Estudio de extractos de Stevia rebaudiana Bertoni, y la ...

“Campus Omar Dengo”

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

ESCUELA DE QUÍMICA

Estudio de extractos de Stevia rebaudiana Bertoni, y la evaluación de sus efectos en la cavidad bucal de canes con enfermedad periodontal.

Trabajo sometido a consideración del Tribunal Examinador de la Escuela de Química

Como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Química Industrial, Énfasis Biodiversidad

Seiling Vargas Villalobos

Tutor: MSc. Marco Calvo Pineda.

Asesores: Lic. Juan José Ramírez

Lic. Mariano Barrios Chica

Heredia Mayo del 2006

i

RESUMEN

En el Millón de Cariari, un grupo organizado de mujeres pequeñas productoras,

plantaron en su vivero Stevia rebaudiana Bertoni, con el fin de aprovechar las

propiedades edulcorantes, anticaries, antibacteriales y antiinflamatorios que ésta

posee.

La enfermedad periodontal es una patología que presenta alteraciones del tejido

gingival, lo cual acarrea consecuencias bucales, y por lo tanto orgánicas

incapacitantes para los pacientes. Dicha enfermedad es frecuente en los seres

humanos, por lo que el actual estudio despertó el interés en desarrollar soluciones

alternativas para esta enfermedad.

La actividad antiinflamatoria de Stevia rebaudiana Bertoni es una buena opción para

complementar los procedimientos de raspado, alisado, existentes para mejorar la

salud bucal de pacientes con enfermedad periodontal.

Esta investigación planteó sus objetivos con el propósito de estudiar esta planta y

evaluar sus efectos en el tratamiento de dicha enfermedad.

El primer paso fue obtener el extracto crudo de S. rebaudiana y particiones del

mismo. Para realizar el análisis toxicológico y los efectos anti-oxidantes de dicho

extracto.

Se seleccionó un grupo de doce caninos del Refugio de Animales de San Rafael de

Heredia, afectados con enfermedad periodontal para efectuarles una valoración

odontológica completa; se les midió el índice de hemorragia gingival. Como

profilaxis el raspado y alisado que corresponde ante la presencia de enfermedad

periodontal.

ii

Como alternativa natural para mejorar el tratamiento de esta enfermedad, se

aplicaron por quince días consecutivos los extractos de la S. rebaudiana, repartiendo

las fracciones del extracto crudo entre los canes de estudio.

La evaluación continuó con medición de bolsas periodontales y un estudio

histopatológico de tejidos orales de un grupo control y experimental, pre y post

tratamiento.

El mejor resultado se obtuvo al aplicar el extracto crudo en el can denominado

Manrique, quien inicialmente presentó una medición de bolsa de 7 milímetros y un

índice de hemorragia gingival del 85%. Luego de quince días, Manrique presentó

una mejoría significativa con una disminución de la medición de la bolsa en 6

milímetros, quedando esta medición en un milímetro y una disminución del índice

de hemorragia gingival de un 75%, obteniendo finalmente un 10% de índice de

hemorragia gingival.

Por lo tanto, se puede concluir que la aplicación del extracto de S. rebaudiana tiene

propiedades curativas para la enfermedad periodontal, lo cual es de suma

importancia para continuar investigando acerca de las cualidades de esta planta en la

cavidad bucal y llegar a desarrollar un producto alternativo para beneficio de los

pacientes afectados.

iii

DEDICATORIA

Este trabajo es dedicado en primer lugar a Dios y a la Virgen porque son los que me

han guiado y dado fortaleza para seguir adelante.

A mis padres Rodrigo Vargas y Ruth Villalobos; mis hermanos: Lisbeth, Yorleny,

Yency y Rodrigo, por brindarme apoyo y ayuda siempre que lo necesité, y porque

con su ejemplo llegué a ser lo que soy ahora.

A Hugo Madrigal porque me diste siempre fuerza, y me brindaste un amor sincero.

A mi Abuela Tita y Abuela Hermelinda porque gracias a ellas tengo unos padres

excelentes y con sus oraciones logré finalizar este proyecto.

iv

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios por haberme dado fuerza, sabiduría, paciencia y principalmente

porque me permitió cumplir con esta meta.

A mis padres y hermanos, por su apoyo incondicional, por estar siempre a mi lado

en las buenas y en las malas, y por todo el amor que me dan.

A mi tutor Marco Calvo por su paciencia, sus enseñanzas a lo largo de la carrera por

ayudarme siempre a cumplir mi sueño de ser licenciada en química desde el primer

día que inicie en la Universidad.

Un agradecimiento muy especial a Juan José Ramírez y Mariano Barrios por su

ayuda incondicional, gracias a ellos se me abrieron muchas puertas, por dedicarme

buena de su parte de su tiempo y haberme ayudado con sus conocimientos.

Al doctor Eduardo Zamora y su esposa por su gran ayuda profesional desinteresada,

por compartir conmigo sus conocimientos y por desear siempre el éxito de esta

investigación.

A mis amigos Mario Arce y Nela por sus consejos, enseñanzas, paciencia y apoyo

que todos los días me brindaron.

A todo el Personal del Refugio de Animales por la ayuda brindada, por abrirme

siempre las puertas y hacerme sentir como en casa y nunca impedir el proceso de la

investigación, muy en especial gracias al Dr. Carlos Moncada

A José Elizondo, por dar gran aporte a esta investigación.

A toda la familia de mi novio, que son parte importante en mi vida, gracias por todo

el respaldo.

A mi novio Hugo, por crear en mi una mujer con metas claras y con decisión de

triunfar, por todos los consejos, gracias, te amo.

v

ÍNDICE Pág. RESUMEN i DEDICATORIA iii AGRADECIMIENTOS iv ÍNDICE DE CUADROS Vii ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS Viii ÍNDICE DE FIGURAS ix ABREVIATURAS x Capítulo I 1. Introducción 1 1.1 Antecedentes de S. rebaudiana 2 1.2 Descripción botánica de S. rebaudiana 3 1.3 Fitoquímica de S. rebaudiana 4 1.4 La S. rebaudiana y la salud 24 1.5 Enfermedad periodontal en canes 25 1.6 Inflamación en la enfermedad periodontal 27 1.7 Objetivos del proyecto 28 Capítulo II 2. Metodología 29 2.1 Recolección 29 2.2 Obtención del extracto crudo 29 2.3 Determinación cualitativa de los metabolitos secundarios 29 2.4 Evaluación de la actividad antioxidante 30 2.5 Verificación de la toxicidad del extracto crudo de S. rebaudiana 31 2.6 Evaluación del efecto de los extractos de S. rebaudiana en caninos con enfermedad periodontal

32 2.7 Reactivos utilizados en la investigación 36

vi

Capítulo III

3. Resultados 37 3.1 Resultados de la actividad antioxidante 37 3.2 Resultados de la evaluación de la toxicidad 37 3.3 Medición de las bolsas periodontales 37 3.4 Informe de patología 4466

Capítulo IV 4. Conclusiones y recomendaciones 60 4.1 Conclusiones 60 4.2 Recomendaciones 61 Capítulo V 5. Bibliografía 62 Capítulo VI 6. Anexos 71

vii

ÍNDICE DE CUADROS

Pág.

Cuadro1 . Constituyentes químicos de S. rebaudiana 11

Cuadro 2. Aceites esenciales de S. rebaudiana 22

Cuadro 3. Estudio fitoquímico y actividades biológicas realizados a S.

rebaudiana 25

viii

ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS

Pág. 1. Stevia rebaudiana Bertoni 3 2. Enfermedad periodontal en canes 27 3. Sedación de los canes 33 4. Medición de la bolsa periodontal 33 5. Profilaxis 34 6. Toma de biopsia 34 7. Aplicación del extracto 35 8. Biopsia inicial de camilo (canino control) 47 9. Biopsia post-profilaxis de camilo 48 10. Biopsia post-profilaxis de camilo 48 11. Biopsia post-profilaxis de camilo 49 12. Biopsia inicial de Alfredo (canino experimental) 50 13. Biopsia inicial de Alfredo (canino experimental) 50 14. Biopsia inicial de Alfredo (canino experimental) 51 15. Biopsia post-profilaxis de Alfredo 51 16. Biopsia post-profilaxis de Alfredo 52 17. Biopsia inicial de Tita (canino experimental) 53 18. Biopsia inicial de Tita (canino experimental) 53 19. Biopsia post-profilaxis de Tita 54 20. Biopsia post-profilaxis de Tita 54 21. Biopsia inicial de Peluche (canino experimental) 55 22. Biopsia post-profilaxis de Peluche 56 23. Biopsia post-profilaxis de Peluche 56 24. Biopsia inicial de Firulay (canino experimental) 57 25. Biopsia inicial de Firulay (canino experimental) 58 26. Biopsia inicial de Firulay (canino experimental) 58 27. Biopsia post-profilaxis de Firulay 59 28. Biopsia post-profilaxis de Firulay 59

ix

ÍNDICE DE FIGURAS Pág.

Figura 1. Estructuras de compuestos diterpénicos aislados de S rebaudiana. 5 Figura 2. Estructuras de ent-kaurenos diterpénicos aislados de S. rebaudiana 7 Figura 3. Estructuras de labdanos diterpénicos aislados de S. rebaudiana 15 Figura 4. Estructuras de labdanos diterpénicos aislados de S. rebaudiana 17 Figura 5. Estructuras de labdanos triterpénicos aislados de S. rebaudiana 19 Figura 6. Estructuras de flavonoides aislados de S. rebaudiana 20

x

ABREBIATURAS

13C-NMR = resonancia magnética nuclear carbono-13

1H-NMR = resonancia magnética nuclear protónica

DMSO = dimetilsulfóxido

DPPH = 2,2-difenil-1-picril-hidracilo hidratado

GC = cromatografía de gases

H/E = Hematoxilina y eosina

HPLC = cromatografía líquida de alta frecuencia

IR = infrarrojo

J = constante de acoplamiento

LD50 = dosis letal del 50%

MS = espectroscopia de masas

UV = ultravioleta

1

CCAAPPÍÍTTUULLOO II

11.. IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN Actualmente en Costa Rica, el estudio de la gran variedad de flora nacional se

encuentra en estado incipiente, pese que a nivel mundial el uso de medicamentos

procedentes de plantas medicinales, está ganando cada vez más popularidad en el

tratamiento de enfermedades (Poveda, 1999).

Estudiar productos naturales y evaluar su actividad biológica, es el punto de partida

para el diseño de medicamentos y la aplicación práctica en la fitoterapia, que a

veces, es superior a los medicamentos convencionales, e inclusive con efectos

colaterales mínimos. En los productos naturales está el futuro de la química

orgánica, la medicina y la farmacia, por lo que se hace una necesidad para nuestro

país desarrollar las vías de análisis y estudio de las plantas medicinales, lo que

provocará el desarrollo de nuevos productos y hará que nuestro país compita con

países desarrollados de gran tradición científica.

En Costa Rica, diferentes instituciones gubernamentales y no gubernamentales, han

venido apoyando proyectos socio-productivos a nivel nacional, tendientes a

fortalecer asociaciones de agricultores en la producción de plantas medicinales, con

los cuales se ha logrado beneficios económicos importantes para estos pequeños

agricultores. Uno de estos proyectos se está llevando acabo en el Millón de Cariari.

El objetivo es introducir plantaciones de Stevia rebaudiana para aprovechar las

propiedades edulcorantes que posee, y luego orientarla a otras actividades que

pudiera contener en el campo de la salud.

