Erbs Cintra Dr2011

0

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

EXTRATO DE Allamanda blanchetti NA INDUÇÃO DE

FITOALEXINAS EM SORGO E RESISTÊNCIA EM VIDEIRA

‘SUPERIOR SEEDLESS’ CONTRA Uncinula necator

ERBS CINTRA DE SOUZA GOMES

AREIA, PB 2011

1





Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (PPGA) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Agronomia, área de concentração Agricultura Tropical.

Orientador: Profa. Dra. Luciana Cordeiro do Nascimento Universidade Federal da Paraíba Campus II, Areia, PB Programa de Pós-Graduação em Agronomia Laboratório de Fitopatologia

Orientador: Prof. Dr. Leonardo Sousa Cavalcanti Universidade Federal do Vale do São Francisco Colegiado de Engenharia Agrícola e Ambiental Campus Juazeiro, Bahia

AREIA, PB 2011

1

Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da

Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, Campus II, Areia – PB.

G633e Gomes, Erbs Cintra de Souza.

Extrato de Allamanda blanchetti na indução de fitoalexinas em sorgo e

resistência em videira ‘Superior Seedless’ contra Uncinula necator. / Erbs

Cintra de Souza Gomes - Areia: UFPB/CCA, 2011.

96 f. : il.

Tese (Doutorado em Agronomia) - Centro de Ciências Agrárias.

Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2011.

Bibliografia.

Orientadora: Luciana Cordeiro do Nascimento.

Co-orientador: Leonardo Sousa Cavalcanti

1. Videira – indução de resistência 2 . Videira – Cultura 3 .

Alamanda roxa 4. Oídio I. Nascimento, Luciana Cordeiro do

(Orientadora) II. Cavalcanti, Leonardo Sousa (Co-orientador) Título.

UFPB/CCA CDU:

634.8(043.2)

2





APROVADO EM 05/04/2011

BANCA EXAMINADORA

Profª. Luciana Cordeiro do Nascimento, D. Sc. Orientadora

PPGA/CCA/UFPB

Prof. Leonardo Sousa Cavalcanti, D. Sc. Orientador UNIVASF

Profª Lílian Margarete Paes Guimarães, D. Sc. -1º Examinador-

UFPB

Alderi Emídio de Araújo, D. Sc. -2º Examinador-

EMBRAPA

AREIA, PB 2011

3

“O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza dos seus sonhos”

Eleanor Roosevelt

4

Ao DEUS eterno e todo poderoso...

“A fé em Deus nos faz crer no incrível, ver o invisível e realizar o que muitas vezes

parece ser impossível.”

OFEREÇO.

Ao meu pai Carlos Cintra (in memoriam)

“Sonhos não morrem, apenas adormecem na alma da gente.”

(Chico Xavier)

Estaremos sempre juntos...

À minha mãe Maria Yolanda

Melhor do que todos os presentes... Mãe, você é a luz das nossas vidas!

Obrigado pelo amor incondicional, pelas orações, confiança e carinho de sempre.

Aos meus irmãos Wellington, Kelly, Eide e Antonio Carlos

O meu amor, carinho e gratidão pelas muitas oportunidades que me proporcionaram, muitas vezes

renunciando à própria realização dos seus sonhos...

Vencemos juntos!

À minha esposa Jacyara

e aos meus filhos José Henrique Cintra e Esther Cintra

O meu amor e todo o meu carinho por embarcarem comigo neste sonho...

Somos todos vencedores!

Aos meus sobrinhos Thaynná, Davy, Wellesson, Wadington, Pedro, José

Antonio, Enzo, Líris e Lara,

Acreditar sempre! Por mais difíceis que sejam os momentos...

“Somos exatamente aquilo que queremos ser”!

DEDICO.

5

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal da Paraíba e ao Programa de Pós-graduação em Agronomia

pela oportunidade de realização dos Cursos de Mestrado e Doutorado; ao CNPq

pela concessão das bolsas de estudo;

À Profa. Dra. Luciana, minha orientadora, amiga e “mãe”... Sem o seu apoio, nada

disso seria possível. Obrigado pela confiança, profissionalismo e pelos desafios

lançados ao longo deste período;

Ao Prof. Dr. Leonardo, meu orientador, pelo profissionalismo e caráter desafiador

com que conduziu este trabalho;

À Profa. Dra. Jane Perez... “Este sonho começou no PIBIC em 2006”. Obrigado por

acreditar em mim e pela oportunidade de me apresentar ao universo da

Fitopatologia;

À Profa. Dra. Flávia Cartaxo pelo apoio em todos os momentos. Os frutos deste

trabalho também são seus.

À Profa. Edigênia Cavalcanti pelas contribuições para realização deste trabalho;

Aos meus irmãos Tato e Ronilton; à minha sogra Jacyra pelo apoio constante.

Aos Profs. Cícero Antonio, José Batista, Silvanda Silva, Napoleão Beltrão, Walter

Esfrain, Rejane Mendonça, Ítalo Aquino, Riselane Bruno, Jacinto Batista e Ademar

Pereira pelos conhecimentos transmitidos e pela amizade sincera;

Aos amigos do Departamento de Ensino do IF SERTÃO-PE, hoje parte da minha

família, Profas. Fátima Palitot, Patrícia Pereira e Lucileide, minha gratidão pela

importante contribuição para realização deste trabalho;

Aos amigos do Laboratório de Química Orgânica e Bioquímica Vegetal da UNIVASF,

Ivanildo, Thais e Juliana. Aos “meus” bolsistas Elbson, Leonardo, Sinara e Bruna. A

vocês, meu reconhecimento pela contribuição para realização deste trabalho;

Aos amigos de turma Mary, Perla, Lucínio, Tiago, Juliana, Joseane PDF, Leandro,

Kedma, Rodrigo, Fábio Jr; a vocês todo o meu carinho por todos os momentos de

aprendizado que esta convivência nos deu. E a todos os demais colegas que

contribuíram de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho.

6

SUMÁRIO

Pág

RESUMO........................................................................................................... 11

ABSTRACT....................................................................................................... 12

CAPÍTULO I

Introdução.......................................................................................................... 13

Objetivos gerais e específicos........................................................................... 16

Referencial teórico............................................................................................. 17

A cultura da videira............................................................................................ 17

O cultivo de uvas apirênicas no Vale do Submédio São Francisco................... 18

Oídio da videira [(Uncinula necator) (SCHWEIN; BURR)]................................. 19

Extratos vegetais no manejo de doenças de plantas........................................ 20

Allamanda blanchetti A. DC............................................................................... 21

Resistência induzida em plantas a patógenos.................................................. 22

Metabólitos secundários.................................................................................... 25

Fitoalexinas........................................................................................................ 27

Principais vias metabólicas envolvidas na defesa de plantas contra fitopatógenos..................................................................................................... 28

Referências........................................................................................................ 32

CAPÍTULO II

Indução de fitoalexinas em sorgo em resposta a extrato de Allamanda blanchetti A. DC................................................................................................. 44

Resumo.............................................................................................................. 45

Abstract.............................................................................................................. 46

Introdução.......................................................................................................... 47

Material e Métodos............................................................................................ 49

Preparo dos extratos de A. blanchetti................................................................ 49

Bioensaios para produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo................ 50

Delineamento experimental............................................................................... 51

Resultados e Discussão.................................................................................... 51

Conclusões........................................................................................................ 54

Referências........................................................................................................ 55

CAPÍTULO III

Ativação de respostas de defesa em videira „Superior Seedless‟ contra Uncinula necator por extrato de Allamanda blanchetti e acibenzolar-S-metil................................................................................................................... 59

7

Resumo.............................................................................................................. 60

Abstract.............................................................................................................. 61

Introdução.......................................................................................................... 62

Material e Métodos............................................................................................ 64

Progresso da doença em discos de folhas........................................................ 65

Experimento em campo..................................................................................... 66

Determinação da incidência da doença ............................................................ 66

Caracterização dos mecanismos bioquímicos envolvidos na resposta de defesa de videiras „Superior Seedless‟ induzidas por extratos de A. blanchetti 67

Extração de proteínas para determinação da atividade de fenilalanina amônia-liase, peroxidases e β,1-3,glucanase................................................... 67

Determinação da atividade enzimática de Peroxidases.................................... 68

Determinação da atividade enzimática de β,1-3, glucanase............................. 68

Análise estatística.............................................................................................. 68

Resultados e Discussão.................................................................................... 69

Progresso da doença em discos de folhas e percentual de controle................ 69

Curva de progresso de Uncinula necator.......................................................... 70

Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD)............................... 72

Determinação da atividade enzimática de fenilalanina amônia-liase (FAL), peroxidases e β-1,3-glucanase.......................................................................... 73

Conclusões........................................................................................................ 79

Referências........................................................................................................ 81

CAPÍTULO IV

Considerações Finais........................................................................................ 88

ANEXOS............................................................................................................ 90

8

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO III

Tabela. 1 Proteção de videiras „Superior Seedless‟ em resposta à aplicação

de extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. x Uncinula

necator Schwein e Burr. Petrolina, PE. 2010...................................

69

9

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura. 1 Principais vias metabólicas utilizadas pelos vegetais na promoção

de respostas de defesa em plantas a patógenos............................ 29

Figura. 2 A rota do xiquimato. ........................................................................ 30

CAPÍTULO II

Figura. 1 Produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo submetidos ao

tratamento com extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC.

extraído a quente (em aparelho Soxhlet por 36 h), a frio (pó seco

em contato com o solvente por 72 h) e produto comercial

acibenzolar-S-metil (ASM - 200 mg . L-1

). ...................................... 51

Figura. 2 Produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo submetidos ao

tratamento com extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC.

extraído a quente (em aparelho Soxhlet por 36 h), a frio (pó seco

em contato com o solvente por 72 h)............................................... 53

CAPÍTULO III

Figura. 1 Curva de progresso de oídio (Uncinula necator) em videiras

„Superior Seedless‟ submetidas ao tratamento com extrato

etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (Abq),

a frio (Ab), produto comercial acibenzolar-S-metil (ASM),

agroquímico e testemunha - água destilada e esterilizada.

Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab),

200 mg . L-1

(ASM) e metyran + pyraclostrobin (2 kg.ha-1

) e

mancozeb + metalaxyl-M (250 g.ha-1

), respectivamente................. 70

Figura. 2 Área abaixo da curva de progresso da doença (Uncinula necator)

em videiras „Superior Seedless‟ submetidas ao tratamento com

extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a

quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial acibenzolar-S-metil

(ASM), agroquímico e testemunha - água destilada e esterilizada.

Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab),

200 mg . L-1


) e

mancozeb + metalaxyl-M (250 g.ha-1

), respectivamente................. 72

Figura. 3 Atividade de fenilalanina amônia-liase a partir de diferentes

concentrações de extrato etanólico de Allamanda blanchetti A.

DC. extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial

acibenzolar-S-metil (ASM), *agroquímico e **testemunha - água

destilada e esterilizada. Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 75

10

1000 ppm (Abq e Ab), 200 mg . L-1

(ASM) e metyran +

pyraclostrobin (2 kg.ha-1

) e mancozeb + metalaxyl-M (250 g.ha-1

),

respectivamente...............................................................................

Figura. 4 Atividade de peroxidases a partir de diferentes concentrações de

extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a


(ASM), *agroquímico e **testemunha - água destilada e

esterilizada. Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm

(Abq e Ab), 200 mg . L-1

(ASM) e metyran + pyraclostrobin (2

kg.ha-1


), respectivamente. 76

Figura. 5 Atividade de β-1,3-glucanase a partir de diferentes concentrações

de extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a


(ASM), *agroquímico e **testemunha - água destilada e

esterilizada. Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm

(Abq e Ab), 200 mg . L-1


kg.ha-1


), respectivamente. 78

11

RESUMO

A indução de resistência em plantas a patógenos a partir de extratos vegetais tem

demonstrado ser uma alternativa promissora no manejo de doenças de plantas.

Assim sendo, foram desenvolvidas pesquisas com o objetivo de avaliar a eficiência

do extrato etanólico de Allamanda blanchetti no manejo do oídio da videira (Uncinula

necator) e na ativação de enzimas envolvidas na indução de mecanismos de defesa

em videiras „Superior Seedless‟ à doença no Vale do Submédio São Francisco.

Inicialmente avaliou-se o potencial do extrato etanólico de A. blanchetti em ativar a

produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo. Em campo, plantas de videira

foram pulverizadas com extrato etanólico de A. blanchetti a quente com extração em

aparelho Soxhlet e a frio, em etanol absoluto nas concentrações 10, 100, 500 e 1000

ppm, acibenzolar-S-metil (200 mg.L-1), agroquímicos metyran + pyraclostrobin

(2kg.ha-1) e mancozeb + metalaxyl-M (250g.ha-1). Determinou-se o progresso da

doença em discos de folhas e em condições de campo. A evolução da doença em

discos de folhas foi avaliada 96h após a primeira pulverização e 14 dias após a

inoculação com o patógeno. Em condições de campo utilizou-se o monitoramento

semanal de acordo com a planilha de amostragem de doenças da videira

recomendado pela produção integrada de frutas. A atividade das enzimas

fenilalanina amônia-liase, peroxidases e β-1,3-glucanase foi avaliada nos tempos 0,

24, 48, 96 e 192h após a primeira pulverização. O acúmulo de fitoalexinas 3-

deoxiantocianidinas foi maior nas concentrações 1000 ppm a quente, 10, 100, 500 e

1000 ppm a frio e no indutor comercial acibenzolar-S-metil (200 g.L-1). O extrato

etanólico de A. blanchetti independente do método de extração (a quente ou a frio)

induziu a síntese de fitoalexinas 3-deoxiantocianidinas em sorgo. Ocorreram

diferentes níveis de controle de U. necator em discos de folhas e em condições de

campo. Extrato a frio 1000 ppm e ASM conferiram maior capacidade de defesa de

plantas de videira „S. Seedless‟ a U. necator. Extrato a frio 1000 ppm promoveu o

aumento na atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase, peroxidases, e β-1,3-

glucanase.

Palavras-chave: Indução de resistência, Alamanda roxa, oídio.

