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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA (EEL–USP)

O ESTUDO SOBRE ARCHAEA E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS

Lorena

2013

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FLAVIO KIYOSHI TOMINAGA

O ESTUDO SOBRE ARCHAEA E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao

Departamento de Biotecnologia da Escola Estadual

De Lorena – Universidade de São Paulo

Orientador: Profª. Drª Maria Bernadete De Medeiros

Lorena

2013

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DEDICATÓRIA

À minha família, base da minha vida.

Aos meus professores orientadores.

E aos verdadeiros amigos.

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AGRADECIMENTOS

À professora Drª. Maria Bernadete de Medeiros, pela atenção, paciência, dedicação e

empenho nas orientações deste trabalho.

Aos demais professores do curso, que muito contribuíram com sua experiência e dedicação.

Aos colegas de classe, companheiros sempre presentes nos momentos de alegria e nas

dificuldades encontradas neste caminho.

Aos meus amigos, por ter me incentivado a cursar esta faculdade e a não desistir nos

momentos difíceis.

Aos meus pais, que concederam a base da minha formação.

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RESUMO

O domínio Archaea é composto por um grupo de bactérias com características

extremófilos. Toleram condições ambientais extremas, que lembram o ambiente dos

primórdios do aparecimento da vida. Desenvolvem-se sob condições de elevadas ou baixas

temperaturas, ausência total de oxigênio, condições osmóticas e pHs extremos. As células

apresentam características únicas, como as composições química da membrana

citoplasmática e parede celular, além de apresentar vias metabólicas específico como as

bactérias metanogênicas.

Woese e Fox (1990) sugeriram que o sistema biológico fossem divididos em três

dominios: Archaea, Eukarya e Bacteria. No entanto essa divisão ocorreu com base nos dados

da fração 16S do RNA ribossomal (1997). Até o momento o metabolismo das

arquebacterias não está totalmente caracterizado. Entretanto algumas vias metabólicas

foram elucidadas (Danson 1988).

A utilização de enzimas em escala industrial vem sendo ampliada anualmente. Após

a descoberta das Archaea, o interesse das enzimas sintetizadas por arqueobacterias, ampliou a

área de interesse das enzimas comerciais. Como no processo industrial as operações são

conduzidas sob condições adversas principalmente, de temperatura e pH, as enzimas

produzidas pelas Archaea, podem ser utilizadas nessas operações ou em etapas adicionais.

Sempre com os objetivos de aumentar a eficiência dos processos industriais e reduzir os

custos de produção.

As enzimas sintetizadas por Archaea são conhecidas como extremoenzimas. Podem

ser produzidas por linhagem de DNA recombinante, ou seja, a produção pode ser realizada

sem a necessidade da cultura desses extremófilos. O gene, que consiste em uma parte

específica do DNA, pode ser inserido no microrganismo “domesticados”, possibilitando a

produção de clones para a produção de enzimas desejadas

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ABSTRACT

The Archaea domain comprises a group of bacteria with features extremophiles. They

tolerate extreme environmental conditions that resemble the environment of the early

appearance of life. They are able to develop under conditions of high or low temperatures, the

total absence of oxygen, osmotic conditions and extreme pHs. The cells exhibit unique

characteristics such as chemical composition of the cytoplasmic membrane and cell wall, in

addition to presenting specific metabolic pathways as methanogenic bacteria.

Woese and Fox (1990) suggested that the biological system to be divided into three

domains: Archaea, Bacteria and Eukarya. However this division was based on data from the

16S ribosomal RNA (1997). By the time the metabolism of archaea is not fully characterized.

However, some pathways were elucidated (Danson 1988).

The application of enzymes in industrial scale has been increased every year. After the

discovery of the Archaea, the interest of the enzymes synthesized by Archaea, expanded the

area of interest of commercial enzymes. As in industrial processes the operations are carried

out under adverse conditions especially temperature and pH, enzymes produced by Archaea

can be used in these operations or additional steps. Aiming at increasing the efficiency of

industrial processes and reducing production costs.

The synthesized enzymes by Archaea are known as extremenzyme. They can be

produced by recombinant DNA strain, in other words, the production can be performed

without the need for culture of these extremophiles. The gene, which consists of a specific

portion of DNA can be inserted into the organism "domesticated", allowing the production of

clones for production of desired enzymes

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Divisão filogênica baseada da divisão do RNA ribossomal ................................................. 10

Figura 2- Estrutura da Pseudomureina ................................................................................................. 12

Figura 3 - Estrutura de Lipídeos de Arqueobacteria (a) Estrutura diéter (b) Estrutura tetraéter ............ 13

Figura 4- Diferentes mecanismos de formação de acetato e síntese de ATP a partir de piruvato em

Archaea e Bactérias anaeróbicas estritas. A numeração refere-se as enzimas: 1) piruvato

descarboxilase; 2) ferredoxina oxidoredutase; 3) acetil-CoA sintetase; 4) fosfato acetiltransferase 6)

acetato quinase. .................................................................................................................................... 15

Figura 5 – Mecanismo proposto para a produção de acetato, CO2 e H2 em Pyrococcus sfuriosu. Os

números referem-se as enzimas: 1) α-glicosidase; 2) glicose: ferredoxina oxidoredutase. 3) gluconate

desidratase; 4) KDG aldolase. 5) ferredoxina oxidoredutase; 6) glicerato kinase; 7) enolase; 8)

piruvato quinase. 9) piruvato: ferredoxina oxidoredutase; 10) ADP-dependente acetil- CoA sintetase;

11) hidrogenase .................................................................................................................................... 16

Figura 6 - Via metabólica proposta para a formação de alanina a partir de maltose, celobiose ou

piruvato por Pyrococcus furiosus, combinação de não-fosforilada via Entner-Doudoroff. As

numerações correspondem as seguintes enzimas 1) alanina aminotransferase; 2) glutamato

desidrogenase; 3) ferrodoxina: NADP + oxiredutase. .......................................................................... 17

