resultar confusos si la

interferencia por sustancias coloridas producidas por el aislado resulta positiva.

En general, la Figura 13 muestra que el aislado A6 presenta un comportamiento

semejante tanto en ausencia (Figura 13A) como en presencia del catalizador gastado

(Figuras 13By 13C), sin embargo cada gráfica presenta características distintivas.

En la Figura 13A, se observa que el aislado alcanza su fase estacionaria de crecimiento a

partir de las 24 horas de incubación y en ausencia del catalizador, la cual se mantiene a lo

largo del periodo de incubación; no se observó una fase de muerte. En esta figura, de 36

horas en adelante, se observa también un aparente incremento en el contenido de proteína.

Sin embargo, los valores obtenidos a partir de las 36 horas y hasta las 60 no presentan

aumento o disminución con respecto al obtenido a las 24 horas.

Los resultados de la cinética de crecimiento del aislado A6 en la menor concentración del

catalizador (194 mg/L) con un contenido de vanadio de 17 mg/V, se presentan en la Figura

13B. Se observa que el aislado alcanza su fase estacionaria (absorbancia) a partir de las 24

horas de incubación, manteniéndose en esta fase a lo largo del ensayo. Un

comportamiento diferente fue el obtenido para proteína, la cual presentó una mayor

producción a las 24 horas de incubación (2.489 mg/L) para posteriormente caer.

54


0

0.6

1.2

1.8

2.4

3

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 12 24 36 48 60 72

mg p

rote

ína/

L

Abs

600

nm

A

0

0.6

1.2

1.8

2.4

3

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 12 24 36 48 60 72

mg p

rote

ína/

L

Abs

600

nm

B

0

0.6

1.2

1.8

2.4

3

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 12 24 36 48 60 72

mg p

rote

ína/

L

Abs

600

nm

Tiempo (horas)

C

crecimiento proteína

Figura 13 Cinéticas de crecimiento para el aislado A6 en ausencia y presencia de

catalizador gastado. A) Sin catalizador, B) 17 mg V/L (194 mg catalizador/L) y C) 34 mg

V/L (388.8 mg catalizador/L).

55


En la mayor concentración de catalizador evaluada, 388.8 mg de catalizador/L con un

contenido de vanadio de 34 mg/L (ver Figura 13C), se observa que el microorganismo

alcanza su fase estacionaria a partir de las 24 horas de incubación y hasta las 48 horas,

aparentemente a partir de este tiempo el aislado presenta un ligero incremento en su

crecimiento respecto a los valores anteriores. La proteína presenta un comportamiento

muy similar, esto se parece incrementar después de las 48 horas, sin embargo ésta presenta

desviaciones mayores.

En resumen podemos decir que la presencia del catalizador afectó el crecimiento del

microorganismo. Los resultados obtenidos no fueron los esperados, ya que la presencia de

un material (catalizador) con un contenido de varios metales, incluido el vanadio, ejerciera

un efecto negativo considerable sobre el crecimiento de estos microorganismos, situación

que no fue observada claramente. Sin embargo, dicha situación puede deberse a

condiciones importantes como son: a) los microorganismos provienen de ambientes con

alto contenido de metales (ver Tabla 9) y por tanto la presencia de este material no tiene

un efecto estresante, b) los metales y el catalizador no se encontraban biodisponibles pues

estaban en una fase sólida, y c) no se tuvieron las condiciones óptimas de cultivo (contacto

microorganismo-catalizador).

3.6.2 Remoción de metal V en cultivo líquido

En las Figuras 14 y 16 se presentan los resultados obtenidos de la remoción de

vanadio en µg V/L por los aislados A1 y A6 en medio PHG-II adicionado con catalizador

a dos concentraciones, 194 y 388 mg de catalizador/L (conteniendo 17 y 34 mg de V/L

respectivamente), mientras que en la Figura 15 se muestra la remoción de vanadio por el

aislado A3 en medio PHG-II adicionado con catalizador a las concentraciones de 111 y

222 mg catalizador/L, con un contenido de vanadio de 9.7 y 19.5 mg/L respectivamente.

Es importante recordar que únicamente se presentan los resultados de remoción obtenidos

a las 36 y 60 horas.

