Eritropoyetina recombinante

Eritropoyetina - Introducción

• Hormona renal esencial para la viabilidad y proliferación de los progenitores eritrocitarios generando reticulocitos en la medula ósea.

• Durante el período embrinario la EPO se produce en los hepatocitos pero tras el nacimiento se da en el riñón.

• Es una cadena de 165 residuos de aminoácidos y 4 glicanos de aproximadamente 34 kDa.

• Su producción es regulada por la tensión de oxígeno tisular.

• La deficiencia de ésta es la causa primaria de anemia en enfermedad renal crónica.

Historia

Paul Carnot

USO CLÍNICO DE LAS ERITROPOYETINAS RECOMBINANTES

• Los agentes recombinantes análogos a la eritropoyetina son producidos para el tratamiento de la anemia en pacientes con enfermedad renal crónica

• Hay dos agentes de eritropoyetina humana recombinante en el mercado, epoetin alfa y epoetin beta.

• Ambas son estructuralmente homólogas a la hormona endógena

• Actúan sobre el receptor de la eritropoyetina• Promueve la proliferación y supervivencia de

células progenitoras eritroides en la médula ósea, incrementando el conteo de células rojas circulantes y la concentración de hemoglobina.

FARMACOLOGÍA

FACTORES QUE AFECTAN LA EFICACIA DE LA rHuEPO

- Ingesta de hierro, vitamina B12 y ácido fólico.- Infecciones agudas o crónicas.- Enfermedades inflamatorias.- Toxicidad por aluminio.

Beneficios secundarios a la corrección de la anemia por rHuEPO

• Revierte o mejoran los efectos causados en el sistema cardiovascular.

• Mejora la función de las plaquetas.• Mejora la función sexual.• Mejora la función endocrina.

Efectos adversos de la terapia con rHuEPO

- Se piensa que los efectos adversos reportados no son debidos al producto recombinante per se pero si a el incremento en el hematocrito y viscosidad de la sangre resultantes del tratamiento.

- Los efectos adversos reportados son:- Hipertensión (20 – 30% de los pacientes tratados)- Encefalopatía- Trombosis vascullar- Hiperkalemia- Síntomas como de influenza - Irritación de la piel (sólo en eopetin alfa)

Producción comercial de eritropoyetina recombinante

• Para la producción de EPO recombinante, debemos asegurarnos que el método utilizado generé la correcta secuencia de aminoácidos y la cantidad correcta de glicosilaciones, para alcanzar la eficacia deseada in vivo.

• La célula hospedadora usada para la producción de eritropoyetina recombinante debe ser de mamífero, en este caso se usan líneas celulares de ovarios de hámster chino, CHO.

Células CHO generasn patrones de glicanos muy bien tolerados por

los pacientes y producen altas tasas de crecimiento.

Desarrollo de la línea celular

• A) Trensfección y selección: el desarrollo de la línea celular comienza con la transfección de un vector de expresión a la línea celular hospedadora. Le siguen etapas de selección para matar selecivamente a las células que no tienen el vector de expresión. Dando una diversa línea de células sobrevivientes. Las cuales producen un “Master Cell Bank”

• En este caso el vector contiene: • Un plásmido pBR322

mutante.• Un mini gen de

dihidrofolato reductasa de ratón.

• Origen de replicación de SV40.

• El crecimiento de estas células en un medio con mehotrexato nos dará una amplificación de la producción de r-HuEPO.

Producción

• La habilidad del cultivo celular de producir la hormona es afectada por ambiente nutricional y otros parámetros físicos como temperatura, pH, osmolaridad y concentración de gases disueltos.

• La materia prima usada para el procesos de fermentación consiste en el banco de células y los nutrientes para mantener y expandir esas células.

• Los nutrientes suelen se amino ácidos, fiuentes de carbono adicionales (glucosa), vitaminas, elementos traza, factores de crecimiento, hormonas y sales.

Producción

Opciones de procesamiento

Batch

Fed batch

Producción comercial de la eritropoyetina

Manufactura

Expansión de las células de un banco de células

“Seed train”

Producción

En suspensión

Modo adherente

Producción comercial de la eritropoyetina

Crecimiento celular• En el primer reactor se coloca medio de cultivo estéril y

se inocula con células CHO para la formación de biomasa durante 13 días aproximadamente,

• Es importante mantener el pH en 7-7,5, la temperatura en 30 ° C y cambiar de medio de cultivo cada 72 horas.

Fermentación y expresión.• Cuando las células llegan al día 13, se depositan en

fermentadores de 10 L, y son mezcladas con medio de cultivo adicionado con insulina y metrotrexatoque facilita la expresión de eritropoyetina al medio. Se mantienen las mismas condiciones del paso anterior.

Purificación

Cromatografía en gel

Concentración

Cromatografía de afinidad

HPLC

Producción comercial de la eritropoyetina

• Formulación• En base a la cantidad de eritropoyetina se adicionan

las cantidades correspondientes de excipientes para asegurar la formulación con la que saldrá al mercado.

• La mezcla se dosifica en viales de vidrio, previamente lavados y esterilizados.

• Liofilizado• Los viales se introducen en una liofilizadora para

evaporar el agua y obtener un polvo blanco muy fino.