Figura 7 – Via metabólica de fermentação de glicose a acetato, CO2 e H2 do hipertermofilico

Themotoga marítima através do metabolismo de Embden-Meyerholf. Enzimas: 1) hexoquinase ATP

dependente; 2) glicose-6-fosfato isomerase; 3) 6-fosfofrutoquinase ATP dependente; 4) frutose-1,6-

bisfosfato aldolase; 5) triose-fosfato isomerase; 6) gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. 7)

fosfoglicerato quinase; 8) fosfoglicerato quinase. 9) enolase; 10) piruvato quinase; 11) piruvato;

ferredoxina oxidoredutase; 12) fosfate acetiltranferase; 13) acetato quinase; 14) NADH: ferrodoxina

oxidoredutase; 15) desidrogenase ....................................................................................................... 18

Figura 8 Eletro-micrografia da seção do halófilo Halobacterium salinarum. (a) Longitudinal seção. (b)

Alta magnificação da eletro-micrografia mostrando a estrutura regular da célula ................................ 21

Figura 9 – Enzimas envolvidas na redução do sulfato a H2S. Enzimas: 1) ATP sulfurilase; 2)

pirofosfatase; 3) Adenililsulfato (APS) redutase; 4) sulfito redutase. ................................................... 24

Figura 10 .............................................................................................................................................. 26

Figura 11 - ............................................................................................................................................ 30

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SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ......................................................................................................................................... 3

AGRADECIMENTOS ................................................................................................................................ 4

RESUMO ................................................................................................................................................. 5

ABSTRACT ............................................................................................................................................... 6

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................. 7

SUMÁRIO ............................................................................................................................................... 8

INTRODUÇÃO ......................................................................................................................................... 9

SISTEMÁTICA ........................................................................................................................................ 10

ESTUDO METABÓLICO DE ARCHAEA .............................................................................................. 14

TERMÓFILOS E PSICRÓFICOS ............................................................................................................ 19

HALÓFILOS ....................................................................................................................................... 20

METANOGÊNICAS............................................................................................................................. 22

ARQUEOBACTÉRIAS QUE OXIDAM ENXOFRE ................................................................................... 23

APLICAÇÕES ......................................................................................................................................... 24

TERMOENZIMAS ............................................................................................................................... 25

Glicosil hidrolases ......................................................................................................................... 25

Amilases ....................................................................................................................................... 26

Celulases ...................................................................................................................................... 26

BIOEXTRAÇÃO DE MINÉRIOS ............................................................................................................ 27

BACTERIORHODOPSIN ...................................................................................................................... 28

TRATAMENTO DE ÁGUAS RESIDUAIS ............................................................................................... 29

CONCLUSÃO ......................................................................................................................................... 31

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................................ 32

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INTRODUÇÃO

O domínio Archaea é composto por um grupo de bactérias com características

extremófilos. Toleram condições ambientais extremas, que lembram o ambiente dos

primórdios do aparecimento da vida. Desenvolvem-se sob condições de elevadas ou baixas

temperaturas, ausência total de oxigênio, condições osmóticas e pHs extremos. As células

apresentam características únicas, como as composições química da membrana

citoplasmática e parede celular, além de apresentar vias metabólicas específico como as

bactérias metanogênicas.

As linhagens Archaea sintetizam produtos com propriedades diversificadas. Dentre os

bioprodutos de interesse econômico estão as enzimas termoestáveis. Em especial, as

polimerases do DNA que são sintetizadas por Thermus aquaticu. É uma enzima utilizada na

ampliação da molécula do DNA portanto, muito utilizada nas técnicas da biologia molecular.

Enquanto que, as amilases e ciclodextrina termoestáveis sintetizadas por Pyrococcus woesei

possuem mercado nas industrias de alimentos e fármacos. A bactéria Pyrococcus furioses

produz celulases que poderá ser utilizada nos processo de biopolpação sob condições de

temperatura elevada. As bactérias metanogênicas produzem o gás natural metano. Incluem

as bactérias dos grupos halofilicas e hipertermofílicas que se encontram em diferentes nichos

ambientais. O processo é misto quanto a fermentação. Sob condições de anaerobiose estrita

Methanococcus jannaschi, utiliza os gases hidrogênio, dióxido de carbono e o acetato e

produz o metano

Atualmente, as bactérias do domínio Archaea estão sendo pesquisadas no Brasil. Existem

grupos pontuais nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Ceará que estão desenvolvendo trabalhos

nessa área da ciência. Entretanto considerando o clima tropical do pais, as inúmeras fontes com

água termal e os solos das salinas, que são nichos ambientais propícios para o desenvolvimento das

bactérias extremófilos, espera-se mais investimentos nessa área da microbiologia.

Portanto o grande desafio para os pesquisadores será incorporar as informações decorrente do

estudo das bactérias extremófilos em novas tecnologias, utilizando o seu potencial para a síntese de

bioprodutos estáveis e de interesse econômico.

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SISTEMÁTICA

Woese e Fox (1990) sugeriram que o sistema biológico fossem divididos em três

dominios: Archaea, Eukarya e Bacteria (Figura 1). No entanto essa divisão ocorreu com base

nos dados da fração 16S do RNA ribossomal (1997). A descoberta das Archaea permitiu que

a antiga divisão entre Eukarya e Bacteria fosse ampliada.

Figura 1 - Divisão filogênica baseada da divisão do RNA ribossomal

Segundo Forterre (1997), a classificação e identificação do RNA ribossomal permite a

avaliação da evolução dos organismos. Estudos do genoma de Archaea permitiram essa

comparação que possibilitaram essa divisão. Zillig e colaboradores identificaram uma

estrutura típica no RNA ribossomal de Archaea.

