Eq 7 Microbiologia Industrial

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Equipo: 7 Rueda Candelaria Robinson González Hernández Ricardo A. Ortiz San Agustín Alejandra Grupo: 1602 México D.F . 5 de Noviembre de 2009 Producción de Antibióticos, vitaminas y enzimas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Equipo: 7Rueda Candelaria Robinson

González Hernández Ricardo A.Ortiz San Agustín Alejandra

Grupo: 1602

México D.F . 5 de Noviembre de 2009

Producción de Antibióticos, vitaminas y enzimas

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Antibiótico

Producto metabólico de un microorganismo quetiene la propiedad de inhibir o destruir a otrosmicroorganismos

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Microorganismos productoresHongos filamentosos (Eumycetes) : Producen el 25 % de los antibioticos conocidos

Géneros principales: Aspergillus , Monilia, Penicillum, Cephalosporium

AspergillusPenicillum

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Microorganismos productoresBacterias:Producen el 75 % de los antibioticosconocidos

Actinomycetes: Generos Streptomyces yNocardia(65%)

Pseudomonales y Bacillus (10%)

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BacitracinaCefalosporinaChloranfenicol

CicloheximidaCicloserinaEritromicinaGriseofulvinaKanamicinaLincomicinaNeomicinaNistatinaPenicilinaPolimixina BEstreptomicinaTetraciclina

Bacillus licheniformisCephalosporium sp.

Streptomyces venezuelae(hoy síntesis química)

Streptomyces griseusStreptomyces orchidaceusStreptomyces erytreusPenicillium griseofulvinStreptomyces kanamyceticusStreptomyces LincolnesisStreptomyces fradiaeStreptomyces nourseiPenicillum chrysogenumBacillus polymyxaStreptomyces griseusStreptomyces rimosus

Antibiótico Microorganismo productor

Algunos antibióticos producidos comercialmente

Tipo de microorganismo

Bacteria esporulada

HongoActinomiceto

ActinomicetoActinomicetoActinomicetoHongoActinomiceto

ActinomicetoActinomicetoActinomicetoHongoBacteria esporuladaActinomicetoActinomiceto

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Características de los microorganismos productores de antibióticos

1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable.

2 Su velocidad de crecimiento debería ser alta.

3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidosfagos.

4. Sus requerimientos nutricionales deberían sersatisfechos a partir de medios de cultivo de costoreducido.

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Características de los microorganismos productores de antibióticos

5. Debe ser de fácil conservación por largos períodos detiempo, sin pérdida de sus características particulares.

6. Debería llevar a cabo el proceso fermentativocompleto en un tiempo corto.

7. Si el objetivo del proceso es un producto, éste deberíaser de alto rendimiento y de fácil extracción del medio decultivo.

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Métodos para el estudio de microorganismos antagónicos

1. Método de estría cruzada de Garré

2. Método de las estrías alternas

3. Método de los discos de agar

4. Método de las estrías radiales

5. Método de las cajas superpobladas

6. Método del celofán

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Búsqueda de antibióticos: Rastreo

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Mejoramiento de microorganismos de uso industrial

1. Selección natural

2. Mutación inducida

3. Recombinación genética

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PROCESO DE OBTENCIÓN DE ANTIBIÓTICOS

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Esquema general de fermentación para la obtención de antibióticos

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Fermentador.

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Esquema de producción de penicilina

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El término vitamina se le da al Bioquímico polaco

Casimir Funk quien lo planteó en 1912.

Consideraba que eran necesarias para la vida y la

terminación Amina es por que creía que todas estas

sustancias poseían la función Amina.

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QUE ES UNA VITAMINA

Son compuestos orgánicos relativamente sencillos,sonabsolutamente insispensables para la existencia.

Se utilizan en el interior de las células como antecesorasde las coenzimas, a partir de las cuales se elaboran lasmiles de enzimas que regulan las reacciones químicasde las que viven las células.

