Estructura y función celular

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Manual con contenido para la elaboración de practicas de laboratorio

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    Presentacin

    Este manual de prcticas de laboratorio est diseado de acuerdo al

    programa de la Unidad de Enseanza Aprendizaje (UEA) de Estructura y Funcin Celular I, que forma parte del tronco bsico profesional incluido

    en el nuevo Plan de Estudios de las Licenciaturas de Biologa, Biologa Experimental, Hidrobiologa, Ingeniera en Alimentos, Ingeniera

    Bioqumica Industrial y Produccin Animal que se imparten en el trimestre III en la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud de la

    Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa.

    Las prcticas de laboratorio propuestas en este manual, estn diseadas de manera que despierten el inters de los alumnos y tratando de

    relacionar la estructura celular y su funcin. Son resultado de los aos de experiencia que tienen las autoras impartiendo las UEA de Bioqumica

    y Biologa Celular, que por los nuevos planes de estudio desaparecen; de cierta forma, para dar paso a las dos UEA de Estructura y Funcin

    Celular I y II. Estas UEA abordan los temas de manera en que pueda

    relacionarse la estructura de las biomolculas con la funcin de cada uno de los organelos que forman parte de la clula.

    Con esto se pretende que el alumno adquiera un conocimiento de

    manera conjunta y no fragmentado como suceda al abordar la estructura de las biomolculas, la estructura y funcin de los organelos

    celulares de forma separada. Cabe sealar que este Manual es producto de un proyecto apoyado por un acuerdo del Rector General (12/2007)

    que inici en septiembre de 2007 y culmin en noviembre del 2009.

    El presente manual incluye en cada una de las prcticas, una breve introduccin del tema y el fundamento del procedimiento a realizar. La

    introduccin debe ser complementada por el alumno con las clases de teora o con informacin recabada de los textos relacionados con la UEA.

    Tambin cuenta con un apartado de material y reactivos que van a

    utilizar y una descripcin detallada para la realizacin de cada desarrollo experimental. Al final de cada prctica se incluye una serie de preguntas

    con las cuales se pretende que el alumno logre una integracin del conocimiento prctico con el terico. Las preguntas estn diseadas de

    tal forma que pueden ir contestndose al momento de la prctica o posterior a la misma, con la finalidad de que les permita desarrollar un

    mayor inters y comprensin de un mtodo, tcnica o tema en particular.

    Adems, las prcticas propuestas permiten familiarizar al alumno en el

    conocimiento y manejo de algunas tcnicas y aparatos de uso comn en

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    un laboratorio de Bioqumica y Biologa Celular. Para ello se ha diseado

    utilizar material biolgico de fcil acceso, aprender el uso y manejo correcto del microscopio para la identificacin de tipos celulares.

    Tambin presenta un esquema de prcticas que permitir al alumno

    realizar extracciones y determinaciones cuantitativas y cualitativas de molculas biolgicas que forman parte de la estructura de la clula.

    Estas le permitirn al alumno aprender a utilizar un espectrofotmetro, realizar una curva patrn e interpolar los resultados obtenidos.

    Asimismo aprender a preparar un ensayo de actividad enzimtica y a evaluarla mediante determinaciones espectrofotomtricas.

    El tiempo para el desarrollo de cada una de las prcticas fue probado

    directamente con los alumnos durante la vigencia de proyecto mencionado previamente, por lo que estn diseadas para realizarse en

    3 horas, tiempo estipulado para la sesin prctica de la UEA. El uso eficiente del tiempo dentro de las sesiones prcticas depender en gran

    medida de su habilidad del profesor para organizar a los alumnos, as como que ellos comprendan los procedimientos a realizar. Finalmente,

    es importante que el estudiante mantenga un registro completo de sus

    experimentos; por lo que las autoras recomiendan el uso de una bitcora en el laboratorio. El objetivo de una bitcora es que el alumno

    conozca y aprenda la forma en la que realiz el desarrollo experimental. En esta los alumnos deben escribir los resultados, clculos,

    conclusiones, etc. Este registro se hace al momento en que se realiza la prctica y debe estar escrito de manera clara para que cualquiera pueda

    entender cmo se realiz la prctica y cules fueron los resultados obtenidos.

    El Manual de Estructura y Funcin Celular I lo hemos preparado con

    prcticas sencillas, ya que como dijo Albert Einstein La ciencia debe ser lo ms sencilla posible, pero no ms simple. Por lo que se incluyen algunos micromtodos pretendiendo presentar a los alumnos herramientas ampliamente utilizadas en los laboratorios de investigacin

    como es el uso de las micropipetas. Tambin son prcticas

    representativas que intentan explicar algunas de las propiedades de la biomolculas, tcnicas para estudiarlas, as como evaluar algunos

    procesos celulares. Se espera que el estudiante adquiera los conocimientos bsicos y necesarios que le permitan proseguir con los

    cursos posteriores en el transcurso de cada Licenciatura en cuestin.

    AGRADECIMIENTOS

    Expresamos nuestro ms sincero agradecimiento a los alumnos, quienes nos ayudaron a estandarizar ests prcticas durante sus cursos de las

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    UEA de Bioqumica I y Biologa Celular de la UAM-Iztapalapa. A las

    tcnicas de laboratorio: Mara de la Luz Luna y Ma. Graciela Garca, quines durante la estandarizacin de las prcticas nos apoyaron de

    manera extraordinaria. Finalmente agradecemos a la Dra. Carolina

    Campos por incitarnos a participar en este proyecto.

    Tambin agradecemos a los revisores su valiosa aportacin para mejorar el contenido de este manual.

    Irma Jimnez Morales

    Leonor Rodrguez Cruz

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    NDICE

    Tema Pgina

    El Laboratorio 5

    Manejo del Microscopio de Campo Claro 16

    Clulas Animales y vegetales 25

    Aislamiento de ADN 31

    Extraccin y separacin de protenas y lpidos 37

    Cuantificacin de lpidos y protenas 41

    Identificacin Cualitativa de Carbohidratos 47

    Hidrlisis de almidn: Actividad de la amilasa 53

    Actividad cataltica de la Tirosinasa 58

    Coacervados 66

    Identificacin morfolgica de clulas representativas de cada uno de los cinco reinos

    71

    Funcin de los peroxisomas: Actividad enzimtica de las peroxidasas

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    El Laboratorio

    El Laboratorio es el espacio destinado para que los alumnos realicen las

    actividades experimentales sealadas por el profesor. El Laboratorio constituye el lugar de trabajo para la investigacin y la enseanza en

    las escuelas. En este lugar se evalan diversos aspectos, como la capacidad para observar, descubrir y participar en una investigacin, as

    como para adquirir hbitos de orden, limpieza y organizacin en el trabajo.

    Normas de seguridad

    Toda actividad que implique el manejo de fuentes de energa calorfica y

    elctrica, as como el de sustancias corrosivas o txicas, exige tener cuidado y seguir una serie de recomendaciones y normas de seguridad

    que permiten adquirir confianza y destreza en la utilizacin de toda clase de equipos y sustancias empleados en las prcticas.

    Algunas reglas de seguridad para los alumnos son:

    Utilizar una bata de algodn para las actividades prcticas a fin de proteger la ropa y el cuerpo de alguna sustancia inflamable o de sufrir

    alguna quemadura.

    No manipular equipo o sustancias hasta no recibir indicaciones pertinentes.

    Realizar la limpieza de los materiales, equipos y rea de trabajo antes y

    despus de la prctica.

    Los solventes inflamables (alcohol, ter, etc.) se utilizan frecuentemente en el laboratorio. Los vapores, sobre todo del ter, pueden inflamarse y

    en ciertas circunstancias explotar. Por lo que se recomienda que antes

    de abrir un frasco de cualquier solvente inflamable, verificar que no se encuentre ningn mechero prendido cerca. Los solventes inflamables no

    deben usarse en lugares cerrados en donde los vapores pueden acumularse hasta formar con el aire mezclas explosivas. Las soluciones

    que contengan solventes inflamables nunca deben calentarse sobre mechero Bunsen, deben utilizarse los baos de agua.

    Los cidos fuertes (sulfrico, clorhdrico, ntrico, etc.), son sustancias

    que destruyen rpidamente los tejidos. Los accidentes ms frecuentes son las salpicaduras sobre las manos, ojos y cara, y las quemaduras en

    la boca al pipetear directamente desde la botella (lo cual NUNCA debe

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    hacerse). La mejor opcin para transferir cidos fuertes consiste en

    emplear alguna de las distintas bombas de plstico (pro pipetas). Al diluir cido con agua, se produce calor, sobre todo en el caso del cido

    sulfrico, si se mezcla gran cantidad de este cido con una pequea

    cantidad de agua puede generarse suficiente calor para producir una explosin. Por lo tanto al diluir cidos, agrega lentamente el cido al

    agua, para evitar que salte violentamente, adems, maneja este tipo de sustancias SIEMPRE dentro de una campana de extraccin. De ser

    necesario, el cido diluido se enfriar antes de aadir ms. Finalmente debe limpiarse cuidadosamente cualquier lquido derramado al exterior

    de los frascos o sobre la mesa. Las pipetas utilizadas para medir el cido deben ser inmediatamente lavadas.

    Las bases fuertes (hidrxidos) en su forma slida o en solucin

    concentrada, pueden lesionar profundamente los tejidos, en especial a nivel de las mucosas de la boca. Al disolverse los hidrxidos slidos en

    agua, se produce una gran cantidad de calor. Para hacer soluciones de bases fuertes, deben tomarse las mismas precauciones que para los

    cidos fuertes. Cuando se emplean hidrxidos de sodio o potasio en

    lentejas, es indispensable una agitacin constante para evitar que se acumulen en un mismo lugar y se produzca un calentamiento local

    intenso.

    Algunos compuestos como el perxido de hidrgeno, dicromato de potasio y el cido crmico, pueden daar la piel y los ojos, por lo cual

    deben aplicarse las precauciones necesarias.

    En algunos casos la ventilacin en un laboratorio puede ser aceptable para el trabajo ordinario, pero no basta para remover completamente

    los vapores txicos. Lo mejor es que cualquier manipulacin que produzca un vapor txico se realice bajo la campana. Los estudiantes no

    siempre se dan cuenta de que los vapores de acetona, cloroformo, ter, tetracloruro de carbono y alcohol metlico pueden ser muy peligrosos.

    Todas las manipulaciones de estos solventes deben llevarse a cabo bajo

    la campana.

    Tener cuidado al manejar las fuentes de energa calorfica y elctrica: mechero, parrilla, estufa, contactos. Las parrillas de calentamiento

    elctricas deben colocarse en forma de evitar lo ms posible el contacto accidental de las manos, de los brazos, etc. Con las superficies

    calientes.