As células das Archaea não possuem a membrana nuclear e se assemelham as

bactérias. Yue (1996) verificou que a enzima CCA-adicionado do tRNA, da Archaea

Sulfolobus shibatae é semelhante à polyA polimerase de eucariotos enquanto que a poliA

polimerase é encontrada em bactérias. Tauer (1997) e Bergeat (1997) associaram os

resultados das análises bioquímica e da sequência da ribonucleases redutases (RNR) e,

concordaram com a divisão em três dominios. Tauer (1997) purificou e fez a sequência

parcial da enzima ribonucleotideo redutase e B12-dependente da arqueobacteria

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Thermoplasma acidophila. Utilizando a técnica seqüencial de sonda, o geneda enzima foi

clonado, completamente sequênciado e expresso em células de Escherichia coli. Bergeat

(1997) clonou e sequênciou o genes A e B das subunidades da enzima topoisomerase II, da

espécie Sulfolobus shibatae.

O sequênciamento dos nucleotídeos do rRNA das bactérias do domínio Archaea

permitiu definir, que as arqueobactérias, apresentam, características genéticas semelhantes

aos eucariotos e as bactérias, além de apresentar genomas específicos. O genoma das

arqueobactérias contém muitos genes semelhantes e que expressa as vias metabólicas, os

transportem dos nutrientes, os mecanismos de reparo da molécula do DNA e divisão celular.

Jacobs e Grogan (1997) estudaram os níveis de mutação das arqueobactérias e

verificam que apresentam pouca mutação genética. Essa variação genética pode ser explicada

através dos fatores fisiológicos. A molécula de DNA apresenta ligações estáveis. As ligações

ditas primárias, uma vez que a temperatura entre 75-105°C pode ocorrer a ruptura dessas

ligações. Ligações secundárias e terciárias, que promovem a conformação das enzimas - no

eficiente mecanismo de reparação do DNA.

O domínio Archaea consiste nas divisões Crenarchaeota, que contém as arqueas

redutoras de enxofre, Euryarchaeota compreende uma grande diversidade de bactérias, como

as metanogênicas, halófilas extremas e algumas hipertermófilas e Korarchaeota, uma divisão

mais recente que engloba os microrganismos hipertermofílicos, atualmente pouco conhecidos.

Considerando as três divisões, os Crenarchaeota possuem os hipertermófilos mais

conhecidos capazes de suportar as condições de temperatura mais elevadas. São

quimiolitótrofos autótrofas, ou seja, são capazes de utilizar como substrato compostos

orgânicos reduzidos e obtém energia através do metabolismo oxidativo. Isso ocorre devido às

condições extremas de exposição das células. Não há registro que realize a fotossíntese. As

Euryarchaeota apresentam diversidade quanto a fisiologia. As Metanogênicos são anaeróbios

obrigatórios, enquanto que, as halófilas em sua maioria é aeróbio obrigatório. Korarchaeota é

uma classe recém-descoberta de amostras coletadas em Yellowstone e através de analise

genética foi classificada como Archaea.

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PAREDE CELULAR

As Archaea possuem algumas características marcantes para classificar no domínio.

Em especial quanto a composição da parede e da membrana celular como também das

moléculas que compõem o RNA ribossomal.

Kanderl e Hong (1998) estudaram a composição química da parede celular de Archaea.

A estrutura da parede não apresenta mureína e peptideoglicano. Na parede celular das

Arqueas classificadas como gram-positivas são encontrados diversos tipos de polímeros.

Entretanto como a maioria das Arqueas é gram-negativa, a célula contem moléculas de

proteínas ou glicoproteínas conhecido como Camada S. Ao invés de peptideoglicano,

apresentam um polímero denominado de pseudomureina (Figura 2- Estrutura da

Pseudomureina). Composto de ácido L-talosaminurôcino ao invés de ácido murâmico que é

encontrado em paredes de procariotos. A biosíntese da pseudomureína ocorre a partir de n-

acetilglicosamina e n-acetil-talosamimuranico, resultando na biosíntese de um dissacarídeo

formado por uridina difosfato-N-acetilglicosamina-N- ácido acetiltalosaminuronico (UDP-

GlcNAc-NAcTalNA) e UDPativado por um pentapeptídeo . O ácido n-acetil-

talosamimuranico é formado a partir do N-acetilgalactosamina pela via ácido N-

acetilaltrosaminuronico . O pentapeptídeo de UDP-activado é derivado do ácido glutâmico

Nα-fosforilo pela adição de quatro aminoácidos

resíduais em detrimento do trifosfato de adenosina (ATP).

Figura 2- Estrutura da Pseudomureina

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MENBRANA CITOPLASMATICA.

O estudo da membrana celular das arqueobacterias permitiu verificar uma divisão ao

longo da evolução. Langworhty e Pond (1986) verificaram que a membrana é formada por

éteres de acido graxo com cadeia lateral ligado a fitanol (C20), formando cadeias longas e

ramificadas. O éter isopranil glicerol realiza a ligação hidrofóbica substituindo os gliceróis

lipídeos ligados á cadeia de ácidos presentes em organismos eucariotos. As cadeias de

hidrocarbonetos de glicerol são isopronois ramificados, não apresentando variabilidade na

cadeia. Possuem o tamanho equivalente de 20 a 40 átomos de carbono. A maioria das

arqueobacterias apresentam duas cadeias de C20 fitanil (Figura 3 (a) . Cadeias que contém

dibifitanil diglicerol tetraéteres que possuem duas cadeias de C40 fitanil (Figura 3 (b) ligadas

por ligações éter a duas moléculas de glicerol são menos comuns. Estas estruturas são

encontradas em bactérias metanogênicas, termófilas, ácido-termófilios. Em

Haloalcalinofílicos esta se apresenta pela composta por diéteres que contenham C20 fitanil,

além de cadeias de C25 sestertepafil. O termofilo metanogênicos, Methanococcus jannaschi,

contem dieter C40 bifitanol macrociclico como componete majoritário. Há duas exceções que

não contém a estrutura tetraéter que ocorrem em espécies Sulfolobis – apresentam grandes

quantidades de monitoglicerol tetraéter em que nove carbonos de nonitol substituem uma de

duas moléculas de glicerol, embora contenha pequenas quantidades de uma cadeia de tetraéter

C40 bifitanol e duas de dieter C20 bifitanol

Figura 3 - Estrutura de Lipídeos de Arqueobacteria (a) Estrutura diéter (b) Estrutura tetraéter

Sprott (1992) verificou que halófilas do gênero Halobacterium apresetam ligações

dieteres, formadas por ligaçoes de fosfolipideos e ligaçoes sulfato. Estas ligaçoes consistem

em uma maior de fosfolipedeos (PGP), duas menores de fofoslipideos (PG e PG-sulfatado),

uma maior (Gal-MAnlGLclDs-sulfatado) e outras menores de glicolipideos.