En la Figura 14A se observan los resultados de remoción de vanadio por el aislado A1 a la

concentración de 194 mg catalizador/L (17 mg/L). Como se puede ver, hubo una remoción

del metal tanto a las 36 horas como a las 60 horas, la cual correspondió a 313 µg V/L; sin

56


embargo no hay diferencia entre la remoción del metal a las 36 y a las 60 horas; la

situación anterior pudiera resultar importante si se quiere realizar la experimentación en un

periodo más corto.

En cuanto a los resultados de remoción de vanadio por este mismo aislado pero a una

concentración de catalizador mayor (388 mg/L con un contenido de vanadio de 34 mg/L),

se puede observar en la Figura 14B, que hay una mayor remoción del metal durante las

primeras 36 horas (874.9 µg /L) presentándose después de este tiempo una posible

liberación del mismo, lo cual pudo ser resultado de algún mecanismo de salida (active

efflux) de sustancias tóxicas fuera de la células, ya que éste es considerado una parte vital

del metabolismo de xenobióticos (Mergeay, 1995; Pümpel et al., 1995). Sin embargo esta

situación no fue verificada en el presente estudio.

Cabe indicar que a la mayor concentración de catalizador (388.8 mg/L) y a las 60 horas, la

remoción también fue considerable y mayor a la obtenida en la concentración de 194

mg/L, esto es, se lograron remover 618.28 µg V/L. Los resultados anteriores permiten

sugerir que a este microorganismo no le resultó tóxica la mayor concentración evaluada; al

contrario, fue capaz de remover una mayor cantidad del medio, situación favorable pues el

objetivo del presente estudio era obtener organismos que no sólo toleraran sino fueran

capaces de remover metales presentes en catalizadores gastados y entre mayor sea esta

capacidad más oportunidad se tiene de llegar a una aplicación industrial.

Una desventaja de este organismo pudiera estar relacionada a la liberación del metal

después de cierto periodo, sin embargo será cuestión de profundizar en los estudios de sus

mecanismos de remoción y la optimización de las condiciones de cultivo respecto a la

remoción de metales.

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Figura 14 Remoción de vanadio en µg /L por el aislado A1 a: A) 194 mg/L (17 mg V/L) y

B) 388.8 mg catalizador/L (34 mg V/L).

En la Figura 15 se observa la remoción de vanadio por el aislado A3 a las dos

concentraciones de catalizador evaluadas (111 y 222 mg/L).

58


1000

Figura 15 Remoción de vanadio en µg /L por el aislado A3 a: A) 111 mg/L (9.7 mg V/L) y

B) 222 mg catalizador/L (19.5 mg V/L).

La remoción de vanadio por el aislado A3 a la concentración de catalizador de 111 mg/L

se presenta en la Figura 15A. En esta figura se observa que el vanadio fue removido del

medio, alcanzando una remoción similar tanto a 36 como a las 60 horas de incubación,

con una remoción promedio de 275 µg V/L y no se presentó una diferencia entre estos

tiempos. Este valor de remoción es menor al obtenido para el aislado A1 a esta misma

concentración.

Por otro lado, en la Figura 15B, se puede observar que a la concentración de 222 mg/L, el

aislado A3 fue también capaz de remover vanadio y en una cantidad mayor respecto a la

remoción obtenida por este mismo aislado a la concentración de 111 mg/L (Fig. 15A), esto

es, el aislado fue capaz de remover durante las primeras 36 horas 396 µg del metal V/L,

mientras que a las 60 horas se obtuvo una mayor remoción de vanadio, la cual

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correspondió a 502 µg/L. Se observa que al agregar el doble de catalizador (Figura 15B),

también se obtiene el doble de metal V en la biomasa.

Con base en los resultados anteriores, podemos decir que para el aislado A3, el aumentar

la concentración de catalizador en el medio de cultivo favoreció la remoción del metal,

además es importante recalcar que en el sistema conteniendo el catalizador a la mayor

concentración, el tiempo tiene un papel importante, pues la remoción aumentó conforme al

tiempo de incubación.

La Figura 16A presenta los resultados de remoción de vanadio obtenidos a la

concentración de catalizador de 194 mg/L. Como se puede observar el comportamiento en

este sistema es muy parecido al observado para los aislados A1 y A3; esto es la remoción

de vanadio tiene lugar pero es independiente del tiempo de incubación. Es decir, el aislado

A6 fue capaz de remover vanadio del medio en una concentración promedio de 274.5

µg/L, valor cercado al obtenido para los aislados A1 y A3. En cuanto al tiempo de

incubación, se puede decir que no hubo diferencia entre la remoción a las 36 y 60 horas.

