Enzymové inženýrství
Transcript of Enzymové inženýrství
![Page 1: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/1.jpg)
Enzymové inženýrství
![Page 2: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/2.jpg)
Jak získat enzym s novými vlastnostmi?
- hledání nových zdrojůorganismy z nových zdrojůextremofilní mikroorganismy (psychrofilní, termofilní,
hypertermofilní, halofilní, barofilní, …)genomové projektymetagenomika
- enzymové inženýrství„medium engineering“chemické modifikaceracionální metodymetody řízené evoluce
selekce vs. screeningsaturační mutagenese
![Page 3: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/3.jpg)
Závislost aktivity na teplotě, teplotní optimum
![Page 4: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/4.jpg)
medium engineering
Enzymy v nevodném prostředí
- organické rozpouštědla, DMSO, DMF
- nedetergenní sulfobetainy
- iontové kapaliny
- hluboce eutektická rozpouštědla
![Page 5: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/5.jpg)
Chemické modifikace
- imobilisace
- pegylace
- „chemická glykosylace“
![Page 6: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/6.jpg)
Racionální metody
Glykosidasy
Glykosynthasy
![Page 7: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/7.jpg)
Racionální metody
Cyclophilin (1LOP) „Cyproasa“ 1E.coli cyclophilin A91S, F104, N106D
Nature 1998, 391, 301-304.
![Page 8: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/8.jpg)
Kombinatorické metody
- chemická mutagenese
- error-prone PCR
- kmeny s oslabenýmiopravnými mechanismy
- DNA-shuffling
![Page 9: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/9.jpg)
Kombinatorické metody
- screening – high-throughput screening (HTS),fluorescene-activated cell sorting (FACS),screening na miskách
- selekce – vystavení selekčním tlakům,phage display
![Page 10: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/10.jpg)
Kombinatorické metody
Phage display – jak udělat z DNA-polymerasy RNA-polymerasu
![Page 11: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/11.jpg)
Kombinatorické metody
Zvýšení stability a „rozpustnosti“ proteinů
Nativní Denaturovaný
![Page 12: Enzymové inženýrství](https://reader036.fdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/62ac72d96af9c8660c211e38/html5/thumbnails/12.jpg)
Kombinatorické metodyThymidinkinasa z viru Herples Simplex (HSV-TK)- „suicide gene“ spolu s acyklovirem, ganciklovirem- možný „bezpečnostní gen“ při genových terapiích
a allogenní transplantaci kostní dřeně- není možné použít pro léčbu HIV, protože antivirotika
(např. AZT) působí podobně jako ganciklovir a spol.
HSV1-TK + HSV2-TK
DNA-shuffling
desítky tisíc klonů
Robotizovaný HTS
enzym 32x méně citlivý k AZT než HSV1-TK,ale aktivní na ganciklovir
Nat. Biotechnol. 1999, 17, 259-264.