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ESTUDO METABÓLICO DE ARCHAEA

Até o momento o metabolismo das arquebacterias não está totalmente caracterizado.

Entretanto algumas vias metabólicas foram elucidadas (Danson 1988). Archaea não

apresentam enzimas específicas além da via glicolíticas, o que sugere ausência de rotas

alternativas como o ciclo de Entner-Doudoroff. Siebers e Hensel (1993) e Kengen e

colaboradores (1994) verificaram que a ausência da enzima 6-fosfofrutoquinase nas células

deve-se ao fato de que estas enzimas utilizam o DDP ou PPi como co-fatores ao invés de ATP.

Schafer e Schonheit (1992) observaram que hexoquinase e fosfofrutoquinase não foram

encontradas em extratos de células livres de Archaea..

Kengen e colaboradores (1993) e Constantino e Kelly (1990) concluíram que a

maltose e celobiose são transportadas pela membrana citoplasmática como dissacarídeos e no

citoplasma são hidrolisados por α-glicosidase ou β-glicosidase, respectivamente..Produzindo

duas moléculas de glicose por dissacarídeo consumido. Kengen e colaboradores (1994)

conduziram uma fermentação com Pyrococcus furiosus contendo como substratos a maltose

ou a celobiose e verificaram que a bactéria utiliza os dois substratos porem não produziu o

CO2. Entretanto, Schafer e Schonheit (1991) e Kengen e Stams) 1994 descobriram que o

acetato, a alanina, o hidrogênio e CO2 são os principais produtos da fermentação.

A produção de acetato ocorre em todos os microrganismos que realizam a fermentação.

Schafer e Schonheit (1991) observaram que arqueobactérias geralmente possuem as enzimas

acetil-CoA sintetase, ferrodoxina oxidoredutase e hidrogenases. Que são responsáveis pela

síntese de energia e também pela formação de ADP e Pi. Em uma reação reversível acetil-

CoA, ADP e Pi são convertidos a acetato, ATP e CoA ( Figura 4).

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Figura 4- Diferentes mecanismos de formação de acetato e síntese de ATP a partir de piruvato em Archaea e

Bactérias anaeróbicas estritas. A numeração refere-se as enzimas: 1) piruvato descarboxilase; 2) ferredoxina

oxidoredutase; 3) acetil-CoA sintetase; 4) fosfato acetiltransferase 6) acetato quinase.

Schafer e Schonheit (1992) propuseram uma via metabólica especifica na fermentação

da maltose realizada por Pyrococcus furiosus (Figura 5).

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Figura 5 – Mecanismo proposto para a produção de acetato, CO2 e H2 em Pyrococcus sfuriosu. Os números referem-

se as enzimas: 1) α-glicosidase; 2) glicose: ferredoxina oxidoredutase. 3) gluconate desidratase; 4) KDG aldolase. 5)

ferredoxina oxidoredutase; 6) glicerato kinase; 7) enolase; 8) piruvato quinase. 9) piruvato: ferredoxina

oxidoredutase; 10) ADP-dependente acetil- CoA sintetase; 11) hidrogenase

Kengen e Stam (1993) estudaram a síntese de L-alanina durante o processo de

fermentação. A produção de alanina ocorre no desvio de via para a formação de acetato.

Fatores como pressão osmótica provocado por hidrogênio, concentração do íon de amônio

interferem na formação dos produtos (alanina/acetato). A síntese ocorre na via alanina

aminotransferase (Figura 6).

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Figura 6 - Via metabólica proposta para a formação de alanina a partir de maltose, celobiose ou piruvato por

Pyrococcus furiosus, combinação de não-fosforilada via Entner-Doudoroff. As numerações correspondem as seguintes

enzimas 1) alanina aminotransferase; 2) glutamato desidrogenase; 3) ferrodoxina: NADP + oxiredutase.

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Figura 7 – Via metabólica de fermentação de glicose a acetato, CO2 e H2 do hipertermofilico Themotoga marítima

através do metabolismo de Embden-Meyerholf. Enzimas: 1) hexoquinase ATP dependente; 2) glicose-6-fosfato

isomerase; 3) 6-fosfofrutoquinase ATP dependente; 4) frutose-1,6-bisfosfato aldolase; 5) triose-fosfato isomerase; 6)

gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. 7) fosfoglicerato quinase; 8) fosfoglicerato quinase. 9) enolase; 10) piruvato

quinase; 11) piruvato; ferredoxina oxidoredutase; 12) fosfate acetiltranferase; 13) acetato quinase; 14) NADH:

ferrodoxina oxidoredutase; 15) desidrogenase

A enzima gyrase reversa geralmente é encontrada em microrganismos que possuem

uma temperatura ótima de crescimento de 65°C. Portanto, é encontrada na maioria das

arquebacterias. Confalonieri e colaboradores (1993) estudaram a girase reversa de Sulfolobus

acidocaldarius. Os resultados indicaram que a enzima é formada pela associação de duas

enzimas distintas: a topoisomerase e a putative helicase. O domínio da helicase pertence à

classe de proteínas ligantes ao ATP. Incluem as enzimas da síntese do DNA, transportadores e

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fatores de alongamento. A classe de topoisomerase é proveniente da família de DNA

topoisomerases I.