En lo referente a este mismo aislado pero a la concentración de catalizador mayor (388.8

mg/L) se puede observar en la Figura 16B que nuevamente la remoción de vanadio se ve

favorecida alcanzando valores entre 392 a 855 µg V/L para 36 y 60 horas respectivamente.

El resultado más interesante en esta gráfica es el hecho de que la remoción incrementa con

respecto al tiempo; esto es, se lograron valores máximos de remoción de vanadio de 855

µg/L a las 60 horas de incubación, ligeramente menor a la obtenida por el aislado A1 a la

misma concentración pero a las 36 horas.

Finalmente, se observó que los aislados A1, A3 y A6 presentan la capacidad de crecer,

tolerar y remover el vanadio presente en el medio de cultivo y sobre todo contenido en el

catalizador agotado, los resultados anteriores son de suma importancia no sólo por el

hecho de remover vanadio sino también porque el catalizador contiene otros metales que,

en principio, harían suponer un efecto sobre el crecimiento, tolerancia y la remoción del

metal en estudio.

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po (horas) Figura 16 Remoción de vanadio en µg V/L por el aislado A6 a: A) 194 mg/L (17 mg V/L)

y B) 388.8 mg/L (34 mg V/L).

En cuanto a la remoción de vanadio, los aislados no mostraron diferencias en la remoción

en la concentración de catalizador de 194 mg catalizador/L (para A1 y A6) y 111 mg para

A3, sin embargo el comportamiento de remoción de vanadio en general por los tres

aislados en la concentración de 388.8 mg/L (para A1 y A6) y 222 mg /L (para A3) se vio

favorecida alcanzando remociones cercanas a los 900 µg/L para los aislados A1 y A6.

En la literatura se encuentran pocos estudios sobre la interacción bacteria-metal V. Uno de

ellos es el reportado por Bellenger et al., (2008) quienes hacen mención sobre el

requerimiento del metal V por la bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacter vinelandii,

donde se demuestra que en ausencia del elemento Mo ésta bacteria utiliza al V presente

como un cofactor alternativo para la enzima V-nitrogenasa, este estudio utilizó una

concentración de V en el medio de 10-8 y 10-6 M. Ortiz-Bernard et al., (2004) mencionan

61


62

que para la remoción in situ del metal V, la bacteria Geobacter metallireducens primero lo

reduce de V(V) a V(IV) y posteriormente lo precipita, este mecanismo ha sido propuesto

como un mecanismo de inmovilización del metal, lo cual resulta ideal para ambientes

contaminados en superficie. Respecto a la acumulación del metal V por bacterias, se

encontraron los siguientes dos trabajos; el primero hace mención sobre la bacteria Bacillus

cereus que es capaz de acumular, entre otros metales, al V en un rango de 4-4.8 mg/L), el

segundo trabajo, de Hernández et al., (1998), demuestra la acumulación de metal V

inducida en varias bacterias por la resistencia a diversos antimicrobianos. Las bacterias

utilizadas en dicho estudio y las cantidades de metal acumuladas se indican a

continuación: Escherichia hermani CNB50 (687.71±29.55 nmol/mg biomasa),

Escherichia hermanii CNB52 (918.07±58.21 nmol/mg biomasa) y Enterobacter cloacae

(671.70±13.03 nmol/mg biomasa).

Antipov et al., 2008 reportaron el aislamiento de una proteína unida a vanadio, del medio

de cultivo de la bacteria reductora de vanadio Pseudomonas isachenkovii utilizando

vanadato como aceptor terminal de electrones bajo respiración anaerobia. La proteína se

encontraba asociada a vanadio en un relación molar de aproximadamente 1:20. El análisis

de resonancia paramagnética de electrones mostró que el vanadio estaba asociado a la

proteína en su estado 4+. Este estudio, también estudio la distribución del vanadio dentro

de la célula mediante microscopia electrónica y microanálisis de rayos X de las células de

P. isachenkovii encontrando que el vanadio, acumulado en depósitos especiales en la

superficie de las membranas celulares, es reducido y excretado al medio.