Dicho proyecto está siendo coordinado por el Instituto Tecnológico de Costa Rica,

específicamente la Escuela de Biología y la Escuela de Química, con el fin de

beneficiar a mujeres jefas de hogar de esta región.

Con miras a dar otros usos alternativos a esta planta y diversificar su producción, se

plantea el diseño de esta investigación, la cual consiste en estudiar extractos de S.

2

rebaudiana y evaluar su actividad en el tratamiento de canes con enfermedad

periodental.

La enfermedad periodontal está catalogada como uno de los padecimientos

bucodentales más comunes en mamíferos, y se define como la inflamación crónica

de la membrana periodontal, caracterizada por la reabsorción del hueso alveolar,

pérdida dentaria, atrofia de las encías y sangrado gingival. Puede ser local, afectando

un solo diente, sin embargo usualmente se presenta de forma generalizada (Berkow,

2002.)

S. rebaudiana, también llamada hierba dulce, viene a constituir un ejemplo del

abandono con que tratamos a nuestra naturaleza, al desechar por mucho tiempo las

bondades que encierra esta planta, y que ahora retomamos para determinar las

cualidades que la rodean para beneficio de nuestra humanidad.

1.1. Antecedentes de Stevia rebaudiana

Su nombre científico es Stevia rebaudiana Bertoni, pero popularmente se la conoce

como hierba dulce, hierba dulce del Paraguay, kaá heé, caá ehé, kaá-jeé. Es

originaria de la zona selvática del norte de Paraguaya, en los altiplanos del

Amambay, al límite con Brasil. (Soejarto D, 1984). Esta especie vegetal era

conocida y empleada por los nativos desde épocas remotas, lo cual fue documentado

por los conquistadores de España, figurando en los textos del Archivo Nacional de

Asunción. (Cerdas M, 1982).

• Su denominación vernácula kaá-ge-é significa en lengua guaraní hierba dulce.

• En 1887 los indígenas y yerbateros de la zona del Monday, Paraguay, hacen

referencia sobre la planta al Dr. Moisés Bertoni.

• En 1900 el químico paraguayo Dr. Ovidio Rebaudi publicó en la Revista de

Química y Farmacia de Buenos Aires, el primer análisis químico del principio

dulce extraído de este vegetal. (Khoda H, 1983).

• En 1921 el esteviósido se registra como una sustancia 300 veces más dulce que

el azúcar ante la Unión Química Internacional. (Elkins M, 1997).

3

• En 1969, el Profesor Derek Banton (Premio Nobel de Química) dirige un trabajo

de investigación con hierba dulce en la Academia Real de Ciencias de Londres.

(Souzaan C, 1996).

1.2. Descripción botánica de S. rebaudiana

Se trata de una hierba subleñosa perenne, perteneciente a la familia de las

compuestas, caracterizada por presentar una altura de 30-80 cm; tallo color pardo; se

levanta desde una base corta, gruesa y leñosa, ramificada, ramas escasas, resinosa al

secarse. Hojas, opuestas oblongo-lanceoladas, de 5 a 10 cm de largo, puntiagudas y

finamente dentadas, con numerosas glándulas oleosas. Sus flores son amarillas

cabezuelas terminales, hermafroditas, receptáculo cilíndrico, de 9 a 10 mm de largo,

estriados, de 3mm de largo. La raíz es de un tamaño equivalente a un cuarto de la

planta. Existen en la actualidad alrededor de doscientas especies, diseminadas a

través de toda América. (Gupta M, 1995)

Fotografía 1. Stevia rebaudiana Bertoni

Fuente: Yamada (1984).

En Paraguay, S. rebaudiana es muy utilizada. Se cultiva en diversas regiones del

norte de la Argentina y del litoral brasileño y paraguayo. También hay referencias su

uso y tenencia en pequeños cultivos en otras latitudes como Uruguay, México,

Canadá, suroeste de los Estados Unidos de América, China, Taiwán, Gran Bretaña,

Filipinas, Israel, Tailandia y Japón. Su cultivo requiere suelos arenosos-humíferos,

con un pH de 6,5- 7,5 en ausencia de salinidad, siendo la mejor época entre

4

primavera y verano para cada uno de los países anteriormente mencionados. La

temperatura óptima para la germinación de las semillas debe ser superior a 20º C.

(Soejarto, 1984) (Elkins, 1997).

1.3 Fitoquímica de S. rebaudiana

S. rebaudiana se ha estudiado a profundidad, por los grandes beneficios que se han

obtenido de sus componentes de sabor dulce. Es utilizada comercialmente como

edulcorante, muy en particular en la industria alimenticia del Japón.

Esto dio motivo a intensivas investigaciones fitoquímicas de los distintos

compuestos presentes en la hierba. Existen datos de más de cien compuestos que se

han identificado en esta especie, siendo los más conocidos edulcorantes ent-

kaurenos diterpenos glucosidados, especialmente el esteviósido y rebaudiósido A.

En varios artículos de revistas se hace referencia de los compuestos de S.

rebaudiana, entre ellos los escritos por los japoneses Abe y Sonobe en 1977; Morita

1977; Tanaka 1987. También aparece en revistas inglesas por Kinghorn y Soejorto

1985; Hanson y De Oliveira 1993; entre muchos otros.

1.3.1 Diterpenoides (ent-kaurenos)

Aunque gran número de productos naturales se han aislado de S.rebaudiana, los más

conocidos son los diterpénicos, específicamente los del sabor dulce ent-kaurenos

glucósidos. Seis de los glicósidos ent-kaurenos que se han descrito para S.

rebaudiana, son el esteviósido (1), rebaudiósido A, C, D, E (2-5) y dulcósido A (6)

(figura 1). El esteviósido (1), es el componente de sabor dulce que más abunda en

las hojas. Los primeros estudios fitoquímicos realizados a S. rebaudiana fueron

enfocados a aislar y determinar la estructura de los constituyentes dulces de la

hierba. La elucidación de la estructura de estos edulcorantes, fue un duro proceso de

más de 50 años. Bertoni en el año 1905 fue el que reportó preliminarmente los

constituyentes edulcorantes en S. rebaudiana (Kennelly, 2000).

5

COOR1H3C

CH2

OR2

123

45

6 7

89

10

1112

13

14

15

16

17

18 19

20

Componente

R1

R2

1 Esteviósido

Glu

Glu-Glu (2-1)

2 Rebaudiósido A Glu

Glu-Glu (2-1)

Glu (3-1)

3 Rebaudiósido C Glu

Glu-Rha(2-1)

Glu(3-1)

4 Rebaudiósido D Glu-Glu

(2-1)

Glu-Glu (2-1)

Glu (3-1)

5 Rebaudiósido E

Glu –Glu (21)

Glu-Glu (2-1)

6 Dulcósido A Rebaudiósido B

Glu

Glu-Rha(2-1)

Fuente: (Kennelly, 2000)

Glu= β-D-glucopiranosil; Rha= α-L-rhamnopiranosil

Figura 1. Estructuras edulcorantes, glicósidos diterpénicos aislados de S.

rebaudiana

6

Dieterich, en 1908, aisló dos compuestos de sabor dulce, el eupatorin cristalino y el

rebaudin no cristalino, apartir del extracto acuoso del polvo de las hojas y tallos de

S. rebaudiana. Cuando Dieterich experimentó la hidrólisis, encontró que esos

compuestos son glucósidos, cerca de 150 a 180 veces más dulces que la sacarosa.

Los investigadores franceses Bridel y Lavieille, en 1931, determinaron que el

rebaudin no cristalino era una mezcla de eupatorin con varias impurezas orgánicas.

Eupatorin fue después renombrado como esteviósido (1), porque cambió la

nomenclatura de la planta de Eupatorium rebaudianum a S. rebaudiana. Rasenack,

en 1908, aisló un componente de sabor dulce de S. rebaudiana y propuso una

probable fórmula molecular de C42H72O21, además notó la presencia de taninos y

resinas no caracterizados en el extracto crudo (Kennelly, 2000). En los años treinta,

Bridel y Lavieille publicaron una serie de compuestos químicos de S. rebaudiana;

ellos obtuvieron el glucósido cristalino esteviósido (1), de un extracto alcohólico, y

encontraron que era 300 veces más dulce que la sacarosa. A través de

experimentación con hidrólisis, estos investigadores demostraron que el esteviósido

(1) es glucosidado y contiene tres unidades de azúcar cada una identificada como D-

glucosa. Propusieron la siguiente ecuación para la reacción de hidrólisis:

C38H36O18 + 3H2O = C20H30O3 + 3C6H12O6

De estas hidrólisis, Bridel y Lavieille, en 1931, mostraron que existía una enzima

que catalizaba la hidrólisis del esteviósido (1). Ellos usaron extractos del intestino

del caracol Helix pomatia, para producir la anglicona de nombre esteviol (7),

mientras que usando la catálisis ácida para la hidrólisis del esteviósido, se produce

isoesteviol (8). Ellos notaron que el esteviol (7) y el isoesteviol (8) eran ácidos

débiles. Además Bridel y Lavieille encontraron que en disoluciones alcalinas de

esteviol (7) el isoesteviol (8) podría precipitar con dióxido de carbono los lleva a la

hipótesis de que el esteviósido contiene grupos fenólicos, ácidos hidroxilicos.

Concluyeron que los azúcares estaban unidos a través de enlaces con grupos

funcionales ácidos. Ellos no fueron capaces, de determinar totalmente la estructura

7

química correcta del esteviósido (1), esteviol (7), o isoesteviol (8). Con la base de

datos de Bridel y Lavieille, otros investigadores especularon erróneamente sobre las

estructuras derivados del esteviol (7) e isoesteviol (8). Un grupo de investigadores

del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Metabólicas del Instituto Nacional

de la Salud, Bethesda, Marylan, publicaron la estructura correcta del esteviósido

Mosetting y Ness 1955; Vis y Fletcher 1956; Dolder et al.1960; Djerassi et al.1961 ,

Mosetting et al. 1961 Mosetting et al. 1963. Mosetting and Ness, 1955,

determinaron la estructura del esteviol (7) y el isoesteviol (8), donde el esqueleto de

los diterpenos ácidos contienen la forma de 2,11-ciclopentanoperhidrofenantreno,

con hidroxilos ácidos y grupos metilenos terminales (figura 2).

COOH

OR1

CH2

H

H

COOH

O

H

H 8 Isoesteviol

R1

7 Esteviol H 9 Esteviólsido Glu-Glu( 2-1 ) 10 Rebaudiósido B Glu-Glu ( 2-1 ) Glu ( 3-1 )

Glu= β-D-glucopiranosil

Figura 2. Estructuras derivadas de la S. rebaudiana, ent-kaurenos diterpénicos

glucosidados.

Fuente: (Kennelly, 2000).

8

Ellos también encontraron que el isoesteviol (8) puede sufrir una reducción tipo

Wolf-Kisher, que lleva al ácido isostévico, el cual podría volver a reducirse al

hidrocarburo isostevano. Wood y Fletcher, en 1956, proponen que en el esteviósido,

el azúcar unido al ester es el grupo β-D-glucopiranosil, mientras que Vis y Flecher

en 1956, proponen que otro azúcar unido al esteviósido es la β-soforosa [2-O-(β-D-

glucopiranosil)–D-glucosa]. Finalmente, la configuración absoluta del esteviol (7) se

determina por reacciones de degradación con dispersión rotatoria óptica, además de

otras medidas físicas. La inequívoca elucidación de la estructura del esteviósido (1)

fue completada por Mosetting et al. en 1963.