TERMÓFILOS E PSICRÓFICOS

Dentre as Archaea as mais estudadas são as classificadas como termófilos. Possuem

temperatura ótima de crescimento próximo de 45°C. Entretanto as denominadas de

hipertermofílicos a temperatura ótima é em torno de 80°C. O primeiro extremófilo capaz de

crescer a temperaturas próxima a 70°C foi identificado na década de 60. Este microrganismo

foi denominado de Thermus aquaticus. Despertou interesse devido à possibilidade de ser

utilizado em processo inovador na área da biotecnologia. Na mesma época foi descoberta a

Sulfolobus acidocaldarius, uma arqueabacteria que cresce a elevada temperatura e sob

condição ácida..

Quando submetido a altas temperaturas a célula começa a sofrer problemas de lise

celular. Para coibir tal problema, as archaeabacterias possuem uma parede celular com maior

rigidez. Como também a membrana citoplasmática possui uma estrutura química constituída

por lipopolissacarídeos (lipoglycan) que consistem de lipídeos tetraéter com unidades de

manose e glicose. Esses lipídeos apresentam ligações covalentes entre as unidades de

phytanyl, formando uma monocamada da membrana citoplasmática, o que confere uma

resistência a temperatura elevada.

O DNA começa-se a desnaturar sob temperatura elevada. O citoplasma de

hipertermófilos metanogênicos contém grandes quantidades de 2,3-difosglicerato de potássio

cíclico que evita possíveis danos - como na replicação do DNA forma sítios sem a presença

purinas - que ocorrem a elevadas temperaturas. Em arqueas que não possuem o metabolismo

metanogênico, há a produção de DNA topoisomerase conhecida por DNA gyrase reverse. A

gyrase reverse introduz supercoils no DNA com o gasto de ATP, que auxilia na estabilização.

Para evitar a desnaturação de proteínas, as arqueobacterias apresentam uma grande

quantidade de proteínas denominadas chaperonas. Estas proteínas ajudam a evitar no

desnaturamento de outras proteínas, estando presente em aproximadamente 80% do

citoplasma celular. As proteínas apresentam um aumento das pontes de hidrogênios, aumento

de interações hidrofóbicas e uma menor porcentagem de aminoácidos termolábeis. Os

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aminoácidos presentes em termoenzimas são asparagina, glutamato, cisteina, metionina e

triptrofano, que possuem menos sucessibilidade à degradação.

Em contraste com os termófilos, as arqueabacterias psicrofilos crescem em baixas

temperaturas. São encontrados em diversos ambientes submarinos congelados, como a

Antártica. São microrganismos planctônicos que vivem livre na água ou imobilizados em

partícula. Sua ocorrência na água é em torno de 104 células por mililitro, mesmo sob condição

ambiental com escassez nutricional. A arquebacteria psicrófilo Polaromanos vacuolata

possui temperatura ótima de crescimento de 4°C. A temperatura superior a 12°C

compromete a sua reprodução. Este grupo de microrganismos é objeto de pesquisa em

indústria de refrigeração.

Geralmente sob condições de baixa baixas temperaturas ocorre a inativação de

proteínas. Para contornar esse problema, a célula apresenta uma menor quantidade de

aminoácidos com pontes de hidrogênio, como o dissulfeto como também, as interações

hidrofóbicas da estrutura protéica. O resultado é o aumenta da flexibilidade da molécula das

proteínas.

HALÓFILOS

As arquebacterias Halófilos que são também designados como “halobacteria” em

razão do gênero Halobacterium ter sido o primeiro representante desse grupo mais pesquisado.

Halobacterias são gram negativas, aeróbias e capazes de viver em ambientes com

concentração salina muito elevada. Reproduzem-se por divisão binária e não possuem

endósporos. A maioria das linhagens não apresenta mobilidade. Entretanto, as espécies

móveis se locomovem através de flagelo polar. Apresentam o metabolismo

quimiorganotróficos, sendo que a maioria das espécies são aeróbios obrigatórios.

Diferentes aminoácidos e ácidos orgânicos são utilizados como fontes de carbono e

energia e requerem uma grande variedade de fatores de crescimento. Algumas espécies de

Halobacterium apresentam a capacidade de oxidar carboidratos. A cadeia de transporte dos

elétrons contém os citocromos a, b e c. A conservação de energia durante o crescimento sob

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condições de aerobiose é resultado da força motriz dos prótons decorrentes de reações

quimiósmoticos mediado pela membrana celular.

O deslocamento da água tende a seguir a direção onde a concentração salina é elevada,

promovendo a desidratação celular. Halobaceruim salinarum possui uma concentração de

cloreto de potássio elevada no citoplasma célular. Algumas halobactérias são equipadas com

bombas de potássio, permitindo que essa concentração no interior da célula seja maior que a

encontrada no meio de crescimento celular. Portanto, as enzimas no citoplasma possui

atividade sob altas concentrações deste sal. No entanto, as proteínas isoladas do H. salinarum

necessitam de uma elevada concentração de cloreto de sódio como cofator.

Para evitar o rompimento celular as Halófilos possuem uma parede celular constituída

por glicoproteínas que tem uma maior porcentagem de aminoácidos que atraem o íon Na+

para

o contorno da célula. Em eletromicrografias (

Figura 8) arquebacteria parece semelhante a um bactérias gram negativas, porém

Na+ conecta a superfície da parede celular da Halobaceruim e é essencial para manter a

integridade celular. Quando a concentração de íons de sódio é insuficiente ocorre a lise das

paredes célula, levando ao rompimento da célula.