Por otra parte, Bell et al., (2004) realizaron el aislamiento y caracterización de bacterias

tolerantes a altas concentraciones de varias sales de vanadio (2, 4 y 8 mM) provenientes de

suelos contaminados con petróleo y a partir de sitios de labranzas que tratan residuos de

refinería. Se lograron aislar 31 cepas. Los resultados demostraron que aunque las sales de

vanadio ejercen efectos tóxicos hacia los microorganismos, los ensayos de concentración

mínima inhibitoria y la prueba de reducción de bioluminiscencia demostraron que los

efectos fueron debidos principalmente al pH más que a la toxicidad inherente del metal.

Cabe indicar que este parámetro no fue evaluado en el presente estudio, lo que abre nuevas

oportunidades de investigación.

Conclusiones

4 CONCLUSIONES

• Los cultivos de enriquecimiento, preparados a partir de las muestras ambientales

permitieron obtener microorganismos capaces de crecer y tolerar la presencia de

los metales Ni y V, sin embargo se obtuvieron un mayor número de aislados en

presencia de V que de Ni, por lo que se concluye que el Ni resultó ser más tóxico

para estas especies bacterianas. Cabe resaltar que cuando se utilizaron ambos

metales en el medio, se obtuvieron también microorganismos, lo cual pudiera

deberse a que la presencia de metal V de alguna forma permitió resistir la

presencia del metal Ni.

• La técnica de revelado in situ mediante la generación de vapores de H2S, puso de

manifiesto que algunos de los microorganismos en estudio no sólo son capaces de

crecer sino también de remover el metal del medio y que este crecimiento y

remoción o formación de halo alrededor de la colonia se ve afectada al incrementar

la concentración del metal.

• Las concentraciones mínimas inhibitorias de metal V fueron de 50 mM para los

aislados A1 y A6 y de 35 mM para A3.

• El ensayo de remoción de V en cultivo líquido por la biomasa de los aislados A1,

A3 y A6 demostró que el orden de remoción fue el siguiente: A3>A6>A1,

alcanzando una máxima remoción de 285.5 µg V/g por el aislado A3.

• Los resultados de las cinéticas de crecimiento demostraron que los aislados

presentan comportamientos diferentes tanto por la presencia del catalizador

gastado como por la concentración de la misma. El crecimiento del aislado A1 no

se vio afectado por la presencia del catalizador ni por la concentración del mismo.

• En presencia del catalizador gastado, en la concentración más baja evaluada (194

mg catalizador/L), el aislado A1 fue el que removió mayor cantidad de metal V,

seguido de A6 y A3. Para la concentración más alta evaluada (388 mg

63

Conclusiones

64

catalizador/L), el mismo aislado, A1, fue el que permitió la mayor remoción

seguido de A6 y A3.

• Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten concluir que los

microorganismos obtenidos son buenos candidatos para ser aplicados en la

remoción de V presente en catalizadores, sin embargo se requiere profundizar en el

estudio de los mecanismos de remoción involucrados, a fin de encontrar las

condiciones óptimas de remoción.

Recomendaciones

5 RECOMENDACIONES

• Identificación molecular de los microorganismos responsables de la remoción de

vanadio en presencia del catalizador.

• Evaluar la producción de polisacáridos por los microorganismos estudiados y

determinar el papel que desempeñan en la remoción de metales.

• Establecimiento y validación de técnicas que permitan una buena y confiable

separación de las fases catalizador, sobrenadante y biomasa a fin de disminuir los

errores en la cuantificación de metales por ICP-EOS debido a la heterogeneidad

del sistema.

• Selección y evaluación de medios de cultivo que permitan el aislamiento de un

mayor número de microorganismos, particularmente referidos a microorganismos

capaces de remover Ni.

• Evaluación y optimización de parámetros de cultivo como son pH, temperatura,

concentración de oxígeno, fuente de carbono, concentración de metal(es),

concentración de catalizador, pruebas de absorción-adsorción. Lo anterior a fin de

incrementar la remoción de metales por los microorganismos estudiados.

• Determinar los mecanismos de remoción de metales utilizados por los

microorganismos en estudio mediante técnicas de microscopía electrónica de

barrido, fuerza atómica por mencionar algunas.