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CLASIFICACIÓN DE VITAMINAS

VITAMINAS LIPOSOLUBLES

Vitamina A (Retinol)

Vitamina D (Calciferol)

Vitamina E (Tocoferol)

Vitamina K (Antihemorrágica)

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CLASIFICACIÓN DE VITAMINASVITAMINAS HIDROSOLUBLES

Vitamina C. Ácido Ascórbico. Antiescorbútica.

Vitamina B1. Tiamina. Antiberibérica.

Vitamina B2. Riboflavina.

Vitamina B3. Niacina. Ácido Nicotinico. Vitamina PP.

Antipelagrosa.

Vitamina B5. Ácido Pantoténico. Vitamina W.

Vitamina B6. Piridoxina.

Vitamina B8. Biotina. Vitamina H.

Vitamina B9. Ácido fólico.

Vitamina B12. Cobalamina.

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FUNCIONESLa función de las vitaminas en sistemas biologicos sonsustancias nutricionales importantes (factores decrecimiento) y en el metabolismo tiene 4 principalesfunciones que son:

-Estabilizadores de membranas.

-Hormonas.

-Electro donadores o aceptores de protones.

-Coenzimas.

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FACTORES DE CRECIMIENTOLos factores de crecimiento pueden ser de dos tipos.

1. Los que se necesitan en cantidades muy pequeñas y que funcionen cataliticamente como parte de los sistemas enzimáticos el complejo de vitamina B12 es un ejemplo muy claro de este grupo.

2. aquellos que se necesitan en cantidadessustancialmente grandes como aminoáciodos, purinasy pirimidinas.

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Avitaminosis

Avitaminosis por deficiencia de vitamina C

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HIPOVITAMINOSIS

Ratiquismo causado por hipovitaminosis D

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HIPERVITAMINOSIS

Hipervitaminosis causado por vitamina A

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VITAMINA A Es una sustancia antioxidante ya que elimina radicaleslibres y proteje al ADN de su acción mutágena, contribuyendo, por tanto, a frenar el envejecimientocélular.

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La función principal de la vitamina A es intervenir en la formación y mantenimiento de la piel, membranasmucosas, dientes y huesos. Tambien participa en la elaboración de enzimas en el hígado y de hormonassexuales y suprarrenales.

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PRODUCCIÓN DE VITAMINAS La mayor parte de las vitaminas se fabrican por síntesis

química. Sin embargo unas cuantas son demasiadocomplicada de sintetizar de forma barata, pero puedenfabricarse por fermentación microbiana. Las masimportantes son la vitamina B12 y Riboflavina.

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VITAMINA B12Es sintetizada en la

naturalezaexclusivamente porlos microorganismos;se encuentra presenteen cada tejido animalen concentracionesbajas.

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La producción comercial se lleva a cabo en la

actualidad enteramente por fermentación. La

vitamina B12 fué obtenida comercialmente al

principio como un subproducto de las

fermentaciones de estreptomicetos para la

producción de los antibióticos estreptomicina,

cloranfenicol o neomicina, con un rendimiento de

aproximadamente 1 mg/l.

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PROCESOS DE PRODUCCIÓN

1- Propionibacterium (freudenreichii y shermanii)

Con estos microorganismos se conduce un proceso en dos etapas.

a- fase anaerobia de 2-4 dias: el producto de estaetapa es el 5’desoxiadenosil cobinamida.

b- fase aerobia de 3-4 dias: el producto de esta etapaes el 5,6 dimetil benzimidazol. Estas dos estructuras secondensan luego dando la coenzima B12.

Para liberar la vitamina de las celulas se hace uncalentamiento (10 30 min a 80- 120 oC, pH= 6.5- 8.5)donde se convierte en la forma mas estable(cianocobalamina) El producto crudo se usa en piensos.

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2- Pseudomonas denitrificans

Con este microroganismo se conduce un proceso enuna sola etapa.