El esteviósido es el glucósido mayoritario de sabor dulce en S. rebaudiana, Cramer

y Ikan, 1986, reportaron que es de 250-300 más dulces que la sacarosa. La

concentración del esteviósido en S. rebaudiana es muy variable, oscila entre un 5 y

22% en peso de las hojas secas, según las condiciones de crecimiento del cultivo

(Kim y Dubois 1991). El esteviósido (1) se ha encontrado también en flores, pero

en bajas concentraciones (0,9% p/p). Se ha mostrado que con el reordenamiento de

Wagner-Meerwein, el isoesteviol (8) puede lograr la inversión al anillo D del

esteviol (7) (figura 2), esto puede suceder con una catálisis ácida. La saponificación

del esteviósido con una base fuerte produce esteviólsido (9) (figura 1).

Ocho de los glucósidos edulcorantes de S. rebaudiana contienen una anglicona

común llamada esteviol (7) (ácido 13-hidroxi-ent-kaur-16-en-19-oico), y difiere

solamente en los glucósidos unidos al C-13 y C-19. Tanaka y sus colaboradores

reportaron al rebaudiósido A (2) y rebaudiósido B. El rebaudiósido A, fue obtenido

a partir de la extracción metanólica de hojas de S. rebaudiana, con un rendimiento

de 1,4% (m/m).

La hidrólisis del rebaudiósido A permitió conocer la estructura del isoesteviol (8),

mientras que la hidrólisis del rebaudiósido A (2) con hesperidinasa dió como

producto que fue identificado como rebaudiósido B. La identificación del esteviol

como genuina anglicona para el rebaudiósido A (2) y B, se logro casi totalmente por

mediciones de 13C-NMR. Las porciones de glucósidos del rebaudiósido A (2) y B

fueron determinadas por la comparación de carbonos anoméricos, 13C-NMR, con

9

señales emitidas por el esteviósido (1) y el esteviólsido (9), junto con la hidrólisis

alcalina del rebaudiósido A(2) y B, además del análisis MS del producto de la

metilación del rebaudiósido B. (Kobayaschi et al. 1977). El rebaudiósido A (2) es el

edulcorante de los ent-kaurenos glucósidos aislados de S. rebaudiana, que hasta la

fecha es aproximadamente 300-450 más dulce que la sacarosa, mientras que el

rebaudiósido B es aproximadamente de 300-350 veces mas dulces que la sacarosa

( Crammer e Ikan 1987). El rebaudiósido A (2) es el segundo ent-kaureno más

abundante encontrado en las hojas de S. rebaudiana, con un aproximado de 25 a

54% del rendimiento, comparado con el esteviósido (1) a partir de las hojas secas

(Crammer e Ikan 1987). El rebaudiósido A (2) es el de sabor más agradable y es

más soluble en agua que el esteviósido (1), por consiguiente es el más indicado para

utilizarlo en comidas y bebidas (Crammer e Ikan 1987). El rebaudiósido A (2)

también se encuentra en concentraciones bajas en las flores 0,15% (Darise et al

1983).

A partir de los extracciones metanólicas de los ent-kaurenos se han obtenido tres

ent-kaurenos glucósidos minoritarios, rebaudiósido C, D y E (3-5) que fueron

aislados por Tanaka y sus colaboradores, con un rendimiento de 0,4%, 0,03% y

0,03% m/m respectivamente (ver cuadro 2).

Los extractos metanólicos fueron recristalizados para remover el esteviósido (1), y el

remanente del extracto fue sometido a repetidas cromatografías con gel de sílice

hasta obtener los rebaudiósidos C, D y E (3-5) (Sakamoto et al.1977). Para la

elucidación de la estructura del rebaudiósido C (3) se utilizó 13C-NMR, incluyendo

la relajación por el método de transformación de Fourier. (Sakamoto et al.1977).

La determinación química del rebaudiósido C (3) incluye hidrólisis enzimática de

las unidades de azúcar, saponificación de los ésteres enlazados a los azúcares,

permetilación y metanólisis.

Para la elucidación del rebaudiósido D (4) y E (5) también se usó la técnica de 13C-

NMR, la hidrólisis enzimática y saponificación de los ésteres enlazados con los

azúcares (Sakamoto et al.1977).

10

En 1977 Kobayashi, y sus colaboradores de la Universidad de Hokkaido reportaron

dos ent-kaurenos glicósidos minoritarios de S. rebaudiana, los cuales fueron

denominados dulcósido A y B; notaron que ambos eran dulces. Para la elucidación

de la estructura del dulcósido A (6) se utilizaron métodos espectroscópicos, y

derivaciones químicas, incluyendo metilación del dulcósido A (6) que lleva a su

permetilación lo cual ayudó a establecer los residuos del C-13 como 2-O-

rhamnosil(1-2) glucosa ( también llamado neohesperidosa) (Kobayashi et al 1977).

La estructura del dulcósido B (3) fue reportada como 19-O-β-glucopiranisil-13-O-

[α-rhamnopiranosil(1-2)-β-glucopiranisil(1-3)] β-glucopiranisilsteviol (Kobayashi et

al 1977). Esta es idéntica a la previamente reportada como rebaudiósido C (3)

(Sakamotto et al 1977).

Se notó que el esteviósido (1) y rebaudiósido A (2) son muy parecidos al dulcósido

A (6) y rebaudiósido C (3) respectivamente. La diferencia está en la presencia de

grupos rhamnosil del dulcósido A (6) y rebaudiósido C (3) (Kobayashi et al 1977).

Estas sustituciones de rhamnosil disminuyen la intensidad del sabor dulce del

dulcósido A (6) y rebaudiósido C (3) que son solo una décima parte dulces,

comparados con el rebaudiósido A (2) y esteviósido (1) respectivamente.

La presencia de los edulcorantes ent-kaurenos glicosidados se han reportado en las

hojas, tallos y flores de S. rebaudiana, pero no en las raíces (Tanaka 1982). Aunque

otras especies de S. rebaudiana, contienen ent-kaurenos diterpénicos, sólo en una

de las otras especies, S. phlebophylla se ha encontrado el edulcorante esteviol

glicosidado (Soejarto et al 1984). Algunos estudios hechos a S.rebaudiana in vivo e

in vitro, intentan incrementar la producción de ent-kaurenos glicósidos.

11

Cuadro 1. Constituyentes químicos de S. rebaudiana

Constituyente. Parte de la planta %(m/m) Referencias

Diterpeno ent-Kaureno Dulcósido A (6) Hojas 0,03 Kobayashi 1977 _ (-)-Kaureno Tallo ns Hanson y AITE 1968 Rebaudiósido A (2) Hojas 1,43 Khoda et al 1976 Flores 0,15 Darise et al 1983 Rebaudiósido B (10) Hojas 0,44 Khoda et al 1976 Rebaudiósido C (3) Hojas 0,4 Sakamoto et al 1977 Rebaudiósido D (4) Hojas 0,03 Sakamoto et al 1977 Rebaudiósido E (5) Hojas 0,03 Sakamoto et al 1977 Esteviolsido (9) Hojas 0,04 Khoda et al 1976 Esteviósido (1) Hojas 2,18 Khoda et al 1977 Flores 0,92 Darise et al 1983 Láudano Austro inulina (12) Hojas 0,06 Sholichin et al 1980 Flores 0,21 Darise et al 1983 6-O-Acetilaustroinulina (13) Hojas 0,15 Sholichin et al 1980 Flores 0,18 Darise et al 1983 7-O-Acetilaustroinulina (14) Flores 0,08 Darise et al 1984 Jhanol (11) Hojas 0,006 Sholichin et al 1980 Flores 0,04 Darise et al 1983 Esteberina A (15) Hojas 0,001 Oshima et al 1986 Esteberina B (16) Hojas 0,0009 Oshima et al 1986 Esteberina C (17) Hojas 0,0003 Oshima et al 1988 0,0004 Oshima et al 1988

12


Esteberina G (21) Hojas 0,0002 Oshima et al 1988 Esteberina H (22) Hojas 1,0002 Oshima et al 1988

Otros Gibberelina A20 Hojas/ Tallos 0,0000001 Alves y Ruddat 1979

Flavonoides Apigenina 4-O-glucósido (30) Hojas 0,01 Rajbhandari y Roberts 1983

Apigenina 7-O-glucósido (37) Hojas ns Matsuo et al 1986

Kaempferol 3-O-rhamnosido (31) Hojas 0,008 Rajbhandari y Roberts 1983

Luteolin 7-O-Glucósido (32) Hojas 0,09 Rajbhandari y Roberts 1983

Quercetina 3-O- arabinosa (33) Hojas ns Rajbhandari y Roberts 1983

Quercetina 3-O- glucósido (34) Hojas ns Rajbhandari y Roberts 1983

Quercetina 3-O- rhamnosido (35) Hojas ns Rajbhandari y Roberts 1983

Quercetina 3-O- rutinósido (38) Cultivo 0,0007 Susuki et al 1976

3,5,7-trihidroxi-3,6,4-trimetoxiflavona Hojas 0,001 Rajbhandari y Roberts 1983 Esteroles Campesterol (27) ns ns D�Aostino et al 1984

13


Estigmaesterol (26) Hojas ns Nabeta et al 1976 cultivo 0,01 Nabeta et al 1977 Estigmaesterol-β-D-glucósido (29) Hojas ns Matsuo et al 1986 Triterpenoides Acetato de β-Amirina (23) Hojas ns Sholichin et al 1980 Lupeol Hojas ns Sholichin et al 1980 Palmitato 3-lupeol (24) ns 0,1 Yasukawa 1993 Ésteres del lupeol Hojas ns Sholichin et al 1980 Otros Clorofila A ns ns Cheng y Chang 1983 Clorofila B ns ns Cheng y Chang 1983 Ácido cítrico ns 0,535 Cheng y Chang 1983 Ácido fórmico ns 0,817 Cheng y Chang 1983 Glucosa Hojas ns Viana y Metivier 1980 Indol-3-acetronitrilo Semillas ns Randi y Felipe 1981 Ácido láctico ns 0,26 Cheng y Chang 1983 Ácido málico ns 0,188 Cheng y Chang 1983 Ácido succinico ns 0,4 Cheng y Chang 1983 Sacarosa Hojas ns Viana y Metivier 1980 Taninos Hojas 7,8 Resenack 1908 Ácido tartárico ns 1,715 Cheng y Chang 1983

Fuente: (Kennelly, 2000)

14

S. rebaudiana crece en corto tiempo, y según las condiciones de crecimiento, puede

elevar el nivel de esteviósido (1). Cheng et al, en 1983, examinaron niveles post-

cosechas de esteviósido (1) y rebaudiósido A (2), y encontraron que en S.

rebaudiana en aire seco, de cuatro a siete días, y una humedad relativa de 15-20%,

el nivel de esteviósido (1) y rebaudiósido A (2) decrecen significativamente. La

temperatura óptima para la producción de esteviósido se ha reportado de 25º/20º (día

y noche) (Mizukami et al, 1983). Estudios de rutas biosintéticas del esteviósido (1)

llevan a aislar un (-)-kaureno (D,L-Sodiomevalonato), en los tallos de la S.

rebaudiana. Este componente, y el ácido-kaureno- 16-en-19-oico, son considerados

como los precursores de la biosíntesis del esteviósido (1) (Hanson y White 1968).

En otro estudio biosintético, realizado por Alves and Ruddat (1979), aislaron

giberilina A20 de los tallos y hojas de S. rebaudiana y propusieron al esteviol como

precursor de C-13 hidroxi-gibberelinas.