• Establecimiento de un sistema experimental en cultivo sólido que permita evaluar

la remoción de Ni y V, mediante lixiviación u otro mecanismo, contenidos en el

catalizador empleando los microorganismos en estudio.

65

Bibliografía

6 BIBLIOGRAFÍA

Almaguer, V., Garza, T., Rivera, J. 2006, Biosorción de Pb2+ en una columna empacada

con biomasa inmovilizada, Ingenierías, vol. 9, no. 31, pp. 13-17.

Alonso, F., Gómez, M. T. y Ancheyta, J., 2004, Estado del arte sobre las tecnologías para

la recuperación de metales a partir de catalizadores gastados de hidrotratamiento.

Informe Técnico del Instituto Mexicano del Petróleo D. 00148.9. pp. 1-76.

Aung, K., Ting. 2005, Bioleaching of spent fluid catalytic cracking catalyst using

Aspergillus niger, Journal of Biotechnology, no. 116, pp. 159-170.

ATSDR, 1997, Toxicological Profile for Nickel. (Final Report). NTIS Accession No.

PB98-101199. Atlanta, GA: Agency for Toxic Substances and Disease Register,

pp. 293.

Bacelar-Nicolau, P., Johnson, D. 1999, Leaching of pyrite by acidophilic heterotrophic

Iron-oxidizing bacteria in pure and mixed cultures. Applied and Environmental

Microbiology, pp. 585-590.

Bal, W., Kasprzak, K., 2002, Induction of oxidative DNA damage by carcinogenic metals.

Toxicology letter, vol. 127, pp 55-62.

Bell, J., Philip, J., Kuyukina, M., Ivshina, I., Dunbar, S., Cunningham, C., Anderson, P.

2004, Methods evaluating vanadium tolerance in bacteria isolated from crude oil

contaminated land, Journal of Microbiological Methods, no. 58, pp. 87-100.

Bellenger, J., Wichard, T., Kraepiel, M. 2008, Vanadium requirements and uptake kinetics

in the dinitrogen-fixing bacterium Azotobacter vinelandii, Applied and

Environmental Microbiology, pp. 1478-1484.

Borrachero M., Monzo, J., Payá, J., Peris-Mora, E, Vunda, C., Velánzquez, S., Soriano, L.

2002, El catalizador gastado de craqueo catalítico adicionado al cemento Portland:

las primeras 48 horas de curado y la evolución de la resistencia mecánica, VIII

Congreso nacional de propiedades mecánicas de sólidos, 579-589.

Bradford, M.M. 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding, Analytical

Biochemistry, vol. 72, pp. 248–254.

Brombacher, C., Bachofen, R., Brandl, H. 1998, Development of a laboratory-scale

leaching plant for metal extraction from fly ash by Thiobacillus strains, Applied and

Environmental Microbiology, pp. 1237-1241.

66

Bibliografía

Cañizares-Villanueva, R.O. 2001, Biosorción de metales pesados mediante el uso de

biomasa microbiana, Revista Latinoamericana de Microbiología, vol. 42, pp. 131-

143.

Castro-Silva, M., de Souza, A., Gerchenski, A., Batista, D., Rodríguez, A., Lima, P., Rubi,

L. 2003, Heavy metal resistance of microorganisms isolated from coal mining

environments of Santa Catarina', Brazilian J Microbiol, vol. 34, suppl. 1, pp. 45-47.

Chen, J., Czajka, D., Lion, L., Shuler, M., Ghiorse, W. 1995, Trace metal mobilization in

soil by bacterial polymers, Environmental Health Perspectives, no. 103, pp. 53-58.

Clarke, S., Stuart, J., Sanders-Loehr, J. 1987, Induction of siderophore activity in

Anabaena spp. and its moderation of copper toxicity, Applied and Environmental

Microbiology, vol. 53, no. 5, pp. 917-922.

Cotoras, D., 1995, Recicladores invisibles, Induambiente, vol. 13, no. 14, pp. 27-29.

Cruz-Vega, D., 2008, “Remoción de metales por microorganismos productores de

polisacáridos”, Tesis Maestría, Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y

Tecnología Avanzada – Unidad Querétaro, Instituto Politécnico Nacional, México.