    Tambin es de gran importancia de rotular correctamente todos los frascos y recipientes en el laboratorio, para evitar confusiones.

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    MEDICIN DE LA MASA

    Para medir la masa se utiliza la balanza, existen balanzas con las que se

    determina la masa de los objetos con precisin de un microgramo. La

    eleccin de cul balanza utilizar depende de la precisin necesaria y de la cantidad del material a medir. En la figura 1 se muestran dos tipos de

    balanzas.

    Unidades de masa ms utilizadas

    Unidades mtricas Smbolo Equivalentes en gramos

    Potencia de 10

    equivalente

    Kilogramo Kg 1000 10 3g

    gramo g 1 100g

    miligramo mg 0.001 10-3g

    microgramo g 0.000001 10 -6 g

    nanogramo ng 0.000000001 10 -9 g

    Por lo tanto es importante tener en cuenta que:

    1g = 1000mg 1mg = 1000g

    FIGURA 1. Dos tipos de balanzas utilizadas ampliamente en el

    laboratorio. Izquierda: Balanza de un platillo superior, cuya precisin es

    de 0.001g (mg), derecha: Balanza analtica electrnica digital con precisin de 0.0001g.

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    MEDICIN DEL VOLUMEN

    La unidad de volumen en el sistema mtrico es el metro cbico (m3), la

    cual es demasiado grande como unidad para el trabajo normal de

    laboratorio, de modo que se emplea decmetros cbicos (dm3) o centmetros cbicos (cm3). Sin embargo, el litro y el mililitro (que se

    abrevian L y mL, respectivamente) son unidades normales de volumen que se emplean en la mayora de los laboratorios qumicos, ya que la

    mayor parte del material de vidrio de laboratorio est calibrado en litros o mililitros.

    Los instrumentos y equipos ms usados para medir lquidos son el

    matraz aforado, la probeta, la bureta y la pipeta (Figura 2). Estos instrumentos se fabrican casi siempre, de vidrio o de plstico y se

    consiguen de diferentes tamaos.

    Unidades de volumen ms utilizadas

    Unidades

    mtricas

    Smbolo Equivalentes

    en Litros

    Potencia de

    10 equivalente

    Litro L 1 10 0 L

    Mililitro mL 0.001 10 -3 L

    Microlitro L 0.000001 10 -6 L

    Es importante recordar que:

    1 L = 1000mL = 1000 cm3 1 mL = 1000 L

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    Matraz aforado

    Probeta Bureta Pipeta graduada

    Pipeta semiautomtica

    o micropipeta

    FIGURA 2. Instrumentos principalmente utilizados para medir el

    volumen de los lquidos.

    Las pipetas, el material volumtrico que se emplea ms frecuentemente, juegan un papel crucial en la determinacin del grado de exactitud y

    precisin en un gran nmero de anlisis realizados en el laboratorio. Si se emplean las pipetas en el laboratorio, deben seleccionarse

    adecuadamente y emplearse con cuidado.

    10 mL 1 mL 0.1 mL

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    Las pipetas presentas ciertas caractersticas que hacen posible distinguir

    fcilmente el volumen que pueden medir. Primero siempre tienen marcado en el extremo superior de la pipeta (cerca del sitio por donde

    se succiona) el volumen en mililitros (10, 5, 2 etc.). Adems, las pipetas

    tambin tienen un cdigo de colores, es decir, dependiendo del volumen es el color que presentan las pipetas (una franja de color tambin en el

    extremo superior de la pipeta).

    Volumen Color Escala Graduacin

    1 mL Marrn 1/10 en 1/100 0.1, 0.2, 0.3...

    1 mL Carmn 1/10 0.1, 0.2, 0.3...

    2 mL Negro 2/10 en 1/100 0.02, 0.04, 0.06...

    2 mL Verde 1/10 0.2, 0.4, 0.6...

    5 mL Azul 1/10 1, 2, 3...

    10 mL Naranja 1/10 1, 2, 3...

    I. Mtodo para el empleo de pipetas.

    Muchas ocasiones se da como hecho el que todos los alumnos en el laboratorio saben cmo pipetear correctamente, sin embargo, pueden

    haber desarrollado malos hbitos o haberse hecho descuidados o impacientes en el momento de hacerlo. Tales hbitos y actitudes pueden

    conducir a un pipeteo incorrecto. La precisin en el laboratorio puede mejorarse si todos los alumnos se adhieren a un proceso uniforme y

    cuidadoso. Se recomienda el siguiente proceso de pipeteo, ya que es fundamental una buena tcnica en el manejo de las pipetas:

    1. Se examina la pipeta. Es el tamao correcto? Est limpia? Est

    libre de gotas de agua? Est libre de grietas o punta rota? Si la respuesta a cualquiera de estas preguntas es NO, no se emplea.

    2. El tallo de la pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio

    3. Se introduce la pipeta unos 5 centmetros en el lquido que se va a medir para que se puede aspirar el volumen necesario sin aire y se

    succiona. Se introduce el lquido lentamente con aspiracin suave en la pipeta hasta un centmetro por encima de la marca de calibracin, se

    cierra la pieza de la boca con el dedo ndice. La pipeta no debe introducirse directamente en el reactivo o en las botellas patrones. La

    disolucin debe verterse en un recipiente limpio, de tamao adecuado y

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    el pipeteo debe hacerse a partir de este recipiente. De otra manera, una

    pipeta sucia podra contaminar el reactivo o patrn y no podra detectarse. Una succin lenta del lquido es importante porque pueden

    quedar atrapadas burbujas de aire en la columna si el lquido se

    introduce rpidamente en la pipeta.

    4. Se mantiene la pipeta en posicin vertical, se deja que el nivel del lquido baje hasta la marca de calibracin moviendo con suavidad el

    ndice sobre la pieza de la boca. El dedo no debe retirarse. Se vaca la pipeta lentamente hasta que la parte inferior del menisco est en lnea

    con la marca, la cual debe estar al nivel del ojo. La mayora de las inexactitudes se producen en el momento en que la parte inferior del

    menisco alcanza la marca. El lquido debe vaciarse muy lentamente hasta que la parte inferior del menisco toca justamente la marca, el

    menisco nunca debe atravesar la marca. Se mantiene cerrado el extremo donde se pone la boca (o bien mantener firme la pro pipeta).

    5. Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepcin, colocando su

    punta contra el y se vierte el lquido contenido en este recipiente de

    vidrio adecuado. Hay cuatro puntos importantes a recordar durante este paso:

    1. Se mantiene la pipeta tan verticalmente como sea posible, la cantidad correcta se vierte slo cuando la pipeta est en posicin

    vertical. 2. Se deja fluir el lquido, no se fuerza a que salga el lquido de la

    pipeta para terminar ms rpido, no se debe colocar la pipeta en el recipiente de vidrio con obstruccin del flujo libre.

    3. Cuando el nivel del lquido alcanza el tubo inferior de la pipeta, se toca con la punta de la pipeta la pared del recipiente receptor hasta

    que el flujo est finalizado. Si no ocurre as, la ltima gota del lquido podra quedar colgando en la punta de la pipeta.

    4. Al final del vertido, no se deja la punta de la pipeta en contacto con el lquido, este podra ascender por la pipeta por accin capilar.

    Las pipetas graduadas siguen utilizndose como una herramienta muy importante de los laboratorios, sin embargo poco a poco van siendo

    desplazadas por la micropipetas. Las micropipetas en los laboratorios de investigacin son totalmente indispensables y en los laboratorios de

    docencia comienzan a ser utilizadas, es decepcionante que existan alumnos que cursan el ltimo ao de sus estudios universitarios y no

    conozcan esta herramienta. Por lo tanto consideramos de suma importancia iniciar a conocer y aprender el adecuado manejo de las

    micropipetas.

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    II. Pipetas semiautomticas o micropipetas.

    La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para medir

    pequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas

    tcnicas cientficas. Los volmenes utilizados para cada una de las pipetas es variable segn el modelo. Con estos instrumentos se pueden

    medir diferentes lquidos empleando puntas desechables

    Manejo correcto de la micropipeta

    Las micropipetas son herramientas sumamente tiles para medir pequeos volmenes que van desde 0.5 l hasta 1 mL. Actualmente existen pipetas automticas de 5 mL, que ya no es un volumen pequeo pero permite medir estos volmenes con mayor precisin que las

    pipetas graduadas y sin necesidad de una propipeta.

    Figura 3. Esquema general de

    las primeras micropipetas que comenzaron a utilizarse.

    A continuacin se describen las instrucciones generales para el correcto

    manejo de las micropipetas, este puede variar ligeramente de acuerdo a la marca de micropipeta que se tenga disponible (Figura 3).

    1. El primer paso es seleccionar la micropipeta a utilizar segn el

    volumen requerido. 2. Tomar la micropipeta cuidadosamente con una mano e identificar

    el volumen mximo que puede medir.

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    3. La mayora de la micropipetas indican en el botn pulsador el

    intervalo o volumen mximo que pueden pipetear. 4. Oprimir el botn pulsador para familiarizarse con la presin que

    debe ejercerse sobre l.

    5. Es importante sentir que este botn tiene tres posiciones: la inicial en la cual se encuentra cuando no se ejerce presin sobre el

    botn, la primera posicin en la cual se ejerce presin con el dedo sobre el botn y este muestra cierta rigidez y la segunda posicin

    en la cual se ejerce an ms presin sobre el botn hasta llegar al tope de este.

    6. Una vez reconocidos las diferentes posiciones del botn pulsador o pistn, proceder a seleccionar el volumen que se pretende medir.

    7. Localizar el indicador de volumen, compuesto de tres dgitos que se deben leer de arriba hacia abajo.

    8. Es muy importante que para prevenir un dao en el mecanismo interno de la micropipeta no sobrepasar el volumen mximo para

    cada micropipeta. 9. Colocar la punta adecuada de acuerdo al volumen de la pipeta,

    para insertar la punta de forma correcta y evitar que esta se

    desprenda, es necesario ejercer una fuerte presin. NOTA: Jams utilizar la pipeta sin colocar previamente la punta.

    10. Tener localizados y cerca el recipiente que contiene la

    solucin que se va a tomar y el recipiente donde se colocar el volumen de solucin tomada.

    11. Para absorber el lquido, presionar el botn hasta la primera

    posicin, con la pipeta en posicin vertical, introducir la punta aproximadamente 5 mm en el lquido y despus, lentamente,

    permitir que el pistn vuelva a la posicin original. 12. Esto permite tomar el volumen correspondiente. Es muy

    importante no soltar el botn pulsador ya que esto permite la entrada de aire en la punta y esto provoca la toma de volmenes

    incorrectos. 13. Colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior

    del recipiente donde se va a depositar el lquido. 14. Apretar el botn pulsador suavemente hasta la primera

    posicin. Apretar el botn pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del lquido.