1.3.2 Labdanos

Además de los ent-kaurenos diterpénicos, un número de labdanos tipo diterpénicos,

han sido identificados en las hojas de la S. rebaudiana. Dos de los conocidos

labdanos diterpénicos; jhaol (11) y austroinulina (12), y un nuevo diterpeno, 6-O-

acetilaustraluina (13), fueron aislados por Sholichin en 1980, a partir de la

extracción metanólica de las hojas de S. rebaudiana. Los labdanos fueron

identificados usando las técnicas de 1H-NMR, 13C-NMR, UV, y saponificación de

los componentes que producen la austroinulina (12). El jhaol (11), austroinulina(12)

y el 6-O-acetilaustroluina (13), se han identificado en las flores de S. rebaudiana.

También se conocieron otros labdanos, como 7-O-acetilaustraloina (14) en una

cantidad de 0,04, 0,21, 0,18 y 0,08% m/m respectivamente ver cuadro1. (Darise et

al.1983).

15

O

CH2OH

Jhanol (11)

R1

R2

OH1

10

5

18 19

20 17

1216

15

HR1

R2

OH

O

110

5

18 15

12

Figura 3. Estructura de labdanos tipo diterpénicos aislados en S. rebaudiana.

Fuente: Kennelly (2000)

Componente R1 R2

Austroinolina (12) OH OH 6-O-Acetilaustroilina (13) OAc OH 7-O-Acetilaustroilina (14) OH OAc

Componente R1 R2

Esterbina A (15) OH OH Esterbina B (16) OAc OH Esterbina C (17) OH OAc Esterbina D (18) H OH

16

De las hojas de S. rebaudiana se aislaron una serie de ocho labdanos tipo

diterpénicos, las esterebinas A, B, C, D, E, F, G, H (15-22), que fueron identificadas

por Oschima y sus colaboradores entre 1986 y 1988.

El análisis espectroscópico para la esterebina A reveló que su estructura general está

relacionada con la austroluina, tienen dobles enlaces trans, dos secundarios, y un

hidroxilo terciario (Oschima y et al.1986-1988). La estructura de la esterebina A

(15) fue verificada por la preparación de sus benzoil derivados, usando cloruro de

benzoilo en piridina en presencia de ρ-dimetilamino piridina, produciendo el

dibenzoato que luego fue hidrogenado con la catálisis paladio-carbón para obtener la

cetona saturada, que confirmó la absoluta estereoquímica de C-6 y C-7 como R y S

respectivamente (Oschima y et al.1986; 1988).

La esterebina B (16), fue saponificada con una disolución de hidróxido de potasio

1N, produciendo la esterebina A (15), indicando que esto podría ser monoacetato de

esterebina A (15). La esterebina C (17), fue encontrada por tener la misma fórmula

molecular que la esterebina B (16), y similar espectro 1H-NMR. El análisis

cuidadoso del 1H-NMR, 13C-NMR, revela que la esterebina C (17), tiene un grupo

funcional acetato en el C-7, mientras que la esterebina B (16), lo tiene en el C-6,

(Oschima y et al.1986; 1988). La esterebina D (18), es diferente a las esterebinas A,

B, C, (15-17) porque expone un sola señal cerca de 3.5 ppm en el espectro 1H-NMR.

A partir del análisis de los valores de la J (constante de acoplamiento) de estos

protones, fue determinada la esterebina D, que contiene un grupo hidroxilo

orientado en posición ecuatorial en C-7(Oschima y et al,1986).

Las esterebinas A, B, C, y D (15-18) se encontraron en bajas concentraciones en las

hojas de S. rebaudiana; cerca de 0,001%, 0,0009%, 0,003%, y 0,0004% m/m

respectivamente (cuadro 1). Los datos del 1H-NMR y 13C-NMR, para la esterebina E

(19) indica la ausencia de un grupo carbonilo, encontrado en las esterebinas A, B, C,

D (15-18), además de la presencia de una trisustitución de un doble enlace, una

disustitución en otro doble enlace, y un 5-hidroxi-3-metil-1,3-pentadienil al lado de

la cadena en C-9 (Oschima y et al.1988).

17

HOH

OH

OH

OH

HOH

OH

OH

OH

HOH

OH

OH

OHH2COH

Esterebina E (19) Esterebina F (20) Esterebina G (21)

(La esterebina G y H (22) son epímeros en el C-14)

Figura 4. Estructura de labdanos diterpénicos aislados en S. rebaudiana.


La esterebina F (20) (6α, 7β, 8α, 11E ,13 Z), fue encontrada por ser el C-13 isómero

geométrico de la esterebina E (6α, 7β, 8α, 11E ,13E). Aunque los anillos A-B de la

esterebina G (21) y H (22) fueron determinados de la misma manera que la

esterebina E (19) y F (20), en la esteberina G (21) se encontró un grupo 4,5-

dihidroxi-3-metileno-1-pentyl en el C-9. Las esterebinas G (21) y H (22) son

idénticas, pero difieren en los isómeros posiciónales del C-14. Es bajo el porcentaje

reportado para las de esterebinas E, F, G, H, (19-22) en S. rebaudiana; 0,002%,

0,003%, 0,0002% y 0,0002% (m/m) respectivamente (ver cuadro 1). (Oschima y et

al,1988).

1.3.3 Triterpenos esteroidales

El triterpenoide, acetato de β-amirina, y tres unidades no identificadas de ésteres del

lupeol, fueron obtenidos desde la partición no polar, del extracto crudo metanólico

de las hojas de S. rebaudiana

18

AcO H acetato de β-amirina (23)

H

H

H

CH3(CH2 )14COO

3-palmitato de Lupeol (24)

R1O

R2

R1 R2

β-Sitoesterol (25) H CH3

Campesterol (26) H H β-Sitoesterol β-D-glucosa (27) Glu CH3

19

RO

R

Estigmaesterol (28) H

Estigmaesterol β-D-glucosa (29) Glc

Figura 5. Estructura de triterpenos esteroidales aislados en la S. rebaudiana.


Se identificó al éster, 3-palmitato lupeol (24), obtenido a partir de la extracción

metanólica de S. rebaudiana, por cromatografía de gases y espectroscopia de masas.

El β-sitoesterol (25) y el estigmaesterol (28) (figura 5), fueron encontrados en la S.

rebaudiana en un porcentaje de 39,4% y 45,5% m/m. El campesterol (26) fue

identificado por cromatografía de gases y espectroscopia de masas, este compuesto

se encuentra en un 13,1% de la fracción total de esterol presente en la planta.

(Kennelly, 2000). Matsuo, et al 1986, aisló dos esteroides glucosidados;

estigmaesterol-β-D-glucosa (29) y el β-sitoesterol-β-D-glucosa (27), sus estructuras

fueron identificadas con la ayuda de 1H-NMR y espectroscopia de masa.

1.3.4 Flavonoides

El estudio de los flavonoides que contienen las hojas de S. rebaudiana, fue

realizado por Rajbhandari y Roberts, en 1983 dio como resultado la identificación

de seis flavonoides glicosidados en la fracción del acetato de etilo, estos son: la

apigenina- 4-O-glicósidos (30), kaemferol-3-O-rhamnosido (31), luteolin-7-O-

20

glucósido, quercitina-3-O-glucósido (32), 3-O-rhamnosido (35) (quecitina). Estos

compuestos fueron identificados usando métodos estándares de UV,1H-NMR y

espectroscopia de masas.

O

O

R1

OH

R2

R3

R4

R5

2

34

5

6

78

1'

2'3'

4'

5'

Componente R1 R2 R3 R4 R5

(30) Apigenina-4-O-glucósido H H OH H Glu

(31) Kaempferol 3-O-Rhamnosido Rha H OH H OH

(32) Luteolin 7-O-glucósido H H Glu OH OH

(33) Quercitina 3-O-glucósido Glu H OH OH OH

(34) Quercitina 3-O-arabinosa Ara H OH OH OH

(35) Quercitina 3-O-rhamnósido Rha H OH OH OH (36) Centauridina OMe OMe OH OH OMe

(37) Apigenina-7-O-glucósido H H Glu H OH

(38) Quercitina 3-O-rutinósido Rut H OH OH OH

Glu= O-β-D-glucopiranosil; Rha=O-α-L-rhamnopiranosil; Ara= O-α-D-arabinopiranosil; Rut= 6-O-α-L-rhamnopiranosil-D-glucopiranosil.

Figura 6. Estructuras de flavonoides aislados de S. rebaudiana

21

A partir de la extracción con cloroformo, se encontraron flavonoides metoxilados,

3,5,7-trihidroxi-3,4,6-trimetoxiflavona (centaureidina) (36), también aislados por

Rajbhandari y Roberts en 1983. Ellos identificaron, a partir de las hojas de S.

rebaudiana la apeginina 7-O-glicosidada (37). Un cultivo celular de S. rebaudiana

exhibía un notable color amarillento con una pigmentación. Esta pigmentación sería

identificada como el flavonoide glicosidado rutina (quercitina 3-β-rutinósido), con

un 0,0007% del peso del cultivo celular fresco (Suzuki 1977).

1.3. 5 Aceites esenciales.

Los aceites esenciales de las hojas de S. rebaudiana que se han estudiado son:

algunos monoterpenos, sesquiterpenos, aldehídos, alcoholes aromáticos. Estos

fueron identificados por Fujita et al, 1977, y Martelli en 1985, utilizando las técnicas

de GC-MS, Fujita et al, 1977, fue capaz de identificar 32 compuestos de aceites

esenciales de S. rebaudiana, incluyendo los sequiterpenos β-cariofenileno, trans-β-

farneseno, α-humuleno, δ-cardineno, oxido de cariofenileno, nerolidol, y los

monoterpenos, linalol, terpinen-4-ol y el α-terpineol, identificado como el

constituyente mayoritario. Además, 22 picos fueron notados por GC, MS e IR, pero

no pudieron ser identificados.

En otro estudio con las hojas secas de S. rebaudiana, extrayendo los aceites con la

técnica de arrastre con vapor de agua, encontraron el óxido cariofenileno y

espatunelol, componentes mayoritarios que fueron separados por cromatografía de

columna. El remanente con los constituyentes minoritarios, analizados por las

técnicas GC-MS, mostraron más de 100 picos, de los cuales 54 fueron identificados

por Marrtelli, 1985.

1.3.6 Otros componentes

Un número de compuestos variados se identificaron en S. rebaudiana, estos son los

pigmentos de clorofila A, B, y β-carotenos. El ácido tártarico es el ácido mayoritario

22

orgánico en el extracto de S. rebaudiana, seguido por el cítrico, fórmico, láctico,

málico y succínico, identificados por Cheng y Chang en 1983.

La fitohormona, indol-3-acetonitrilo, fue reportada en las semillas de S.

rebaudiana. Esta fue identificada por Randi y Felipe, 1981, utilizando tiempos de

retención y pruebas de color. Chung y Lee, en 1978, identificaron taninos no

especificados.

Cuadro 2: Aceites esenciales identificados en S. rebaudiana.