EFSA, European Food Safety Authority, 2004, Opinion of the Scientific Panel of Dietetic

Products, Nutrition and Allergies on a request from the Commission related to the

tolerable upper intake level of Vanadium, vol. 33, pp. 1-22.

EPA 3050B, ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 1996, Method 3050B (SW-

846): Acid digestion of sediments, sludges and soils.

Ford, T., Ryan, D. 1995, Toxic metals in aquatic ecosystems: A microbiological

perspective. Environmental Health Perspectives, no. 103, pp. 25-28.

Gallego, V., Martín, S., García, M.T., Ventosa A. 2003, Diversidad Microbiana en los

Suelos de la Cuenca del Guadiamar Contaminados Por Lodos Piríticos. Ciencia y

Restauración del Río Guadiamar: Resultados del Programa de Investigación del

Corredor Verde del Guadiamar. Sevilla, España. Junta de Andalucía, Consejería de

Medio Ambiente. pp. 262-265.

Hartwig, A., 1995, Current aspects in metal genotoxicity. Biometals, vol. 8, pp. 3-11.

Hernández, A., Mellado, R., Martínez, J. 1998, Metal accumulation and vanadium-

induced multidrug resistance by environmetal isolates of Escherichia hermanii and

Enterobacter cloacae. Applied and Environmental Microbiology, pp. 4317-4320.

IARC, International Agency for Research on Cancer, 2006, Monographs on the evaluation

of carcinogenic risk to humans. Cobalt in hard-metals and cobalt sulfate, gallium

arsenide, indium phosphide and vanadium pentoxide. Lyon, vol. 86.

67

Bibliografía

Juárez, A., 2004, “Biolixiviación de minerales sulfuro-ferrosos en jales: aislamiento y

caracterización de cultivos puros y mixtos de microorganismos involucrados, Tesis

Doctorado, Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y

Agropecuarias.

Kada, T., Hirano, K., Shirasu Y. 1980, Screening of environmental chemical mutagens

bye the rec-assay system with Bacillus subtilis. Chemical mutagens: Principles and

methods for their detection, Plenum Press, vol. 5, pp. 149-173.

Kanematsu, N., Kada, I. 1978, Mutagenicity of metal compounds. Mutation Research. No.

53, pp. 207-208.

Kanematsu, N., Hare, M., Kada, I. 1980, Rec assay and mutagenicity studies on metal

compounds, Mutation Research, no. 77, pp. 109-116.

Langerkvist, G., Nordberg, G.F., Vouk, V. 1986, Vanadium. Handbook on the toxicology

of metals, Elsevier Science Publishing, Amsterdam, vol. 2, pp. 638-663.

Lindsay, J., Riley, T., 1994, Staphylococcal iron requirements, siderophore production,

and iron-regulated protein expression. Infection Immunology, no. 62, pp. 2309-2314.

Macías, V.F. 1993, Capacidad productiva y alternativas de uso del suelo en Galicia. El

campo, vol. 127, pp. 85-105.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. 2000, Microbial Ecology on Brock, Biology of

Microorganisms, novena edición, Prentice Hall, pp. 642-719.

Marguesin, R., Schinner, F. 1997, Heavy metal resistant Arthrobacter sp. a tool for

studying conjugational plasmid transfer between gram-negative and gram-positive

bacteria, Journal of Basic Microbiology, vol. 37, no.3, pp.217-227.

Menoufy, M.F., Ahmed, H.S. 2008, Treatment and reuse of spent hydrotreating catalyst,

Energy Sources, Parte A: Recovery, utilization and environmental effects, vol. 30,

pp. 1213-1222.

Mergeay, M., 1995, Heavy metal resistance in microbial ecosystems. En : Akkermans,

A.D.L., van Elsas, J.D., de Brujin, F.J. (Ed.), Molecular microbial ecology manual.

Kluwer Academic Publishing, The Netherlands, sección 6.1.7, pp. 1-17.

Morton, B.O. 2006, Contenido de metales pesados en suelos superficiales de la Ciudad de

México, Tip Revista especializada en ciencias químico-biológicas, vol. 9, no. 001,

pp.45-47.

NOM-001-ECOL-1996, NORMA OFICIAL MEXICANA (1996). Que establece los

límites máximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales

en aguas y bienes nacionales. Junio 24, Secretaría de medio ambiente recursos

68

Bibliografía

naturales y pesca, México.