    15. Mantener apretado el botn pulsador en el segundo tope hasta sacar la punta del recipiente.

    16. Soltar el botn pulsador.

    17. Apretar el botn del expulsador de la punta para que esta sea liberada.

  • 14

    Figura 4. Posiciones de la micropipeta para su uso de forma correcta cuando se necesita medir un volumen especfico.

    Este instrumento de laboratorio es sumamente sensible y delicado, por

    lo que se deben tener ciertos cuidados para no daar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta:

    1. Lo primero que se debe conocer es el tipo de pipeta que se est

    utilizando y antes de hacer cualquier movimiento de sus partes preguntar la forma correcta de ajustar el volumen, ya que algunos

    modelos presentan un botn que evita que la perilla de ajuste de volumen se mueva y de hacerlo sin oprimir el botn provocar

    graves daos a la micropipeta.

    2. Los lquidos nunca deben entrar en contacto con el cono de la micropipeta.

    3. Nunca voltear la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo. 4. Jams colocar la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene

    lquido. 5. NO ajustar el volumen fuera del intervalo (menor y mayor

    volumen) de la micropipeta. 6. Colocar la micropipeta en un parte segura de la mesa para que no

    se caiga, aparentemente cundo caen no les pas nada (si es que no se rompi alguna parte) pero el mecanismo interno es muy

    sensible y puede sufrir daos que tal vez no sean visibles pero que provocarn que cundo se utilice esa pipeta, est ya no tome los

    volmenes correctos.

  • 15

    BIBLIOGRAFA

    Gonzlez, L. Bioqumica para tcnica de laboratorio. Editorial Marbn. Madrid, Espaa, 1988.

    Hein M., Arena S. Fundamentos de Qumica. International Thomson Editores, Mxico, 1997.

    Murali D. Control de Calidad en los Laboratorios. Editorial Revert.

    Espaa, 1982.

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    Manejo del Microscopio de Campo Claro

    INTRODUCCIN

    En las ciencias biolgicas el uso del microscopio es muy importante, en particular en las reas de la biologa, histologa, microbiologa y biologa

    celular. Por esto resulta conveniente que el estudiante se familiarice con el manejo de este instrumento. Por tal motivo, el conocimiento de todas

    sus partes lo mismo que cada una de ellas contribuye a facilitar la observacin es de gran utilidad.

    Fundamento

    En los microscopios de luz se pueden distinguir tres sistemas que

    permiten una buena observacin (Figura 1). Los microscopios estn constituidos por un sistema ptico que consta de dos lentes

    principales: una cercana a la preparacin llamado objetivo y otra

    cercana al ojo del observador llamada ocular. Tambin cuenta con una fuente de luz (sistema luminoso) en su base que enva los rayos

    luminosos a travs de un condensador, que sirve para concentrar la mayor cantidad de luz en un punto y la hace pasar a travs de la

    preparacin. Finalmente el sistema mecnico que proporciona la estructura y soporte de los dos sistemas anteriores (Figura 2).

    Figura 1. Sistemas que

    integran un microscopio.

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    La base adems de sostener todo el peso del microscopio, le da solidez

    y estabilidad al aparato. En un gran nmero de modelos de microscopios en esta parte se encuentre integrada la fuente de luz. El brazo sirve de

    asa para sujetar y transportar el microscopio. En el brazo del

    microscopio se encuentran los tornillos macromtrico y micromtrico que son los que elevan y descienden la platina, la cual

    est sostenida en el brazo, tambin se apoyan el soporte del condensador, diafragma y los tornillos que regulan su movimiento.

    NOTA: El microscopio es un aparato de empleo delicado hay que manejarlo con mucho

    cuidado, adems de tomar el microscopio del brazo con una mano se recomienda

    tomar la base con la otra.

    Figura 2. Partes del

    microscopio de campo claro.

  • 18

    Para el uso correcto del microscopio de campo claro es imprescindible que al inicio de cualquier observacin se realice la iluminacin de

    Kohler, tcnica que consiste bsicamente en centrar el haz de luz,

    alineando el condensador con respecto a los objetivos, su finalidad es obtener una iluminacin ptima de la muestra.

    Existen diferentes mtodos para observar clulas o tejidos en el

    microscopio, observacin de clulas en fresco, es decir, clulas o tejidos obtenidos del organismo inmediatamente antes de la observacin al

    microscopio. El otro mtodo es realizando la fijacin de las clulas o tejidos para preservar su morfologa.

    Existen agentes qumicos y fsicos que evitan la descomposicin de las

    clulas, estos son los fijadores. Los fijadores tienen como finalidad preservar la morfologa y la composicin qumica de los distintos

    componentes citolgicos, de modo que lo que uno observa en el microscopio corresponda a lo que exista cuando las clulas formaban

    parte del organismo completo.

    El uso ms importante de los fijadores es preservar la morfologa

    celular. Los fijadores sirven para proteger la muestra del ataque bacteriano, evitar autlisis de las clulas, evitar distorsiones y

    retracciones y finalmente preparar las diversas estructuras para que cuando se tian reaccionen ms intensamente con los colorantes y de

    esta manera es ms fcil su identificacin.

    Los fijadores son soluciones que actan sobre las protenas de las clulas (principales constituyentes de las estructuras celulares y las

    responsables de todos los procesos metablicos) y por consiguiente los fijadores detienen el metabolismo y con esto la autlisis.

    La mayora de las clulas son incoloras, por lo que deben teirse para

    facilitar su observacin al microscopio y poder diferenciar algunos

    organelos celulares. Para teir una clula por lo general suelen utilizarse dos colorantes: uno cido y otro bsico. Entre los colorantes ms

    empleados se encuentran la hematoxilina-eosina, colorante bsico y cido respectivamente. Los componentes de la clula con un pH cido se

    tien con colorantes bsicos (basfilos), como el ncleo de la clula y los componentes celulares que tienen un pH bsico, reaccionan con

    colorantes cidos (acidfilos), como el citoplasma.

  • 19

    OBJETIVOS

    Conocer las partes que componen un microscopio fotnico de

    campo claro.

    Aprender el manejo y cuidado que deben tener los microscopios.

    Descubrir las diferencias entre observar una muestra en fresco y una fija.

    MATERIAL

    Material por equipo Reactivos

    Portaobjetos cido actico Cubreobjetos Cloruro de Sodio (NaCl)

    Micropipetas Soluciones Puntas para micropipetas Solucin isotnica de NaCl al 0.9%

    Lanceta estril Colorante de Wright

    2 pipetas pasteur cido actico al 2% Piceta con agua destilada Azul de metileno al 0.2%

    Equipo Material Biolgico proporcionado por los alumnos

    Microscopio de campo claro Jitomate Espectrofotmetro Ptalos de clavel o bugambilia de

    color claro Parrilla de calentamiento Sangre

    DESARROLLO

    I. Manejo inicial del microscopio

    Coloque el microscopio ptico de campo claro sobre la mesa de trabajo de forma que sea de fcil acceso a todos los integrantes del equipo y no

    haya necesidad de moverlo constantemente. La base del microscopio debe permanecer a una distancia no menor de 10 cm del borde de la

    mesa, la cual deber ser lisa, firme y no inclinada. Para una adecuada visualizacin de las muestras se requiere, para el microscopio de campo

    claro, realizar la iluminacin de Kohler: Este procedimiento slo puede hacerse en algunos microscopios,

    generalmente los anticuados. 1. Cerrar el diafragma del condensador (con la palanca colocada en

    el borde derecho del mismo).

  • 20

    2. Girar el tornillo del condensador para subir el portacondensador

    hasta el tope. 3. Encender la lmpara (mantener la luz tenue para evitar lastimar

    los ojos)

    4. Enfocar con el tornillo macromtrico el filamento del foco y centrarlo, esto se logra moviendo las perillas laterales que estn

    sobre el extremo posterior de la lmpara. 5. Cerrar el diafragma de la lmpara

    6. Centrar el halo luminoso (en forma de hexgono) que se aprecia en el campo visual.

    7. Abrir el diafragma hasta que aparezcan los bordes oscuros de ste.

    NOTA: No se debe hacer girar el revlver tomando los objetivos, sino colocando la

    yema de los dedos pulgar e ndice sobre el borde de la placa dentada circular del

    revlver en direccin de las manecillas del reloj.

    Manejo y uso del microscopio ptico

    1. Despus de realizar la iluminacin de forma correcta. 2. Colocar el objetivo de menor aumento (objetivo de 5x o 10x segn

    sea el caso) en posicin de empleo y bajar la platina completamente.

    3. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.

    4. Realizar el enfoque desde el tope de arriba y bajando para enfocar. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin,

    empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando

    directo a la preparacin y no a travs del ocular (se corre riesgo de golpear el objetivo con la preparacin pudiendo daar alguno

    de ellos o ambos). 5. Mirando a travs de los oculares, separar lentamente el objetivo

    de la preparacin con el tornillo macromtrico y, cuando se observe con nitidez la muestra, girar el tornillo micromtrico hasta

    obtener un enfoque fino. 6. Pasar al siguiente objetivo (objetivo de 20x o 40x segn sea el

    caso). La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el tornillo micromtrico para lograr

    el enfoque fino.

    Empleo del objetivo de inmersin. 1. Bajar totalmente la platina, subir totalmente el condensador para

    ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a

    visualizar y donde habr que echar el aceite. 2. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin (100x) dejndolo a

    medio camino entre ste y el de 40x. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. Terminar de girar

  • 21

    suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de

    inmersin, es decir, la lente del objetivo deber quedar inmersa en el aceite.

    3. Subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de

    aceite, enfocar cuidadosamente con el tornillo micromtrico. 4. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la

    platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. Al terminar absorba el aceite de la lente usando papel

    seda. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en

    posicin de observacin. NOTA: Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se

    puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite.

    Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando papel seda.

    I. Preparaciones en fresco

    Observacin de pulpa de jitomate

    1. Utilizando una navaja cortar a la mitad el jitomate.

    2. Cortar un trozo de pulpa de jitomate de unos 2mm de grosor. 3. Depositarlo en el centro de un portaobjetos.

    4. Colocar un cubreobjetos y aplastar suavemente con los dedos hasta obtener una capa muy fina del fragmento de pulpa de

    jitomate. 5. Colocar la preparacin en la platina del microscopio y realizar la

    observacin a 10X. Seleccionar grupo de clulas que se aprecien bien y observar a 40X y 100X.