12

ABSTRACT

Induction of plant resistance against pathogens using plant extracts has been shown

as a promising alternative in the management of plant diseases. Therefore, it was

developed works with the objective to evaluate the efficiency of the ethanolic extract

of Allamanda blanchetti as a segment of grapevine powdery mildew (Uncinula

necator) management and enzymes activation involved on mechanisms of defense

induction in grapevines 'Superior Seedless' disease in Vale do São Francisco,

Pernambuco, Brazil. First it was evaluated the potential of ethanolic extract of A.

blanchetti on activating phytoalexins production in sorghum mesocotyl. In field, vine

plants were sprayed with ethanolic extract of A. blanchetti extracted, hot and cold on

solvent, in absolute ethanol at concentrations of 10, 100, 500 and 1000 ppm,

acibenzolar-S-methyl (200 mg.L-1), fungicide metyran + pyraclostrobin (2kg.ha-1)

and mancozeb + metalaxyl-M (250g.ha-¹). It was determined disease progress on

leaf discs and on field conditions. Disease evolution in leaf discs was assessed 96h

after the first spray and 14 days after inoculation with pathogen. In field conditions, it

was used monitoring according to method of sampling of grapevine diseases

recommended by the integrated fruit production management. The activity of

phenylalanine ammonia-lyase, peroxidases and β-1,3-glucanase was measured at 0,

24, 48, 96 and 192h after the first spraying. Phytoalexins accumulation 3-

deoxiantocianidyns at 1000 ppm hot, 10, 100, 500 and 1000 ppm in cold and inductor

acibenzolar-S-methyl (200 gL-¹). The ethanol extract of A. blanchetti, independent of

extraction method, induced phytoalexin synthesis in sorghum 3-deoxiantocianidinas.

There were different levels of U. necator control on leaf disks and field conditions.

Cold extract 1000 ppm and ASM conferred higher ability to protect grapevine „S.

Seedless‟ against U. necator. Cold extract 1000 ppm promoted the increased activity

of phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase and β-1,3-glucanase.

Keywords: Induction of resistance, alamanda purple, powdery mildew.

13

Capítulo I

Introdução Geral

14

EXTRATO DE Allamanda blanchetti NA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA EM

VIDEIRA ‘SUPERIOR SEEDLESS’ CONTRA Uncinula necator

Erbs Cintra de Souza Gomes1*; Luciana Cordeiro do Nascimento1; Leonardo Sousa

Cavalcanti2

1*Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Sertão Pernambucano (IF SERTÃO-PE),

Campus Petrolina Zona Rural, BR 235, Km 22, PISNC N-4, Petrolina, PE, C.P.: 178, CEP: 56.302-

910; 1Laboratório de Fitopatologia, PPGA/CCA/UFPB, Universidade Federal da Paraíba, Campus

II, Rodovia PB 079, Km 12, CEP 58397-000, Areia, PB; 2Laboratório de Química Orgânica e

Bioquímica Vegetal, UNIVASF; Universidade Federal do Vale do São Francisco, Av. Antonio

Carlos Magalhães, 510, Santo Antonio, CEP 48902-300, Juazeiro, BA

GOMES, E.C.S.; NASCIMENTO, L.C.; CAVALCANTI, L.S. Extrato de Allamanda

blanchetti na indução de resistência em videira „Superior Seedless‟ contra

Uncinula necator

1. INTRODUÇÃO

A agricultura mundial centra-se cada vez mais na máxima correlação

entre produção e lucro. Estima-se que no mundo, mais de 500 mil toneladas de

agroquímicos interditos, obsoletos e não desejados trazem ameaças ao meio

ambiente e à saúde humana. Outro problema de relevância mundial é a contínua

redução na média de terras aráveis por habitante, o que gerou a necessidade

imediata da adoção de práticas sustentáveis de exploração agrícola (FAO, 2011).

No Brasil, não obstante à realidade das principais regiões produtoras do

mundo, surge a necessidade de desenvolvimento de tecnologias alternativas ao

controle químico de pragas. Atualmente, o país é o maior consumidor mundial de

agrotóxicos com aproximadamente 700 milhões de litros aplicados nas lavouras

(SINDAG, 2009). Nesse contexto, o controle químico convencional representa

uma séria ameaça à manutenção dos mais diversos agroecossistemas de cultivo,

além de potencializar riscos diretos à saúde humana e ao meio ambiente, e

favorecer a quebra da produtividade e o surgimento de patógenos resistentes.

No Vale do Submédio São Francisco um dos principais problemas

fitossanitários que acometem a cultura da videira „Superior Seedless‟ é o oídio

15

[(Uncinula necator (SCHWEIN; BURR)]. O patógeno representa uma séria

ameaça aos viticultores em nível mundial, uma vez que os danos causados em

todas as fases fenológicas resultam em perda de produtividade, e/ou consequente

queda de qualidade do produto, inviabilizando sua comercialização.

Dentre os métodos alternativos, a busca por fungicidas naturais

principalmente à base de extratos vegetais (BASTOS, 1997) e a resistência

induzida (WALTERS; FOUNTAINE, 2009) constituem importantes ferramentas

para o manejo sustentável de doenças. A utilização de extrato bruto ou óleos

essenciais com propriedades antimicrobianas é frequentemente empregada com

sucesso no controle de agentes fitopatogênicos (FIORI et al., 2000; BALBI-PEÑA

et al., 2006; ROZWALKA et al., 2008).

Quanto ao complexo mecanismo de defesa de células vegetais contra

patógenos, Nojosa; Resende; Resende (2005) afirmam que a resistência induzida

pode ser ativada por uma série de substâncias com o objetivo de evitar, e/ou

atrasar a entrada ou subsequente atividade do patógeno em seus tecidos. Esse

fenômeno ocorre por meio de mecanismos de defesa próprios, que poderão

culminar em reações duradouras ou não.

Assim, para atender à necessidade de desenvolvimento de tecnologias

alternativas ao controle químico convencional, o uso de extratos vegetais

constitui-se ferramenta promissora na dissolução dos problemas fitossanitários

em campo.

16

2. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS

2.1 Objetivos gerais

Avaliar a eficiência do extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC

no manejo do oídio da videira [(Uncinula necator (SCHWEIN; BURR)] e na

ativação de enzimas reconhecidamente envolvidas na promoção de respostas de

defesa de videiras „Superior Seedlees‟ no Vale do Submédio São Francisco.

2.2 Objetivos específicos

Caracterizar os níveis de produção de fitoalexinas em mesocótilos de

sorgo (Sorghum bicolor L. Moench), em resposta à utilização do extrato etanólico

de A. blanchetti a partir do método de extração a quente (em aparelho Soxhlet) e

a frio (pó seco imerso em etanol absoluto por 72h).

Determinar a melhor concentração do extrato etanólico de A. blanchetti

a partir do método de extração a quente e a frio, para reduzir a incidência do oídio

(U. necator) em videiras „Superior Seedless‟.

Identificar os níveis de atividade das enzimas fenilalanina amônia liase,

peroxidases e β-1,3-glucanase em resposta à utilização das concentrações do

extrato etanólico de A. blanchetti e acibenzolar-S-metil.

17

3. REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 A cultura da videira

A videira é uma planta perene, lenhosa, caducifólia e sarmentosa, provida

de órgãos de sustentação chamados gavinhas. Pertence à família Vitaceae e ao

gênero Vitis. Entre as espécies de maior interesse econômico pertencentes a este

gênero, tem-se as videiras americanas (Vitis labrusca L. e outras espécies) e

européias (V. vinifera L.). Dentro de cada espécie e híbrido existem cultivares,

podendo haver ainda, dentro destas, clones com características agronômicas e/ou

comerciais de maior interesse (KISHINO, 2007).

No Brasil a área destinada à produção de uvas atingiu 81.677 hectares

em 2009. A região Sul destacou-se ocupando 72,5% das áreas destinadas ao

cultivo de videiras no país, seguida da região Sudeste com 14,8% e da região

Nordeste com 12,1%. Quanto à produção brasileira de uvas em 2009, foram

registrados 1.365.491 toneladas. A região Sul foi responsável por 66,4% da

produção, seguida da região Nordeste com 18,6% e da região Sudeste com

14,5%. Quanto aos dados de produtividade em 2009, os maiores valores foram

observados para a região Nordeste com 25,58 t.ha-1, seguidos da região Sudeste

com 16,39 t.ha-1 e da região Sul com 15,37 t.ha-1 (IBGE, 2011).

Na região Nordeste do Brasil, o Vale do Submédio São Francisco

apresenta-se como a principal região produtora de uvas de mesa, consagrando-

se, segundo Grangeiro; Leão; Soares (2002) como pólo produtor e exportador de

uvas de mesa de alta qualidade, com destaque para o alto padrão tecnológico

adotado nos sistemas de cultivo.

Em 2009 a área ocupada pelo cultivo de videiras nos Estados de

Pernambuco e Bahia correspondia a 9.727 hectares, 11,95% da área nacional.

Pernambuco possuía 7,37% (6.003 ha) deste total, enquanto a Bahia 4,57%

(3.724 ha). Somadas as produções dos dois estados em 2009, obteve-se uma

produção de 249.025 t. Pernambuco foi responsável por 63,65% desta produção,

com produtividade média de 26,4 t.ha-1 e a Bahia atingiu 36,35% do total

produzido, com produtividade média de 24,3 t.ha-1 (IBGE, 2011).

Segundo Silva e Correia (2011), a especificidade da viticultura na região

semiárida do Nordeste do Brasil ocorre em virtude da adaptação e do

18

comportamento diferenciado das plantas nas condições climáticas presentes na

região. Em consequência destas particularidades regionais, os processos

fisiológicos das plantas são acelerados, a propagação é rápida e em cerca de um

ano e meio após o plantio, inicia-se a primeira safra. Outra particularidade

regional é a redução do ciclo da cultura em virtude das alterações dos processos

fisiológicos das plantas. Mediante o manejo da irrigação e a realização de podas

programadas, pode-se obter até duas safras e meia por ano, considerando um

ciclo médio da cultura de aproximadamente 120 dias.

Não obstante à realidade das principais regiões produtoras de uvas no

mundo, a região do Vale do submédio São Francisco enfrenta sérios problemas

de ordem fitossanitária, gerando prejuízos significativos à cultura da videira

(GOMES; PEREZ; BARBOSA, 2009). Há relatos de prejuízos causados por

diferentes agentes fitopatogênicos, principalmente levando-se em conta a

sazonalidade em que se registra o pico de incidência (TAVARES; LIMA; MELO

2000; GOMES et al., 2007; GOMES; PEREZ; BARBOSA, 2009; CAMARGO et al.,

2011).

Dentre os principais agentes patogênicos, o oídio (Uncinula necator) e o

míldio [(Plasmopara viticola) (BERK; CURTIS) Berl. e De Toni] destacam-se por

causar grandes prejuízos à cultura na região do Vale do Submédio São Francisco

(TAVARES; LIMA; MELO, 2000).

3.1.1 O cultivo de uvas apirênicas no Vale do Submédio São

Francisco

A região do Vale do Submédio São Francisco é o principal pólo produtor e

exportador de uvas de mesa de alta qualidade do Brasil. Para Grangeiro; Leão;

Soares (2002) os viticultores da região tem se preocupado em diversificar a

produção vinícola com a introdução de novas variedades, não somente para

evitar a saturação do mercado com a oferta exclusiva de uva „Itália‟. Silva e

Correia (2011) destacaram que um dos principais objetivos dessa diversificação é

o atendimento às novas exigências de consumo do mercado mundial de frutas

frescas que inclina-se para a produção de uvas apirênicas.

Para Araújo (2011) as uvas apirênicas vêm conquistando consumidores

europeus, gerando uma demanda cada vez maior por esta variedade. No entanto,

19

apesar das variedades de uvas sem sementes já representarem ¼ do total de

uvas finas de mesa exportadas pelo Vale do Submédio São Francisco, com

aproximadamente 9.000 t das 36.000 t comercializadas no mercado externo

(EMBRAPA, 2011), a produção brasileira ainda é pequena.

3.1.2 Oídio da videira [(Uncinula necator) (SCHWEIN; BURR)]

Perdas significativas de produtividade são relatadas na maioria das

espécies agrícolas, principalmente devido ao ataque de doenças fúngicas (WANI,

2010) responsáveis por mais de 70% de todas as doenças citadas na agricultura

(AGRIOS, 2005).

Dentre os principais fitopatógenos da videira (Vitis sp.), U. necator causa

o oídio, a doença de maior importância econômica em nível mundial (GODFREY,

ABLE; DRY, 2007). O patógeno é um parasita biotrófico que invade as células

epidérmicas do hospedeiro, causando infecção nos tecidos, caracterizada por

uma sequência de eventos distintos em um espaço de tempo determinado

(LEINHOS et al., 1997). No processo de germinação, emerge do conídio um único

tubo germinativo, que após elongado, diferencia-se para formar apressórios e o

peg de penetração, iniciando assim, as tentativas de penetração das células

epidérmicas do hospedeiro (HEINTZ; BLAICH, 1990). Se a penetração é bem

sucedida, ocorrerá a formação do haustório assegurando a nutrição do patógeno.

Uncinula necator infecta toda a parte aérea da videira, incluindo

folhas, caules, inflorescências e frutos. Os sintomas variam ao longo do ciclo da

cultura em decorrência das diferentes fases fenológicas. No início do ciclo, todos

os tecidos em crescimento são altamente susceptíveis à infecção. As primeiras

lesões são pequenas, inicialmente descoloridas, seguidas pelo aparecimento de

uma fina camada branca sobre as folhas (FALACY et al., 2007).

A capacidade de infecção por oídio em parreirais evolui rapidamente de

infecção primária à secundária em decorrência das condições epidemiológicas.

Apesar de todas as partes da videira apresentarem susceptibilidade, a infecção

de alguns órgãos apresenta variações significativas ao longo do ciclo. As flores e

as bagas são altamente susceptíveis à infecção desde a sua formação,

frutificação, até as bagas atingirem um teor de sólidos solúveis igual a oito

(GADOURY et al., 2003).

20

O oídio é uma doença policíclica e os principais agentes dispersantes dos

conídios são as águas das chuvas e o vento (WILLOCQUET; CLERJEAU, 1998).

Folhas jovens e em expansão são mais susceptíveis à infecção do que as folhas

maduras, ou totalmente expandidas. No entanto, a ráquis e o pedicelo, o pecíolo e

os brotos são susceptíveis ao ataque do oídio durante todo o ciclo da cultura

(GADOURY et al., 2003).

3.2 Extratos vegetais no manejo de doenças de plantas

O uso de produtos derivados da indústria química no manejo de doenças

na agricultura moderna tem sido alvo de constantes questionamentos pela

sociedade. Isso ocorre principalmente em função dos efeitos adversos causados

por estes (PAULA JÚNIOR et al., 2006) e expressos através do surgimento de

resistência de patógenos a princípios ativos. Para Garrido; Sônego; Valdebenito-

Sanhueza (2004), a intensificação do controle químico no manejo de

fitopatógenos provoca sérias perturbações no ecossistema e no agroecossistema.