Clase de compuesto Sustancia %(m/m) en la hierba seca

Monoterpenos Borneol Alcanfor 0,0017 Carvacrol

1,8 Cineoleno 0,0008 ρ-Cimeno 0,0008 Geraniol 0,0016 Limoneno 0,0001 Linalol 0,0067 cis-óxido de linalol 0,0026 trans-óxido de linalol 0,0029 Mircerno Mirternal Mirternol α-Pineno 0,0005 β-pineno 0,002 Pinocarveol Pinocarvoneno Sabineno γ-Terpineno 0,0002 Terpinen-4-ol 0,0012 α-Terpineol 0,0054 Terpinoleno trans-Verbenol Sesquiterpenos β-Bergamoteno

Bisaboleno

23

Clase de compuesto Sustancia %(m/m) en la hierba seca

γ-Cardineno 0,0034 δ-Cardineno 0,0012 α-Cardiol 0,0017

terc-Carninol 0,0028 α-Calacoreno 0,0024 Calameneno 0,0018 β-Cariofileno 0,0013 óxido de cariofenileno 0,0188 α-Copaeno 0,0001 α-Cubebeno 0,0001 β-Elemeno 0,0006 γ-Elemeno trans-β-Farneseno 0,0008 Germacreno D α-Humuleno 0,0029 β-Ioneno Epoxi-β-ioneno Nerolidol 0,0088 β-Selinoneno 0,0029 Espatulenol Torreiol

Otros compuestos Anetol

alcohol bencílico 0,0012 aldehído cumínico Eugenol n-hexanal 0,01 cis-Hex-3-en-1-ol trans-Hex-2-en-1-ol Hex-3-enilacetato

Hex-3-enil-2 metilbutanona

Hexan-1-ol 0,9 Metileugenol Octa-3-ol 0,0004 Octa-2-3-diona Octa-1-3-ol 0,0008 ácido pentanoico 2-pentilfurano Feniletil valerato

24

Los compuestos inorgánicos comprenden aproximadamente un 13% del total

extraíble en S. rebaudiana, siendo el potasio el mayor constituyente inorgánico en el

extracto. Otras sustancias inorgánicas que encontraron Cheng y Chang, 1983,

incluyen al calcio, hierro, magnesio, fósforo, sodio y zinc.

1.4 Stevia rebaudiana y la salud

Todos los estudios fitoquímicos realizados a S. rebaudiana durante los últimos años,

comprueban la existencia de una gran diversidad química, que explica el por qué S.

rebaudiana da buenos resultados cuando se ha utilizado en la medicina indígena y

popular. Una notable característica es su buen sabor, Soejarto, 1984, combinado con

sus virtudes medicinales. Una de esas virtudes es su actividad anti-microbiana,

(Bruneton1995) debida a los aceites esenciales de fuerte e irritante olor.

De acuerdo con las normas aprobadas en el año 1931 por la " Unión Internacional de

Química" reunida en Dinamarca, se le dio el nombre esteviósido, al grupo de

compuestos edulcorantes. Los estudios realizados por diferentes investigadores en

distintos años, determinaron que el esteviósido es bien tolerado y efectivo, pudiendo

ser tomado en cuenta como alternativa para pacientes diabéticos, ya que actúa

estimulando en forma directa las células beta del páncreas, generando así una

secreción considerable de insulina (Suzuki, H. 1977).Alrededor de 1000 toneladas

anuales de extracto de S. rebaudiana son consumidos en Japón, sin que hasta el

momento se hayan denunciado efectos tóxicos por el Japanese Food and Drug

Safety Center.

Este hecho ha cobrado vital relevancia a la luz de los comentarios surgidos por el

uso de otros edulcorantes de síntesis tal como el aspartame, que en principio no

tendría el mismo margen de seguridad. Algunos de los edulcorantes a base de S.

rebaudiana que hoy existen el mercado son: Sweet leaf products, Herbal Coffe,

Migra Spray, Stevia Clear, Stevia extracto, Stevia Spoonable, entre otros.

Los indígenas guaraníes y otras poblaciones que consumían periódicamente S.

rebaudiana en Suramérica, no presentaban problemas de caries, y de echo existe un

25

estudio que comprueba el efecto anticaries de esta hierba, pero no se conoce sobre

los efectos de S. rebaudiana en la enfermedad periodontal. Sería muy interesante

encontrar un producto natural que contenga ambos beneficios. ( Kinghorn y Soejarto

1985)

Cuadro 3. Estudios Fitoquímicos y actividades biológicas realizadas a S.

rebaudiana Especie Investigación química/ Bioensayos(Referencia)

S. rebaudiana

Efecto antibacterial Anonimo1980, Dao y Le 1995.

Efecto anticaries Pinhiero et al, 1987.

Efecto anticonceptivo Planas y Kuc, 1968.

Efecto antiedema Yasukawa et al, 1993

Efecto antifúngico Takaki et al, 1985.

Efecto antihiperglucémico en conejos Suzuki et al.1977, Harmini 1986.

Efecto hipoglicémico en Humanos Oviedo et al, 1970; Álvarez et

al,1981.

Inhibición de la fosforilación Oxidativa Bracht et al, 1981.

Inhibición de la Peroxidasa Dao y Le, 1995.

Fuente: Kinghorn y Soejarto (1985). 1.5. Enfermedad periodontal en canes: En esta investigación se realizaron estudios químicos a los extractos de S.

rebaudiana y ensayos biológicos de dichos extractos en canes, con el objeto de

encontrar un tratamiento efectivo para aliviar la enfermedad periodontal. Este

trabajo tiene como propósito realizar un análisis de los extractos de S. rebaudiana

que podrían ser coayudantes en el tratamiento de la enfermedad periodontal en

canes, lo cual nos servirá de base para establecer una secuencia en la parte humana.

26

En la mayoría de los hogares costarricenses encontramos canes como mascotas. Se

ha observado que el 85% de perros a los tres años de edad, ya tienen establecido el

padecimiento periodontal, lo que a corto plazo representa serias consecuencias

nutricionales, depresiones e irritabilidad, que pueden provocar cambios en la

conducta animal, desencadenando agresividad. Al presentar los perros una salud

periodontal defectuosa, se verán afectados psicológicamente, y al no poder consumir

sus alimentos habituales, no adquirirán los factores nutritivos indispensables para la

vida (Berkow, 2002). Es de sobra conocido que la cavidad oral es el medio más

inmediato para captar nuestras necesidades de alimentación, y en el que repercuten

toda una serie de alteraciones patológicas, sino se le trata con la debida atención.

Un beneficio que se les podría ofrecer seria la elaboración de un producto a base de

la planta antes mencionada, que pueda controlar el problema destructivo en

odontología y justificar el estudio propuesto, además de promocionar la odontología

veterinaria, que es una práctica cotidiana en otros países.

Referente a la cavidad oral, debemos recordar que la enfermedad periodontal afecta

a grandes poblaciones, tanto humanas como animales, tal el caso de los perros. En

la práctica odontológica veterinaria es común que los problemas que derivan de esta

enfermedad terminen en exodoncias, debido a que los profesionales veterinarios que

la practican no le dan seguimiento adecuado a sus pacientes, o los dueños no saben o

se les dificulta realizarles una adecuada higiene oral.

La enfermedad periodontal es una enfermedad que afecta las encías y la estructura

de soporte de los dientes. Las bacterias presentes en la placa causan esta

enfermedad, de manera que si la placa no se retira diariamente con el cepillo y el

hilo dental, esta se endurece y se convierte en una sustancia dura y porosa llamada

cálculo o sarro (Carranza A, 1998). Las toxinas que se producen por la presencia de

las bacterias en la placa irritan las encías, y ante un deficiente cuidado bucal,

provocan que las encías se desprendan de los dientes y se forman las bolsas

periodontales, las cuales se llenan de más toxinas y bacterias. Conforme la

enfermedad avanza, las bolsas se extienden y la placa penetra más y más hasta que el

27

hueso que sostiene al diente se destruye. Eventualmente, el diente se caerá o

necesitará ser extraído. (Carranza, 1982).

Por lo tanto, el cuidado oral debe permanecer constante en cualquier organismo para

no padecer a corto o mediano plazo de las dolencias que se presentan en la cavidad

oral, y que tienden a repercutir ampliamente en el resto del individuo.

A continuación se presentan imágenes de canes con enfermedad periodontal:

Fotografía 2. Enfermedad periodontal en canes Fuente: (Consultorio Veterinario, Collados J, 2005)

1.6 Inflamación en la enfermedad periodontal.

La enfermedad periodontal es una serie de cambios que se asocian a la inflamación y

a la pérdida de las estructuras profundas de los dientes.

Las partículas de alimento y las bacterias se recogen a lo largo de la encía, formando

la placa bacteriana. Si la placa no se elimina, los minerales de la saliva se combinan

con ésta y forman el cálculo, que se adhiere fuertemente a los dientes. La placa

comienza a mineralizar de 3 a 4 días después de formada. El cálculo es irritante para

las encías y causa una inflamación llamada gingivitis. Esto se puede ver como el

enrojecimiento de las encías adyacentes a los dientes, también causa el mal aliento.

(Carranza A, 1998).

La enfermedad periodontal es un proceso inflamatorio del tejido periodontal que es

causado por infecciones bacterianas, entre ellas infecciones causadas por bacterias

gramnegativas anaerobias.

28

La cavidad bucal es un ecosistema complejo y denso, compuesto principalmente por

estreptococos del grupo viridans y bacterias anaerobias. Los microorganismos

predominantes son Streptococcus sanguis, Streptococcus mútans, Streptococcus

mitis, Streptococcus salivarius, Peptoestreptococcus sp., Micrococcus sp.,

Enterococcus sp., Neisseria sp., Veillonella sp., Actinomyces sp., Lactobacillus sp.,

Bifidobacterium sp., Corynebacterium sp., Provetella sp., Porphyromonas sp.,

Fusobacterium sp., Capnocytophaga sp., Actinobacillus sp., Selenomonas sp.,

Eikenella sp., Campylobacter sp., Treponema sp., etc. Aunque pueden aislarse en

toda la cavidad oral, presentan una marcada predilección por determinados nichos.

Así, S. sanguis, S. mutans, S. mitis y Actinomyces viscous, colonizan

fundamentalmente la superficie del dientes; S. salivarius y Veillonella sp., en la

lengua y la mucosa bucal y Fusobacterium sp., Prevotella sp., Prophyromonas sp. y

espiroquetas anaerobias, en la cresta gingival (Carranza A, 1998).

11..77 OObbjjeettiivvoo ggeenneerraall

El objetivo de esta investigación consiste en estudiar extractos de Stevia rebaudiana

y evaluar sus efectos en la cavidad bucal de un grupo de doce caninos del Refugio

de Animales de San Rafael de Heredia, afectados con enfermedad periodontal.

Objetivos específicos:

1. Preparar un extracto crudo y particiones de las hojas frescas de S. rebaudiana.

2. Verificar la toxicidad y la actividad antioxidante del extracto crudo.

3. Realizar, un estudio de la naturaleza de los metabolitos segundarios presentes en

el ó los extractos que presentan mayor actividad utilizando métodos de

cromatografía de capa fina, asi como reveladores químicos y físicos.

4. Analizar, por medio de un informe de patología de tejidos orales, y la medición de

bolsas periodontales del grupo control y experimental, el efecto de los extractos en

el tratamiento de la enfermedad periodontal.

29

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII

2. METODOLOGÍA.

2.1 Recolección Los ejemplares de S. rebaudiana se recolectaron en un vivero ubicado en el Millón

de Cariari, Limón en Febrero del 2005.

2.2 Obtención del extracto crudo.

En los laboratorios del área de Biodiversidad de la Escuela de Química, en la

Universidad Nacional, se extrajeron a temperatura ambiente, con la ayuda de un

recipiente, y etanol al 95%, los principales metabolitos que contiene S. rebaudiana.

Se cortaron en trozos pequeños de aproximadamente de 1 cm2, 2 kg de las hojas

frescas de S. rebaudiana, de tal manera que proporcionara un mayor contacto con el

etanol.

El material vegetal se extrajo por un período de cuatro días, al cabo de los cuales se

filtró la solución resultante. Esta solución se concentró en un evaporador rotatorio a

menos de 40° C; se obtuvo un extracto crudo con un volumen aproximado de 500

mL. Este extracto se probó sobre lesiones periodontales de los caninos, tal y como

se detalla en el inciso 2.6.