    6. Dibujar las observaciones.

    Observacin de clulas de ptalos de clavel o bugambilia

    1. Desprenda un fragmento de ptalo de clavel o bugambilia.

    2. Depostelo en un portaobjetos cuidando que quede completamente extendido.

    3. Adicionar una gota de agua. 4. Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio de campo claro.

    5. Anote sus observaciones.

    Observacin de clulas de sangre

    1. Observacin de eritrocitos.

    1. Picar la yema del dedo meique con una lanceta.

  • 22

    2. Colocar una gota de sangre sobre un portaobjetos.

    3. Agregar una gota de solucin de NaCl al 0.9%. 4. Colocar el cubreobjetos.

    5. Observar al microscopio a 10X, 40X y 100X.

    6. Anotar sus observaciones. NOTA Evitar que la muestra se seque agregando, en caso necesario, una gota de NaCl

    al 0.9% por los bordes del cubreobjetos.

    2. Observacin de leucocitos

    1. Colocar 10 l de sangre o bien una gota con una pipeta pasteur.

    2. Adicionar 190 l de solucin de cido actico al 2% (dilucin

    1:20), mezclar muy bien y observar a 10X y 40X. Si no se tiene la micropipeta entonces adicionar 19 gotas con una pipeta pasteur.

    3. Anotar las diferencias entre las clulas con las observadas en el punto 1.

    II. Preparaciones Fijas

    Observacin de clulas sanguneas

    1. Colocar una gota de sangre en un extremo de un portaobjetos libre de grasa.

    2. Colocar otro portaobjetos en un ngulo de 45 tocando la gota de sangre (Figura 3).

    3. Permitir que la sangre se extienda a lo largo del segundo portaobjetos, empuje la sangre hacia delante, despus en un solo

    movimiento regrese el portaobjetos inclinado hasta el otro extremo del portaobjetos.

    4. Permitir que el frotis seque a temperatura ambiente. 5. Teir el frotis con colorante de Wright no diluido, dejando esta

    solucin durante cinco minutos. Colocar el frotis en posicin horizontal sobre papel adsorbente (sanitas) y adicionar con una

    pipeta pasteur cuidadosamente el colorante hasta cubrir

    totalmente la superficie del portaobjetos, evitando que el colorante se derrame por los bordes. Este proceso debe realizarse

    cerca de las tarjas que se encuentran en el laboratorio. 6. Sin eliminar el colorante concentrado, adicionar con una pipeta

    pasteur 2-3 volmenes de agua destilada, mezclando el colorante con el agua. En este punto no importa que el colorante pudiera

    derramarse por los bordes del portaobjetos, sin embargo hay que ser cuidadosos para no mancharse las manos.

    7. Dejar el colorante diluido en contacto con el frotis 10 minutos.

  • 23

    8. Lavar la preparacin al chorro de agua durante un minuto y dejar

    secar a temperatura ambiente. 9. Observar al microscopio a 40X. Anotar sus observaciones.

    NOTA: En esta preparacin, las clulas fueron fijadas por lo que se pueden mantener

    por largo tiempo. Cuidadosamente con una cinta adhesiva fijar el portaobjetos sobre el

    frotis teido (no es lo adecuado pero sirve para evitar rayar el frotis y con esto perder

    las clulas) y guardarlo para la prctica de los cinco reinos.

    III. Mantenimiento y precauciones

    1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor

    aumento en posicin de observacin. 2. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian,

    limpiarlas muy suavemente con papel seda. 3. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est

    utilizando el microscopio. 4. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio

    (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador).

    Figura 3. Frotis

    sanguneo. Colocar una gota

    en el extremo del

    portaobjetos. Poner en

    contacto, en un ngulo de 45

    grados, un portaobjetos

    limpio con la gota de sangre, de

    forma que est se extienda a todo lo

    largo del portaobjetos.

    En un movimiento rpido en direccin de la flecha extender la sangre tratando de formar una capa muy delgada de clulas

  • 24

    5. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo

    siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra.

    6. Mantener seca y limpia la platina del microscopio.

    RESULTADOS

    a) Esquematizar cada una de sus observaciones. b) Resaltar claramente las diferencias entre la observacin en el

    microscopio de campo claro de preparaciones frescas y fijas. c) Al observar al microscopio la sangre se observar principalmente

    los eritrocitos teidos de color rojo. Los leucocitos se identifican fcilmente por la presencia de ncleo, teido de morado.

    CUESTIONARIO

    a) Mencionar los cuidados que se deben tener con el microscopio

    cuando se utiliza aceite de inmersin. b) Explicar las diferencias observadas cuando las preparaciones

    fueron frescas y cuando fueron fijadas. c) Qu ventajas o desventajas piensa pueda tener el fijar o no las

    clulas?

    BIBLIOGRAFA

    Anzalda Arce S., Tolosa Snchez J. Manual de prcticas de

    histologa veterinaria. 3 edicin. Universidad Autnoma Nacional de Mxico. Mxico, 2003.

    Barrera Escorcia H., Crdenas Reygadas R. El microscopio.

    Primera edicin. Plaza y Valds, S. A. de C. V. Mxico, 1997.

    Brown A. B. Hematology: Principles and Procedures. Sixth Edition. Philadelphia, 1993. p101

  • 25

    Clulas Animales y Vegetales

    INTRODUCCIN

    El descubrimiento de las clulas y el papel que juegan en la formacin de los tejidos animales y vegetales, fue posible a partir de la invencin

    del microscopio, ya que su tamao escapa al poder de resolucin del ojo humano.

    La Biologa Celular aborda el estudio de la organizacin estructural y

    funcional de la clula, como unidad constituyente de los seres vivos. Los bilogos utilizan diversos instrumentos para lograr el conocimiento de

    las clulas. Obtienen informacin de sus formas, tamaos y componentes, que les sirve para comprender adems las funciones que

    en ellas se realizan. Desde las primeras observaciones de clulas, hace ms de 300 aos, hasta la poca actual, las tcnicas y los aparatos se

    han ido perfeccionando. Debido al pequeo tamao de las clulas, el uso

    del microscopio es de enorme valor en la investigacin biolgica. En la actualidad, los bilogos utilizan dos tipos bsicos de microscopio: los

    pticos y los electrnicos.

    El microscopio ptico es un aparato capaz de modular la energa luminosa. Debido a sus lentes puede agrandar muchas veces la imagen

    de un objeto.

    Fundamento

    Los microscopios pticos estn constituidos de un sistema ptico que consta de dos lentes principales: una cercana a la preparacin llamado

    objetivo y otra cercana al ojo del observador llamada ocular. El microscopio tambin cuenta con una fuente de luz en su base que

    enva los rayos luminosos a travs de un condensador, que sirve para

    concentrar la mayor cantidad de luz en un punto y la hace pasar a travs de la preparacin.

    El microscopio de campo claro ha sido en esta rea un instrumento

    de gran importancia en el estudio de las clulas. La mayora de las clulas son incoloras, por lo que para poder ser observadas en el

    microscopio de campo claro, deben teirse para facilitar su observacin y poder diferenciar algunos organelos celulares.

    Para el uso correcto del microscopio de campo claro es necesario

    realizar la iluminacin de Kohler, tcnica que consiste en centrar el haz

  • 26

    de luz, alineando el condensador con respecto a los objetivos, su

    finalidad es obtener una iluminacin ptima de la muestra. Los microscopios actuales ya presentan este tipo de iluminacin.

    El microscopio de contraste de fases (Figura 1) permite ver con bastante detalle y buen contraste, objetos muy transparentes que con la

    luz ordinaria son prcticamente invisibles, sirve tambin para detectar diferencias muy pequeas de grosor y densidad del objeto sin necesidad

    de fijar o por teir, de manera que se pueden observar clulas en su estado natural.

    El principio de este microscopio se basa en que la luz transmitida tiene

    dos componentes que al interferir entre si permiten que se logre una imagen muy contrastada; para lograr este efecto se requiere luz

    monocromtica y estos microscopios requieren de un filtro de color verde colocado en el condensador para seleccionar una sola longitud de

    onda. El condensador cuenta adems con un dispositivo para formar un cono de luz hueco en el centro, tiene un sistema ptico que descompone

    la luz en dos partes, una de ellas llega a una velocidad normal al ocular

    y la otra llega retrasada con un cuarto de longitud de onda respecto a la primera.

    FIGURA 1.

    Microscopio de contraste de

    fases con su condensador.

  • 27

    Para lograr este retardo se requiere de un objetivo especial, que tiene

    grabado las letras Ph junto con un nmero que puede ser 1 o 2 segn sea de 40X o de 100X. Para lograr este efecto de contraste es necesario

    centrar el anillo luminoso del condensador con el anillo de fase del

    objetivo y esto se logra por medio de unos tornillos laterales colocados en el portacondensador y con la ayuda de un ocular especial que se

    sustituye momentneamente en el microscopio, llamado lente auxiliar (ocular de Amici_Bertrand), que sirve para poder observar y centrar los

    anillos, una vez centrados los anillos se vuelve a cambiar la lente auxiliar por el ocular normal para poder realizar la observacin de la

    muestra.

    OBJETIVOS

    Conocer dos tipos de microscopio de luz: microscopio de campo

    claro y microscopio de contraste de fases.

    Identificar las partes de los dos tipos de microscopios, as como

    semejanzas y diferencias entre estos.

    Visualizar las diferencias entre observar una muestra en el microscopio de campo claro y el de contraste de fases.

    Observar las diferencias entre clulas animales y vegetales.

    MATERIAL

    Material por equipo Reactivos Portaobjetos Etanol

    Cubreobjetos Cloruro de Sodio (NaCl) Vidrio de reloj Aceite de inmersin

    Tubo de ensayo pequeo Soluciones

    Gradilla Solucin isotnica de NaCl al 0.9% Lanceta estril Azul de metileno al 0.2%

    2 pipetas pasteur Piceta con agua destilada

    Pinzas de diseccin Equipo Material Biolgico

    proporcionado por los alumnos Microscopio de campo claro Jitomate

    Microscopio de contraste de fases Ptalos de clavel o bugambilia de color claro

    Parrilla de calentamiento Sangre

  • 28

    Lente auxiliar

    DESARROLLO

    Colocar el microscopio de campo claro y el de contraste de fases al mismo lado de la mesa a una distancia no mayor de 50 cm y que

    permita que dos persona al mismo tiempo puedan hacer sus observaciones al microscopio.

    Para el microscopio de contraste de fases es necesario realizar el ajuste

    correcto de la siguiente forma:

    1. Realizar la iluminacin de Kohler (ver nota) 2. Colocar el condensador en el nmero que se encuentra en rojo

    despus de la inicial Ph en el objetivo que se vaya a utilizar:

    Condensador Objetivo

    2 Ph 2 (40X)

    3 Ph 3 (100X)

    3. Cambiar un ocular por la lente auxiliar. Enfocar los dos crculos (anillo de fases y diafragma anular) separando las partes que

    componen la lente auxiliar.