Figura 8 Eletro-micrografia da seção do halófilo Halobacterium salinarum. (a) Longitudinal

seção. (b) Alta magnificação da eletro-micrografia mostrando a estrutura regular da célula

Outro problema é a desnaturação de proteínas, o sal tende a realizar ligações

hidrofóbicas, fazendo com que os polipeptídios agreguem-se e perda atividade. As

(a)

(b)

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glicoproteínas de Halobaceruim contêm aminoácidos com grupos ácidos como aspartato e

glutamato. Nessas proteínas ficam expostos os aminoácidos de carga negativa, de maneira

que, quando os íons positivos entram em contato com a proteína, esta se estabiliza. (Eisenberg

& Watchel 1987; Danson 1988). Eisenberg & Watchel (1987)

As linhagens Natronobacterium, Natronosomonas e Natronococcus possuem as

características de halófilos como também de alcolinofílos. Essas arquibacterias são

diferentes de outros microrganismos do mesmo grupo. Apresentam um crescimento ótimo

em baixas concentrações do íon Mg2+

e pHs elevados na faixa de 9 a 11. Na composição da

parede celular apresentam diéter de lipídeos e polímeros de acido glutâmico em especial

oligossacarídeos contendo N-acetilglicosamina, glicose, e outros tipos de açúcar que estão

ligados através do grupo amino do aminoácido glutanima.

METANOGÊNICAS

As Archaeas apresentam uma característica exclusiva que é o metabolismo

metanogênico. Não se conhece outro tipo de organismo que consiga produzir metano como

produto de seu metabolismo. As metanogênicas são microrganismos anaeróbios estritos e que

liberam metano como resíduo do seu metabolismo e não apresentam outro fonte de energia

(Whitman 1985).

Vivem em ambientes com ausência de oxigênio e abundância de matéria orgânica,

sendo encontradas, principalmente, em pântanos, açudes, lagos, sedimentos marinhos e

rúmen bovino. Elas retiram o hidrogênio e gás carbônico desses ambientes e utilizam em seu

metabolismo. Vivem em simbiose com outros tipos de microrganismo, convertendo os

produtos finais da fermentação em gás metano.

As metanogênicas são gram positivas a maioria das espécies identificadas são

mesófilas e liberam metano como resíduo do seu metabolismo. Em função de sua fisiologia,

são classificadas em dois grupo como a metanogênicas acetoclásticas, e as hidrogenotróficas.

As metanogênicas acetoclásticas utilizam o acetato como fonte de carbono e energia, sendo

os predominantes na digestão anaeróbia. Desenvolvem-se na forma de filamentos e tem

grande importância na formação da trama bacteriana presente nos grânulos.

23

ΔG0 = -31kJ

Equação 1- Metabolismo de acetoclástica - Oxidação de acetato para a produção de energia

As hidrogenotróficas são capazes de produzir metano a partir de hidrogênio e gás

carbônico, resultando em uma maior liberação de energia.

ΔG0 = -131kJ

Equação 2- Metabolismo de hidrogenotroficos - Oxidação de gás carbônico para a produção de energia

ARQUEOBACTÉRIAS QUE OXIDAM ENXOFRE

Arqueobactérias dependentes de enxofre são conhecidas por solfataras. Crescem em

temperatura elevada na faixa de 50 a 87°C. Algumas espécies preferem condições acidas e

crescem em pH 4 a 5,5. A linhagem Sulfolobus é quimiorganotroficos e oxida o enxofre ou

compostos orgânicos. Enquanto que a Thermoproteus que removem elétrons do H2 e do H2S.

Foram isoladas de amostras provenientes de diferentes locais como Itália, Iceland, Nova

Zelândia, Yellowstone National Park em Wyoming (EUA), principalmente em áreas com

atividades geológicas.

Schonheit & Schafer (1995) descreveram o modelo metabólico de arqueobacterias que

oxidam enxofre. São litotróficos extremófilos e na sua maioria hipertermófilos que reduzem

o H2 a H2S. Utilizam o H2 e CO2 como fontes de energia e de carbono, respectivamente. O

mecanismo de ganho de energia no metabolismo que utiliza o sulfalto, ocorre através do

transporte de elétrons e fosforilação oxidativa. A via metabólica e energética da redução do

H2S acontece de maneira semelhante aos mesófilos redutores de enxofre.

24

Figura 9 – Enzimas envolvidas na redução do sulfato a H2S. Enzimas: 1) ATP sulfurilase; 2) pirofosfatase; 3) Adenililsulfato (APS)

redutase; 4) sulfito redutase.

APLICAÇÕES

A utilização de enzimas em escala industrial vem sendo ampliada anualmente. Após

a descoberta das Archaea, o interesse das enzimas sintetizadas por arqueobacterias, ampliou a

área de interesse das enzimas comerciais. Como no processo industrial as operações são

conduzidas sob condições adversas principalmente, de temperatura e pH, as enzimas

produzidas pelas Archaea, podem ser utilizadas nessas operações ou em etapas adicionais.

Sempre com os objetivos de aumentar a eficiência dos processos industriais e reduzir os

custos de produção.

Atualmente, um dos grandes problemas enfrentados por pesquisadores é a condições

dos ambientes para o crescimento das archabactérias selvagens. Entretanto, esse problema

pode ser contornado quando se expressa essas enzimas em bactérias heterólogos, que mantém

suas características originais ( Eicheler 2011 ).

As enzimas sintetizadas por Archaea são conhecidas como extremoenzimas. Podem

ser produzidas por linhagem de DNA recombinante, ou seja, a produção pode ser realizada

sem a necessidade da cultura desses extremófilos. O gene, que consiste em uma parte

específica do DNA, pode ser inserido no microrganismo “domesticados”, possibilitando a

produção de clones para a produção de enzimas desejadas. Pesquisadores têm explorado duas

possibilidades para avaliar o potencial desse microrganismo. O teste consiste na forma

tradicional, ou seja, é realizado um cultivo desses microrganismos. Em seguida, verifica-se se

25

possuem a capacidade de produzir a enzima para a finalidade desejada. Caso apresente um

resultado positivo, os genes responsáveis pela produção da proteína são codificados e isolados,

assim, eles podem ser inseridos em outro hospedeiro. O outro método consiste em realizar o

crescimento aleatório de extremófilos. Em seguidas o DNA é isolado e através de técnicas de

DNA recombinante é inserido em hospedeiros dosmesticados. A partir do crescimento das

colônias que contem o gene, é realizado experimentos para verificar a atividade dessas

enzimas.

