Enzimi. “Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità...
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EnzimiEnzimi
““Proteine che agiscono Proteine che agiscono da catalizzatori biologici da catalizzatori biologici aumentando aumentando enormemente la velocità enormemente la velocità delle reazioni delle reazioni biochimiche” biochimiche”
Alta specificitàAlta specificità dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico
Alta velocità di reazioneAlta velocità di reazione aumentano la velocità di reazione fino a 1012 volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da enzimi
Capacità di regolazioneCapacità di regolazione inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima
Agiscono in condizioni moderateAgiscono in condizioni moderate temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro
CatalizzatoriCatalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati
PROPRIETÀ DEGLI ENZIMIPROPRIETÀ DEGLI ENZIMI
Sintesi Sintesi proteicaproteica
Zimogeno
(precursore)
ApoenzimaApoenzima
(parte proteica)(parte proteica)
OLOENZIMAOLOENZIMA
coenzima (vitamina)
ione metallico
gruppo prostetico (legato covalentemente)
ApoenzimaApoenzima(inattivo)(inattivo)
CoenziCoenzimimi
Coenzima Precursore
Biocitina Biotina
5‘-Deossiadenosilcobalamina Vitamina B12
Flavin adenin dinucleotide Riboflavina (B2)
Acido lipoico Acido lipoico
Nicotinamide adenin dinucleotide Ac. Nicotinico
Piridossal fosfato Piridossina (B6)
Tetraidrofolato Folato
Tiamin pirofosfato Tiamina (B1)
Elementi inorganici che Elementi inorganici che servono come cofattori di servono come cofattori di
enzimienzimiCu2+ Citocromo ossidasi
Fe2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi
K+ Piruvato cinasi
Mg2+ Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi
Mn2+ Arginasi
Mo Dinitrogenasi
Ni2+ Ureasi
Se Glutatione perossidasi
Zn2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi
Velocità delle Velocità delle reazionireazioni
La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius:
Velocità = Ae - Ea/RT
Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1K-1) e T la temperatura assoluta
X + Y Z
Stato di transizione
S
P
Ene
rgia
Coordinte di reazione
ENERGIA DI ATTIVAZIONE
Ea
La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione
Come agiscono gli enzimi?Come agiscono gli enzimi?
Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione
Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto
Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione
Num
ero
di m
olec
ole
Energia cinetica delle molecole
Molecole con valori medi di energia
Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una
reazione catalizzata da un enzima
Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata
Distribuzione delle Distribuzione delle energie cinetiche energie cinetiche
E + S ES EP E+ P
S P
Reazione non catalizzata
Reazione catalizzata da un enzima
En
ergi
a
Coordinate di reazione
E + S
ES
EP
E + P
Stato di transizione
ΔG°
Stato di transizione
Stato di transizione Eatt (enzimatica)
Eatt (non enzimatica)
Profilo energetico di una Profilo energetico di una reazione catalizzata da un reazione catalizzata da un
enzimaenzima
Misura dell’attività Misura dell’attività enzimaticaenzimatica
Mi permette di determinare la Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un quantità di enzima presente in un
campione campione
Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione dell’enzima di catalizzare una reazione
Supponiamo di voler determinare la Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) quantità di Lattico deidrogenasi (LDH)
presente nel sangue di un pazientepresente nel sangue di un paziente
Piruvato + NADHPiruvato + NADH Lattato + NADLattato + NAD++LDHLDH
AB
SA
BS
Lunghezza d’ondaLunghezza d’onda
340 nm340 nm
NADHNADH
NADNAD++
TamponTamponee
SubstratSubstratoo
Miscela Miscela
tampone-substratotampone-substrato
Preparazione Preparazione testtest
Cuvetta (quarzo-Cuvetta (quarzo-vetro-plastica)vetro-plastica)
1 2 3
4 5 6
7 8 9
0
START
Scelta della lunghezza Scelta della lunghezza d’ondad’onda
STOP
0.000
minuti
AB
S
340 nm
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1.000
2.000
1 20
SpettrofotometrSpettrofotometroo
Lunghezza Lunghezza d’ondad’onda
SpettrofotomeSpettrofotometrotro
Posizionamento Posizionamento della cuvetta nello della cuvetta nello spettrofotometrospettrofotometro
1.546
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
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1 20
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minuti
ABS 340 nm
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2.000
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ABS 340 nm
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1.546