    4. Centrar los dos crculos, utilizando los tornillos situados en la parte frontal y lateral del condensador (Figura 2).

    5. Apretar el tornillo lateral. 6. Retirar la lenta auxiliar, colocar nuevamente el ocular y afinar el

    enfoque. 7. Cada vez que cambie el objetivo (10X, 40X y 100X) debe cambiar

    el condensador al nmero correspondiente. El objetivo de 10X no es para contraste de fases, por lo tanto cuando se use el

    condensador deber estar en J (campo claro).

  • 29

    FIGURA 2. Condensador de fases,

    diferencia bsica con el microscopio de campo claro.

    NOTA: Iluminacin de Kohler. Este procedimiento slo puede hacerse en algunos

    microscopios, generalmente los anticuados.

    Cerrar el diafragma del condensador (con la palanca colocada en el borde derecho del

    mismo). Girar el tornillo del condensador para subir el portacondensador hasta el tope.

    Encender la lmpara (mantener la luz tenue para evitar lastimar los ojos). Enfocar con

    el tornillo macromtrico el filamento del foco y centrarlo, esto se logra moviendo las

    perillas laterales que estn sobre el extremo posterior de la lmpara. Cerrar el

    diafragma de la lmpara. Centrar el halo luminoso que se aprecia en el campo visual.

    Abrir el diafragma hasta que aparezcan los bordes oscuros de ste.

    I. Observacin de clulas epiteliales

    1. Con dos hisopos raspar la superficie interna de la mejilla. 2. Frotarlos sobre dos portaobjetos perfectamente limpios.

    3. En uno agregar una gota de azul de metileno al 0.2% (microscopio de campo claro).

    4. En el segundo agregar una gota de solucin de NaCl al 0.9% (microscopio de contraste de fases).

    5. Colocar los cubreobjetos y observar en el microscopio respectivo con el objetivo de 10X, 40X y 100X.

    II. Observacin de clulas de ptalos de clavel o bugambilia

    1. Desprender dos fragmentos de ptalos de clavel o bugambilia. 2. Depositarlos en dos portaobjetos cuidando que queden

    completamente extendidos. 3. A uno agregar una gota de azul de metileno al 0.2%.

    4. Al otro adicionar una gota de agua. 5. Colocar ambos cubreobjetos sobre cada uno de los portaobjetos.

    6. Observar el que se ti con colorante en el microscopio de campo claro.

    7. El que tiene agua en el de contraste de fases, ambos con el objetivo de 10X y 40X.

    8. Anotar sus observaciones.

  • 30

    III. Observacin de clulas sanguneas

    1. Picar la yema del dedo meique con una lanceta estril.

    2. Colocar una gota de sangre sobre un portaobjetos. 3. Agregar una gota de solucin de NaCl al 0.9%.

    4. Colocar el cubreobjetos. 5. Observe al microscopio a 10X, 40X y 100X (campo claro y

    contraste de fases). 6. Anotar sus observaciones.

    NOTAS: a) cada vez que haga una observacin con el objetivo de 100X, deber colocar

    sobre el cubreobjetos de la preparacin una pequea gota de aceite de inmersin, es

    decir, la lente del objetivo deber quedar inmersa en el aceite. Al terminar limpiar el

    aceite de la lente usando papel seda. b) Evitar que la muestra se seque agregando, en

    caso necesario, una gota de la solucin correspondiente, por los bordes del

    cubreobjetos.

    RESULTADOS

    a) Esquematizar cada una de las observaciones.

    b) Resaltar las diferencias entre la observacin en el microscopio de campo claro y el de contraste de fases.

    c) Destacar las diferencias entre la estructura de las clulas vegetales y clulas animales.

    CUESTIONARIO

    a) Describir las diferencias y semejanzas entre sus observaciones de clulas animales y clulas vegetales.

    b) De acuerdo con las observaciones de esta prctica, Qu diferencias se observan al utilizar el microscopio de campo claro y

    el de contraste de fases?

    c) Qu ventajas o desventajas puede mencionar al utilizar estos dos tipos de microscopio?

    BIBLIOGRAFA

    Anzalda Arce S., Tolosa Snchez J. Manual de prcticas de histologa veterinaria. 3 edicin. Universidad Autnoma Nacional

    de Mxico. Mxico, 2003.

    Barrera Escorcia H., Crdenas Reygadas R. El microscopio. Primera edicin. Plaza y Valds, S. A. de C. V. Mxico, 1997.

  • 31

    Aislamiento de ADN

    INTRODUCCION

    Desde hace ms de cien aos Gregor Mendel desarrollo reglas que trataban sobre los patrones de herencia que observ en plantas de

    guisante, l concluyo que la informacin hereditaria se transmita en forma de unidades diferenciadas llamadas genes, los cuales consisten en

    secuencias de ADN (cido desoxirribonucleico). El ADN contiene la informacin gentica de la mayor parte de los organismos vivos (una

    excepcin son algunos virus, denominados retrovirus, que utilizan el ARN o cido ribonucleico para guardar su informacin gentica). Este

    puede ser copiado a travs de las sucesivas generaciones de clulas; puede ser traducido a protenas y ser reparado cuando sea necesario.

    Su estructura contiene las instrucciones que necesita un organismo para su desarrollo y funcin.

    El ADN fluye entre generaciones de clulas y dentro de cada clula

    individual. Est compuesto por nucletidos (unidades monomricas de los cidos nucleicos), formados por bases nitrogenadas que son la

    adenina (A), citosina (C), guanina (G) y tiamina (T), una molcula de azcar de cinco tomos de carbono (desoxirribosa) que se une a una

    molcula de fosfato, que acta como enganche de cada nucletido.

    Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, es decir, un polinucletido. Lo que distingue a un nucletido de otro es,

    entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin

    secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de nucletidos a lo largo de la cadena

    es la que codifica la informacin gentica. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucletidos, en la que las

    dos hebras estn unidas entre s por puentes de hidrgeno. Una doble cadena de ADN mide de 22 a 26 angstroms (2,2 a 2,6 nanmetros) de

    ancho, y una unidad (un nucletido) mide 3,3 (0,33 nm) de largo. Aunque cada unidad individual que se repite es muy pequea, los

    polmeros de ADN pueden ser molculas enormes que contienen millones de nucletidos. Por ejemplo, el cromosoma humano ms largo,

    el cromosoma nmero 1, tiene aproximadamente 220 millones de pares

    de bases. Las dos cadenas de ADN se enroscan sobre s mismas formando una especie de escalera de caracol, denominada doble hlice.

    El modelo de estructura en doble hlice fue propuesto en 1953 por James Watson y Francis Crick. La importancia de este modelo radicaba

    en su consistencia con las propiedades fsicas y qumicas del ADN,

  • 32

    adems la complementariedad de bases poda ser relevante en su

    replicacin, y tambin la importancia de la secuencia de bases como portadora de informacin gentica. La conformacin que adopta el ADN

    depende de su secuencia, la cantidad y direccin de superenrollamiento

    que presenta, la presencia de modificaciones qumicas en las bases y las condiciones de la solucin, tales como la concentracin de iones de

    metales y poliaminas.

    Desde el descubrimiento del ADN y el conocimiento de sus propiedades

    fsicas bsicas tales como la doble hlice, se ha progresado sobre las

    propiedades qumicas del ADN y las interacciones entre el ADN y su entorno. Con respecto a la densidad; existe una relacin lineal entre el

    contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. Es decir a mayor contenido en G+C mayor densidad posee

    el ADN. Por otro lado, la proporcin A+T/C+G est relacionada con la estabilidad de la molcula de ADN de doble hlice. Cuanto mayor es el

    contenido en G+C de una molcula, mayor cantidad de pares G-C presentar, como consecuencia tendr una mayor cantidad de triples

    enlaces y, por consiguiente, ser necesario suministrar una mayor cantidad de energa a esa doble hlice para separar sus dos hebras

    (desnaturalizacin o fusin del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de

    doble hlice para desnaturalizarlo. El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su capacidad de absorcin de la luz

    ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produce en

    estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin pasando a estado de hlice sencilla, si degradamos

    este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.

    Las funciones biolgicas del ADN incluyen el almacenamiento de

    informacin (genes y genoma), la codificacin de protenas (transcripcin y traduccin) y su autoduplicacin (replicacin del ADN)

    para asegurar la transmisin de la informacin a las clulas hijas durante la divisin celular. El ADN se puede obtener de cualquier clula

    que posea ncleo. Una gota de sangre, un trozo de hoja o un cabello aunque no tenga raz. La extraccin se realiza mediante la aplicacin de

    diversas tcnicas, en funcin de la calidad y cantidad de ste. Se requiere de romper la membrana celular para liberar el contenido de

    DAN de la clula.

    OBJETIVOS

    Extraer ADN de clulas vegetales.

  • 33

    Utilizar las propiedades qumicas de la molcula de ADN para

    aislarlo de las clulas.

    Determinar el espectro de absorcin de esta macromolcula.

    MATERIAL

    Material por equipo Reactivos Vaso de precipitados de 100 mL Tris

    2 Tubos para centrfuga de 50 mL cido etilendiaminotetraactico (EDTA)

    Micropipetas y puntas de diferente volumen

    Cloruro de Sodio (NaCl)

    Celdas para espectrofotmetro Cloroformo-alcohol isoamlico Varilla de vidrio Dodecil sulfato de Sodio (SDS)

    2 Tubos de ensayo Citrato de sodio 1 embudo de vidrio Soluciones

    Mortero Tris/EDTA/NaCl (50mM:20mM:

    0.3g 1 pipeta de 10mL Amilasa (100 mg/mL)

    1 pipeta Pasteur Solucin saturada de NaCl Cloroformo-alcohol isoamlico

    (24:1) Solucin salina de citratos (Citrato

    de sodio 0.15M, NaCl 0.15M) SDS al 10%

    Equipo Material proporcionado por los alumnos

    Centrfuga

    1 guayaba grande

    Espectrofotmetro

    Celdas para espectrofotmetro

    DESARROLLO

    I. Obtencin del ADN

    1. Colocar 30 mL de etanol en un vaso de precipitados de 100 mL. Meter el vaso con el alcohol en un refrigerador para que est fro

    cuando sea requerido.

  • 34

    2. Colocar 15 gr de guayaba en un mortero.

    3. Adicionar 5.0 mL de la solucin Tris/EDTA/NaCl (50mM:20mM: 0.3g).

    4. Triturar durante 5 min.

    5. Adicionar 300 L de amilasa a una concentracin de 100 mg/mL.

    6. Agregar 10 mL de una solucin saturada de NaCl y 5 mL de SDS al

    10%. 7. Continuar macerando durante 5 min ms.