El proceso de produccion es una fermentacion enbatch que se prolonga alrededor de 90 horas a 30oC con agitacion y aireacion

El medio de cultivo contiene : melazas deremolacha 10%, extracto de levadura 0.2%, fosfatode amonio 0.5 %, sulfato de magnesio 0.1%, sulfatode manganeso 0.02% y otros microelementos.Debe agregarse Co2+ y 5,6 dimetil benzimidazol(pH=7.4) Este es el proceso que desarrolla la firmaMerck desde 1971 y la productividad aproximadaes de 60 mg/litro.

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Se conocen varias cepas productoras que se encuentran aquicon sus rendimientos.

Microorganismo Rendimiento de producciónde B12

Bacillus megaterium 0.45g/l

Butyribacterium rettgeri 5mg/l

Streptomyces olivaceus 3.3mg/l

Micromonaspara sp 11.5g/l

Klebsiella pneumoniae 0.2gm/l

Propionibacterium sherami 19mg/l

Pseudomonas dentrificans 60mg/l

Rhodopseudomonas protamicus(hibrido) obtenida porla uniónde Protaminobacter ruber y Rhosopseudomonas spheroides

135mg/l

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VITAMINA B2 RIBOFLAVINA

Sintetizada por muchos microorganismos que incluyen

bacterias, levaduras y hongos, el hongo Ashbya gossypiiproduce una enorme cantidad de esta vitamina. A pesar de este buen rendimiento existe una gran competenciaeconomica entre este proceso microbiano y la sintesisquímica.

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PRODUCCIÓN POR FERMENTACIÓN DIRECTA

1- Microorgaismos productores:bacterias, hongos y levaduras.

El primer microorganismo empleado en la producciónindustrial fue el hongo Eremothecium ashbyii, con rendimientos maximos de 2 g/l. Luego fue remplazadopor Ashbya gossipi, que produce 10-15g/l.

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2- Medios de cultivo.

Fermentador el cual contenía sacarosa 1.5 %, aceite demaíz 2 %, extracto de malta 0.5%, extracto de levadura0.5%, fosfato diamónico 0.025%. El pH del medio decultivo fue de 6.5 este se esterilizó a 121 ºC por 20minutos.

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3- Proceso fermentativo.

La producción de la vitamina en un fermentador. Laincubación se realiza a 30 ºC con aireación 7 dias defermentación y sin agitación para evitar daños en elmiscelio.

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4- Extracción y purificación de la riboflavina.

La riboflavina contenida en el producto seco, fue

extraída con butanol, posteriormente se lleva a

cabo. La purificación se realiza en una columna

seca de silica gel utilizando una mezcla de solventes

formada por butanol/etanol/agua en proporción

7:2:1.

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OTROS MICROORGANISMOSEn la actualidad se experimenta con levaduras de

los generos: pichia, usando alcanos como fuentes de

carbono; Hansenula,empleando etanol como fuente

de carbono; Saccharomyces empleando acetato

como fuente de carbono.

Estructura de la riboflavina, FMN y FAD

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VITAMINA ORGANISMOS QUE LA NECESITAN

FORMA DE COENZIMA

FUNCIONES METABOLICAS

Tiamina Staphylococcus aureusLactobacillus fermente

DPT Activación de cetoácidos ycetoazucares; transferencia deunidades de carbonos

Riboflavina Lactobacillus caseiStreptococcus lactis

Riboflavin 5-P Dinucleotido de Flavina-adenina

Transferencia de hidrogeno

Ácidonicotínico

Lactobacillus plantarumProteus vulgaris

NAD Y NADP Transferencia de hidrogeno

Ácidopatonténico

Brucella abortusProteus morgani

CoA4-Fosfapanteteína

Activación y transferencia de acilos.Sintesis de ácidos grasos.