Dentre os principais efeitos adversos desta interação, Carson (2010) destaca os

riscos de contaminação do homem e do meio ambiente e o surgimento de

indivíduos resistentes.

Na agricultura o número elevado de pulverizações com agroquímicos tem

como objetivo reduzir e/ou controlar os índices de infecção no campo gerando

uma colheita de “qualidade” com elevados índices de produtividade. No entanto,

para Garrido; Sônego; Valdebenito-Sanhueza (2004), o uso contínuo de

fungicidas para o controle de doenças da videira traduz um completo desequilíbrio

do Sistema de Produção Convencional.

Na busca de alternativas menos agressivas para o manejo de doenças de

plantas, o uso de extratos vegetais apresenta-se como prática promissora (SILVA

et al., 2006). De acordo com Cruz et al. (2005) o uso de extratos de Azadirachta

indica e extrato cítrico apresentaram atividade biológica antimicrobiana (2,0 e

4,0%) no controle de Colletotrichum musae em bananas na pós-colheita. Resende

et al. (2007) utilizando extratos elaborados a partir de ramos de lobeira (Solanum

grandiflorum R. P.) infectados por Crinipelis perniciosa observaram a capacidade

dos extratos em induzir respostas de defesa em mudas de cacaueiro (Theobroma

cacao L.) contra o mesmo patógeno. Carvalho et al. (2000) utilizando extrato

21

aquoso da casca de barbatimão (Stryphnodendron barbatiman L.) observaram

uma redução significativa na incidência da fusariose (Fusarium gutiforme) em

abacaxizeiro (Ananas comosus L.), com a aplicação do extrato em substituição

aos fungicidas durante o período de abertura das flores.

Atualmente, a busca por substâncias bioativas a partir de extratos

vegetais com reconhecida atividade antimicrobiana ou antifúngica norteiam as

pesquisas atuais. Em 1971, os pesquisadores Whittaker e Fenny destacaram que

uma das principais funções das substâncias que compõem os extratos vegetais

(metabólitos secundários) é fornecer proteção às plantas contra o ataque de

fitopatógenos. Para Schwan-Estrada e Stangarlin (2005) a riqueza das plantas

medicinais que possuem princípios ativos microbicidas está na capacidade de

utilização destas fontes no manejo de fitopatógenos, tanto pela atividade

antimicrobiana quanto pela promoção de respostas de defesa em plantas a

fitopatógenos.

3.2.1 Allamanda blanchetti A. DC.

No Nordeste do Brasil a vegetação de caatinga do semiárido brasileiro

constitui um bioma com altos níveis de ameaça de extinção à sua fauna e flora.

Segundo Albuquerque e Andrade (2002), este bioma ainda é pouco estudado.

Monteiro et al. (2006) afirmaram que esta situação tende a evoluir lentamente

com a adoção de práticas modernas de investigação etnobotânica desenvolvidas

por pesquisadores na região. Segundo Araújo; Castro; Albuquerque (2007), a

carência de estudos detalhados sobre os recursos botânicos e os impactos que o

uso intensivo destes recursos pode ter na sua disponibilidade natural são

importantes ferramentas para sustentabilidade das pesquisas.

Bezerra et al. (2011) concordam que embora a vegetação do semiárido

apresente grande potencial botânico, existe pouco conhecimento a respeito dos

constituintes químicos de potencial terapêutico dos seus vegetais.

Dentre as principais famílias de plantas em estudo, a família

Apocynaceae destaca-se pelo grande número de gêneros. Foram catalogadas

cerca de 250 gêneros e 2000 espécies de árvores tropicais, arbustos e

trepadeiras. Uma característica da família Apocynaceae é que todas as espécies

produzem seiva leitosa. As folhas são simples e opostas, com flores grandes e

22

coloridas. Na medicina tradicional, as espécies de Apocynaceae são usadas para

tratar doenças gastrointestinais, febre, malária, dor e diabetes (WIART, 2006).

Essas plantas apresentam crescimento moderado, adaptam-se a todos os

estados brasileiros, desenvolvendo-se plenamente em temperaturas mais

elevadas com maior insolação. A propagação dá-se principalmente por estaquia

de caule, apresentando altas taxas de regeneração sob sistema de nebulização,

mesmo sem o uso de indutores adequados de enraizamento. Porém, o processo

para formação de mudas com dimensões adequadas à maior demanda do

mercado é lento (LORENZI; SOUZA, 2001).

No Brasil, o gênero Allamanda compreende 10 espécies (JOLY, 1975),

que são reconhecidas pela produção de princípios ativos, dentre os quais se

destacam os iridóides (ANDERSON; CHANG; McLAUGNLIN, 1988). Para Coppen

(1983) plantas do gênero Allamanda apresentam uma vasta atividade biológica,

inclusive contra algas. Estudos com extratos de plantas de Allamanda registraram

compostos antifúngicos (TIWARI; PANDEY; DUBEY, 2002) e atividade

antitumoral sobre células em cultura (KUPCHAN et al., 1974; ANDERSON;

CHANG; McLAUGNLIN, 1988; NAVARRO SCHMIDT et al., 2006).

Algumas espécies, incluindo A. cathartica, A. blanchetti e A. schotti foram

estudadas quanto à sua composição química e propriedades farmacológicas. A.

cathartica tem sido utilizada na medicina tradicional para diferentes fins, incluindo,

o tratamento de tumores hepáticos (MORS; RIZZINI; PEREIRA, 2000). Outras

espécies produzem metabólitos secundários que apresentam expressiva atividade

farmacológica como os iridóides, flavonóides, cumarinas e terpenóides

(NAVARRO SCHMIDT et al., 2006).

3.3 Resistência induzida em plantas a patógenos

A resistência induzida em plantas a patógenos pode ser definida como um

aumento da capacidade de defesa das plantas, a fim de mobilizar respostas de

defesa antes ou após o ataque de patógenos (BAKKER; PIETERSE; VAN LOON,

2007). Sob o aspecto fisiológico, trata-se da capacidade da planta em atrasar ou

evitar a entrada e/ou subsequente atividade dos patógenos em seus tecidos

(GOODMAN; KIRALY; WOOD, 1986).

23

Barreiras físicas e bioquímicas pré-formadas representam a primeira linha

de defesa contra a maioria dos fitopatógenos. Todavia, ao superar essas defesas,

os patógenos encontram mais um obstáculo, pois o reconhecimento do

microrganismo pelos receptores presentes na parede celular dos vegetais é

responsável pela ativação de uma cascata de respostas contra a invasão dos

agentes patogênicos (DAVID et al., 2010).

A regulação da ativação dos mecanismos de defesa induzida ocorre de

maneira coordenada a partir de uma matriz elaborada de transdução de sinais. Os

hormônios vegetais ácido salicílico (AS), ácido jasmônico (AJ) e etileno (ET),

atuam como moléculas chave desse processo (LORENZO; SOLANO, 2005;

GRANT; LAMB, 2006; BRUCE et al., 2007).

Em resposta ao ataque de patógenos, as plantas podem produzir

compostos de defesa altamente específicos, resultando na ativação de diferentes

conjuntos de genes relacionados com os mecanismos de defesa (KOORNNEEF;

PIETERSE, 2008; BARI; JONES, 2009). Assim, a sinalização é variável em

quantidade, tempo e composição das respostas de acordo com o patossistema

em estudo.

A chegada do patógeno desempenha um papel fundamental na ativação

de rotas de defesa de plantas, consolidando a natureza específica das respostas

acionadas (ROJO; SOLANO; SANCHEZ-SERRANO, 2003; DE VOS et al., 2005;

MUR et al., 2006). Estas, por sua vez, são resultantes de uma complexa rede de

interações bioquímicas que conectam os caminhos individuais e permite a

promoção de respostas específicas (GRANT; JONES, 2009; PIETERSE et al.,

2009).

Com os avanços científicos, observou-se que a sensibilização dos

mecanismos moleculares está associada à biossíntese pré-infeccional e/ou pós-

transducional de componentes celulares. A acumulação e a modificação destes

componentes, por si só, não ativariam a maioria das respostas de defesa das

plantas. No entanto, devido ao estado condicional, as células pré-estimuladas

estão preparadas para responder (amplificar os sinais de repostas)

potencializando a expressão dos sinais de defesa das plantas (CONRATH et al.,

2006).

24

Segundo Prusky (1996), estudos sobre o processo de infecção em frutos

imaturos demonstram que dentre outros fatores, a presença de mecanismos de

defesa pré-formados, estimulados por estresses bióticos ou abióticos, resultou na

suspensão temporária dos processos de infecção pelo acúmulo de compostos

antimicrobianos (fitoalexinas). Estes, por sua vez, apresentam baixo peso

molecular e estão presentes nas plantas antes mesmo da chegada do patógeno,

podendo ainda, serem sintetizados a partir de componentes pré-existentes.

O papel dos compostos antifúngicos na resistência natural das plantas às

doenças tem sido relatado extensivamente em muitas culturas hortícolas (TERRY

et al., 2004). Entretanto, a elucidação de rotas cuja atuação sinérgica seja

verdadeiramente comprovada ainda necessita de estudos.

Como há diferenças entre os níveis de resistência e susceptibilidade,

geralmente as respostas de defesa são amplamente dependentes da associação

de fatores como o tempo e a amplitude dessas defesas (POLESANI et al., 2010).

A investigação de uma interação compatível reflete na disponibilidade dos

mecanismos de defesa promovendo o desenvolvimento de novas estratégias de

manejo levando a identificação de fatores correlatos entre o agente patogênico e

a progressão da doença. Investigar a base molecular da interação planta-

patógeno possibilitará a descoberta de novos aspectos da biologia celular das

plantas e os mecanismos de sinalização existentes (LEGAY et al., 2010).

Há casos em que indutores de resistência podem determinar níveis muito

elevados de controle da doença superiores a 70% (GOMES et al., 2007; GOMES;

PEREZ; BARBOSA, 2009) . No entanto, há muito mais exemplos de resistência

induzida fornecendo níveis mais baixos de controle de doenças (MILES;

WILLINGHAM; COOKE, 2004).

Para Si-Ammour; Mauch-Mani; Mauch (2003), o uso de acibenzolar-S-

metil (ASM) não induziu respostas de defesa nos patossistemas Phytophthora

brassicae x Arabidopsis e P.infestans x Solanum tuberosum L. Mais

recentemente, em uma avaliação dos efeitos de diferentes agentes no controle de

Xanthomonas axonopodis pv. citrumelo e X. axonopodis pv. citri de laranja doce,

ASM e a proteína harpina (Messenger®) não promoveram um controle significativo

da doença (GRAHAM; LEITE, 2004).

25

3.3.1 Metabólitos secundários

Os processos que envolvem a interação planta-patógeno são complexos.

Apesar do grande número de pesquisas publicadas mundialmente com produtos

naturais, novas substâncias continuam sendo descobertas, e ainda há muito mais

por ser pesquisado. Estas substâncias não se enquadram no metabolismo

primário dos vegetais, representados por um grupo de susbtâncias essenciais

para a vida na célula (LOBO; LOURENÇO, 2007).

Metabólitos secundários podem ser definidos como uma série de

compostos originados a partir da ativação de rotas metabólicas resultando na

formação de compostos químicos específicos, tendo a sua distinção baseada nos

conhecimentos sobre a sua função e distribuição na natureza. O conceito destes,

foi descrito por Kossel (1891), primeiro autor a definir os metabólitos secundários

como opostos aos metabólitos primários.

Os metabólitos secundários têm sido sumariamente definidos como

compostos pouco abundantes, com uma frequência inferior a 1% do carbono total,

ou pelo fato de sua estocagem ocorrer em órgãos ou células específicas. O

desenvolvimento das técnicas analíticas como, por exemplo, os diversos tipos de

cromatografia, permitiram isolar mais destas moléculas, constituindo-se como a

base para o estabelecimento da fitoquímica (HARBORNE, 1998). O principal

objetivo desta ciência é a identificação de metabólitos secundários presentes nas

espécies vegetais, observando-se a utilização de técnicas de extração,

separação, purificação e determinação estrutural das substâncias (UGAZ, 2011).

Os produtos secundários têm um papel importante na adaptação das

plantas aos seus ambientes. Essas moléculas contribuem para que haja interação

direta com os diferentes ecossistemas (HARBORNE, 1988; AERTS et al., 1991).

As substâncias oriundas do metabolismo secundário aumentam a probabilidade

de sobrevivência de uma espécie, pois são responsáveis por diversas atividades

biológicas. Atuam como antibióticos, antifúngicos e antivirais e protegem as

plantas dos patógenos, além de apresentar atividade antigerminativa ou tóxica

para outras plantas. Alguns destes metabólitos constituem importantes compostos

resposnáveis pela absorção da luz ultravioleta evitando que as folhas sejam

danificadas (LI et al., 1993).

26

Harborne (1999) classificou os metabolitos secundários de plantas de

acordo com a sua rota biossintética. Os compostos fenólicos, os compostos

terpênicos e esteróides e os alcalóides são as três principais famílias.

Os compostos fenólicos estão envolvidos com a síntese das ligninas que

são comuns a todas as plantas superiores. Atrativos aos seres humanos devido

ao odor, sabor e coloração agradáveis, estes compostos são importantes nas

relações com outros animais, os quais são atraídos para polinização ou dispersão

de sementes. Para Croteau; Kutchan; Lewis (2000), esse grupo de compostos é

importante para proteger as plantas contra os raios ultravioleta, insetos, fungos,

vírus e bactérias. Há ainda relatos de espécies vegetais que desenvolveram

compostos fenólicos para inibir o crescimento de outras plantas competidoras em

um mecanismo conhecido como alelopatia (FUMAGALI et al., 2008).

Os alcalóides podem ser definidos como compostos farmacologicamente

ativos, contendo um nitrogênio e derivados de aminoácidos (CORDELL, 1981).

Entretanto, os alcalóides não são distribuídos de maneira uniforme no reino

vegetal e são mais específicos para alguns gêneros e espécies de plantas. Esta

distribuição restrita dos compostos secundários constitui a base da

quimiotaxonomia e ecologia química (HARBORNE, 1988). A sua localização nos

vegetais ocorre principalmente em quantro tipos de tecidos ou células: tecidos

com crescimento ativo, células epidérmicas ou hipodérmicas, bainhas vasculares

e vasos laticíferos. Intracelularmente, são sintetizados no retículo

endosplasmático, concentrando-se em seguida, nos vacúolos e, dessa maneira,

não aperecem em células jovens antes de ocorrer a formação dessas estruturas.