    8. Filtrar el macerado a travs de varias capas de gasa previamente colocadas en un embudo de vidrio, NO exprimir las gasas con el fin

    de obtener mayor volumen. 9. Recuperar el filtrado en un tubo de centrfuga de 50 mL.

    10. Adicionar 15 mL de la mezcla cloroformo-alcohol isoamlico (24:1). 11. Tapar el tubo y agitar vigorosamente por 1 min.

    12. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 min. 13. Sacar el vaso con el etanol fro.

    14. Con una pipeta Pasteur recuperar cuidadosamente el sobrenadante, evitando tocar el precipitado.

    15. Verter el sobrenadante lentamente al vaso de precipitados que

    contiene los 30 mL de etanol fro. 16. Se observar la formacin de hebras en el etanol.

    II. Medicin del Espectro de absorcin del ADN

    1. Con una varilla de vidrio recuperar estas hebras (ADN). 2. Dejar escurrir el etanol y colocar la varilla de vidrio en la cual se

    enroll el ADN en un tubo de ensayo. 3. Adicionar al tubo, escurriendo por la varilla, 2 mL de la solucin

    salina de citratos. 4. Preparar 1 mL de una dilucin 1:10 con la solucin salina de

    citratos. 5. Encender el espectrofotmetro y ajustar la longitud de onda a 200

    nm.

    6. Colocar en una celda para espectrofotmetro 1 mL de la solucin salina de citratos. Esta solucin ser utilizada como blanco, es

    decir con este tubo ajustar el espectrofotmetro a una absorbencia de cero.

    7. Hacer lecturas de absorbancia a intervalos de 10 nm hasta llegar a una longitud de onda de 350 nm.

    8. Es importante recordar que cada vez que se cambie la longitud de onda se necesita ajustar a cero de absorbancia con el blanco.

  • 35

    RESULTADOS

    a) Anotar en la tabla los valores de absorbancia.

    b) Elaborar una grfica de longitud de onda (eje x) contra absorbancia (eje y), marcar el pico mximo de absorcin del ADN

    que obtuvieron.

    Longitud de Onda (nm)

    Absorbancia

    200

    210

    220

    230

    240

    250

    260

    270

    280

    290

    300

    310

    320

    330

    340

    350

  • 36

    CUESTIONARIO

    a) Cul fue la longitud de onda donde el ADN extrado de clulas de

    guayaba mostr el pico de absorcin?

    b) Describir la estructura de los nucletidos que forman el ADN?

    BIBLIOGRAFIA

    Berg J. M., Stryer L., Tymoczko J. L. Bioqumica. 6a edicin. Editorial Revert, Espaa. 2008.

    Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M. Principios de Bioqumica. 4a edicin. Editorial Omega, Espaa. 2005.

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    Mandelkern M., Elias J., Eden D., Crothers D. (1981). The dimensions of DNA in solution. J Mol Biol 152 (1): 153161.

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    Huret J. L. ADN: Estructura molecular. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2006.

  • 37

    Extraccin y separacin de protenas y lpidos

    INTRODUCCION Las protenas y los lpidos son fundamentales, tanto para la estructura

    como para la funcin de las clulas. Los lpidos son compuestos

    orgnicos qumicamente heterogneos entre s. Se puede definir como lpido a aquellos compuestos que son insolubles en agua, pero solubles

    en solventes orgnicos como el etanol, ter, acetona, etc. Lo cual indica la naturaleza no polar de los lpidos, esto debido a la presencia de las

    cadenas hidrocarbonadas en la estructura de estas molculas. Los componentes principales de las membranas celulares son los

    fosfolpidos, que adems estar compuestos de una cadena hidrocarbonada apolar, presentan otros grupos con carga negativa.

    Las protenas son macromolculas formadas por monmeros conocidos

    como aminocidos. Las protenas son las biomolculas ms abundantes en los seres vivos y las que presentan gran diversidad de funciones.

    Una yema con un peso aproximado de 10 g contiene un 50% de agua,

    17% de protenas y 33% de lpidos; entre los cules los fosfolpidos

    representan un tercio de la masa lipdica y se componen esencialmente de lecitinas (70%) y cefalinas (25%).

    Fundamento

    En esta prctica se inicia al alumno en las tcnicas de aislamiento

    de diferentes biomolculas (protenas y lpidos) a partir de materiales biolgicos, lo cual es de especial inters en numerosos tipos de estudios

    bioqumicos. Adems de la extraccin de la protena albmina, se extraen y separan dos grupos de lpidos muy importantes, ambos

    conocidos como fosfolpidos, por contener fsforo: lecitinas y cefalinas.

    Los compuestos qumicos, de origen biolgico, que son solubles en disolventes orgnicos (acetona, ter, cloroformo, etc.), se consideran

    como los componentes de la fraccin lipdica. Dicha fraccin, est

    formada por molculas muy diversas, cuyas estructuras slo tienen en comn que son solubles en disolventes orgnicos, por lo tanto poco

    solubles o insolubles en agua.

    La propiedad de solubilidad de los lpidos en compuestos orgnicos, se puede aprovechar como un mtodo de extraccin de stos

    a partir de tejidos de origen animal o vegetal. Los disolventes ms comunes para la extraccin total de los lpidos son etanol, metanol,

  • 38

    cloroformo, ter, ter de petrleo, hexano, o bien mezclas de ellos. Y la

    extraccin se incrementa cuando estos disolventes estn calientes.

    OBJETIVOS

    Obtener fosfolpidos a partir de un producto natural (huevo de gallina).

    Separar una protena (albmina) a partir de un producto natural

    (huevo de gallina).

    Entender las diferencias qumicas de las protenas y los lpidos, las cuales permiten aislarlos de la misma muestra.

    Utilizar diferentes solventes para aislar dos distintas biomolculas:

    protena y lpidos.

    MATERIAL

    Material por equipo Reactivos 2 vasos de precipitados de 100 mL etanol

    3 pipetas de 10 mL Sulfato de sodio anhidro ((NH4) 2 SO4, Peso Molecular 132.14 g/mol)

    1 pipeta de 5 mL ter 1 termmetro ter petrleo

    2 Tubos para centrfuga acetona papel filtro ter etlico

    1 probeta de 100 mL 1 varilla de vidrio Soluciones

    1 embudo de vidrio cido actico 2 M (CH3COOH) 2 tubos de ensayo Sulfato de amonio al 60% a pH 11

    2 matraces Erlenmeyer de 100 mL alcohol:ter (3:1)

    2 matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 cristalizador

    Equipo Material Biolgico proporcionado por los alumnos

    Parrilla de calentamiento 1 huevo Centrfuga 2 frascos de 20 mL con tapa

  • 39

    DESARROLLO

    1. Pesar un vaso de precipitados de 50 mL y una probeta de 100 mL.

    2. Hacer una pequea perforacin a un huevo de manera que permita la salida de la clara. Colocar la clara en la probeta, cuidar que la

    yema no se rompa. 3. Pesar la probeta con la clara para determinar su peso.

    4. Romper el cascaron para colocar la yema en el vaso de precipitados de 50 mL previamente pesado.

    5. Pesar el vaso de precipitados que contiene la yema para calcular el peso de est.

    I. Extraccin y separacin de fosfolpidos (lecitina y cefalina)

    1. Colocar el vaso de precipitados con la yema dentro de la campana de

    extraccin. En caso de que no haya una en el rea de trabajo abrir ventanas para permitir circule el aire.

    2. Agregar al vaso de precipitados que contiene la yema de huevo, ter

    hasta cubrir totalmente la yema. 3. Agitar con una varilla de vidrio para homogenizar bien.

    4. Agregar lentamente y sin dejar de agitar, un volumen de acetona igual al del ter.

    5. Dejar en reposo 5 minutos. Mientras preparar un embudo de vidrio con papel filtro.

    6. Filtrar, desechar el lquido que sale del embudo. La lecitina y cefalina se encuentran en el papel filtro.

    7. Colocar un tubo de ensayo limpio abajo del tallo del embudo. Lavar el precipitado (papel filtro) con etanol fro.

    8. El filtrado recibido en el tubo de ensayo es la lecitina, que es ms soluble en el alcohol fro. En el papel filtro queda la cefalina.

    9. Para obtener la lecitina, evaporar el etanol lentamente en bao mara.

    10. Deje secar los precipitados y pesarlos.

    11. Guardar los frascos con las muestras para la prctica de determinacin de lpidos.

    II. Aislamiento de protenas de la clara de huevo (albminas)

    1. A la probeta que contiene la clara adicionar un volumen igual de agua

    destilada, agitar con una varilla de vidrio. 2. Traspasar esta mezcla a un matraz Erlenmeyer de 250 mL.

    3. Adicionar 100 mL de sulfato de amonio al 60%, mezclar perfectamente con una varilla de vidrio.

  • 40

    4. Permitir reposar 10 minutos, repartir en tubos de centrfuga de 50

    mL y centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos. 5. Separar el sobrenadante en un tubo y recuperar el precipitado.

    6. Pesar el precipitado y guardarlo para la prxima prctica. Guardar 1

    mL de sobrenadante tambin para la prctica de cuantificacin.

    RESULTADOS

    a. Calcule la cantidad de lpidos obtenidos:

    a= peso en gramos del frasco

    b=peso del frasco con la muestra Lpidos = b - a = g de lpidos/ peso en g de la yema

    b. Observe la muestra y especifique su aspecto

    c. Una vez seca la protena pesarla. d. Elaborar la siguiente tabla:

    Muestra Cantidad obtenida

    (gr)

    Cefalina

    Lecitina

    Protenas

    NOTA: Guardar las 3 muestras para la prctica de cuantificacin de protenas y lpidos.

    CUESTIONARIO a) Qu importancia biolgica tienen los fosfolpidos? b) Qu diferencia estructural existe entre las lecitinas y cefalinas?

    c) Investigar el contenido de lpidos y protenas en el huevo de

    gallina.

    BIBLIOGRAFA

    Goodsell D., Olson A. J. (1993). Soluble proteins: size, shape, and function. Trens Biochem Sci. 18: 65-68.

    Hernndez L. R. Bioqumica Experimental. Editorial Limusa. Mxico, 1979.

    Voet D, Voet J. 1992. Bioqumica. Ediciones Omega. Espaa., pp81-82.

  • 41

    Cuantificacin de lpidos y protenas

    INTRODUCCIN

    Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de

    purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una enzima, en el diagnstico de enfermedades,

    para cuantificar el contenido de una protena de inters en un extracto biolgico, entre otros propsitos.

    Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas, los

    cuales se basan en: a) Propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV.

    b) Formacin de derivados qumicos. c) Capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

    En general, no hay mtodo completamente satisfactorio para medir la concentracin de protenas en una muestra. La eleccin del

    mtodo depende de la naturaleza de la protena, de los otros componentes, de la rapidez y sensibilidad deseada (Tabla 1).

    Tabla 1. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas

    Mtodo Ventajas Desventajas

    Mtodos de Absorcin

    Ultra Violeta (UV)

    No se pierden las

    muestras

    Interfieren varios compuestos

    que absorben en UV.

    Mtodos Colorimtricos

    Biuret

    Muy especfico para

    protenas

    Poca interferencia

    Es barato

    Tiene poca sensibilidad.

    Lowry Tiene bastante

    sensibilidad

    No todas las protenas

    reaccionan igual.

    Presenta interferencias con

    detergentes no inicos

    Bradford Muy sensible Muestra interferencias con

    detergentes.

    cido Bicinconinico

    BCA

    Es el mtodo mas sensible

    Es el que muestra menos

    interferencias

    Mtodos Fluorimtricos

    o-ftalaldehdo Muy sensible

    La interferencia de aminas.

    No todas las muestras

    reaccionan igual.

  • 42

    Fundamento

    Mtodo de Bradford

    Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul

    y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que

    el colorante libre. Este ensayo es muy reproducible y rpido ya que el proceso de unin del colorante a la protena se realiza en un tiempo no

    mayor de 2 minutos a temperatura ambiente y la estabilidad del color es de aproximadamente 1 hora. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones

    bsicas.

    En relacin a los fosfolpidos, el mtodo para la determinacin cuantitativa de los fosfolpidos obtenidos de la yema de huevo, se basa

    en la determinacin cuantitativa del fsforo presente en el fosfolpidos

    mediante el mtodo modificado por Bartlett (1959). Este mtodo se basa en la reaccin del fsforo inorgnico con el molibdato de amonio en

    disolucin cida para formar cido fosfomolbdico. Posteriormente al adicionar un agente reductor, este reduce al molibdeno produciendo una

    coloracin azul que puede medirse en un espectrofotmetro.

    OBJETIVOS

    Realizar una curva estndar para cada mtodo.

    Determinar la concentracin de fosfolpidos de la muestra

    problema.

    Determinar la concentracin de protenas de la muestra problema.

    MATERIAL

    Material por equipo Reactivos 30 Tubos de ensayo 10ml ter

    10 Celdas Reactivo de Bradford 5 pipeta graduada de 1ml, Soluciones

    5 pipeta graduada de 5mL cido sulfrico 10 N 1 gradilla Molibdato de Amonio 6.6 % en

    H2SO4

  • 43

    vaso de precipitado de 1litro Sulfato Ferroso al 10 %

    Pro-pipeta Solucin de NaCl al 0.15 M Puntas para pipetas Solucin estndar BSA (0.5mg/ml)

    Termmetro Solucin KH2PO4 10 mM

    Equipo Soluciones Espectrofotmetro Patrn de albmina de suero

    bovino (BSA) 0,5 mg/mL Parrilla de calentamiento Muestra de protena: diluciones

    1:10 MI y 1:200 M2 Material Biolgico

    Muestra de fosfolpidos (Lecitina y Cefalina), obtenidas en la prctica

    anterior.

    Muestra de protenas obtenidas en la prctica anterior.

    DESARROLLO I. Determinacin de fosfolpidos

    1. Adicionar a la lecitina y cefalina, de la prctica de separacin de fosfolpidos, 2 mL de ter y mezclar perfectamente.

    2. Marcar dos tubos de ensayo con los nmeros 5 y 6 (para la muestra de lecitina) y con los nmeros 7 y 8 (para la muestra de

    cefalina). 3. Colocar 0.5 mL de cada muestra en el tubo correspondiente.

    4. Colocar los cuatro tubos en un bao de agua caliente (aproximadamente 40 C) para evaporar totalmente el ter.

    NOTA: Es muy importante que antes de tomar cualquier volumen de H2SO4 las

    pipetas o cualquier material del vidrio que vaya a tener contacto con este cido

    est perfectamente seco para lo cual es necesario darles un bao con acetona.

    5. Adicionar cuidadosamente resbalando por las paredes del tubo 0.5 mL de cido sulfrico 10 N.

    6. Colocar los tubos en bao mara a aproximadamente 70 C.

    7. Incubar durante 20 minutos o bien que la solucin se observe

    transparente. 8. Mientras comenzar a preparar la curva patrn de fosfato de potasio

    (Punto II). 9. Retirar los tubos del bao mara, colocarlos en la gradilla para

    permitir que se enfren. 10. Adicionar lentamente 2 mL de agua destilada.

    11. Nuevamente colocar los tubos en el bao mara a 70 C durante

    10 minutos.

  • 44

    II. Identificacin de fosfolpidos

    1. Marcar cuatro tubos, recordar que los otros cuatro se estn

    incubando en bao mara. Adicionar los reactivos indicados de acuerdo a la siguiente tabla:

    Reactivo Tubo

    1 2 3 4 5 6 7 8

    mL

    KH2PO4 0 0.1 0.2 0.4

    H20 1 0.9 0.8 0.6

    H2SO4 0.25 0.25 0.25 0.25

    Lecitina 1.0 1.0

    Cefalina 1.0 1.0

    1. Los tubos 5-8 sern preparados una vez concluido el punto I. 2. Ya con los 8 tubos preparados de acuerdo a la tabla, proceder a

    adicionar 1 mL de molibdato de amonio a todos los tubos y agitar. 3. Aadir 1 mL de sulfato ferroso, agitar y permitir incubar 10

    minutos a temperatura ambiente. 4. Mientras encender el espectrofotmetro y ajustar la longitud de

    onda a 660 nm. 5. Al terminar los 10 minutos leer la absorbancia de cada tubo.

    6. Anotar sus resultados en la tabla de resultados.

    III. Cuantificacin de Protenas

    Preparacin de la Muestra

    a) De la muestra de Albmina obtenida en la prctica anterior pesar

    0.5 g y adicionar 100 mL de NaCl 0.15M. b) Mezclar hasta que se disuelva totalmente la protena.

    c) Tomar la cantidad necesaria para tener una dilucin de 1:10 y 1:20.

    d) Tomar 0.1 mL de la solucin y agregar 0.9 mL de NaCl al 0.15 M (dilucin 1:10), marcar el tubo con el nmero 6. Para la dilucin

    1:20 colocar en un tubo 1.9 mL de NaCl 0.15M y adicionar 0.1 mL de la albmina preparada en el inciso b (tubo 7).

  • 45

    e) Para determinar la concentracin de protenas de la muestra

    problema se prepara una curva patrn a partir de una solucin estndar de BSA con una concentracin de 0.5 mg/mL (tubos 1-5

    de la tabla 2). NOTA: El tubo 1 contiene slo NaCl, sirve de blanco para el ajuste del colormetro a

    cero de absorbancia. De esta forma slo se mide el color producido por las protenas,

    puesto que se resta el color debido a los reactivos.

    Mtodo de Bradford

    a) Marcar 14 tubos para hacer el ensayo por duplicado (1-7 y 1-7),

    aadir las cantidades indicadas en la tabla 2 y agitar. b) Aadir 5 mL del reactivo de Bradford a los tubos estndar y

    muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla 2 y agitar.

    c) Dejar a temperatura ambiente 5 minutos y leer Absorbancia a 595 nm (A595) frente al blanco. El color es estable 1 hora.

    Tabla 2. Protocolo tipo para la cuantificacin de protenas por el

    mtodo de Bradford

    REACTIVOS RESULTADOS

    Tubos BSA

    (0.5mg/mL)

    NaCl

    0.15 M

    Reactivo

    Bradford

    A595 nm [protena]

    1 0 l 500 l 5 mL

    2 25 l 475 l 5 mL

    3 50 l 450 l 5 mL

    4 75 l 425 l 5 mL

    5 100 l 400 l 5 mL

    6 - 500 l 5 mL

    7 - 500 l 5 mL

    RESULTADOS

    a) Realizar una curva estndar o patrn para cada una de las determinaciones.

    b) Calcular la concentracin de BSA en cada uno de los tubos de la curva patrn, para lo cual es necesario considerar el volumen

  • 46

    adicionado de BSA y la concentracin de la solucin patrn (0.5

    mg/mL). c) Graficar la curva estndar con la concentracin de la BSA como

    variable independiente (eje X) y la absorbancia como variable

    dependiente (eje Y). d) Linealizar la curva usando el mtodo de regresin lineal. La

    concentracin que tienen las muestras problema se determina por interpolacin de los valores de absorbancia en la curva patrn.

    e) Determinar la concentracin de fosfolpidos y de protenas. Nota: la concentracin de BSA puede obtenerse usando el principio de dilucin (C1 V1 = C2 V2).

    f) Comparar los resultados que obtuvo en las concentraciones de protenas y lpidos y verificar si corresponde a lo esperado en

    teora.

    BIBLIOGRAFA

    Bartlett G. R. (1959). Colorimetric Assay Methods for Free and Phosphorylated Glyceric Acids. J. Biol. Chem. 234:469-471.

    Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.

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    Clark J. M. Bioqumica Experimental. Editorial Acribia. Espaa, 1966.

    Fujimoto E. K., Goeke N. M., Olson B. J., Klenk D. C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem

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    Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). J. Biol. Chem. 193: 265-275.

    Martin D. W., Mayes P. A., Rodwell V. W. 1981. Harpers Review of Biochemistry. 18 . Ed. Langer Medical Publication, USA., pp20-21

    Voet D, Voet J. 1992. Bioqumica. Ediciones Omega. Espaa., pp81-82.

  • 47

    Identificacin Cualitativa de Carbohidratos

    INTRODUCCIN

    Los carbohidratos o hidratos de carbono constituyen compuestos qumicos formados principalmente por carbono, hidrgeno y oxgeno,

    elementos que se conjugan para formar diversos tipos. Por su estructura qumica son aldehdos polihidroxilados o cetonas polihidroxiladas. Los

    carbohidratos estn ampliamente distribuidos tanto en tejidos animales como vegetales.

    Los carbohidratos pueden ser monosacridos, disacridos, oligosacridos

    y polisacridos. Los disacridos y los polisacridos se pueden hidrolizar para producir monosacridos. Los monosacridos son los azucares

    ms sencillos, son compuestos qumicos que dependiendo del nmero de carbonos se clasifican como triosas, tetrosas, pentosas, hexoxas y

    heptosas. Los ms importantes biolgicamente son los que tienen 3, 5 y

    6 tomos de C. Estos contienen un gran aldehdo (aldosas) o cetona (cetosas) y nos son hidrolizables, todos son reductores. Entre los

    principales monosacridos se encuentra la glucosa (azcar en el cual se convierten todos los dems carbohidratos antes de ser oxidados en el

    organismo) y la fructosa (se produce junto con la glucosa durante la degradacin de la sacarosa).