Vitamina B6 Piridoxalpiridoxamina

Lactobacillus caseiClostridium perfringensStreptococcus fecalis

Peridoxal-PPiridoxamina-P

Descarboxilación,desaminación, transaminación y raceminación de a.a.

Ácido folico Lactobacillus caseiClostridium tetani

Ácidotetrahidrofólico

Transferencia de 1 carbono

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Ac. P-aminobenzoico

Clostridium acetobutylicumAcetobacter suboxydans

Ácidotetrahidrofólico

Transferencia de 1 carbono

Biotina LeuconostocmesenteroidesaClostridium tetaniLactobacillus lactis

Biotina-CO2 Fijación de CO2, Sintesis de acido graso.

VitaminaB12

Lactobacillus leichmanniliLactobacillus lactis

5-desoxiadenosil-B12

Transferencia de 1 carbono. Sintesis de desoxirribósidosisomerarización.

Vitamina E Necesaria para la síntesis de células y macromoléculas

Vitamina K Bacteroidesmelaninogenicus

Coenzima utilizada en transporte de elctrón(naftoquinones y quinones)

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PRODUCCION VITAMINICA DE ALGUNAS LEVADURAS (mcg/g de celulas)ESPECIES TIAMINA RiBOFLAVINA NIACINA AC. FOLICO

Saccharomyces cereviciae

28-37 44 296-402 34

Candida utilis 21-26 53 213-282 10-15

Candida arborea

16-22 58-60 301-313 12-20

O. lactis 12-14 40 196 12-15

VITAMINAS Enterobacteraerogenes

Pseudomonas fluorescens

Clostridium butyricum

Ac. nicotinico 240 210 250

Riboflavina 44 67 55

Tiamina 11 26 9

Piridoxina 7 6 6

Ac. pantotenico 140 91 93

Ac. folico 14 9 3

biotina 4 7 -------------

OTRAS BACTERIAS (mcg/g de celulas)

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¿QUE ES LA BIOTECNOLOGIA?

Tecnologia basada en la biologiaque es usada sobre todo en la industria alimenticia, farmaceutica, textil, y que sea benefico para el hombre, la biotecnología ha sido utilizada por el hombre desde los comienzos de la historia en actividades tales como la preparación del pan y de bebidas alcohólicas

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¿QUE SON LAS ENZIMAS?

Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteíca son macromoleculas complejas que producen un cambio químico específico en otras sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas.

Las enzimas son esenciales para todas las funciones corporales y se encuentran en la boca (saliva), el estómago (jugo gástrico), los intestinos (jugo pancreático, jugo y mucosa intestinal), la sangre y en cada órgano y célula del cuerpo.

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¿CÓMO ESTA FORMADA LA ENZIMA?

Algunas enzimas son proteínas conjugadas; ya que poseen un grupo no proteico o prostético, Una enzima completa se denomina holoenzima, y está formada por una parte proteica (apoenzima) y un cofactor no proteico (coenzima).

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA

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LA REACCION DE LA ENZIMA-SUSTRATO

El sustrato es una molécula sobre la que actúa una enzima .El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo enzima-sustrato. El sustrato por acción de la enzima es transformado en producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato

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TIPOS Y FUENTES DE OBTENCION DE ENZIMAS

Enzimas vegetales: La mayoría de las enzimas vegetales se encuentran disponibles en forma de polvo sin una purificación muy elevada. También se encuentran disponibles líquidos de papaína de baja actividad. El aumento de la disponibilidad de las enzimas vegetales depende de diversos factores

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Enzimas microbianas: Las enzimas producidas por la fermentación de microorganismos representan aproximadamente el 90% de todas las enzimas producidas para los procesos industriales.