2.3 Determinación cualitativa de los metabolitos secundarios del extracto crudo.

Con el objeto de poder evaluar la presencia de diferentes de tipos de metabolitos

secundarios presentes en el extracto crudo, se tomó una porción muy pequeña (par

de gotas) de dicho extracto, que se disolvió en etanol al 95%. Se aplicó una

microgota de esta disolución, sobre una placa de cromatografía con gel de sílice.

Con la ayuda de diferentes eluentes (hexano, diclorometano, acetona-diclorometano,

acetona, etanol) y agentes cromogénicos como vainillina y lámpara ultravioleta se

determinaron los tipos de metabolitos mayoritarios. Con el resto del extracto, se

30

realizó una partición con diclorometano y se tomó en cuenta el remanente acuoso;

además la obtención de aceites esenciales por de arrastre con vapor. Todos estos

extractos, fueron concentrados en un evaporador rotatorio a menos de 40°C. Cada

uno de los extractos fue analizado por cromatografía con gel sílice.

Las particiones anteriores, se utilizaron para realizar bioensayos (de la misma

manera que se procedió con en el extracto crudo) tendientes a corroborar su

efectividad en el tratamiento de la enfermedad periodontal en los caninos del

Refugio de Animales en San Rafael de Heredia.

2.4 Evaluación de la actividad antioxidante.

Este método identifica compuestos que protegen las células contra los efectos

dañinos de especies reactivas de oxígeno tales como los radicales de peróxidos e

hidroxilo. (Pryor, 1986).

Parte Experimental:

Para la búsqueda de agentes que capturan radicales libres puede emplearse un

bioensayo “in vitro”, que se fundamenta en el radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-

hidrazilo hidratado) de color violeta intenso. Al ser capturado su radical libre, el

compuesto pierde su color característico. Es posible cuantificar la capacidad

capturadota de radicales libres que poseen distintas sustancias, mediante la

determinación del grado de decoloración que dichos compuestos provocan a una

disolución metanólica de DPPH.

Para ello se preparó una disolución metanólica fresca del radical DPPH 20 mg/L

(debe ser preparada en el momento de realizarse la práctica y protegerla de la luz),

además se prepararon soluciones metanólicas de los compuestos a ensayar, a

concentraciones de 100 µg/mL, 10 µg/mL y 1 µg/mL.

Cuando se realizó el ensayo se mezcló 1.5 mL de la disolución del DPPH (20 mg/L)

y 750 µL del extracto en tres concentraciones 100 µg/mL, 10 µg/mL y 1 µg/mL. Se

preparó además un blanco que contenía 1.5 mL de la disolución del DPPH (20

mg/L) y 750 µL de agua desionizada.

31

Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante cinco minutos y se les

midió la absorbancia a 517 nm, ajustando el espectrofotómetro a cero con la mezcla

metanol: agua (2:1). (Joyeux et al, 1995)

Se calculó el porcentaje de decoloración (capacidad capturadota de radicales libres)

con la siguiente fórmula:

Capacidad de decoloración % = 1- [absorbancia del compuesto] x 100

absorbancia del blanco

2.5 Verificación de la toxicidad del extracto crudo de S. rebaudiana.

El método para estudiar la toxicidad del extracto crudo de S. rebaudiana es el

llamado: “examen de mortalidad en camarones de agua salada”, que es un

procedimiento simple, rápido y satisfactorio, que bien puede adaptarse al estudio de

la bioactividad de los compuestos. La Artemia salina es un simple camarón que se

utilizó para este propósito. Este camarón es un crustáceo que se encuentra en aguas

muy saladas en donde difícilmente lo alcanzan depredadores.

Los huevos deshidratados de Artemia salina se pueden mantener por mucho tiempo.

Para volver a encubarlos solo se regresan a una solución salina y se esperara de 16 a

36 horas, para que las larvas comiencen a nadar libremente.

Para iniciar este examen de toxicidad se utilizó 5 mL del extracto en

concentraciones de 10, 100 y 1000 ppm, en viales que contengan larvas de

camarones en agua de mar. Después de 24 horas se contaron a los camarones

sobrevivientes. Con la ayuda de un programa de análisis de probabilidad en

computadora se estimó el LC50 con 95% de intervalo de confianza.

Se pesó 20 mg del extracto crudo de S. rebaudiana y se le adicionó 2 mL de

disolvente para obtener una concentración de 1000 ppm, y de esta se tomó 0.5 mL

para agregar a un vial (se hicieron tres muestras).

De la disolución de 1000 ppm se tomó 0.2 mL y se le adicionó 1.8 mL de disolvente

para obtener una concentración de 100 ppm, de esta se agregaron 0.5 mL a un vial

(se hicieron tres muestras).

32

Se tomó 0.2 mL de la disolución de 100 ppm y se le adicionó 1.8 mL de disolvente

para obtener una concentración de 10 ppm. A esta se agregan 0.5 mL, en un vial (se

hicieron tres muestras). El volumen total de cada vial debió ser de 5 mL con el

extracto y el agua de mar incluidos.

Los huevecillos de los camarones de agua salada se encubaron con agua de mar

artificial de las que proveen los acuarios. Después de 48 h de incubación, a una

temperatura de 22-29 ºC, las larvas fueron recolectadas con una pipeta pasteur para

colocarlas en un beaker con agua marina artificial.

En cada vial se colocaron de 10-15 larvas y después de 24 h se contaron cuantos

murieron. Para calcular el LD50 se utilizó un programa de computadora antes

mencionado.

2.6 Evaluación del efecto de los extractos de S. rebaudiana en caninos con

enfermedad periodontal.

Los bioensayos se realizaron con la ayuda de un equipo multidisciplinario, integrado

por el Doctor Veterinario Carlos Moncada del Refugio de Animales en San Rafael

de Heredia, el patólogo Eduardo Zamora de la Escuela de Medicina de la

Universidad de Costa Rica, los histotecnólogos, Juan José Ramírez de la

Universidad Veritas y Mario Arce de la escuela de medicina en la Universidad de

Costa Rica y el odontólogo José Elizondo de la Universidad Veritas.

Para este estudio se seleccionaron doce canes del Refugio de animales, mayores de

tres años de edad, como modelos experimentales para comprobar el efecto de S.

rebaudiana en el tratamiento de la enfermedad periodontal. De estos, se tomaron a

dos caninos como el grupo control y a los diez restantes, como el grupo

experimental. Se sedaron (fotografía 3), y se les realizó un examen clínico de las

piezas dentales.

33

Fotografía 3. Sedación de los canes antes de realizar el examen clínico y la profilaxis, 2005

Se les midió el índice de placa y la profundidad de las bolsas periodontales por medio de sondeo, como se muestra la fotografía 4.

Fotografía 4. Medición de la bolsa periodontal, 2005.

Se procedió al tratamiento peridontal, el cual consiste en un raspado y alisado

manual de las piezas dentales afectadas para eliminar el cálculo (fotografía 5).

34

Fotografía 5. Raspado y alisado manual de las piezas afectadas, 2005.

Se tomaron biopsias del tejido blando, bajo total anestesia (fotografía 6), con el

objetivo de medir la efectividad de los diferentes extractos en el tratamiento de la

enfermedad periodontal, comparado con la evolución del grupo control.

Fotografía 6. Toma de biopsia, 2005.

Cuando el odontólogo realizó el examen clínico de las piezas al grupo experimental,

dividió la cavidad bucal de los canes en cuadrantes, con el objeto de que a cada

35

perro se le aplicara en un cuadrante de su cavidad bucal, el extracto crudo

(fotografía 7), en otro cuadrante, el extracto polar, en otro, el extracto no polar, y en

el último, cuadrante los aceites esenciales. Para asegurar la fijación de los extractos

en el tejido blando de la encía, se les aplicó gel foam saturado con el extracto.

Fotografía 7. Aplicación del extracto con la ayuda del gel foam, 2005.

La toma de muestra del tejido post tratamiento se realizó después dieciséis días de

aplicación continua de los extractos (la aplicación de los extractos fue de una vez al

día. Estas muestras de tejidos fueron procesadas histopatológicamente para la

observación de parámetros como: infiltrado inflamatorio, congestión vascular,

diferenciación entre el nuevo tejido y el tejido viejo, contaminación bacteriana y

proliferación de células como los fribloblastos y células endoteliales.

2.6.1 Tratamiento histoquímica de los tejidos.

Las muestras de tejidos, inmediatamente después de ser tomados, se colocaron en un

recipiente con formaldehído al 10%, esto con el fin de que las características del

tejido a la hora de la toma de muestra, se mantuvieran intactas hasta el momento de

su análisis.

36

Los tejidos se colocaron en un vial al cual se le añadieron aproximadamente 10 mL

de etanol al 95%, se dejaron reposar por 15 min, en una cámara donde se evitó el

contacto con la humedad del ambiente, después de los 15 min, se elimina el

contenido de etanol (se repitió este procedimiento dos veces ).

Se siguió el mismo procedimiento, pero disminuyendo la polaridad del disolvente;

primero con etanol al 100% y luego xilol.

El último paso fue dejar reposando por 15 min el tejido con parafina (esta parafina

contiene DMSO (dimetilsulfóxido) que permite mejor penetrabilidad de la parafina

al tejido), después de los 15 min, se derritió la parafina para separarla del tejido (se

repitió este procedimiento dos veces).

Todo esto se hizo con el fin de eliminar el agua contenida en el tejido e incluirlo en

bloques de parafina de 20 cm2.

Estos bloques de parafina fueron necesarios para realizar cortes de 0.5 micras de

ancho del tejido en el micrótomo.

Estos cortes se colocaron en portaobjetos con el fin de teñirlos con hematoxicilina y

eiosina para poder observarlos al microscopio y tomar las fotografías que se

muestran en la sección 3.4 del informe de patología.

2.7. Reactivos utilizados en la investigación.

Etanol 95 % para análisis.

Etanol 100 % (grado histológico).

2,2-difenil-1-picril-hidrazilo hidratado para análisis

Folrmaldehído al 10 % para síntesis.

Xilol para síntesis.

Parafina con dimetilsulfóxido

Hematoxicilila y eiosina

Acetona para análisis

Diclorometano para síntesis.

Hexano para síntesis.

Vainillina para análisis

37

CAPÍTULO III

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Evaluación de la actividad antioxidante.

La muestra del extracto crudo de S. rebaudiana, con una concentración 100 µg/mL,

reportó una absorbancia promedio de 0,255, a una longitud de onda de 517nm, y una

capacidad de decoloración del 37,00%. La muestra de concentración 10 µg/mL,

presentó una absorbancia promedio de 0,399, con una capacidad capturadora de los

radicales libres del 1,80 %. Por último la muestra de concentración de 1 µg/mL dio

un valor de absorbancia de 0, 407 con 0 % de capacidad de decoloración; valores no

significativos en comparación con la vitamina C, un excelente antioxidante.

3.2. Evaluación de la toxicidad.

La evaluación de la toxicidad del extracto crudo de S. rebaudiana se realizó

mediante el bioensayo denominado examen de toxicidad con camarones (Artemia

salina leach) salinos, y después de 24 h de incubación, no murió ninguna larva y se

identifico una (dosis letal del 50%) LD50 = 0.

3.3. Medición de las bolsas periodontales.

3.3.1. Medición de la eficacia en la reducción de la longitud de las bolsas

periodontales con la aplicación del extracto de Stevia rebaudiana bertoni.