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
Aggiunta dell’enzima (cofattore o Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato)substrato)
Rapido Rapido mescolamenmescolamen
toto
1.546
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
Inizia la reazione Inizia la reazione enzimaticaenzimatica
1.516
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.493
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.479
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.449
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.411
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.390
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.343
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.317
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.289
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.274
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.245
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.224
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.189
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.156
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
1.123
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.098
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
1.053
minuti
ABS 340 nm
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1.000
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1 20
1.012
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.994
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.964
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.938
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.910
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.889
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.868
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.861
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.844
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.821
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.803
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.789
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.777
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.759
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.719
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.690
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.657
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.634
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.611
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.592
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.558
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.528
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
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0.499
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
0.459
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
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0.425
minuti
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1.000
2.000
1 20
0.399
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.384
minuti
ABS 340 nm
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1.000
2.000
1 20
0.380
minuti
ABS 340 nm
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1.000
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1 20
La registrazione viene La registrazione viene bloccatabloccata
0.380
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
Determinazione dell’attività Determinazione dell’attività enzimaticaenzimatica
Occorre calcolare la velocità della Occorre calcolare la velocità della reazionereazione
Se vengono rispettate Se vengono rispettate determinate condizioni, la determinate condizioni, la velocità della reazione è velocità della reazione è
direttamente proporzionale alla direttamente proporzionale alla concentrazione di enzimaconcentrazione di enzima
?
E + S ES E + P
In condizioni di stato stazionarioIn condizioni di stato stazionario
Velocità= Velocità= kk33[ES][ES]
k1
k2
k3
kk11 >> k>> k22
kk11 ≥ k≥ k33
se la concentrazione di substrato se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevataè sufficientemente elevata
[E] [E] [ES] [ES]
E + S ES E + P
In condizioni di stato stazionarioIn condizioni di stato stazionario
k1
k2
k3
kk11 >> k>> k22
kk11 ≥ k≥ k33
Fino a quando Fino a quando
[E][E] >>[S]>>[S]
V = costanteV = costante
V = kV = k33[ES] [ES] [E] [E]
•
•
••
•
••
•••
••••
[S]
Vo
Andamento della velocità iniziale in Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di funzione della concentrazione di
substratosubstrato
L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten
V V maxmax
½ V½ Vmaxmax
KKmm
v=VVmaxmax [S] [S]
KKmm [S] [S]
0.380
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
Determinazione dell’attività Determinazione dell’attività enzimaticaenzimatica
Pendenza Pendenza A/minA/min