TIPOS Y FUENTES DE OBTENCIÓN DE ENZIMAS

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ENZIMAS EN LA INDUSTRIATIPO DISPONIBILIDAD PRECIO PUREZA

Empleadas a gran

escala

Elevada Bajo Relativamente

baja

Ampliamente

empleadas

Pequeña Alto Alta

Especializados Muy limitada Muy alto Variable

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ENZIMAS MICROBIANAS

Son más útiles que los derivados de las plantas o animales por la su gran variedad de actividades catalíticas que disponen, y porque generalmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratas, de forma regular y de calidad uniforme. Además las enzimas microbianas son más estables que sus homólogos animales y vegetales, y su proceso de obtencion es más fácil y seguro.

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ENZIMAS MICROBIANAS MAS UTILIZADAS

Las enzimas más utilizadas son la -amilasa, la glucoamilasa, la glucosa isomerasa y varias proteasas. Solamente se emplean unas 20 enzimas en cantidades apreciables. De ellas, algunas tienen el suficiente interés industrial como para ser comercializadas en los mercados de materias primas.

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USOS INDUSTRIALES

DETERGENTES

MANUFACTURACION DE LA CERVEZA

CONSERVACION DE ALIMENTOS

INDUSTRIA TEXTIL

INDUSTRIA FARMACEUTICA

ANALISIS CLINICOS

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ESQUEMA DE PRODUCCION

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MECANISMO DE ACCION

Todas estas proteasas hidrolizan gran número de proteínas diferentes a través de polipéptidos hasta aminoácidos; también desdoblan amidas y ésteres de aminoácidos.

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APLICACIONES DE LAS PROTEASAS

En los detergentes proteolíticos se hallan en el mercado este tipo de enzimas.

Durante el proceso de maduración de la carne y el pescado ,actuan estas enzimas proteolíticas que suministran a la carne una textura blanda, jugosa, masticable, de sabor agradable y apta para la cocción y digestión

Usada en el tratamiento de fibras proteínicas (seda y lana)

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MECANISMO DE ACCION

Las amilasas provocan la coagulación del almidón al hidrolizarlo. Se adhieren a las superficies textiles y actúan como pegamento para los compuestos de almidón. Las amilasas empleadas en los detergentes son la -amilasas. Hidrolizan los enlaces -1, 4 glucosídicos

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USOS DE LAS AMILASAS

Las amilasas tambien se emplean en los detergentes para eliminar las manchas que contienen almidón.

Se usan en la fermentacionalcoholica, Estas enzimas son y amilasas

Hidrólisis parcial del almidón para generar dextrinas que son utilizadas como espesantes.

Hidrólisis del almidón para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones, entre ellas la producción de etanol para uso alimenticio y combustible.

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USOS DE LAS AMILASAS

Obtención de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizados en la fabricación de la cerveza y confituras (dulces, helados, tortas).

Obtención de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricación de cerveza, panes y repostería, confituras y bebidas no alcohólicas.

Hidrólisis parcial del almidón en la industria panadera para la liberación de glucosa que es sustrato de fermentación de las levaduras para producir el leudamiento de la masa.

Remoción del almidón utilizado como apresto en la industria textil.

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MECANISMO DE ACCION

Cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa, desde los extremos de los restos de galactosa; siendo los dos monosacáridos resultantes más dulces y más fácilmente asimilables.

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PECTINO-ESTERASA (P.E.) O PECTINO-METIL-ESTERASA.

Origen: Es producida por hongos (Aspergillusniger, Fusarium oxysporum), levaduras, bacterias y algunos vegetales, como tomates, cebollas y frutas cítricas.

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MECANISMO DE ACCION

Produce la hidrólisis de la pectina, formando ácido péctico o poligalacturónico y metanol, al actuar de preferencia sobre los enlaces metílicos, vecinos de grupos carboxílicos libres ..

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APLICACIONES DE PECTINO-ESTERASA

Estas enzimas son las causantes de la pérdida de las características de turbidez de algunos jugos y néctares obtención rápida de un filtrado claro.