TERMOENZIMAS

Aplicação de enzimas em processos industriais aumenta cada vez mais nas industriais

biotecnológicas (Battershy 1985). São utilizadas principalmente em processos de hidrólise.

Uma parte significante do custo da produção da enzima é proveniente da manutenção da

estabilidade enzimática. As termoenzimas são consideradas como um grande potencial para

as indústrias farmacêuticas, alimentícias, química como também aplicadas no tratamento de

efluentes. A utilização dessas enzimas apresenta vantagens quando aplicadas nos processos.

As reações podem ser conduzidas sob temperaturas mais elevadas ditas extremófilos com

temperatura ótima superior a 60°C, que proporciona aumento da taxa de infusão e

solubilidade. Como conseqüência diminui a viscosidade e a tensão superficial do sistema. Isso

ajuda na reduz de custos com o bombeamento, filtração, centrifugação, além de aumentar a

taxa de transferência de massa. Verifica-se também no processo uma redução da

contaminação microbiana de patógeno. O uso de temperaturas mais elevadas reduz a

viscosidade de líquidos.

Glicosil hidrolases

Glicosil hidrolases são capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas de dois

carboidratos ou uma ligação entre carboidrato e não-carboidrato. Foram caracterizadas várias

configurações α-glicosidases e β-glicosidases de arqueobacterias.

26

Amilases

A enzima α-amilase hidrolisa a ligação α-1,4-glicosidica de maneira randômica

produzindo glicose e oligossacarídeos. Estudos realizados com α-amilases de termofilos

como Pyrococcus woesi, (Koch et al., 1991) e P. furiosus (Brown et al., 1990; Koch et al.,

1990) verificaram que a temperatura ótima dessas enzimas é de aproximadamente 100°C. A

maioria de termofilos produz pulanase II, que hidrolisa ligações α-1,6-glicosídicas. Os genes

de P. furiosus e P. woesi foram clonados em células de E. coli, que expressaram a enzima

(Ru¨diger et al., 1995; Dong et 1997).

Em processos industriais a enzima é utilizada no processo de liquefação (Figura 10).

O amido consiste em grânulos semicristalinos insolúveis, com baixa atividade enzimática.

Inicialmente, o processo consiste no aquecimento do amido para aumentar a sua solubilidade.

Condição fundamental para melhor atividade das enzimas.

Figura 10

CELULASES

A celulose, dentre os materiais naturais, é o biopolímero mais abundante do planeta

(Bayer & Lamed 1992) e pode ser hidrolisada, por mecanismos químico ou enzimático, a

glicose. A degradação microbiana da celulose é total e específica e tem estimulado o uso dos

27

processos iotecnológicos na área das fermentações de matérias-primas celulolíticas. Na

natureza, esses processos representam a maior fonte de carbono no solo (Lynch et al. 1981).

A hidrólise da celulose por celulases resulta na produção final de glicose. A enzima

por ser proteína, não conseguem deslocar com facilidade, devido a barreira da lignina nas

células dos vegetais. Portanto o difícil acesso destas enzimas às fibras de celulose constitui o

principal problema para o processo da biodegradação do polímero. (Thiemann et al. 1980).

Atualmente, a hidrólise da celulose tem tido destaque devido aos programas de energia

renovável. A glicose produzida principalmente, na hidrolise enzimática da celulose pode ser

utilizada na produção do biotetanol. Numa proposta de substituir a gasolina pelo etanol, como

fonte de energia.

Na indústria alimentícia, as celulases são usadas em vários processos, principalmente,

na extração de: componentes do chá verde, purificação da proteína de soja, como também na

purificação dos óleos essenciais e do amido da batata doce. Essas enzimas participam são

utilizadas nos processos de produção do vinagre de laranja, do polímero Agar nutriente e na

clarificação de sucos das frutas cítricas (Orberg 1981)

Bauer et all (1999) verificaram a produção de endoglucanases por P. furiosus. Kegen et al

(1993) verificou o crescimento desses extremófilos em celobiose e Voorhorst et al (1995)

puderam expressar esses genes em E. coli.Outros estudos (Grogan, 1991) puderam verificar a

produção de β-glicosidases estáveis em outros arqueobacterias.

BIOEXTRAÇÃO DE MINÉRIOS

Os minérios utilizados como metais são praticamente insolúveis em sulfitos, fazendo-

se necessária a degradação dessas fontes para a liberação de íons. Caso essa concentração de

minérios seja baixa, a extração por processo química é inviável quanto ao fator econômico.

Portanto a biolixiviação é uma proposta interessante (Johson 1985).

Estudos realizados verificaram que Sulfulobus spp conseguem lixiviar o metal em

sulfito (Brierley& Brierley, 1986). As arquebacterias são extremamente termófilos, crescem a

temperatura ótima de 80°C, o que acelera o processo de reação. Ademais são capazes de

atacar a partícula de refratora de molibdênio que contem minérios de sulfito. O pH de

28

crescimento encontra-se na faixa de 2 a 4. Sob essas condições de acidez, o meio favorece a

lixiviação de metais. Essas propriedades das linhagens de arqueobactérias de lixiviar os

metais são considerados de grande interesse. Alguns estudos sobre a bioextração de minério

utilizando metais preciosos como o ouro e prata foram realizados (Hutchins et all, 1988). Em

processos semelhantes à bioextração, algumas arqueobactérias termoacidofílicas foram

utilizadas para a retirada de enxofre do carvão vegetal. Processo conduzido com baixas

perdas de energia (Kargi 1986).

O carvão possui uma taxa de enxofre que varia de 1 a 10% na forma de pirita. A

remoção de enxofre apresenta uma grande importância ambiental, pois sua remoção pode

levar a menor influência em chuvas ácidas. A arqueobacteria Sulfolobus acidoaldarius

apresentou um grande remoção de enxofre do carvão (Kargi 1986). A alta temperatura de

operação (70°C) melhorou a taxa de oxidação química da pirita de enxofre pela oxidação do

ferro metálico que é produzida por oxidação microbiológica da pirita metálica no carvão.