O local de estoque dos alcalóides é diferente daquele no qual foram

sintetizados (SIMÕES et al., 1999). O papel dos alcalóides nas plantas ainda é

uma questão difícil de ser respondida, mas de acordo com Croteau; Kutchan;

Lewis (2000), algumas respostas estão surgindo amparadas nas funções eco-

químicas destes compostos. Sustentado pela grande variedade de efeitos

fisiológicos que estes exercem sobre os animais e, também, por suas atividades

antimicrobianas, Taiz e Zaiger (2009) destacaram que vários alcalóides são

tóxicos a insetos e repelem herbívoros, constituindo-se em importante ferramenta

no controle das doenças de plantas.

27

3.3.2 Fitoalexinas

As fitoalexinas são definidas como compostos antimicrobianos de baixo

peso molecular, que são sintetizados pelas plantas e que se acumulam nas

células vegetais em resposta à infecção microbiana (PAXTON, 1981). Esta

constitui-se na resposta de defesa a patógenos mais bem estudada nas plantas

(TAIZ; ZEIGER, 2009).

A confirmação de que a defesa das plantas pode ser ativada após a

infecção dos tecidos pelo patógeno foi confirmada através dos experimentos

sobre as hipóteses das fitoalexinas (MULLER; BORGER, 1940). Desde então, o

estudo desses compostos passou a fazer parte das pesquisas sobre a ativação

dos mecanismos de defesa das plantas. Esses trabalhos tem feito com que novos

experimentos sejam implantados para o uso da regulação e ativação de genes,

diversidade fitoquímica, química e bioquímica dos metabólitos secundários de

defesa (HAMMERSCHIMIDT, 1999).

O tópico fitoalexinas e as respostas de defesa a patógenos têm sido

estudado e revisado ao longo dos anos (BAILEY; MANSFIELD, 1982;

HAMMERSCHIMIDT; SCHULTZ, 1996; SMITH, 1996; MANSFIELD, 1999;

AGRIOS, 2005; TAIZ; ZAIGER, 2009). Informações advindas de diversas áreas

do conhecimento servem para ilustrar àquelas que podem ser utilizadas como

amostra para elucidação das rotas das fitoalexinas na promoção de respostas de

defesa das plantas (HAMMERSCHIMIDT, 1999).

O mecanismo de ativação das rotas e a produção das fitoalexinas parece

ser um ponto comum de resistência a microrganismos patogênicos em uma

grande variedade de plantas. Em geral, as fitoalexinas estão presentes em baixa

concentração nas plantas antes da infecção, aumentando rapidamente a sua

concentração após o ataque do microrganismo (HAIN et al., 1993) devido a

ativação de novas rotas biossintéticas. O ponto de controle da reação é o início da

transcrição do gene. Esta explicação serve de indicativo para afirmar que as

plantas possuem complexo arsenal enzimático para ativar a síntese de

fitoalexinas. Uma vez incitado logo após a infecção do hospedeiro, provavelmente

desencadeará a transcrição de m-RNAs específicos para a produção das

proteínas de resposta correspondentes (TAIZ; ZEIGER, 2009).

28

De forma geral, o modo de ação das fitoalexinas sobre fungos inclui

granulação citoplasmática, desorganização dos conteúdos celulares, ruptura da

membrana plasmática e inibição de enzimas fúngicas. Esses efeitos refletem-se

na inibição da germinação, elongação do tubo germinativo e redução ou inibição

do crescimento micelial (LO et al., 1996). A resistência expressa está associada

ao aumento de atividade de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-PR)

e é mediada por um processo dependente do ácido salicílico. Outros processos

de defesa podem ser incluídos, como explosão oxidativa, acúmulo de fitoalexinas,

lignificação e enrijecimento de parede (ANTEROLA; LEWIS, 2002; DURRANT;

DONG, 2004).

3.3.3 Principais vias metabólicas envolvidas na defesa das plantas

contra fitopatógenos

Embora aparentemente indefesas ao ataque de fitopatógenos, as plantas

superiores desenvolveram ao longo do processo evolutivo natural um verdadeiro

arsenal bioquímico cujo objetivo maior relaciona-se à sua sobrevivência. A

ativação desse arsenal bioquímico ocorre por meio de sucessivos eventos e

sinais que têm início com o processo de reconhecimento pela planta do agente

invasor ativando respostas de defesa que podem ser físicas e/ou químicas, a

depender da via metabólica ativada.

Dentre as principais vias metabólicas utilizadas pelos vegetais no

processo de defesa a fitopatógenos, destacam-se: I. via do ácido xiquímico; II. via

do acetato malonato; III. via do acetato mevalônico e, IV. via dos metabólitos

nitrogenados (Figura 1).

29

Figura 1. Principais vias metabólicas utilizadas pelos vegetais na promoção de respostas de

defesa em plantas a patógenos (TAIZ; ZAIGER, 2009).

As plantas contêm um número muito elevado de compostos aromáticos

que podem surgir por duas vias biossintéticas distintas: pela via de uma cadeia

policetônica que origina os poliacetatos aromáticos e pela via do ácido xiquímico,

composto que constitui um intermediário chave no processo. O ácido xiquímico foi

isolado pela primeira vez em 1886, e o seu nome deriva da planta japonesa de

onde foi extraído, Shikimi-no-ki (Illicium religiosum) (LOBO; LOURENÇO, 2007). É

a principal rota metabólica em plantas superiores (DIXON; PAVIA, 1995) (Figura

2). Ocorre em plastídios e há evidências de que também está presente no citosol

(HRAZDINA; JENSEN, 1992). O ácido xiquímico é um intermediário chave na

biossíntese de aminoácidos aromáticos essenciais, tais como a fenilalanina, a

tirosina, o triptofano, e ainda outros produtos aromáticos importantes. O esquema

biossintético para a formação do ácido xiquímico envolve a adição de uma

molécula de fosfoenolpiruvato a um açúcar, a eritrose - 4 - fosfato, para originar

um derivado do ácido com 7 carbonos, o 3 - desoxi - D - arabinose -

heptulosonato - 7 - fosfato (DAHP). Em seguida forma-se o 3 - d - hidroxiquimato

http://ecoport.org/ep?SearchType=reference&ReferenceID=552221

30

e, finalmente, a redução do carbonilo a álcool produz o xiquimato (LOBO;

LOURENÇO, 2007). Herrmann (1995) considera que, na realidade, o produto final

desta rota seria o corismato, último precursor comum destes aminoácidos, cujas

três rotas terminais de biossíntese usam este composto como primeiro substrato.

Figura 2. A rota do xiquimato. A abreviações shkA e shkH são propostas para os tipos selvagens

de genes que codificam as enzimas da rota do xiquimato em plantas superiores (HERRMANN,

1995).

No complexo universo da sinalização celular e produção de compostos

que resultam na ativação de respostas de defesa em plantas ao ataque de

patógenos, a via do acetato malonato desempenha importante papel ao sintetizar

compostos poliacetilenos e ainda, atuar na via dos fenilpropanóides. Os

poliacetilenos são derivados da via do acetato-malonato e estão deste modo,

relacionados com os ácidos graxos, nomeadamente nas reações iniciais desta via

biossintética (SEIGLER, 1998).

Na biossíntese da via do acetato malonato, os fenóis formam-se pela

condensação cabeça-cauda de quatro unidades de acetato, observando-se após

http://ecoport.org/ep?SearchType=reference&ReferenceID=552219

31

a ciclização, reações de descarboxilação, redução e oxidação. As substâncias

assim obtidas são meta-hidroxiladas e originam novos produtos (MANN, 1996).

Os terpenos, também denominados terpenóides, constituem um largo

grupo de metabólitos naturais, sendo conhecidos mais de 36.000 terpenóides

individuais (LUCKER, 2002). A grande diversidade de terpenos deve-se à grande

variabilidade das suas estruturas e de grupos funcionais, pois todos derivam de

uma única molécula constituída por cinco carbonos, o isopentenil difosfato (IP) a

partir da qual, se originam vários compostos de duas ou mais unidades em C5

(CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000).

O mevalonato é assim formado pela condensação de uma unidade do

acetoacetil-CoA com uma de acetil-CoA. A polimerização do mevalonato vai

originar consequentemente, moléculas de cadeias carbonadas crescentes cuja

biossíntese é empregada para explicar a origem biogenética de terpenos voláteis

em plantas (DEWICK, 2002).

Os terpenos estão envolvidos em importantes processos fisiológicos

como a fotossíntese, o transporte de elétrons, a arquitetura da membrana celular

e regulação do desenvolvimento celular, podendo ainda, ter funções mais

especializadas na defesa como a produção de algumas fitoalexinas e reprodução

dos vegetais ao atuar na atração de polinizadores e de animais dispersores de

sementes (LUCKER, 2002).

32

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44

Capítulo II

Indução de fitoalexinas em sorgo em resposta

a extrato de Allamanda blanchetti A. DC.

45

INDUÇÃO DE FITOALEXINAS EM SORGO EM RESPOSTA A EXTRATO DE

Allamanda blanchetti A. DC.

Erbs Cintra de Souza Gomes1*; Luciana Cordeiro do Nascimento1; Leonardo

Sousa Cavalcanti2







GOMES, E.C.S.; NASCIMENTO, L.C.; CAVALCANTI, L.S. Indução de

fitoalexinas em sorgo em resposta a extrato de Allamanda blanchetti A. DC.

RESUMO Dentre os principais indicadores observados em plantas com potencial de uso no manejo de doenças, a indução de fitoalexinas destaca-se pela reconhecida atividade sobre fungos. Objetivou-se com este trabalho, avaliar o potencial de extrato etanólico de Allamanda blanchetti em ativar a produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo. Foram preparados extratos de folhas a quente em aparelho Soxhlet e a frio. Sementes de sorgo „Brandes‟ foram desisfestadas em hipoclorito de sódio 1% por 15 min, lavadas e enroladas em papel de germinação, sendo incubadas em escuro total a 25 ºC ± 5 por quatro dias. Em seguida os mesocótilos foram excisados 5 mm acima do nó escutelar e colocados em tubos de ensaio contendo 1 mL de extrato Abq 10 ppm, Abq 100 ppm, Abq 500 ppm, Abq 1000 ppm, Ab 10 ppm, Ab 100 ppm, Ab 500 ppm, Ab 1000 ppm, ASM (200 mg.L-1) e água destilada, com 10 repetições. Os tubos foram mantidos em câmara úmida por 60h. Ao final, descartou-se 5 mm basais de cada mesocótilo. A porção superior excetuando-se as folhas foi pesada, cortada e colocada em microtubos contendo 1,4 mL de metanol 80% acidificado 0,1% HCl v/v a 4° C por 96h, sendo a absorbância determinada a 480nm. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. O acúmulo de fitoalexinas 3-deoxiantocianidinas foi maior nas concentrações 1000 ppm a quente, 10, 100, 500 e 1000 ppm a frio e no indutor comercial acibenzolar-S-metil (200 g . L-1). O extrato etanólico de A. blanchetti independente do método de extração induziu a síntese de fitoalexinas 3-deoxiantocianidinas em sorgo. Palavras-chave: Sorghum bicolor, deoxiantocianidinas, indução de resistência.

46

GOMES, E.C.S.; NASCIMENTO, L.C.; CAVALCANTI, L.S. Induction of phytoalexins in Sorghum in response to the Allamanda blanchetti A. DC. extract

ABSTRACT

Among the main indicators observed in plants with potential use on disease management, phytoalexins induction has recognized activity against fungi. The objective of this study was to evaluate the potential of ethanol extract of Allamanda blanchetti on phytoalexins production in sorghum mesocotyl. Leaf extracts were prepared as hot and cold on solvent. Sorghum seeds „Brandes‟ were desinfested in 1% sodium hypochlorite for 15 min, rinsed and incubated in germination paper, in total darkness at 25 °C ± 5 for four days. The mesocotyl was excised 5 mm above the scutellar node and placed in test tubes containing 1 mL of 10 ppm extract Abq 10 ppm, Abq 100 ppm, Abq 500 ppm, Abq 1000 ppm, Ab 10 ppm, Ab 100 ppm, Ab 500 ppm, Ab 1000 ppm, ASM (200 mg.L-¹) and distilled water with 10 replications. The tubes were kept in a moist chamber for 60h. At the end, it was discarded 5 mm basal of each mesocotyl. The upper portion, except for the leaves, was weighed, sliced and placed in microtubes containing 1.4 mL of acidified 80% methanol 0.1% HCl v/v to 4 °C for 96h, and the absorbance measured at 480nm. The experimental design was completely randomized. Phytoalexin 3-deoxiantocianidins accumulation was higher in concentrations of 1000 ppm hot, 10, 100, 500 and 1000 ppm in the cold and inducer acibenzolar-S-methyl (200 g. L-¹). The ethanol extract of A. blanchetti independent of extraction method induced phytoalexin synthesis in sorghum 3-deoxiantocianidinas. Keywords: Sorghum bicolor, deoxiantocianidins, induction of resistance.

47

1. INTRODUÇÃO

A demanda mundial por alimentos mais saudáveis, isentos de resíduos

tóxicos e com baixo risco de contaminação para o homem e o meio ambiente é

crescente nos últimos anos e, com isso, vários estudos vem sendo realizados

utilizando métodos alternativos de controle de fitopatógenos (MOTOYAMA et al.,

2003; RODRIGUES et al., 2007; COLPAS et al., 2009).

Para combater os problemas de sanidade vegetal e os riscos para o

homem e o meio ambiente, diversos acordos internacionais já foram firmados. O

objetivo destes é impedir a propagação das pragas que ameaçam as culturas e os

produtos vegetais, estimular boas práticas de manejo dos agroquímicos e conferir

aos países importadores o poder para decidir se querem ou não receber no seu

território determinados produtos químicos interditos ou severamente restringidos

(FAO, 2011).

O método mais utilizado para a proteção de plantas contra patógenos é o

da resistência genética (LYON et al., 1995). No entanto, nem todas as plantas

apresentam resistência significativa a patógenos e nem todo material resistente é

adaptado às diferentes regiões, o que favorece a adoção contínua de práticas de

controle químico no manejo de doenças. Dentre as principais técnicas de controle

alternativo, o controle biológico, a indução de resistência em plantas e o uso de

produtos naturais em substituição ao controle químico, como óleos essenciais

(STANGARLIN et al. 1999) e extratos vegetais (RESENDE et al. 2007) são

utilizados no manejo de patógenos apresentando resultados promissores.