También se aplica una adición de esta enzima con el objeto de lograr un mayor rendimiento en jugo a partir de algunas frutas que no se pueden prensar con facilidad, quedando retenida una cantidad apreciable de jugo.

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PECTINASA,POLIGALACTURONIDASA (PG) O

PECTINODEPOLIMERASA Origen: Fúngico

(Aspergillus, Penicilliumchrysogenum) y bacteriano (Bacillussubtillis).

pH óptimo: 3-6 (fúngica) y 5-8 (bacteriana).

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MECANISMO DE ACCION

Desdoblamiento hidrolítico de los enlaces glucosídicosde las cadenas de pectina o del ácido péctico a oligourónidos o a ácido galacturónico monómero (con reducción rápida de la viscosidad)

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APLICACIONES DE LA PECTINASA

Se usa en el procesamiento de frutas y hortalizas para preparar jugos y néctares, formando también parte de las ya mencionadas "enzimas clarificantes", junto a la pectino-esterasa. También se emplea para la maceración de tejidos vegetales con el objeto de obtener aromas (16).

Por otra parte, en la fermentación húmeda de las semillas de café

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ANALISIS CLINICOS

Las enzimas se emplean como reactivos estándar en los laboratorios para el diagnóstico de enfermedades, para el control y el seguimiento de enfermedades y de la respuesta del paciente hacia la terapia seguida, y para la identificación y control de la concentración de drogas o sus metabolitos en la sangre u otros fluidos corporales.

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¿QUE ES EL PCR?

El PCR es en si un técnica muy simple: dos oligonucleotidos son sintetizados cada uno como secuencia complementaria de una hebra opuesta (secuencia de un segmento en cada una de las hebras) del ADN blanco en posiciones que estén mas allá de aquellas donde termina el segmento a ser amplificado. Los oligonucleotidos sirven como cebadores con sus extremos 3' orientados en direcciones opuestas.

El ADN aislado que contiene el segmento a ser amplificado es calentado levemente para ser desnaturalizado (separado en hebras sencillas), después se enfría en presencia de grandes cantidades de los oligonucleotidos sintéticos, lo que permite que por hibridización, se encuentren las secuencias complementarias. En este momento se agregan los cuatro desoxiribonucleotidos trifosfato y el segmento hibridizado sirve como cebador para iniciar la amplificación. El proceso de calentamiento y enfriamiento se lleva a cabo unas 25-30 veces en algunas horas en un aparato que lo hace automáticamente, hasta que el fragmento puede ser analizado o clonado.

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Los segmentos son amplificados utilizando una ADN polimerasa resistente a los cambios de temperatura como la TaqI polimerasa (aislada de una bacteria hipertermófila). Si se diseñan con cuidado los cebadores de tal forma que contengan sitios de corte para endonucleasas, se puede facilitar mucho la clonación del ADN amplificado.

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APLICACIÓN DEL PCR

Con esta técnica se han podido amplificar segmentos de ADN de 40,000 años de antigüedad como momias humanas y animales extintos como el mamut, lo que ha dado origen a la arqueología molecular y a la paleontología molecular. Se utiliza mucho esta técnica para rastrear el origen de los virus humanos y en estudios forenses

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PRODUCTOS FARMACEUTICOS

A diferencia de otros usos industriales para las enzimas, las aplicaciones médicas y farmacéuticas de las mismas requieren generalmente pequeñas cantidades de enzimas muy purificadas

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REFERENCIAS Producción de enzimas: Aliadas productivas de la

industria,http://www.bioplanet.net/magazine/bio_sepoct_1999/bio_1999_sepoct_industria.htm

Brock. T.D. Biología de los Microorganismos. 4ª edición. España: Editorial Omega S.A. 1982.

Koneman, E.W. Diagnóstico Microbiológico. México: Editorial Panamericana. 1984.

Marroquin, Sanchez Alfredo,Ed. Quimica S.A.,1960

Mexico D.F.