0.380
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
Determinazione dell’attività Determinazione dell’attività enzimaticaenzimatica
Velocità Velocità costantecostante
In condizioni di [S] In condizioni di [S] saturanti saturanti
In tali condizioni la velocità è In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla direttamente proporzionale alla
concentrazione di enzimaconcentrazione di enzima
0.380
minuti
ABS 340 nm
0.000
1.000
2.000
1 20
La velocità della La velocità della reazione non reazione non
aumenta aumenta all’aumentare all’aumentare
della della concentrazione di concentrazione di
substratosubstrato
Determinazione Determinazione dell’attività enzimaticadell’attività enzimatica
UI UI A VA Vtottot
d t Vd t Vcc
==
Variazione di Variazione di assorbimentoassorbimento Volume totale testVolume totale test
Coefficiente di Coefficiente di estinzione (mM o estinzione (mM o M) del substratoM) del substrato Cammino Cammino
otticoottico
TempoTempo
Volume Volume enzimaenzima
Unità Unità enzimaticenzimatic
hehe
L’attività di un enzima viene misurata in L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità termini di “Unità enzimatiche” o “Unità
Internazionali”Internazionali”
““Unità Unità enzimatica”enzimatica”
Quantità di enzima capace di Quantità di enzima capace di trasformare una micromole trasformare una micromole
((mole) di substrato in un minuto mole) di substrato in un minuto per ml di soluzioneper ml di soluzione
1 unità di enzima
2 unità di enzima
3 unità di enzima
Tempo
Vel
ocit
à
Incrementando la concentrazione di Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della enzima aumenta la pendenza della
rettaretta
In condizioni di [S] In condizioni di [S] saturanti saturanti
MetodiMetodiContinuoContinuo A tempo fissoA tempo fisso
L’operatore segue la reazione L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di effettivamente una misura di velocità iniziale velocità iniziale la velocità la velocità enzimatica deve rimanere enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da concentrazione dell’enzima da misuraremisurare
L’operatore fa partire la L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione un periodo di incubazione prescelto prescelto è essenziale è essenziale che durante tale periodo la che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero reazione sia di ordine zero relativamente alla relativamente alla concentrazione del concentrazione del substrato e la velocità substrato e la velocità enzimatica sia quindi enzimatica sia quindi sempre massimasempre massima
ContinuoContinuo
TempoTempo
AB
SA
BS
vv00
TempoTempo
AB
SA
BS
vv00
TempoTempovv00
AB
SA
BS
Problemi di Problemi di mescolamento, effetto mescolamento, effetto
diluizione….diluizione….
Soluzione concentrata di Soluzione concentrata di enzimaenzima
A tempo A tempo fissofisso
TempoTempo
AB
SA
BS
vv00
STOPSTOP
TempoTempo
AB
SA
BS
vv00
STOPSTOP
TempoTempo
vv00
STOPSTOP
Elevata concentrazione di Elevata concentrazione di enzimaenzima
Campione non mescolato, Campione non mescolato, precipitato…..precipitato…..
Tipologia di Tipologia di analisianalisi
Test sempliceTest semplice::Nella soluzione di reazione è Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La presente un solo enzima. La reazione può essere seguita reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per coenzima (NADH, NADPH per esempio)esempio)
Test accoppiato:Test accoppiato:Si rende necessario quando Si rende necessario quando nessuno dei composti che nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita con una seconda reazione definita “indicatrice”“indicatrice”
A + NADH + HA + NADH + H++ B + NADB + NAD++A
BS
AB
S
Lunghezza d’ondaLunghezza d’onda
340 nm340 nm
NADH o NADPHNADH o NADPH
NADNAD++ o NADP o NADP++
deidrogenasideidrogenasi
Test ottico Test ottico semplice (test di semplice (test di
Warburg)Warburg)
Test ottico Test ottico accoppiato accoppiato
D + NADH + HD + NADH + H++ E + NADE + NAD++deidrogenasideidrogenasi
A + BA + B C + DC + Denzimaenzima
Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATPCreatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATPcreatinfosfocinasicreatinfosfocinasi
Glucosio + ATPGlucosio + ATP Glucosio-6-P + ADP Glucosio-6-P + ADP
esocinasiesocinasi
Glucosio-6-P + NADPGlucosio-6-P + NADP++ Acido lattico + NADPH + H Acido lattico + NADPH + H++
Glucosio-6-PGlucosio-6-Pdeidrogenasideidrogenasi
Per effettuare un dosaggio enzimatico Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre:in maniera corretta occorre:
Uniformare la temperatura (30°C)Uniformare la temperatura (30°C)
Scegliere il valore di pH ottimaleScegliere il valore di pH ottimale
Escludere la presenza di inibitori (reversibili o Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)irreversibili)