A indução de resistência é conceituada como um aumento da capacidade

de defesa das plantas a fim de mobilizar respostas antes ou após o ataque de

patógenos (BAKKER; PIETERSE; VAN LOON, 2007) com a utilização de um

elicitor de origem biótica e/ ou abiótica. Sob o aspecto fisiológico, a resistência de

um hospedeiro a um microrganismo patogênico pode ser definida como a

capacidade da planta de atrasar ou evitar a entrada e/ou subsequente atividade

dos patógenos em seus tecidos (GOODMAN; KIRALY; WOOD, 1986). Isso ocorre

tanto por sua ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e a

germinação de esporos, quanto pela capacidade de induzir o acúmulo de

48

fitoalexinas, indicando a presença de moléculas com características elicitoras

(BONALDO et al., 2004).

Allamanda blanchetti A. DC., pertence a família Apocynaceae, com cerca

de 250 gêneros e 2000 espécies de árvores tropicais, arbustos e trepadeiras.

Uma das principais características desta família é que todas as espécies

produzem seiva leitosa. Na medicina popular são usadas para tratar doenças

gastrointestinais, febre, malária, dor e diabetes (WIART, 2006). Para Coppen

(1983), plantas do gênero Allamanda apresentam uma vasta atividade biológica,

inclusive contra algas. Há registros de compostos antifúngicos (TIWARI;

PANDEY; DUBEY, 2002) e atividade antitumoral sobre células em cultura

(NAVARRO SCHMIDT et al. 2006). Para Anderson et al. (1988), plantas do

gênero Allamanda são reconhecidas pela produção de princípios ativos, dentre os

quais se destacam os iridóides. Estes por sua vez, são substâncias

monoterpenóidicas formadas por uma ciclização alternativa do pirofosfato de

geranila (SAMPAIO-SANTOS; KAPLAN, 2001). A ampla diversidade de atividades

biológicas observada pelos iridóides (SILVA, 2000) tem estimulado o interesse em

métodos para o seu isolamento e determinação.

Essa diversidade de metabólitos pode representar amplo potencial para a

utilização de substâncias bioativas a partir de extratos de plantas através da ação

elicitora de rotas de defesa com a ativação de fitoalexinas. Mais de 300

fitoalexinas já foram caracterizadas entre diferentes classes de compostos

químicos como cumarinas, diterpenos e flavonóides, entre outras, e tem sido

identificada em mais de 20 famílias botânicas (SNYDER; NICHOLSON, 1990).

As fitoalexinas são metabólitos secundários, definidos como compostos

antimicrobianos de baixo peso molecular. São produzidas pelas plantas em

resposta a estresses físicos, químicos ou biológicos. O modo de ação das

fitoalexinas sobre fungos inclui granulação citoplasmática, desorganização dos

conteúdos celulares, ruptura da membrana plasmática e inibição de enzimas

fúngicas. Esses efeitos refletem-se na inibição da germinação, elongação do tubo

germinativo e redução ou inibição do crescimento micelial (CAVALCANTI et al.,

2005).

49

Em sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) são reconhecidas quatro

fitoalexinas flavonóides 3-deoxiantocianidinas: luteolinidina, 5-metoxiluteolinidina,

apigeninidina e éster do ácido caféico de arabinisol 5-o-apigeninidina

(NICHOLSON et al., 1988). Para Stangarlin et al. (1999), bioensaios com

mesocótilos estiolados de sorgo são ferramentas importantes para avaliar o efeito

elicitor de um tratamento.

Assim, tendo em vista que o estudo e a síntese de fitoalexinas possibilita a

abertura de novas perspectivas para a descoberta de produtos naturais com

reconhecida capacidade elicitora de respostas de defesa em plantas a patógenos,

objetivou-se com este trabalho avaliar o potencial de extrato etanólico de A.

blanchetti A. DC. em ativar mecanismos de defesa em plantas por meio da

produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Laboratório de Química Orgânica e

Bioquímica Vegetal da Universidade Federal do Vale do São Francisco

(UNIVASF), Campus Juazeiro, Juazeiro, BA.

Folhas de A. blanchetti foram coletadas em plantas nativas no distrito de

Caboclo, situado a 8º47‟88”S e 40º93‟79”W, município de Afrânio, PE. Após a

coleta, as amostras foram acondicionadas como exsicatas e identificadas com

numeração específica para controle interno. O material foi transportado ao Centro

de Referência para a Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD)

para posterior identificação, catalogação e depósito do material vegetal no

Herbário do Vale do São Francisco (HVASF). As folhas coletadas para

preparação dos extratos foram secas em estufa a temperatura constante de 40 ºC

até a obtenção de peso contínuo (≈ 72h). Posteriormente foram trituradas em

moinho de faca e o triturado armazenado a temperatura ambiente (25 ºC ± 5).

2.1 Preparo dos extratos de A. blanchetti

Para a obtenção dos compostos foram utilizados dois métodos de

extração: a quente para o qual se empregou aparelho Soxhlet (Abq) e a frio onde

50

o triturado seco foi colocado em contato com o solvente por 72 h (Ab). No método

de extração a quente, uma porção de ≈ 30 g do triturado seco de A. blanchetti foi

submetida à extração com solvente etanol absoluto, em um procedimento cíclico

durante 36 h à temperatura ambiente de 25 ºC ± 5. Para a extração a frio, utilizou-

se uma porção de ≈ 150 g de pó seco imerso em etanol absoluto por 72h a

temperatura ambiente 25 ºC ± 5. Para a utilização dos compostos obtidos, o

etanol absoluto foi extraído por meio de evaporador rotativo por 2h a 78 ºC.

2.2 Bioensaios para produção de fitoalexinas em mesocótilos de

sorgo

A utilização dos extratos deu-se de forma separada, a partir do método de

extração: a quente e a frio. As concentrações utilizadas foram 10, 100, 500 e 1000

ppm. Como testemunhas foram utilizadas água destilada e esterilizada e o

ativador de defesas em plantas acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg . L-1)

(OSSWALD et al., 2004).

Sementes de sorgo cv. Brandes foram desinfestadas em hipoclorito de

sódio 1% por 15 min e lavadas em água destilada. Após esse período foram

postas para germinar em papel de germinação umedecido com água destilada e

incubadas em escuro total a 25 ºC ± 5 por quatro dias. Em seguida as plântulas

formadas foram inicialmente expostas à luz por quatro horas para paralisar a

elongação dos mesocótilos. Para o teste de produção de fitoalexinas, os

mesocótilos foram excisados 5 mm acima do nó escutelar e colocados em tubos

de ensaio na razão de um mesocótilo por tubo, contendo uma aliquota de 1 mL de

cada concentração/tratamento. Os tubos de ensaio abertos foram mantidos em

câmara úmida a 25 ºC ± 5 sob luz fluorescente (WULFF; PASCHOLATI, 1999).

Após 60 h, 5 mm basais de cada mesocótilo foram excisados e descartados. A

porção superior, excetuando-se as folhas, foi pesada, cortada em pequenos

segmentos e colocadas em microtubos contendo 1,4 mL de metanol 80%

acidificado 0,1% HCl, v/v. Os mesocótilos cortados foram mantidos a 4 °C em

metanol por 96 h para extração dos pigmentos e a absorbância determinada em

espectrofotômetro a 480 nm (NICHOLSON et al., 1988).

51

2.3 Delineamento experimental

O delineamento experimental foi interiamente casualizado com 10

tratamentos: T1 - Abq 10 ppm; T2 - Abq 100 ppm; T3 - Abq 500 ppm; T4 - Abq

1000 ppm; T5 Ab - 10 ppm; T6 - Ab 500 ppm; T7 - Ab 500 ppm; T8 - Ab 1000

ppm; T9 - ASM (200 mg.L-1; T10 - testemunha negativa (água destilada) e 10

repetições sendo um tubo de ensaio por repetição. Os dados observados foram

submetidos à análise de variância e análise de regressão. As médias dos

tratamentos comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade

(FERREIRA, 2000).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir das concentrações e dos métodos de extração de A. blanchetti a

quente e a frio, os resultados observados apresentaram significância pelo teste F,

em nível de 1% de probabilidade para a capacidade de indução de produção de

fitoalexinas em sorgo. Independente da concentração e do método de extração

observou-se a produção de fitoalexinas 3-deoxiantocianidinas em mesocótilo de

sorgo (Figura 1) diferindo da testemunha negativa.

0

4

8

12

16

20

Testemunha Abq 10 Abq 100 Abq 500 Abq 1000 Ab 10 Ab 100 Ab 500 Ab 1000 ASM

*Tratamentos

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma p

or

folh

a

Figura 1. Produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo submetidos ao tratamento com

extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto

comercial acibenzolar-S-metil (ASM) e testemunha - água destilada e esterilizada. Concentrações

utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab), e 200 mg.L-1

(ASM), respectivamente.

b b b

a

a a a

a a

c

52

Esse efeito foi caracterizado pelo aumento da atividade de fitoalexinas

observado nas concentrações dose dependente tanto para a extração a quente como

para a extração a frio. Nas concentrações avaliadas, apenas a concentração 1000 ppm

extraída a quente apresentou resultados semelhantes às concentrações de extrato a frio

e ao acibenzolar-S-metil.

Houve diferenças entre as concentrações comparando-se o método de extração.

Nas concentrações 10, 100 e 500 ppm extraídas a quente, o acúmulo de 3-

deoxiantocianidinas foi aproximadamente 3 vezes inferior às mesmas concentrações

extraídas a frio, e sempre maior do que a testemunha negativa. Houve um pico de

acúmulo de fitoalexinas na concentração de 1000 ppm a quente com resultados

semelhantes às concentrações a frio de 10, 100, 500 e 1000 ppm, e ao produto comercial

ASM. A capacidade de extração dos metabólitos pelos diferentes métodos é indicativo de

que as substâncias elicitoras de indução presentes no extrato estão relacionadas com a

sua maior concentração. BONALDO et al., (2004) utilizando diferentes concentrações de

extrato de eucalipto, demonstraram que a produção de fitoalexinas 3-deoxiantocianidinas

em mesocótilos de sorgo foi mais expressiva nas concentrações acima de 10%.

Para Maul (1999) os métodos convencionais de extração à baixa pressão como

a hidrodestilação ou a extração em aparelho Soxhlet mostram-se eficazes. No entanto,

apresentaram desvantagens como o grande volume de solvente orgânico utilizado, o

tempo de processo e a contaminação do extrato por resíduos do solvente. Outro fator

negativo apontado é a possibilidade de degradação térmica dos extratos com perda de

substâncias.

Segundo Souza (2004), quando o tempo em que o extrato passa em contato

com temperaturas elevadas é pequeno, aumenta-se a capacidade de utilização de

substâncias sensíveis ao calor. Isso demonstra que, possivelmente, para as

concentrações 10, 100 e 500 ppm extraídos a quente, ocorreram maiores perdas de

substâncias sensíveis ao calor.

As regressões realizadas demonstram haver efeito das concentrações dose

dependente, sendo que, tanto para extração a quente (R2 = 0,7931) como para extração

a frio (R2 = 0,847) os coeficientes de determinação observados indicam a significância

dos testes (Figura 2 - A e B).

53

y = 0,0101x + 2,2178

R2 = 0,7931

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Concentração do extrato Allamanda blanchetti a quente (ppm)

Ab

so

rbân

cia

480 n

m

gra

ma p

or

folh

a

y = 3E-06x2 - 0,0007x + 12,256

R2 = 0,847

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Concentração do extrato Allamanda blanchetti a frio(ppm)

Ab

so

rbân

cia

480 n

m

gra

ma p

or

folh

a

Figura 2. Produção de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo submetidos ao tratamento com

extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (em aparelho Soxhlet por 36 h),

a frio (pó seco em contato com o solvente por 72 h).

Em pitangueira (Eugenia uniflora L.) e em diversas espécies como

cânfora (Artemisia camphorata Vill.), poejo (Mentha pulegium L.), romã (Punica

granatum L.) e cardo-santo (Cynara scolymus L.), também foi observado maior

síntese de fitoalexinas em concentrações mais elevadas desses extratos

(STANGARLIN et al., 1999). Motoyama et al. (2003) observaram que extrato

cítrico, além de apresentar atividade antifúngica in vitro contra os fungos

A

B

http://www.plantamed.com.br/plantaservas/especies/Cynara_scolymus.htm

54

Colletotrichum lagenarium e Fusarium semitectum, induziram sensivelmente a

síntese de fitoalexinas em mesocótilos de sorgo.

Uma avaliação conjunta dos resultados nos permite afirmar que extrato de

A. blanchetti extraído tanto a quente como a frio apresentam potencial de

utilização no controle alternativo de fitopatógenos. A forma de extração a frio

possibilitou um rendimento maior de fitoalexinas, uma vez que nas menores

concentrações foram observados resultados semelhantes ao controle positivo

(produto comercial ASM). Outra possibilidade evidente é a utilização das

substâncias elicitoras presentes no extrato a partir do isolamento industrial,

permitindo assim, o desenvolvimento de produtos naturais com baixo risco de

contaminação do homem e dos agroecossistemas cultivados.

4. CONCLUSÕES

O extrato etanólico de A. blanchetti, independente do método de extração

induziu a síntese de fitoalexinas 3-deoxiantocianidinas em sorgo.