    Entre los principales oligosacridos se encuentran los disacridos que

    son dos molculas de monosacridos unidas por un tomo de oxigeno, con la consiguiente eliminacin de una molcula de agua. Los ms

    importantes son la sacarosa (glucosa-fructosa), la lactosa (glucosa y galactosa) y la maltosa.

    Los polisacridos son enormes cadenas formadas por uno o varios

    tipos de mosacridos. La celulosa (componente principales de la pared

    celular de los vegetales) y almidn (reserva en las plantas) est formado por unidades de glucosa combinadas entre s, por uniones

    glicosdicas.

    Fundamento

    Existen diferentes pruebas que permiten identificar el tipo de carbohidratos presente en una muestra. En particular los azcares que

    dan resultados positivos con las soluciones de Benedict Fehling se conocen como azcares reductores. Los carbohidratos que no dan

  • 48

    pruebas positivas con estas soluciones se llaman azcares no

    reductores.

    La reaccin de Fehling Se basa en el carcter reductor de los

    monosacridos, en esta el Cu++ reacciona con los carbohidratos reductores, en este caso se oxidar dando lugar a la reduccin del

    sulfato de cobre (II), de color azul, a xido de cobre (I), de color rojo-anaranjado. La reaccin de Bial permite reconocer pentosas

    (carbohidratos de 5 carbonos) y sustancias que las contengan. Se basa en la formacin de un compuesto furfrico que se condensa con la

    orcina del reactivo.

    Todos los carbohidratos al entrar en contacto con cido sulfrico concentrado se deshidratan formando compuestos furfricos (las

    pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos compuestos furfricos reaccionan positivamente con el reactivo de

    Molish (solucin alcohlica de alfa-naftol). La reaccin del Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) se utiliza para identificar

    polisacridos. El color que dan los polisacridos con el lugol se debe a

    que el Iodo ocupa espacios vacos en las hlices de la cadena de unidades de glucosa. Esta unin del I2 a la cadena es reversible, y por

    calentamiento desaparece el color, que al enfriarse reaparece. El lugol da con el almidn color azul y con el glucgeno color rojo caoba.

    OBJETIVOS

    Utilizar diferentes reacciones para identificar los distintos tipos de carbohidratos en muestras problema.

    Identificar el tipo de carbohidrato de acuerdo a la deteccin

    cualitativa de diferentes muestras.

    Realizar la hidrlisis del enlace glicosdico de un disacrido.

    MATERIAL

    Material por equipo Reactivos Tubos de ensaye cido sulfrico concentrado

    Puntas para micropipetas Bicarbonato de sodio 1 Vaso de pp de 250 ml cido clorhdrico concentrado

    1 Esptula Soluciones Gradilla NaOH al 5%

    Micropipetas Hidrxido de amonio 5%

  • 49

    2 pipetas pasteur Reactivo A de Fehling

    Piceta con agua destilada Reactivo B de Fehling Pinzas de diseccin Reactivo de Benedict

    1Pinzas para tubo de ensaye Reactivo de Seliwanoff

    1Matraz Erlenmeyer 125 ml Reactivo de Barfoed HCl al 10%

    Lugol Reactivo de Bial

    Equipo Parrilla de calentamiento

    Muestras de carbohidratos Glucosa al 1% Ribosa al 1%

    Lactosa al 1% Sacarosa al 1% Fructosa al 1% Casena 1% (o alguna otra

    protena) Almidn (1mg/mL)

    DESARROLLO

    Proporcionar a los alumnos muestras de diferentes carbohidratos etiquetados con nmeros de 1-7 (el profesor deber conocer cul

    muestra: carbohidrato y protena corresponde a cada nmero). Con estas muestras problema realizar cada una de las siguientes reacciones

    de carbohidratos.

    I. Reaccin de Fehling (Identifica carbohidratos reductores)

    a) Colocar en un tubo de ensayo 500 L de solucin A y 500 L de

    solucin B del reactivo de Fehling.

    b) A este tubo se le agregan 100 L de la muestra problema.

    c) Colocar en bao mara a ebullicin durante 3 minutos y dejar

    enfriar. d) La formacin de precipitado rojo, con decoloracin de la solucin

    indica prueba positiva.

    NOTA: La reaccin ser positiva (indicando la presencia de azcares como: glucosa,

    maltosa y lactosa) si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo. La reaccin ser

    negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso.

    II. Reaccin de Barfoed (diferencia entre un monosacrido y un

    disacrido)

    a) Colocar en un tubo 750 L del reactivo de Barfoed.

  • 50

    b) Adiciona 250 L de la muestra problema.

    c) Colocar el tubo en bao mara. d) Anotar el tiempo que tarda en aparecer un precipitado rojo de

    xido cuproso.

    III. Reaccin de Bial (Prueba positiva para pentosas)

    a) En un tubo de ensayo colocar 250 L del reactivo de Bial con

    mucho cuidado. b) Agregar 250 L de la muestra problema.

    c) Calentar los tubos en bao mara hasta que se inicie la ebullicin. d) Agitar los tubos, dejar reposar durante 5 minutos.

    e) Observar.

    IV. Reaccin de Seliwanoff (Diferencia entre aldosas y cetosas)

    a) Colocar en un tubo de ensayo 200 L de la muestra problema.

    b) Adicionar 100 L del reactivo de Seliwanoff y calentar a bao de

    ebullicin 1 minuto. c) Anotar los resultados y continuar calentando y observando

    cambios de color a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos. d) Las cetosas dan coloracin rojo intenso y las aldosas muy dbil y

    ms lentamente.

    V. Reaccin de Lugol (Identificacin de polisacridos)

    a) Colocar en un tubo de ensayo 200 L de solucin cada muestra

    problema. b) Adicionar de 2 gotas de lugol.

    c) Anotar el color producido en cada uno de los tubos. d) Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta,

    la reaccin es positiva.

    VI. Prueba de Benedict (Identificacin de monosacridos)

    a) Colocar en un tubo de ensaye 200 L del reactivo de Benedict.

    b) 100 mL de la solucin del azcar.

    c) Caliente a ebullicin y deje enfriar a temperatura ambiente.

    d) Un precipitado cuya coloracin vara desde amarillo hasta rojo, con decoloracin de la solucin, indica prueba positiva.

    NOTA: La solucin de Benedict se utiliza en la determinacin cuantitativa de glucosa en

    la sangre.

  • 51

    VII. Hidrlisis de Carbohidratos

    I. Hidrlisis de Sacarosa

    a) Colocar una muestra de sacarosa en un tubo. b) Aadir unas 10 gotas de cido clorhdrico al 10%.

    c) Calentar a la llama del mechero durante 2 minutos. d) Dejar enfriar y neutralizar con bicarbonato.

    e) Realizar la Prueba de Fehling, observar el resultado. NOTA: La reaccin positiva indica que se rompi el enlace O-glicosdico de la sacarosa.

    Se recomienda antes de aplicar la reaccin de Fehling, neutralizar con bicarbonato.

    RESULTADOS

    a) Anote los resultados de sus observaciones en las siguientes tablas:

    TABLA 1.Resultados de las pruebas positivas para cada una de las muestras

    Reaccin

    Muestra Fehling Benedict Barfoed Bial Seliwanoff Lugol

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    b) De acuerdo al tipo de reaccin que dio positiva en cada una de las

    muestras, coloque el nmero que considere corresponde a cada uno de las muestras problema.

  • 52

    TABLA 2. Identificacin del tipo de carbohidrato

    Muestra Nmero de muestra que

    considera le corresponde

    Sacarosa

    Fructosa

    Almidn

    Ribosa

    Glucosa

    Protena

    Lactosa

    c) De acuerdo a los resultados de hidrlisis de carbohidratos, concluir si se llev a cabo la hidrlisis de las muestras:

    TABLA 3. Hidrlisis de disacridos.

    Muestra

    hidrolizada Fehling Benedict Se realiz la

    hidrlisis? Productos de

    hidrlisis

    Sacarosa

    BIBLIOGRAFA Hernndez L. R. Bioqumica Experimental. Editorial Limusa.

    Mxico, 1979.

    Jacobs T. L., Truce W. E., Ross G. R. Laboratory Practice of Organic Chemistry 5a. Ed.MacMilla Pub. Co. Inc. USA, 1974.

    Hudlicky M. Laboratory Experimetns in Organic Chemistry 3a.

    Ed.Avery Publishing Group Inc. USA, 1985.

    Domnguez, X. A. Mtodos de Investigacin Fitoqumica. Editorial Limusa. Mxico, 1973.

  • 53

    Hidrlisis de almidn: Actividad de la amilasa

    INTRODUCCIN

    Cuando doce o ms monosacridos se encuentran unidos mediante enlaces glicosdicos, el producto que resulta de esta unin es un

    polisacrido. Los polisacridos sirven como elementos estructurales y de almacenajde de energa y carbono tanto en plantas como en animales.

    El almidn es la principal fuente de carbohidratos de reserva de las plantas. Las plantas verdes producen almidn como producto final de la

    fotosntesis, los cereales (trigo, arroz, maz y sorgo) contienen alto contenido de almidn en sus semillas.

    El almidn es un homopolisacrido de reserva o almacenamiento,

    formado por dos tipos de estructuras: la amilosa y la amilopectina. La amilosa es un polmero lineal que tiene enlaces glicosdicos (1

    4), con un extremo no reductor y uno reductor, es decir que tiene su carbono anomrico libre. La amilopectina es un polisacrido ramificado

    formado por cadenas cortas de glucosa unidas por enlaces (1 4) y

    presenta raminifcaciones en las que se presenta una unin de la ramificacin con la cadena lineal (1 6) cada 30 residuos de glucosa.

    El almidn puede ser hidrolizado en un medio cido o bien por accin de las enzimas amilasas y desramificadoras. La -amilasa presente en

    animales y plantas, la -amilasa presente en tubrculos y semillas de

    algunas plantas. Tanto la -amilasa como la -amilasa; ambas hidrolizan

    la amilosa en los enlaces (1 4), pero lo hacen de forma diferente, la

    -amilasa rompe de manera aleatoria y la accin de la -amilasa es ms

    ordenada.

    Fundamento

    La enzima amilasa hidroliza la cadena lineal de la amilosa rompiendo

    los enlaces (1 4) al azar a lo largo


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