NOM-021-SEMARNAT-2000, NORMA OFICIAL MEXICANA (2000). Que establece

las especificaciones de fertilidad, salinidad y clasificación de los suelos. Octubre 17,

Secretaría de medio ambiente y recursos naturales, México.

Ortíz-Bernard, I., Anderson, R., Vrionis, H., Lovley, D. 2004, Vanadium respiration by

Geobacter metallireducens: Novel strategy for in situ removal of vanadium from

groundwater, Applied and Environmental Microbiology, vol. 70, no. 5, pp. 3091-

3095.

Ortíz-Ruiz, S., 2006, Reciclaje: basura convertida en oro, Revisado 27/sep/06,

http://www.manufacturaweb.com/nivel2.asp?pge=7&cve=129_29

PEMEX 2001, Informe Anual

http://www.pemex.com/files/pdf/residuos_peligrosos_01_amb.pdf

Pümpel, T., Pernfuβ, B., Pigher, B., Diels, L., Schinner, F. 1995, A rapid screening

method for the isolation of metal-accumulating microorganisms, Journal of

Industrial Microbiology, no. 14, pp. 213-217.

Rainbow, P.S. 1993, The significance of trace metal concentrations in marine

invertebrates, Dallinger, R. and Rainbow, P.S., (Eds.) Ecotoxicology of metals in

invertebrates, Chelsea: Lewis Publishers, pp. 3-23.

Riviello, V. Diccionario PEMEX, revisado 20 de abril 2007.

Rodríguez-Mercado, J.J., Altamirano-Lozano, M.A. 2006, Vanadio: contaminación,

metabolismo y genotoxicidad, Revista internacional de contaminación ambiental,

vol. 22, no. 4, pp. 173-189.

Rodríguez, R., Moreno, J., Díaz, J., Larreal, M. 2006, Behavior of the electric conductivity

in two series of floor of the sector Caño San Miguel, Mara municipality, State

Zulia State Turing a two year-old period, Revista Facultad Agronomía (LUZ), no.

23, pp. 392-401.

Santhiya, D., Ting, Y. 2005, Bioleaching of spent processing catalyst using Aspergillus

niger with high-yield oxalic acid, Journal of Biotechnology, vol. 116, no. 2, pp.

171-184.

Schwyn, B., Neilands, J. 1987, Universal chemical assay for the detection and

determination of siderophores, Analytical Biochemistry, no. 160, pp. 47-56.

Semenza, M., Curutchet, G., Viera, M., Donati, E. 2000, Importancia de Thiobacillus

caldus en la lixiviación de sulfuros metálicos, Jornadas SAM 2000 – IV Coloquio

Latinoamericano de Fractura y Fatiga, pp. 1-6.

69

http://www.manufacturaweb.com/nivel2.asp?pge=7&cve=129_29

http://www.pemex.com/files/pdf/residuos_peligrosos_01_amb.pdf

Bibliografía

70

Shirdam, R., Khanafari, A., Tabatabaee, A. 2006, Cadmium, nickel and vanadium

accumulation by three strains of marine bacteria, Iranian Journal of Biotechnology,

vol. 4, no. 3, pp. 180-187.

Torres, L.M., Kharisov, B.I., Elizondo, V. N., 2001, Recuperación de V y Mo de

catalizadores gastados de la industria petroquímica, Ciencia UANL, vol. IV, no. 2,

pp. 198-204.

U.S. Department of Health and Human Services, Report on Carcinogens, Pursuant to

Section 301(b) (4), Public Health Service Act as Amended by Section 262, séptima

ed., PL 95-622.

Vullo, D. 2003, Microorganismos y metales pesados: una interacción en beneficio del

medio ambiente, Química Viva, vol. 2, no. 3, pp 1-12.

Weirauch, W. 2007, HPI Impact: World catalyst demand forecast to rise 3.6%/yr to 2010.

Hydro Process March.

Yilmaz, E. 2003, Metal tolerance and biosorption capacity of Bacillus circulans strain

EB1, Research Microbiology, vol. 154, pp. 409-415.

http://www.pemex.com


http://www.fastonline.org/CD3WD_40/HDLHTML/ENVMANL/ES/VOL348.HTM#VA

NADIO



http://www.pemex.com/






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