55

5. REFERÊNCIAS

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59

Capítulo III

Ativação de respostas de defesa em videira

‘Superior Seedless’ contra Uncinula necator

por extrato de Allamanda blanchetti e

acibenzolar-S-metil

60

ATIVAÇÃO DE RESPOSTAS DE DEFESA EM VIDEIRA ‘SUPERIOR

SEEDLESS’ CONTRA Uncinula necator POR EXTRATO DE Allamanda

blanchetti E ACIBENZOLAR-S-METIL

Erbs Cintra de Souza Gomes1*; Luciana Cordeiro do Nascimento1; Leonardo

Sousa Cavalcanti2







GOMES, E.C.S.; NASCIMENTO, L.C.; CAVALCANTI, L.S. Ativação de respostas

de defesa em videira „Superior Seedless‟ contra Uncinula necator por extrato de

Allamanda blanchetti e acibenzolar-S-metil

RESUMO

A demanda mundial por alimentos isentos de resíduos tóxicos é cada vez maior. Tendo em vista que o uso de extratos vegetais constitui-se em tecnologia promissora no manejo de doenças na agricultura, objetivou-se com este trabalho avaliar a eficiência do extrato etanólico de Allamanda blanchetti no manejo do oídio causado por Uncinula necator em videiras „Superior Seedless‟, bem como a expressão das enzimas fenilalanina amônia-liase, peroxidases e β-1,3-glucanase. Plantas de videira foram pulverizadas com extrato de A. blanchetti a quente com extração em aparelho Soxhlet e a frio nas concentrações 10, 100, 500 e 1000 ppm, acibenzolar-S-metil (200 mg.L-1), agroquímico metyran + pyraclostrobin (2kg.ha-1) e mancozeb + metalaxyl-M (250g.ha-1) e testemunha negativa pulverizada com água destilada. Determinou-se a incidência da doença através de avaliações semanais. A atividade enzimática foi avaliada nos tempos 0, 24, 48, 96 e 192h após a primeira pulverização. A evolução da doença em discos de folhas foi avaliada 96h após a primeira pulverização e 14 dias após o desafio com o patógeno. Extrato etanólico de A. blanchetti a quente e a frio conferiram níveis significativos de controle de U. necator em condições de campo e em discos de folhas. Extrato a frio 1000 ppm e ASM conferiram maior capacidade de defesa de plantas de videira „S. Seedless‟ a U. necator. ASM promoveu o aumento na atividade das enzimas peroxidases e fenilalanina amônia-liase. Extrato a frio 1000 ppm promoveu o aumento na atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase, peroxidases, e β-1,3-glucanase. Palavras-chave: Indução de resistência, mecanismos induzidos, oídio da videira.

61

GOMES, E.C.S.; NASCIMENTO, L.C.; CAVALCANTI, L.S. Activation of defense

responses in grapevine 'Superior Seedless' against Uncinula necator by extract of

Allamanda blanchett and acibenzolar-S-methyl

ABSTRACT

Global demand for food without pesticides is increasing year after year. Considering that the use of plant extracts is a promising technology diseases management in agriculture, the objective of this work was to evaluate the efficiency of the ethanol extract of Allamanda blanchetti on powdery mildew caused by Uncinula necator management on vines „Superior Seedless‟, A as well as the expression of phenylalanine ammonia-lyase, peroxidases and β-1,3-glucanase enzymes. Vine plants were sprayed with A. blanchetti extracts ,hot and cold, on solvent concentrations at 10, 100, 500 and 1000 ppm, acibenzolar-S-methyl (200 mg.L-¹), fungicide metyran + pyraclostrobin (2kg.ha-¹) and metalaxyl + mancozeb -M (250g.ha-¹) and negative control with distilled water. It was determined the incidence of disease through weekly evaluations. The enzyme activity was measured at 0, 24, 48, 96 and 192h after the first spraying. Disease evolution on leaf discs was assessed 96h after the first spray and 14 days after challenge with the pathogen. Ethanol extract of A. blanchetti, hot and cold, showed significant levels of control of U. necator on field and in leaf discs. Cold extract 1000 ppm and ASM conferred higher ability to protect grapevine „S. Seedless‟ U. necator. ASM promoted increase in activity of oxidative enzymes and phenylalanine ammonia-lyase. Cold extract 1000 ppm promoted increase activity of phenylalanine ammonia-lyase, peroxidases and β,1,3-glucanase. Keywords: Induction of resistance mechanisms induced, powdery mildew of grapevine.

62

1. INTRODUÇÃO

Dentre as fruteiras cultivadas no mundo, a videira (Vitis sp.) apresenta-se

como uma das mais economicamente importantes devido às inúmeras utilizações

de seus frutos para consumo in natura e processamento (POMMER; MAIA, 2003).

No Brasil, a área total de videiras em 2009 foi de 81.677 ha, com produção de

1.365.491 t e produtividade média por região produtora de 25,58 t.ha-1 na região

Nordeste, 16,39 t.ha-1 no Sudeste e 15,37 t.ha-1 na região Sul (IBGE, 2011).

Nos últimos anos, viticultores preocuparam-se em diversificar a produção

vinícola com a introdução de novas variedades, não somente para evitar a

saturação do mercado com a oferta exclusiva de uva „Itália‟ (GRANGEIRO; LEÃO;

SOARES, 2002), mas também, para atender às novas exigências do consumidor

em nível mundial de frutas frescas que inclina-se, para a produção de uvas

apirênicas (SILVA; CORREIA, 2011).

Para atender à crescente demanda mundial por uvas apirênicas,

produtores da região do Vale do Submédio São Francisco (VSF) iniciaram o

cultivo comercial de uvas sem sementes, com destaque para a variedade

„Superior Seedless‟ conhecida na região como „Festival‟ (GRANGEIRO; LEÃO;

SOARES, 2002).

Segundo Araújo (2011) uvas apirênicas vêm conquistando consumidores

europeus gerando uma demanda cada vez maior por estas variedades. No

entanto, apesar de já representarem ¼ do total de uvas finas de mesa exportadas

pelo VSF, com aproximadamente 9.000 t das 36.000 t comercializadas no

mercado externo (EMBRAPA, 2011a), a produção brasileira ainda é incipiente.

Não obstante à realidade das principais regiões produtoras de videiras no

mundo, o VSF enfrenta sérios problemas de ordem fitossanitária, gerando

prejuízos significativos à cultura (GOMES; PEREZ; BARBOSA, 2009). Há relatos

de prejuízos causados por diferentes patógenos na viticultura (TAVARES; LIMA;

MELO, 2000; GOMES et al., 2007; GOMES; PEREZ; BARBOSA, 2009;

CAMARGO et al., 2011), com destaque para o oídio [(Uncinula necator

(SCHWEIN; BURR.)] e o míldio [(Plasmopara viticola) BERK.; CURT. (BERL.; DE

TONI)] (TAVARES; LIMA; MELO, 2000).

63

O oídio causado por Uncinula necator é a doença de maior importância

econômica da videira em nível mundial (GODFREY; ABLE; DRY, 2007). O fungo

é um patógeno biotrófico que invade as células epidérmicas do hospedeiro,

causando infecção nos tecidos da videira, caracterizada por uma sequência de

eventos distintos em um espaço de tempo determinado (LEINHOS et al., 1997).

U. necator infecta toda a parte aérea da planta, incluindo folhas, caules,

inflorescências e frutos, com sintomas observados ao longo do ciclo da cultura,

em decorrência das diferentes fases fenológicas (FALACY et al., 2007). O

potencial de infecção por oídio em parreirais é tão significativo que pode persistir

durante o ciclo da cultura, evoluindo rapidamente de infecção primária à

secundária, em decorrência das condições epidemiológicas. Trata-se de uma

doença policíclica que tem como principais agentes dispersantes dos conídios a

água das chuvas e o vento (WILLOCQUET; CLERJEAU, 1998).

O controle químico realizado por meio da aplicação de fungicidas é o mais

empregado no controle da doença em virtude do seu efeito rápido. Entretanto

alguns problemas quanto ao uso indiscriminado, ou a não alternância dos

produtos aplicados podem induzir a resistência de patógenos aos fungicidas

(TAVARES; LIMA; MELO, 2000).

Dentre os métodos alternativos ao controle químico, estudos incluem a

busca de fungicidas naturais principalmente à base de extratos vegetais

(BASTOS, 1997) e a resistência induzida (WALTERS; FOUNTAINE, 2009). A

utilização de extrato bruto ou óleos essenciais com propriedades antimicrobianas

tem sido frequentemente empregada com sucesso no controle de agentes

fitopatogênicos (FIORI et al., 2000; BALBI-PEÑA et al., 2006; ROZWALKA et al.,

2008). Quanto ao complexo mecanismo de defesa de células vegetais contra

patógenos, Nojosa; Resende; Resende (2005) afirmaram que a resistência

induzida em plantas a patógenos pode ser ativada por uma série de substâncias

que evitam ou atrasam a entrada e/ou subsequente atividade do patógeno em

seus tecidos.

Sobre os produtos comercialmente utilizados como indutores de

resistência, Gorlach et al. (1996) relataram pela primeira vez os efeitos de um

novo composto químico pertencente à classe química BTH (benzothiadiazole), o

64

acibenzolar-S-Metil, protegendo sistemicamente plantas de trigo contra o ataque

de oídio. Atualmente, muitos outros produtos já estão disponíveis no mercado ou

em fase de pesquisa (RESENDE et al., 2006).

A ativação de enzimas reconhecidamente envolvidas no processo de

indução de resistência em plantas a patógenos constitui-se em importante

ferramenta para elucidar as rotas bioquímicas ativadas pelo elicitor. Neste

cenário, as proteínas relacionadas à patogênese de plantas (proteínas-RP), que

englobam famílias de proteínas com características variadas (quitinases, β-1,3-

glucanase, lisozimas, peroxidases, dentre outras), mas com o fato em comum de

estarem relacionadas aos processos de defesa durante a patogênese,

apresentam potencial para exploração em programas de indução de resistência

em plantas (VAN LOON; VAN STRIEN, 1999).

Neste sentido, tendo em vista que o uso de extratos vegetais constitui-se

em tecnologia promissora no manejo de doenças na agricultura, e ainda, visando

elucidar eventos bioquímicos envolvidos na interação elicitor vs planta, objetivou-

se com este trabalho avaliar a eficiência da utilização foliar de extrato etanólico de

Allamanda blanchetti A. DC. no manejo do oídio em videiras „Superior Seedless‟

no Vale do Submédio São Francisco, bem como elucidar os mecanismos de ação

envolvidos, com base na atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase,

peroxidases e β-1,3-glucanase.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Preparo e obtenção do extrato de folhas de Allamanda blanchetti

Folhas de A. blanchetti foram coletadas em plantas nativas da área rural

do distrito de Caboclo, situado a 8º47‟88”S e 40º93‟79”W, município de Afrânio,

PE. Após a coleta, as amostras foram acondicionadas como exsicatas e

identificadas com numeração específica para controle interno. O material foi

transportado ao Centro de Referência para a Recuperação de Áreas Degradadas

da Caatinga (CRAD) para posterior identificação, catalogação e depósito do

material vegetal no Herbário do Vale do São Francisco (HVASF).

65

As folhas coletadas para preparação dos extratos foram transportadas ao

Laboratório de Química Orgânica e Bioquímica Vegetal da Universidade Federal

do Vale do São Francisco (UNIVASF) para secagem em estufa à temperatura

constante de 40 ºC até a obtenção de peso contínuo (≈ 72h). Posteriormente,

foram trituradas em moinho de faca e o triturado armazenado em sacos de

polietileno à temperatura ambiente (25 ºC ± 5).

Para a obtenção dos compostos foram utilizados dois métodos de

extração: a quente, para o qual se empregou aparelho Soxhlet (Abq) e a frio onde

o triturado seco foi colocado em contato com o solvente por 72 h (Ab). No método

de extração a quente uma porção de ≈ 30 g do triturado seco de A. blanchetti foi

submetida à extração com solvente etanol absoluto, em um procedimento cíclico

durante 36 h à temperatura ambiente de 25 ºC ± 5. Para a extração a frio, utilizou-

se uma porção de ≈ 150 g de pó seco imerso em etanol absoluto por 72h a

temperatura ambiente 25 ºC ± 5. Para a utilização dos compostos obtidos, o

etanol absoluto foi extraído por meio de evaporador rotativo por 2h a 78 ºC. A

aplicação foi realizada separadamente a partir do método de extração.

2.2 Progresso da doença em discos de folhas

Decorridas 96 horas da primeira pulverização, folhas de videira „Superior

Seedless‟ foram coletadas, identificadas por tratamento, acondicionadas em

caixas isotérmicas e levadas ao Laboratório de Química Orgânica e Bioquímica

Vegetal da UNIVASF. Para desinfestação, as folhas foram imersas em solução de

hipoclorito de sódio a 5%, e posteriormente lavadas em água destilada. Cinco

discos de folhas de aproximadamente 3 mm de diâmetros foram retirados com

auxílio de um perfurador manual, depositados em placas de Petri contendo papel

de germinação e umedecidos com água destilada. Posteriormente, os discos de

folhas receberam uma suspensão de esporos de U. necator na concentração de

1x105 conídios. Após a inoculação as placas foram mantidas em temperatura

ambiente (25 ºC ± 5) por 14 dias com alternância luminosa de 12h de claro e

escuro.

A severidade da doença foi avaliada ao final do período de 14 dias,

avaliando-se o tamanho das lesões presentes na superfície foliar de cada disco

66

de folha. Os dados observados foram transformados para porcentagem de

doença através do índice de doença (ID) de McKinney (1923). O delineamento

experimental foi em blocos ao acaso, composto por 11 tratamentos e cinco

repetições. Cada parcela útil foi composta por cinco discos de folhas.

2.3 Experimento em campo

O experimento foi conduzido entre os meses de junho a setembro de 2010, no

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Sertão Pernambucano (IF SERTÃO-

PE), Campus Petrolina Zona Rural, situado a 9º33‟60”S e 40 º69‟10”W, a 418 m de

altitude.

A variedade de videira utilizada foi a „Superior Seedless‟, conduzida em sistema

de latada com espaçamento 2,5 x 2,5 m. Durante o experimento observou-se índice

pluviométrico médio de 7,2 mm, com temperatura média de 24,6 ºC ± 6 e umidade

relativa 60% ± 9 ao mês.

O delineamento experimental em blocos ao acaso com dois métodos de

extração: a quente e a frio, quatro concentrações 10, 100, 500 e 1000 ppm, ASM (200

mg.L-1), agroquímico metyran + pyraclostrobin (2kg.ha-1) e mancozeb + metalaxyl-M

(250g.ha-1) e testemunha negativa, em três repetições com cinco plantas por parcela.

Para os extratos e ASM foram realizadas 12 pulverizações ao longo do ciclo. Plantas

tratadas com agroquímicos foram pulverizadas com intervalos de 30 dias totalizando três

aplicações ao longo do ciclo. As pulverizações foram iniciadas 20 dias após a poda.

Utilizou-se pulverizador costal manual (Jacto modelo PJH) com 20L de capacidade

máxima, pressão variada com a máxima de 6kgf/cm3, bico de jato de cone.

2.3.1 Determinação da incidência da doença

As avaliações do oídio da videira foram realizadas semanalmente ao longo do

ciclo da cultura, utilizando-se o método de amostragem de doenças da videira definidas

pela produção integrada de frutas (EMBRAPA, 2011b). Foram avaliadas nove folhas por

planta, sendo três folhas das posições apical, mediana e basal em três ramos por planta.