La medición de bolsas periodontales, se utilizó para diagnosticar tempranamente la

enfermedad periodontal. Las bolsas periodontales se midieron en mm, de acuerdo

con la profundidad y la separación que tenga el tejido gingival del diente. Existe

presencia de enfermedad periodontal cuando la medida del sondeo sea mayor a 3

mm. Las bolsas periodontales se tomaron como otro parámetro para medir la

presencia de la enfermedad periodontal en los canes del Refugio de Animales de San

Rafael de Heredia. Se practicó un sondeo inicial.

38

En el gráfico 1, se valoraron los efectos de los extractos de S. rebaudiana en la

medición de bolsas periodontales, en la cavidad bucal del can denominado

Manrique. De acuerdo con dicha gráfico, se aplicó del extracto crudo en la pieza

108, extracto del aceite esencial en la pieza 208, extracto polar en la pieza 408 y

extracto no polar en la pieza 308. El extracto que brindó mayor beneficio para el

canino, fue el extracto crudo porque el canino presentó una bolsa periodontal inicial

de 5 mm y luego del tratamiento el sondeo tuvo un resultado de 1 mm. El extracto

que benefició en menor medida al can fue el polar, con el cual se obtuvo una mejoría

de 2 mm en la bolsa periodontal de la pieza 408.

5

1

4

1

3

1

4

1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

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4,5

5

ME

DIC

IÓN

DE

BO

LSA

P

ER

IOD

ON

TA

L

crudo aceiteesencial

polar no polar

Extractos de S. rebaudiana

*Fuente: Recolección de datos Seiling Vargas y José Elizondo.

Gráfico 1: Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana bertoni en la

medición de bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Manrique

Bolsas pretratamientoBolsa postratamiento

En el gráfico 2, se valoraron los efectos de los extractos de S. rebaudiana Bertoni,

en la medición de bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado

39

Pinto. Se aplicó extracto crudo en la pieza 108, extracto del aceite esencial en la

pieza 208, extracto polar en la pieza 408 y extracto no polar en la pieza 308.

Si se analiza el extracto que brindó mayor beneficio para el canino, se debe tomar la

pieza 108, con el extracto crudo; ésta presentó una bolsa periodontal inicial de 5 mm

y luego del tratamiento el sondeo tuvo un resultado de 1 mm. El extracto que

benefició en menor medida al can fue el polar, con el cual se obtuvo una mejoría de

1 mm en la bolsa periodontal de la pieza 408.

5

1

4

2

3

2

3

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0

0,5

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1,5

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4,5

5

ME

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IÓN

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BO

LS

A

PE

RIO

DO

NT

AL


polar no polar


* Fuente:Recolección de datos Seiling Vargas y José Elizondo.

Gráfico 2: Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana la medición de

bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Pinto


En el gráfico 3, se valoran los efectos de los extractos de S. rebaudiana en la

medición de bolsas periodontales, en la cavidad bucal del can denominado Peluche.

De acuerdo con dicha gráfico, se aplicó extracto crudo en la pieza 108, extracto del

aceite esencial en la pieza 208, extracto polar en la pieza 408 y extracto no polar en

la pieza 304. Si se analiza el extracto que brindó mayor beneficio para el canino, se

debe tomar la pieza 208, con el aceite esencial; ésta presentó una bolsa periodontal

40

inicial de 5 mm y luego del tratamiento el sondeo tuvo un resultado de 1 mm. El

extracto que benefició en menor medida al can fue el no polar, con el cual se obtuvo

una mejoría de 1 milímetros en la bolsa periodontal de la pieza 408.

4

1

5

1

3

1

2

1

0

0,5

1

1,5

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5

ME

DIC

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L


polar no polar


* Fuente: Recolección de datos Seiling Vargas y José Elizondo.

Gráfico 3: Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana en la medición de bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Peluche


En el gráfico 4, se valoran los efectos de los extractos de S. rebaudiana, en la

medición de bolsas periodontales, en la cavidad bucal del can denominado Gorda.

Se aplicó extracto crudo en la pieza 104, extracto del aceite esencial en la pieza 208,

extracto polar en la pieza 404 y extracto no polar en la pieza 308.

Si se analiza el extracto que brindó mayor beneficio para el can, se debe tomar las

piezas 208, con el aceite esencial, y la 308, con el no polar; ambas presentaron

bolsas periodontales iniciales de 4 mm y luego del tratamiento el sondeo tuvo un

resultado de 1 mm. El extracto que benefició en menor medida al can fue el polar,

con el cual se obtuvo una mejoría de 2 mm en la bolsa periodontal de la pieza 404.

41

4

2

4

1

3

1

4

1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

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3,5

4

ME

DIC

IÓN

DE

BO

LSA

P

ER

IOD

ON

TA

L


polar no polar

Extractos de Stevia rebaudiana bertoni


Gráfico 4 : Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana en la medición

de bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Gorda


En el gráfico 5, se valoran los efectos de los extractos de S. rebaudiana, en la

medición de bolsas periodontales, en la cavidad bucal del can denominado Carmen.

De acuerdo con dicho grafico, se aplicó extracto crudo en la pieza 108, extracto del


la pieza 308.

Si se analiza el extracto que brindó mayor beneficio para el can, se debe tomar la

pieza 108, con el extracto crudo, que presentó una bolsa periodontal inicial de 4 mm

y luego del tratamiento, el sondeo tuvo un resultado de 1 mm. El extracto que

benefició en menor medida al can fue el polar, con el cual se obtuvo una mejoría de

2 mm en la bolsa periodontal de la pieza 408.

42

4

1

5

2

3

1

3

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0,5

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2,5

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4

4,5

5M

ED

ICIÓ

N D

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OL

SA

PE

RIO

DO

NT

AL


polar no polar



Gráfico 5: Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana en la medición de

bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Carmen



medición de bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Tita. De

acuerdo con dicho grafico, se aplicó extracto crudo en la pieza 108, extracto del


la pieza 208.

Si se analiza el extracto que brindó mayor beneficio para el can, se debe tomar la

pieza 108, con el extracto crudo, que presentó una bolsa periodontal inicial de 4 mm

y luego del tratamiento el sondeo tuvo un resultado de 1 milímetro.

43

4

1

3

1

4

2

4

2

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0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

ME

DIC

IÓN

DE

BO

LSA

P

ER

IOD

ON

TA

L


polar no polar

Extracto de S. rebaudiana


Gráfico 6: Relación de los efectos de los extractos de Stevia rebaudiana bertoni en la

medición de bolsas periodontales en la cavidad bucal del can denominado Tita



medición de bolsas periodontales, en la cavidad bucal de los canes denominados

Firulay, Plinky, Negro y Ginger. En este caso se analizó la pieza más afectada por

la enfermedad periodontal y se le aplicó un extracto diferente a cada uno de los

canes. Se aplicó extracto polar en la pieza 204 del can Firulay, crudo en la pieza

204 del can Plinky, aceite esencial en la pieza 204 del can Negro y extracto no polar

en la pieza 204 del can denominado Ginger.

Firulay presentó una medición inicial de 3 mm y luego de aplicar el extracto polar

de S rebaudiana, presentó 1 mm en la bolsa periodontal de la pieza 204. El

extracto crudo se aplicó en la pieza 204 de Plinky, que inicialmente presentó un

sondeo de 6 mm, el cual mejoró con el tratamiento a 2 mm. El can denominado

Negro recibió del extracto aceite esencial en la pieza 204, la cual presentó una

mejoría de 3 mm a 1 mm en el sondeo. Por último, Ginger presentó una reducción

de 9 mm a 3 mm con la aplicación del extracto no polar en la pieza dental 204.

44

3

1

6

2

3

1

9

3

0

1

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9M

ED

ICIÓ

N D

E B

OL

SA

PE

RIO

DO

NT

AL

Firulais:polar

Plinky: crudoNegro: aceiteesencial

Ginger: nopolar


*Fuente: Recolección de datos Seiling Vargas y José Elizondo,.

Gráfico 7: Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana en la medición de bolsas

periodontales en la cavidad bucal de los canes denominados Firulay, Plinky, Negro y Ginger

Bolsas pretratamiento

Bolsa postratamiento

En el gráfico 8, se presentan los resultados obtenidos por parte de los canes control,

es decir, los canes a los cuales se les realizó la valoración inicial, raspado y alisado,

pero no se les aplicó ningún extracto de S. rebaudiana. En este gráfico se confirman

los beneficios que presenta la aplicación de los extractos sobre la enfermedad

periodontal, pues las bolsas periodontales de los canes control no mejoraron

significativamente. El can denominado Oso, presentó una bolsa periodontal inicial

de 6 mm en la pieza 104, la cual luego del raspado y el alisado disminuyó a 5 mm.

El can denominado Camilo presentó una bolsa periodontal inicial de 4 milímetros en

la pieza 204, la cual luego del raspado y el alisado disminuyó a 3 milímetros.

45

Registro de la disminución de la inflamación gingival, al aplicar el extracto de

S. rebaudiana.

La inflamación gingival es la respuesta defensiva del organismo frente a un agente

irritante o infeccioso en las encías. En el gráfico 9, se observan los datos obtenidos

acerca de la relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana con la

presencia de inflamación en la cavidad bucal de los canes recluidos en el Refugio de

Animales de San Rafael de Heredia.

Dicho gráfico revela que el cien por ciento de los canes presentaban una inflamación

del 66% durante la valoración inicial. Dicha inflamación disminuyó

considerablemente, a un 33%, en los canes a los que se les aplicó alguno de los

extractos de la planta; por el contrario, los canes control no presentaron mejoría

alguna, en cuanto a inflamación se refiere.

6

5

4

3

0

1

2

3

4

5

6

ME

DIC

IÓN

DE

BO

LSA

P

ER

IOD

ON

TA

L

Oso Camilo

NOMBRE DEL CAN CONTROL

*Fuente: Recolección de datos Seiling Vargas y José Elizondo.

Gráfico 8: Evaluación de la medición de bolsas periodontales en los canes control

del Refugio de Animales de San Rafael de Heredia

Bolsas pretratamiento

Bolsa postratamiento

46

Gráfico 9: Relación de los efectos de los extractos de S. rebaudiana con la presencia de

inflamación en la cavidad bucal de los canes recluidos en el Refugio de Animales de San Rafael de Heredia

66 66 66 66 66 66 66 66 66 66 66 66

33 33 33 33 33 33 33 33 33 33

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10

20

30

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60

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ilo (c

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l)

NOMBRE DEL CAN RECLUIDO EN EL REFUGIO DE ANIMALES

*Fuente: Recolección de datos Seiling Vargas y José Elizondo

PO

RC

EN

TA

JE

DE

IN

FL

AM

AC

IÓN

% Pretratamiento

% Postratamiento

3.4. Informe de patología de tejidos orales del grupo control y experimental

(tratado con extractos de la hierva Stevia rebaudiana), analizando su

actividad cicatrizante.

Grupo control: A continuación se presenta el análisis de las biopsias del can

control (Camilo), afectado con enfermedad periodontal.

47

A Camilo se le realizo una profilaxis (raspado y alisado manual de las piezas

dentales), para eliminar la gran cantidad de cálculo que presentaba, se le realizó una

biopsia de inicio, específicamente en la región de la papila interdental. Después de

15 días se le tomo una nueva biopsia control.

Can control 1: Camilo

Biopsia inicial.

Fotografía 8. HE (10x), Se observa mucosa masticatoria correspondiente a una papila interdental. Nótese en el rectángulo, el intenso infiltrado inflamatorio, focalmente existen leucocitos neutrófilos. En la lámina propia se observa (dentro del círculo) dilatación vascular.