BACTERIORHODOPSIN

Bacteriorhodopsin de Halobacterium halobium é uma membrana integral de proteínas

(membranas púrpuras) que consiste em uma única cadeia de polipeptídios contendo

cromóforos retinais (Kusdner 1985).

Os efeitos de da dependência de luz na translocação de prótons do interior para o

exterior da célula geram um gradiente eletroquímica na membrana que será utilizado para a

geração de ATP. Biotecnologicamente, espera-se que o uso de membranas artificiais possa

gerar energia a partir do da luz solar (Prentis 1981). Embora o potencial para a produção de

uma tecnologia de eletricidade a baixo custo, há problemas para ainda não solucionados. O

bacteriorhodopsin deve ser preparado em um meio em que se permita apenas a passagem de

prótons. Além disso, as moléculas das proteínas devem estar sob mesma orientação para que a

passagem de prótons ocorra de maneira regular.

No entanto, verificou-se que a membrana púrpura são bastante resistentes, podem ser

renaturadas após drásticas desnaturações e as moléculas podem ser corretamente orientadas

através da aplicação de uma corrente elétrica (Kungi et all, 1988).

29

Essa eletricidade gerada por estes microrganismos tem sido visto como um grande

potencial para a produção de biochips para uma nova geração de computadores (Hong 1966).

A sensibilidade a luz e a robustez da proteína fazem com que traga vantagens nessa área.

Outra possível aplicação seria a utilização da membrana púrpura para a geração de

água potável (Prentis 1981). A co-imobilização dos íons H+/Na+ no anteporte do

bacteriorhodopsin na membrana possibilitaria o bombeamento dos íons através da membrana ,

possibilitando que a água seja dessalinizada.

TRATAMENTO DE ÁGUAS RESIDUAIS

No processo de oxidação da matéria orgânica em ambientes anaeróbicos ocorrem

processos metabólicos de fermentação e respiração. Enquanto que na fermentação, a oxidação

da matéria orgânica é realizada na ausência de um aceptor final de elétrons, na respiração são

utilizados aceptores inorgânicos, tais como: NO3- (redução de nitrato), SO4

-2 (redução de

sulfato) ou CO2 (formação de metano). A digestão anaeróbica ocorre em etapas sequenciais,

ou seja, representa um sistema ecológico que envolve processos metabólicos complexos. Esse

sistema (figura) depende da atividades de alguns microrganismo: baterias fermentativas (ou

acidogênicas), bactérias sintróficas (ou acetogênicas) e microrganismos metanogênicos.

30

Figura 11 -

Como os microrganismos não são capazes de assimilar a matéria orgânica complexa é

necessário que ela seja hidrolisada a compostos que possam ser transportado através da

membrana citoplasmática e, no citoplasma as reações enzimáticas possam ocorrer. As

bactérias fermentativas acidogênicas, covertem a matéria orgânica complexa (carboidratos,

lipídeos, proteínas) por fermentação e hidrólise em compostos mais simples, principalmente

ácidos orgânicos, alem de hidrogênio e dióxido de carbono. A hidrolise ocorre pela excreção

de enzimas extracelulares, ocorrendo de maneira lenta, sendo que vários fatores como a

temperatura, pH do meio, tamanho das partículas, composição do substrato, concentração de

NH4+, e os produtos de hidrolise, podem afetar o nível de hidrolise do substrato ( Lettinga

ET AL, 1996).

Os microrganismos sintróficos acetogênicos convertem os compostos orgânicos

intermediários, como o propionato e o butirato, em acetato, hidrogênio e dióxido de carbono.

Esses microrganismos dependem da atividade dos metanogênicos. A formação de H2 faz com

que o valor de ph decresça. Além de que a produção de acetato e butirato são

termodinamicamente inibidas pela presença de concentrações baixas de hidrogênio.

Por fim, os microrganismos metanogênicos convertem o acetato e hidrogênio

produzidos na etapa anterior e os convertem em metano e dióxido de carbono. A produção de

31

metano é vista como uma alternativa limpa para a digestão de matéria orgânica que é degradas

(Daniel 1984. Kirsop 1984).

Aproximadamente 5,0 x 1015

g de metano são liberados na atmosfera a cada ano. Do

total cerca de 70% correspondem à produção biológica e o saldo é proveniente de emissões

naturais, queima de biomassa e extração mineral. O uso de biogás passa a ser um recurso sob

o aspecto econômico viável, devido a grande proporção de biogás produzido como também a

fatores operacionais. Considerando que as arqueobacterias metanogênicas apresentam o

metabolismo anaeróbio, reduzindo o custo de aeradores no processo.

A otimização do processo de produção de biogás envolve os estudos de termodinâmica,

cinética e o metabolismo de interação de microrganismos (Daniel 1984. Kirsop 1984).

CONCLUSÃO

As arquebactérias contribuíram para a sistemática dos organismos em três domínios

Archaea, Eukarya e Bacteria. O estudo de ribossomos possibilitou verificar que estas

possuem genes presentes tanto em eucarióticos como em bactérias, e através disso

compreender melhor a ramificações das espécies.

As bactérias classificadas no domínio Archaea são extemófilas porque possuem

membrana citoplasmática e parede celular de composição química especial. Tais

características conferem propriedades que permitem a exploração de vida em ambientes

considerados inóspitos para a vida. A diversidade das arquebactérias quanto ao seu

metabolismo e condições de crescimento classifica as bactérias nos grupos de halófilos,

termófilos, psicrófilos, metanogênicos e as que oxidam os íons metálicos.

São microrganismos que por desenvolver em diferentes nichos ecológicos são

indicados para o tratamento de água com resíduos orgânicos e inorgânicos. Sintetizam uma

variedades de enzimas que por apresentarem atividade enzimática ótima sob condição

especial de temperatura e pH, são consideradas de grande potencial para a industrial.

As principais enzimas comerciais produzidas por arquebactérias são as celulases,

amilases e as utilizadas nas técnicas da biologia molecular como as polimerases e as enzimas

de restrição.

32

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