Foram avaliados três ramos por planta também nas posições apical, mediana e basal. Os

dados foram transformados em % de doença através do Índice de Doença (ID) de

McKinney (1923) e expressos através da área abaixo da curva de progresso da doença

(AACPD).

67

2.4 Caracterização dos mecanismos bioquímicos envolvidos na resposta

de defesa de videiras ‘Superior Seedless’ induzidas por extratos de A. blanchetti

Foram coletadas amostras de folhas nos tempos 0, 24, 48, 96 e 192 h após a

pulverização com os tratamentos para determinação das atividades das enzimas

fenilalanina amônia-liase (FAL), peroxidases e β,1-3,glucanase. Após a coleta, o material

vegetal foi identificado e acondicionado em caixas isotérmicas, transportado ao

Laboratório de Química Orgânica e Bioquímica vegetal da UNIVASF para o preparo dos

extratos foliares. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, com 11

tratamentos: T1 - Abq 10 ppm; T2 - Abq 100 ppm; T3 - Abq 500 ppm; T4 - Abq 1000 ppm;

T5 Ab - 10 ppm; T6 - Ab 500 ppm; T7 - Ab 500 ppm; T8 - Ab 1000 ppm; T9 - ASM (200

mg.L-1); T10 - agroquímico; T11 - testemunha negativa, e três repetições de uma folha

por planta retirada do interior de cada parcela útil.

2.4.1 Extração de proteínas para determinação da atividade de fenilalanina

amônia-liase, peroxidases e β,1-3,glucanase

Amostras de folhas foram pesadas e maceradas em gral de porcelana,

em nitrogênio líquido, adicionando-se 5 mL em tampão acetato de sódio (0,1 M

pH 5,0). Os extratos obtidos foram transferidos para microtubos devidamente

identificados para posterior centrifugação em microcentífuga a 14000 rpm durante

25 minutos, a 4 °C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para

novos microtubos que foram identificados e armazenados até o momento da

análise da atividade enzimática.

Na quantificação da FAL, 250 L de cada amostra foram transferidos para

tubos de ensaio. Adicionou-se 1,0 mL de solução tampão TRIS-EDTA (0,5 M pH

8,5) e 250 µL de solução de L-fenilalanina como substrato a uma concentração

de 300 L.mL-1. A reação foi incubada por 1h a 40 °C em banho-maria. Após esse

período, a reação foi paralisada em banho de gelo, sendo realizada a leitura da

absorbância da reação a 290 nm em espectrofotômetro, com os valores

expressos em g/mL de ácido trans-cinâmico (ALVES et al., 2010).

68

2.4.2 Determinação da atividade enzimática de Peroxidases

O preparo dos extratos foliares foi análogo ao anterior. A atividade de

peroxidases foi determinada pelo método de espectrofotometria direta, pela

medida de conversão do guaiacol em tetraguaiacol a 470 nm. A mistura da reação

continha 1 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M, 250 L de peróxido de

hidrogênio (0,38 M), 50 L de guaiacol e 250 L do extrato protéico. A atividade

de peroxidases foi expressa como atividade específica em unidade de

absorbância. min-1. g de peso fresco.

2.4.3 Determinação da atividade enzimática de β,1-3, glucanase

A atividade de β-1,3-glucanase foi medida pelo aumento dos grupos

redutores de acúcares, usando como substrato a laminarina, sendo que uma

unidade do grupo redutor foi definida como quantidade de enzima capaz de liberar

1mM de glicose em 1 min a 40°C. Na quantificação de β,1-3, glucanase, 150 L

do extrato enzimático e 150 L de tampão acetato de sódio (0,1 M pH 5,0) foram

transferidos para microtubos. Utilizou-se 150 L de Laminarina como substrato a

uma concentração 4,0mg . mL-1. A reação foi incubada por 1h a 40°C em banho-

maria. Após esse período, a reação foi paralisada utilizando-se 200 L de fenol a

5% e 100 L de ácido sulfúrico concentrado. Posteriormente, foram realizadas

leituras em espectrofotômetro a 480 nm e comparadas com padrões de glicose. A

curva padrão de glicose utilizada foi constituída das seguintes concentrações 0, 5,

10, 20, 40, 80, 160 µg.mL-1 (GUIMARÃES et al., 2010).

2.5 Análise estatística

Os dados observados foram submetidos à análise de variância e análise

de regressão. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Scott-

Knott a 5% de probabilidade com auxílio do software estatístico SISVAR

(FERREIRA, 2000).

69

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Progresso da doença em discos de folhas e percentual de controle

Plantas de videira „Superior Seedless‟ pulverizadas com concentrações

de extrato etanólico de A. blanchetti a quente e a frio, 96h antes da inoculação

com U. necator, apresentaram níveis significativos de redução da superfície foliar

lesionada (Tabela 1). O pré-tratamento com extrato de Abq 1000 ppm, induziu

uma redução de aproximadamente 30 vezes na infecção por U. necator

comparada à testemunha negativa pulverizada com água destilada.

Tabela 1. Área lesionada de discos de folhas de videiras „Superior Seedless‟ em resposta a

aplicação de extrato etanólico de Allamanda blanchetti x Uncinula necator. Petrolina,

PE. 2010.

Tratamentos Área lesionada (%)*

Abq 10 ppm 44,01 b

Abq 100 ppm 4,28 c

Abq 500 ppm 49,58 b

Abq 1000 ppm 2,37 c

Ab 10 ppm 45,68 b

Ab 100 ppm 40,44 b

Ab 500 ppm 10,51 c

Ab 1000 ppm 10,68 c

Acibenzolar-S-metil 33,12 b

Testemunha negativa (água destilada) 69,27 a

**Agroquímico 80,36 a

*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (5%). ¹Abq -

Extrato etanólico de Allamanda blanchetti extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial

acibenzolar-S-metil (ASM), agroquímico e testemunha - água destilada e esterilizada.

Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab), 200 mg . L-1

(ASM) e metyran +



), respectivamente.

Os resultados observados em discos de folha indicam a existência de um

pré-condicionamento como componente da resistência sistêmica induzida em

resposta à utilização de extrato de A. blanchetti e ao posterior desafio com o

patógeno. Este fenômeno está associado ao aumento da capacidade da planta

para uma rápida e efetiva ativação das respostas de defesa celular, as quais são

70

induzidas somente após o contato com o patógeno desafiante (CONRATH;

PIETERSE; MAUCH-MANI, 2002), resultando em diferentes níveis de controle.

Em discos de folhas pré-condicionados, os resultados observados indicam

que o fenômeno não é explicado unicamente pela expressão dos mecanismos de

defesa observados (Figuras 3, 4 e 5), e sim pelo aumento da sensibilidade da

planta em perceber a chegada de um patógeno em potencial. Cools e Ishii (2002)

demonstraram que plantas de pepino induzidas com ASM expressaram genes de

peroxidases e proteínas-RP, mas não havia correlação com a expressão de

genes que codificavam para a fenilalanina amônia-liase.

3.2 Curva de progresso de Uncinula necator

Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram haver diferentes

níveis de respostas de defesa entre os tratamentos, com reflexo direto no atraso

dos primeiros sintomas de U. necator em videiras „Superior Seedless‟ (Figura 1).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77

Dias Após a Pulverização

% I

nc

idê

nc

ia

Abq 10 ppm Abq 100 ppm Abq 500 ppm Abq 1000 ppm Ab 10 ppm Ab 100 ppm

Ab 500 ppm Ab 1000 ppm ASM Agroquímico Testemunha

0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90

Dias Após a Poda

% I

nc

idê

nc

ia

Figura 1. Curva de progresso de oídio (Uncinula necator) em videiras „Superior Seedless‟

submetidas ao tratamento com extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente

(Abq), a frio (Ab), produto comercial acibenzolar-S-metil (ASM), agroquímico e testemunha - água

destilada e esterilizada. Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab), 200 mg .

L-1



),

respectivamente.

71

Plantas tratadas com extrato etanólico de A. blanchetti, independente da

concentração e do método de extração utilizado retardaram o surgimento dos

primeiros sintomas do patógeno entre 27 e 34 dias após a poda, diferindo da

testemunha negativa pulverizada com água destilada. Tal fato está relacionado ao

estado de pré-condionamento em que as plantas foram induzidas com a aplicação

do extrato.

Para Conrath; Pieterse; Mauch-Mani (2002) o pré-condionamento

constitui-se de importante componente da resistência sistêmica adquirida. Este

por sua vez, favorece uma super expressão de genes relacionados à defesa de

plantas, promovendo uma resposta eficiente à tentativa de invasão do patógeno

ao tecido vegetal.

3.2.1 Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD)

Através da análise dos dados da área abaixo da curva de progresso da

doença (AACPD) (Figura 2), confirmou-se o maior nível de controle da doença em

plantas tratadas com fungicida, com percentuais superiores a 80% de controle ao

longo de quatro aplicações durante o ciclo da videira.

A incidência de oídio em plantas tratadas com acibenzolar-S-metil (ASM)

e extrato de A. blanchetti a quente (Abq) e a frio (Ab) foram menores do que na

testemunha negativa (P=0,00). Dentre estes, a menor incidência foi observada

nos tratamentos (ASM) e Ab 1000 ppm, conferindo, respectivamente, 61,45 e

62,1% de proteção. No entanto, em todas as concentrações foram observados

níveis superiores a 35% de controle do patógeno.

72

0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça

Testemunha negativa Abq 10 ppm

AACPD = 1348,0 d

% de Controle = 35,9%

0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça


AACPD = 1097,0 c


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça


AACPD = 995,3 c


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça


AACPD = 946,3 c


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça

Testemunha negativa Ab 10 ppm

AACPD = 1350,0 d


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça


AACPD = 1070,3 c


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça


AACPD = 1271,0 d


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça


AACPD = 797,3 b


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça

Testemunha negativa ASM

AACPD = 811,0 b


0

10

20

30

40

50

60

70

20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90 97

Dias Após a Poda

% D

oen

ça

Testemunha negativa Agroquímico**

AACPD = 415,0 b


Figura 2. Área abaixo da curva de progresso da doença (Uncinula necator) em videiras „Superior

Seedless‟ submetidas ao tratamento com extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC.

extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial acibenzolar-S-metil (ASM), agroquímico e

testemunha - água destilada e esterilizada. Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm

73

(Abq e Ab), 200 mg . L-1


) e mancozeb + metalaxyl-M

(250 g.ha-1

), respectivamente.

Segundo Boava et al. (2010) ASM é reconhecidamente um ativador de

defesa de plantas por induzir um estádio de pré-condionamento a que as plantas

são expostas após a sua utilização. Para Col (1999) o ácido salicílico promove

nas células das plantas a produção de proteínas específicas relacionadas com a

patogênese, tais como ß,1-3 glucanase e quitinase que são capazes de degradar

a parede celular de fungos e bactérias patogênicos.

Níveis significativos de controle de patógenos com o uso de extratos de

Allamanda também foram observados por Khan (1999). Para Rumana (2004) o

uso de extrato de folhas de Allamanda tem se mostrado eficiente no controle de

Phomopsis vexans (Sacc. Syd.) Harter e Sclerotium rolfsii Sacc. Hawlader (2003)

relataram que o tratamento de sementes com extratos de folhas de Allamanda

aumentou a germinação de sementes de berinjela e diminuiu os níveis de

doenças.

Na medicina popular o uso de espécies do gênero Allamanda é

expressivo, principalmente pela sua reconhecida atividade farmacológica

(NAVARRO SCHMIDT et al., 2006). Para Nayak et al. (2006), resultados

promissores são obtidos devido às propriedades medicinais presentes na planta,

o que estimula a busca por novos metabólitos. Ainda segundo os autores, todas

as partes da planta contém allamandin, uma lactona tóxica.

3.3 Determinação da atividade enzimática de fenilalanina amônia-liase

(FAL), peroxidases e β-1,3-glucanase

Os resultados observados no presente trabalho demonstraram haver

níveis de pré-condicionamento nas plantas em reposta à utilização dos

tratamentos, refletidos na expressão da atividade enzimática avaliada.

Plantas tratadas com ASM apresentaram níveis induzidos superiores de

atividade de fenilalanina amônia-liase (FAL) 24 h após a pulverização, com pico

às 96 h (Figura 3). Este resultado favoreceu um maior nível de controle da

incidência do patógeno ao longo do tempo (AACPD - Figura 2).

74

O controle de doenças fúngicas pelo uso do ASM tem sido alvo de

diversos estudos. Para Rodrigues et al. (2006), o uso de ASM em caupi cinco dias

após a germinação, possibilitou 68,9% de controle de Fusarium oxysporum f. sp.

tracheiphilum na cultivar susceptível BR-17 Gurgueia e 71,59% de controle na

cultivar IPA-206, que apresenta grau de resistência intermediária.

Abq 10 ppm

y = -2E-05x2 + 0,0056x + 0,2339

R2 = 0,883

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Abq 100 ppm

y = -3E-05x2 + 0,0063x + 0,282

R2 = 0,585

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Abq 500 ppm

y = -1E-06x2 - 0,0009x + 0,4823

R2 = 0,6906

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Abq 1000 ppm

y = -2E-05x2 + 0,0037x + 0,5219

R2 = 0,2814

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Ab 10 ppm

y = -1E-05x2 + 0,0027x + 0,5368

R2 = 0,2367

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Ab 100 ppm

y = -1E-05x2 + 0,0014x + 0,3707

R2 = 0,8213

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Ab 500 ppm

y = 1E-05x2 - 0,0016x + 0,3877

R2 = 0,8077

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Ab 1000 ppm

y = 2E-05x2 - 0,0014x + 0,3864

R2 = 0,966

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Acibenzolar - S - Metil

y = -4E-05x2 + 0,01x + 0,2785

R2 = 0,9419

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Agroquímico*

y = -2E-06x2 + 0,0004x + 0,433

R2 = 0,7348

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

75

Testemunha negativa**

y = 2E-05x2 - 0,0038x + 0,3774

R2 = 0,7741

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 2

90

nm

ug

/mL

de

ác

ido

tra

ns

-cin

âm

ico

Figura 3. Atividade de fenilalanina amônia-liase a partir de diferentes concentrações de extrato

etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial

acibenzolar-S-metil (ASM), *agroquímico e **testemunha - água destilada e esterilizada.

Concentrações utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab), 200 mg . L-1

(ASM) e metyran +



), respectivamente.