Camilo biopsia control:

Biopsia tomada 15 días posteriores a la profilaxis.

48

Fotografía 9.. HE (10x) Post-profilaxis, tejido conectivo que continúa mostrando dilatación vascular (círculos) y disminución moderada del infiltrado inflamatorio.

Fotografía 10. HE (10x), Las flechas señalan la perdida de la arquitectura en el epitelio y en el recuadro se enmarca todavía la presencia de células inflamatorias.

A

49

Fotografía 11. HE (20x), aumento del recuadro A resaltado en la figura 10, donde se observa a mayor claridad el infiltrado inflamatorio. Grupo experimental: Para la evaluación del efecto del extracto crudo de la hierva

S. rebaudiana, en el tratamiento de la enfermedad periodontal, se le realizó una toma

de biopsia al can experimental (Alfredo), después de haber sido sometido a una

profilaxis para aliviar su enfermedad periodontal. Durante 15 días seguidos, a

Alfredo se le estuvo aplicando una vez al día cinco gotas del extracto crudo, y al día

quince, se le realizo la toma de biopsia post-tratamiento.

A continuación el análisis de los resultados:

Can experimental 1: Alfredo

Biopsia Pre-tratamiento.

A

50

Fotografía 12. HE (4x), obsérvese el extremo izquierdo inflamado (recuadro amarillo), lugar del proceso patológico

Fotografía 13. HE (10x), epitelio espongiótico (rectángulo), membrana basal fragmentada (flechas) por la inflamación de la dermis papilar. En la epidermis se demuestra espongiosis, pérdida de la integridad de la membrana basal y migración de linfocitos al epitelio. Gran dilatación vascular de la dermis papilar y reticular (círculo).

51

Fotografía 14. HE (40x) dermis papilar y epitelio basal. Se muestra en la dermis, dilatación vascular importante, edema, inflamación predominantemente a base de linfocitos, macrófagos y células plasmáticas, lo que evidencia transformación de linfocitos B con producción de anticuerpos. Existe también destrucción de colágeno lo que puede estar asociado o indica activación de linfocitos T citotóxico y/o actividad bacteriana.

Alfredo biopsias post-tratamiento.

Toma de biopsia después de haber sido tratado por 15 días con el extracto crudo de

S. rebaudiana

Fotografía 15. HE (10x) En comparación con las biopsias previas al tratamiento se observa una importante disminución de la vascularidad y regeneración del tejido conectivo, con un aumento de la actividad fibroblástica y reposición de la fibra colágena (círculo), lo que evidencia un proceso de cicatrización que se correlaciona con la mejoría clínica, además existe reposición de la membrana basal y disminución de la espongiosis señalados por las fechas.

52

Fotografía 16. .HE (40x) A mayor aumento en la unión dermoepidérmica, se pone en evidencia la actividad fibroblástica (círculo) y la reposición de la colágena (círculo).

Grupo experimental: en el siguiente caso, el can experimental (Tita), después de la

profilaxis y la toma de biopsia, fue tratada por 15 días seguidos con el extracto no

polar S. rebaudiana, con el fin de comprobar si alguno o algunos de los metabolitos

no polares presentes en esta hierva son de alguna manera responsables de mejorar la

enfermedad periodontal del canino.

A continuación los resultados:

Can experimental 2: Tita

Biopsias Pretratamiento.

53

Fotografía 17. HE (10x) La parte superior de la lámina señala un proceso patológico (círculo), y un poco de dilatación vascular a nivel de la dermis papilar (recuadro).

Fotografía 18. HE (40x), dermis papilar y epitelio basal. Se muestra en la dermis, edema, inflamación con presencia de linfocitos y células plasmáticas, lo que evidencia transformación de linfocitos B con producción de anticuerpos (circulo). Existe también destrucción de colágena (recuadro) por lo que indica activación de linfocitos T citotóxico.

54

Tita biopsias post-tratamiento.

Toma de biopsia después de haber sido tratado por 15 días con el extracto no polar

de la hierva S. rebaudiana.

Fotografía 19..HE (10x). Se observan cambios displásicos en el epitelio (atipia celular y ovillos no identificados) y en los epitelio espongiótico (círculo), además de abundante infiltrado inflamatorio crónico en el corion (recuadro).

Fotografía 20. HE (20x). Después del tratamiento con el extracto no polar de S. rebaudiana, la lámina propia muestra una encía todavía enferma, con un alto grado de inflamación, se evidencia destrucción de colágena que puede estar asociado, o indica activación de linfocitos T citotóxico y/o

55

actividad bacteriana responsables de la pérdida de la arquitectura en el epitelio, y de que sea menos evidente la proliferación de fibroblastos y presencia de fibras de colágeno. No se puede decir que el extracto no polar ayude en proceso de cicatrización. Grupo experimental: este paciente del grupo experimental (Peluche), se encuentra

bastante afectado con la enfermedad periodontal inclusive ha perdido algunas piezas

dentales, Se le realizó profilaxis (raspado y alisado) y toma de biopsia.

En este caso se eligieron los aceites esenciales de S. rebaudiana para evaluar su

efecto en el tratamiento de la enfermedad periodontal.

Analicemos los resultados: Can experimental 3: Peluche

Biopsias Pre-tratamiento.

Fotografía 21. HE (20x) Epitelio y tejido conectivo. Se observa abundante infiltrado inflamatorio crónico en el corion con migración en el epitelio (círculo), se evidencia transformación de linfocitos B con producción de anticuerpos. Es total la destrucción de colágena por lo que indica activación de linfocitos citotóxico y la acción destructiva de las bacterias. En la epidermis se demuestra espongiosis (flechas) y también congestión vascular (recuadro).

Peluche post-tratamiento:

Tratamiento por 15 días seguidos con los aceites esenciales de S. rebaudiana

56

Fotografía 22. HE (10x), epitelio y tejido conectivo. No existe mejoría, la encía continua enferma. Se observa abundante infiltrado inflamatorio crónico en la lámina propia (círculo), el epitelio ha perdido su arquitectura (flechas), migración de células inflamatorias al epitelio y destrucción de colágena en el corion.

Fotografía 23. .HE (40x), dermis papilar y epitelio basal, igual que en la biopsia pre-tratamiento es total la destrucción de colágena por lo que indica activación de linfocitos citotóxico y bacterias. El aceite esencial no es el mejor tratamiento para la cicatrización y la enfermedad periodontal

57

Grupo experimental: el último caso del grupo experimental (firulay) es un caso

diferente a los anteriores, porque firulay presentaba manchas como las del sarro en

su colmillos (uno de los síntomas de la enfermedad periodontal), pero como se ve en

la fotografía 22 tenemos una encía clínicamente sana. A este can se le eliminó las

manchas por medio de raspado manual, y se realizó toma de biopsia.

A firulay por quince días se le aplicó el extracto acuoso de S. rebaudiana en la

papila interdental, lugar de la toma de biopsia.

A continuación se realiza un análisis de la actividad cicatrizante del extracto polar

de la de S. rebaudiana

Can experimental 4: Firulay

Biopsias Pre-tratamiento

Fotografía 24. HE (4x) A este aumento se observa una encía sana.

58

Fotografía 25. HE (10x) A mayor aumento, se muestra un proceso inflamatorio normal (circulo), los capilares no se muestran dilatados ni proliferantes, tampoco se encuentra edema.

Fotografía 26. HE (20x) Se observa (en el círculo) un pequeño número linfocitos y células plasmáticas, que se encuentran en el tejido conectivo de la encía normal e intervienen en la defensa y reparación. Firulay post-tratamiento:

Tratamiento por 15 días seguidos con el extracto polar de S. rebaudiana.

59

Fotografía 27. HE (4x) Obsérvese una encía clínicamente sana después del tratamiento con el

extracto polar, únicamente se observa unos cuantos vasos dilatados (círculo), la presencia de

actividad fibroblástica (recuadro) y las fibras de colágeno jóvenes (fibras pálidas) indica que nos

encontramos en el periodo de reparación post-biopsia del proceso de cicatrización.

Fotografía 28 (10x) No existe evidencia de alguna célula del proceso inflamatorio patológico, pero si se observan cambios de regeneración tisular debido a la toma de biopsia previa.

60

CAPÍTULO IV

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. 4.1 Conclusiones

• S. rebaudiana es una planta que tiene propiedades beneficiosas para los seres

vivientes. Entre los beneficios que dicha planta ofrece se pueden mencionar:

la disminución significativa de la enfermedad periodontal en los canes del

Refugio de Animales de San Rafael de Heredia.

• Las bolsas periodontales presentes en los canes con enfermedad periodontal

se redujeron satisfactoriamente en los canes a los que se les aplicó el extracto

de S. rebaudiana, por otro lado los canes control, no tuvieron disminución

significativa en la medición de las bolsas respectivas.

• La inflamación gingival en los canes experimentales se disminuyó casi un

tercio del valor inicial con los procedimientos realizados y la aplicación de

los extractos de S. rebaudiana; así mismo, los perros a los que no se les

aplicó ninguno de los extractos mantuvieron la inflamación gingival a pesar

del raspado y alisado realizado.

• Las biopsias realizadas muestran que en la fase previa al tratamiento, los

tejidos gingivales de los canes, en su gran mayoría, presentan abundante

infiltrado inflamatorio crónico; también, muestran que en las biopsias

posteriores al tratamiento, la inflamación crónica se circunscribe a la lámina

basal y hay presencia de epitelio escamoso estratificado con hiperplasia.

61

• S. rebaudiana, es una planta medicinal que puede llegar a ser muy útil para

el tratamiento de la enfermedad periodontal, si se continuara con los estudios

respectivos en fases más avanzadas.

• 4.2. Recomendaciones

• El estudio de la naturaleza brinda respuestas a muchas de las incógnitas para

las cuales los seres humanos no tenemos solución, la S. rebaudiana es una de

esas maravillas que la naturaleza nos regala y que hay que aprovechar para el

bien de los seres vivientes de la tierra.

• Se recomienda continuar el estudio, para avanzar en fases mayores de la

investigación, con el fin de llegar a probar en los seres humanos, los

beneficios de S. rebaudiana,, así como se han probado en los canes del

Refugio de Animales de San Rafael de Heredia.

62

CAPÍTULO V

5. BIBLIOGRÁFIA

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71

ANEXOS

Tabla 3. Comparación de los resultados obtenidos en la medición quirúrgica y

posquirúrgica de la bolsa periodontal.

g♣: Pieza dental a cual se le tomó muestra de encía para biopsia.

Nombre del can Pieza dental Extracto utilizado

Medición de bolsa periodontal

quirúrgica mm

Medición la bolsa

periodontal posquirúrgica

mm

108 crudo♣ 4 1

208 aceite esencial 4 1

408 polar 3 1

Manrique 308 no polar 4 1

108 crudo♣ 4 1


408 polar 3 2

Pinto 308 no polar 3 1

108 crudo 3 1

208 aceite esencial♣ 5 1

408 polar 3 1

Peluche 304 no polar 2 1

104 crudo 3 2


404 polar♣ 3 1

Gorda 308 no polar 4 1

108 crudo 4 1

208 aceite esencial♣ 5 2

408 polar 3 1

Carmen 308 no polar 3 1

108 crudo 3 1


404 polar 4 2

Tita 208 no polar 4 2

OSO(control) 104 6 4

Camilo(control) 204 4 2

Firulay 204 polar♣ 3 1

Plinky 204 crudo♣ 6 2

Alfredo 204 crudo♣ 3 1

Ginger 204 no polar♣ 9 3

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