Plantas tratadas com extrato etanólico de A. blanchetti, independente do

método de extração e da concentração utilizada, apresentaram resultados

promissores. Os resultados mais expressivos de aumento da atividade de FAL

foram observados com Abq nas concentrações 10 e 100 ppm, apresentando pico

da atividade da enzima 96 h após a pulverização. Os resultados observados são

indicativos de correlação direta entre os níveis de atividade enzimática e a

redução na incidência do oídio que variou entre 35,9 e 47,8%, respectivamente,

para estes tratamentos (Figura 2).

Plantas tratadas com (Ab) 1000 ppm obtiveram pico da atividade da

enzima 192 h após a pulverização, com reflexo direto na incidência final da

doença com 62,1% (Figura 2). Para Kuhn (2007) em uma planta pré-condicionada

a intensidade das alterações metabólicas desencadeadas a partir da chegada do

patógeno é fator determinante para a ativação de respostas de defesa ao ataque

do patógeno.

Em geral, constatou-se baixa atividade de peroxidases em plantas

tratadas com extrato Abq. No entanto, para todas as concentrações foram

observadas diferenças significativas em relação à testemunha negativa (Figura 4).

Os maiores níveis de atividade de peroxidases foram observados em plantas

tratadas com extrato Ab 10 ppm, ASM e fungicida, o que evidencia um estádio de

pré-condicionamento as plantas à expressão de diferentes níveis de seus

mecanismos de defesa.

76

Abq 10 ppm

y = -2E-08x2 + 3E-06x + 0,0001

R2 = 0,4878

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Abq 100 ppm

y = -2E-08x2 + 5E-06x + 6E-05

R2 = 0,8891

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Abq 500 ppm

y = -2E-08x2 + 5E-06x + 2E-05

R2 = 0,9918

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Abq 1000 ppm

y = -5E-08x2 + 1E-05x + 5E-05

R2 = 0,9835

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 10 ppm

y = -8E-08x2 + 2E-05x + 8E-05

R2 = 0,9155

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 100 ppm

y = -9E-09x2 + 5E-06x + 3E-05

R2 = 0,9401

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 500 ppm

y = -4E-08x2 + 9E-06x + 1E-05

R2 = 0,9818

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 1000 ppm

y = -1E-08x2 + 4E-06x - 6E-06

R2 = 0,942

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o


y = -6E-08x2 + 1E-05x - 5E-05

R2 = 0,7855

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Agroquímico*

y = -7E-08x2 + 2E-05x - 1E-05

R2 = 0,9519

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o


y = -7E-09x2 + 9E-07x + 9E-05

R2 = 0,2766

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

70

nm

. m

in

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Figura 4. Atividade de peroxidases a partir de diferentes concentrações de extrato etanólico de

Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial acibenzolar-S-

77

metil (ASM), *agroquímico e **testemunha - água destilada e esterilizada. Concentrações

utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab), 200 mg . L-1


kg.ha-1


), respectivamente.

Paralelamente à expressão de peroxidases nas concentrações dos

extratos Abq e Ab, observou-se que não houve correlação entre os níveis de

controle da doença (Figura 2) e o aumento na atividade de peroxidases (Figura 4).

Dentre os tratamentos alternativos, os maiores percentuais de controle foram

observados em plantas tratadas com extrato (Ab) 1000 ppm. Para Van Lonn; Rep;

Pieterse (2006), as peroxidases são glicoproteínas capazes de catalisar a

redução de H2O2, a formação de lignina, a incorporação de glicoproteínas à

parede celular, a destruição peroxidativa do ácido indolacético e de outros

reguladores de crescimento. Assim, em função de sua participação na síntese de

lignina e oxidação de compostos fenólicos, a peroxidases pode contribuir para

resistência das plantas contra fitopatógenos.

Plantas tratadas com ASM apresentaram correlação direta entre

percentuais de controle da doença e o aumento da atividade de peroxidases. Para

Boava et al. (2010), o aumento da atividade da enzima pode estar relacionado à

capacidade do ASM de ativar mecanismos de defesa das plantas, antecipando

prováveis reações bioquímicas de defesa que só seriam ativadas na presença de

um patógeno.

Na determinação da atividade da enzima β-1,3-glucanase houve um

aumento relativo da atividade enzimática até 96 h após a pulverização em todas

as concentrações do extrato Abq e Ab (Figura 5). Para Cavalcanti et al. (2006)

entre os indicativos de ativação de respostas de defesa de plantas a partir da

aplicação de elicitores, as enzimas peroxidases e β-1,3-glucanase são as

principais. Apenas as plantas pulverizadas com extrato de A. blanchetti nas

concentrações a frio apresentaram tendência de aumento da atividade de β-1,3-

glucanase relacionadas com o aumento da concentração utilizada.

78

Abq 10 ppm

y = -0,0002x2 + 0,0544x + 3,4192

R2 = 0,8069

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Abq 100 ppm

y = 7E-05x2 + 0,0096x + 3,5438

R2 = 0,9993

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Abq 500 ppm

y = -0,0006x2 + 0,1229x + 4,4461

R2 = 0,4815

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Abq 1000 ppm

y = -7E-05x2 + 0,0209x + 2,4638

R2 = 0,9621

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 10 ppm

y = -0,0003x2 + 0,0597x + 2,6742

R2 = 0,7611

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 100 ppm

y = -5E-06x2 + 0,0158x + 3,2523

R2 = 0,922

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 500 ppm

y = -0,0001x2 + 0,0417x + 3,5183

R2 = 0,6857

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Ab 1000 ppm

y = 8E-05x2 + 0,0197x + 3,0762

R2 = 0,9356

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o


y = -0,0003x2 + 0,0729x + 5,1475

R2 = 0,3691

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Agroquímico*

y = 6E-05x2 - 0,0084x + 2,6066

R2 = 0,1025

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o


y = -0,0002x2 + 0,041x + 2,8945

R2 = 0,4053

0

2

4

6

8

10

12

14

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Tempo (h)

Ab

so

rbâ

nc

ia 4

80

nm

gra

ma

pe

so

fre

sc

o

Figura 5. Atividade de β-1,3-glucanase a partir de diferentes concentrações de extrato etanólico

de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (Abq), a frio (Ab), produto comercial acibenzolar-

79

S-metil (ASM), *agroquímico e **testemunha - água destilada e esterilizada. Concentrações

utilizadas: 10, 100, 500 e 1000 ppm (Abq e Ab), 200 mg . L-1


kg.ha-1


), respectivamente.

Dentre as proteínas relacionadas à patogênese de plantas (proteínas-PR)

que mais caracterizam este processo, a β-1,3-glucanase apresenta-se como uma

das mais importantes. Esta enzima hidrolisa polímeros presentes na parede

celular de fungos, constituindo-se em um indicativo real de que está relacionada

com os mecanismos de defesa das plantas contra a infecção fúngica (COLLINGE

et al., 1993). Vários estudos têm demonstrado que as plantas transgênicas com

superexpressão de β-1,3-glucanase mostram aumento de resistência a fungos

infecção (ZHU et al., 1994; GRISON et al., 1996).

Plantas tratadas com ASM apresentaram aumento da atividade de β-1,3-

glucanase nas primeiras 48h após a pulverização. No entanto, os resultados não

indicam a continuidade da expressão de resistência ao longo do tempo. O

acibenzolar-S-metil (ASM) tem sido exaustivamente estudado, ao longo dos anos,

como potencial indutor químico de resistência e iniciador da resistência sistêmica

adquirida (RESENDE et al., 2002).

4. CONCLUSÕES

O extrato etanólico de A. blanchetti extraído a quente, a frio e a aplicação

do acibenzolar-S-metil (ASM) conferiram níveis significativos de proteção de

plantas de videira „Superior Seedless‟ a infecção por Uncinula necator.

O extrato etanólico de A. blanchetti obtido a frio na concentração de 1000

ppm e ASM conferiram maior capacidade de defesa de plantas de videira

„Superior Seedless‟ a infecção por U. necator.

ASM promoveu o aumento na atividade das enzimas peroxidases e

fenilalanina amônia-liase, com pico de atividade 96 h após a aplicação do elicitor,

não promovendo aumento significativo na atividade de β-1,3-glucanase.

O extrato etanólico de A. blanchetti obtido a frio na concentração de 1000

ppm promoveu o aumento na atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase,

peroxidases, e β-1,3-glucanase.

80

O extrato etanólico de A. blanchetti obtido a quente e a frio e a aplicação

de ASM 96 h antes da inoculação com o patógeno, pré-condicionaram plantas de

videira „Superior Seedless‟ a mecanismos de defesa induzida.

81

5. REFERÊNCIAS

ALVES, A.O.; ANDRADE, G.R.; MEDEIROS, D.B.; XAVIER, A.S.; BEZERRA

NETO, E.; BARRETO, L.P. Atividade da fenilalanina amônialiase em

aceroleiras submetidas ao estresse hídrico. Disponível em:

<http://www.eventosufrpe.com.br/jepex2009/cd/resumos/R0122-1.pdf>. Acesso

em: 03 dezembro 2010.

ARAÚJO, J.L.P. Cultivo da videira: Mercado, comercialização, custos e

rentabilidade. Embrapa semiárido. Disponível em:

<http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Uva/CultivodaVideira/

custos.htm>. Acesso em: 08 março 2011.

BALBI-PEÑA, M.I.; BECKER, A.; STANGARLIN, J.R.; FRANZENER, G.; LOPES,

M.C.; SCHWAN-ESTRADA, K. R.F. Controle de Alternaria solani em tomateiro por

extratos de Curcuma longa e curcumina I. Avaliação in vitro. Fitopatologia

Brasileira, v. 31, n. 3, p. 310-314, 2006.

BASTOS, C.N. Efeito do óleo de Piper aduncum sobre Crinipelis e outros fungos

fitopatogênicos. Fitopatologia Brasileira, v. 22, n. 3, p.441-443, 1997.

BOAVA, L.P.; KUHN, O.J.; PASCHOLATI, S.F.; DI PIERO, R.M. FURTADO, E.L.

Atividade de quitinases e peroxidases em folhas de eucalipto em diferentes

estágios de desenvolvimento após tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) e

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88

Capítulo IV

Considerações Finais

89

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A busca por tecnologias alternativas ao uso maciço de agroquímicos no

manejo de doenças na agricultura é ainda um grande desafio para a sociedade

moderna. A demanda por alimentos isentos de resíduos tóxicos, a adoção de

sistemas de produção que preservem os mais diversos agroecossistemas de

cultivo e a própria necessidade humana de sobrevivência tornam este desafio

ainda maior. Dentre as alternativas, o uso de extratos vegetais promovendo

alterações nos mecanismos de defesa em plantas a patógenos tende a

consolidar-se como manejo promissor, associado a um conjunto de práticas de

manejo integrado, o que reduz os riscos de contaminação pela utilização de

agroquímicos. Neste trabalho, observou-se a eficiência do extrato etanólico de

Allamanda blanchetti em induzir mecanismos de defesa de videiras „Superior

Seedless‟ contra Uncinula necator no Vale do Submédio São Francisco. Os

resultados observados indicaram um estádio fisiológico de pré-condicionamento

das plantas tratadas com o extrato de A. blanchetti. As alterações bioquímicas

observadas através das avaliações da atividade enzimática confirmaram os

resultados observados em discos de folhas e em campo, e possibilitaram a

divulgação dos primeiros ensaios conclusivos com extrato etanólico de A.

blanchetti no manejo do oídio da videira nas condições de cultivo do Vale do

Submédio São Francisco.

90

Anexos

91

Capítulo II

Análise de variância da produção de fitoalexinas em mesocótilo de sorgo em resposta à utilização

de extrato etanólico de Allamanda blanchetti A. DC. extraído a quente (em aparelho Soxhlet por 36

h) e a frio (pó seco em contato com o solvente por 72 h). Juazeiro, BA. 2010.

FV GL SQ QM Fc Pr > Fc

Trat

Rep

Erro

9

9

81

3748.110605

264.430765

1308.919705

426.456734

29.381196

16.159503

25.772

1.818

0,0000

0,0773

Total corrigido 99 5321.461075

CV (%)

Média geral

45,13

8.9075

Capítulo II Laboratório de Bioquímica da UNIVASF, Campus Juazeiro, BA.

Foto (esquerda): Teste de fitoalexinas em mesocótilo de sorgo. Foto (direita): Extração em aparelho Soxhlet.

Capítulo III Experimento de campo

Área experimental do Campus Petrolina Zona Rural (IF SERTÃO-PE). Foto (esquerda): Início das pulverizações (20 dias após a poda). Foto (direita): 30 dias após a poda.

92

Capítulo III Experimento de campo

Área experimental do Campus Petrolina Zona Rural (IF SERTÃO-PE). Foto (esquerda): Fita vermelha (Extrato Allamanda blanchetti a quente 100 ppm). Foto (direita): (Extrato A. blanchetti a frio 1000 ppm).

Área experimental do Campus Petrolina Zona Rural (IF SERTÃO-PE). Foto (esquerda): Fita Rosa (ASM). Foto (direita): Tratamento com agroquímicos.

Área experimental do Campus Petrolina Zona Rural (IF SERTÃO-PE). Foto (esquerda): Fita Rosa (ASM). Foto (direita): Sistema de condução (latada).

93

Capítulo III Experimento com discos de folhas

Foto (esquerda): Corte dos discos. Foto (direita): Placas com discos de folhas.

Foto (esquerda): Placas com discos de folhas. Foto (direita): Inoculação com suspensão de esporos de oidio (Uncinula necator).

Foto: Inoculação com suspensão de esporos de oídio (Uncinula necator).

94

Capítulo III Evolução do oídio (Uncinula necator) em discos de folhas 96 h após aplicação de elicitores.

Figura A - Testemunha negativa (água destilada). Figura B - Extrato etanólico de Allamanda blanchetti a quente (Abq) (extraído em aparelho Soxhlet por 36h) 10 ppm.

Figura C - Abq 100 ppm. Figura D - Abq 500 ppm.

A B

C D

95

Figura E - Abq 1000 ppm. Figura F - Extrato etanólico de Allamanda blanchetti a frio (Ab) (pó seco em contato com solvente etanólico por ≈ 72h) 10 ppm.

Foto G - Ab 100 ppm. Foto H - Ab 500 ppm.

Figura I - Ab 1000 ppm. Figura J - Acibenzolar-S-metil (200 g.L

-1).

E F

G H

I J

96

Figura K - Fungicida (metyran + pyraclostrobin (2kg.ha

-1) e mancozeb + metalaxyl-M (250g.ha

-1).

K

Erbs Cintra Dr2011

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