Enzimas Proteo

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Purificación y caracterización

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  • LIPROVE FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS

    DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

    HIDROLASAS DE LTEX DE ESPECIES DEL

    GNERO ARAUJIA. PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE LAS ENZIMAS

    PROTEOLTICAS

    Walter David Obregn

    Tesis para optar al Doctorado de la Facultad de Ciencias Exactas

    Dra. Nora Silvia Priolo Directora Ao 2008

  • El presente Trabajo de Tesis ha sido realizado bajo la direccin de la Dra.

    Nora Silvia Priolo en el Laboratorio de Investigacin de Protenas Vegetales

    (LIProVe) para optar al Grado Acadmico de Doctor de la Facultad de

    Ciencias Exactas. En su transcurso se ha recibido el apoyo de una Beca de

    Nivel Inicial de la Agencia Nacional de Promocin Cientfica y Tcnica y de

    una Beca Tipo I del Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y

    Tcnicas. Durante el desarrollo del trabajo se realizaron estadas en el Instituto

    de Biotecnologa y Biomedicina (IBB) de la Universidad Autnoma de

    Barcelona, Espaa, bajo el auspicio del Programa Iberoamericano de Ciencia

    y Tecnologa (CYTED) y de la Agencia Espaola de Cooperacin Internacional

    (AECI).

  • ndice general

    Hiptesis de trabajo y objetivos 1

    Introduccin 1. Introduccin al mundo de las proteasas 3

    1.2. Caractersticas de la accin enzimtica 3

    1.3. Clasificacin de las enzimas 4

    1.4. Hidrolasas vegetales 7

    1.4.1. Enzimas proteolticas 9

    1.4.1.1. Clasificacin y nomenclatura de las enzimas proteolticas 11

    1.4.1.2. Mecanismos catalticos de las endopeptidasas 15

    1.4.1.2.1. Peptidasas sernicas y treonnicas 15

    1.4.1.2.2. Peptidasas cistenicas 16

    1.4.1.2.3. Peptidasas asprticas 19

    1.4.1.2.4. Metalopeptidasas 20

    1.4.1.2.6. Peptidasas glutmicas 21

    1.4.1.2.7. Peptidasas de mecanismo cataltico desconocido 21

    1.5. Proteasas de ltex 22

    1.5.1. Proteasas de ltex de Asclepiadaceae 22

    2. Introduccin al mundo de las micas 27

    2.1. Biologa molecular 30

    2.1.1. Hitos en el desarrollo de la biologa molecular 30

    2.1.2. Reaccin en cadena de la polimerasa 33

    2.1.3. Clonacin de proteasas cistenicas vegetales 34

    2.2. Protemica 35

    2.2.1. Metodologa protemica 36

    3. Introduccin a la biocatlisis en medios no convencionales 38

    3.1. Inmovilizacin enzimtica en distintos soportes 40

    3.2. Aplicacin de proteasas a la biosntesis en medios

    no convencionales 43

    Referencias 47

  • Materiales & Mtodos Purificacin y caracterizacin de proteasas

    1. Material vegetal 60

    1.1. Araujia angustifolia (Hook. et Arn.) Decaisne 60

    1.2. Araujia hortorum Fourn. 61

    2. Aislamiento y caracterizacin de los extractos crudos 62

    2.1. Obtencin de las preparaciones enzimticas 62

    2.2. Determinacin del contenido de protenas 62

    2.2.1. Mtodo de Bradford 62

    2.2.1.1. Ensayo estndar 63

    2.2.1.2. Microensayo 63

    2.2.2. Medida de la absorbancia directa a 280 nm 63

    2.2.3. Mtodo de biuret 63

    2.3. Ensayos de actividad hidroltica 64

    2.3.1. Actividad esteroltica 64

    2.3.2. Actividad amidsica 65

    2.3.3. Actividad pectinmetilesterasa 65

    2.3.4. Actividad carboximetilcelulasa, poligalacturonidas y xilanasa 66

    2.3.5. Actividad ramnogalacturonidasa 66

    2.3.6. Actividad peptidsica 66

    2.3.7. Actividad carboxipeptidsica 68

    2.3.7.1. Actividad inihibitoria de carboxipeptidasa A 68

    2.4. Caracterizacin proteoltica de los extractos crudos 69

    2.4.1. Perfil de pH de la actividad proteoltica 69

    2.4.2. Efecto de inhibidores 69

    2.4.3. Efecto trmico o calor de inactivacin 70

    2.4.4. Estabilidad trmica 70

    2.5. Anlisis electrofortico 71

    2.5.1. Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida

    (SDS-PAGE) 71

    2.5.1.1. Tipos de SDS-PAGE utilizados 71

    2.5.1.1.1. Electroforesis con Tris-glicina 71

  • 2.5.1.1.2. Electroforesis de alta resolucin con Tris-tricina 74

    2.5.1.1.3. Electroforesis en gradiente de poliacrilamida 76

    2.5.1.2. Fijacin y tincin 77

    2.5.1.2.1. Tincin con Coomassie Brilliant Blue R-250 77

    2.5.1.2.2. Tincin con Coomassie coloidal 78

    2.5.1.2.3. Tincin con plata 79

    2.5.1.3. Anlisis de los geles por densitografia 81

    2.5.2 . Isoelectroenfoque 81

    2.5.2.1. Deteccin de actividad caseinoltica en geles: zimograma 85

    3. Purificacin de los extractos crudos 86

    3.1. Cromatografia de intercambio inico 86

    3.2. Caracterizacin de las fracciones purificadas 87

    3.2.1. Determinacin del contenido de protenas 87

    3.2.2. Actividad peptidsica 87

    3.2.2.1. Perfil de ph de la actividad proteoltica 88

    3.2.2.2. Efecto de inhibidores 88

    3.2.3. Actividad esteroltica 88

    3.2.4. Actividad amidsica 88

    3.2.5. Electroforesis de alta resolucin con Tris-tricina y

    electroforesis en gradiente de poliacrilamida 88

    3.2.8. Determinacin de parmetros cinticos 88

    Metodologa de las micas 1. Anlisis por espectrometra de masas de las proteasas aisladas 90

    2. Secuencia aminoacdica N-terminal y de pptidos internos 92

    3. Mapa peptdico por espectrometra de masas (MALDI-TOF) 93

    3.1. Digestin trptica en geles de poliacrilamida 93

    4. Clonado de proteasas 95

    4.1. Diseo de cebadores (primers) especficos 95

    4.2. Aislamiento del cDNA 96

    4.2.1. Extraccin del RNA total 96

    4.2.2. RACE-PCR 97

    4.2.2.1. Reaccin de retrotranscripcin (RT) 97

  • 4.2.2.2. Reaccin de PCR 98

    4.3. Electroforesis en geles de agarosa 99

    4.4. NESTED PCR 100

    4.5. Purificacin de fragmentos de DNA 101

    4.6. Clonado del cDNA 101

    4.6.1. Medios de cultivo utilizados 101

    4.6.1.1. Medios de cultivo lquidos 101

    4.6.1.2. Medios de cultivo slidos 102

    4.6.1.3. reactivos adicionales 102

    4.6.3.2. Obtencin de clulas e. Coli competentes 103

    4.7. Clonacin 104

    4.7.1. Ligacin 105

    4.7.2. Transformacin y seleccin de los clones 105

    4.7.3. Glicerinado de los clones 106

    4.8. Secuenciacin del cDNA clonado 107

    4.8.1. Aislamiento de DNA plasmdico 107

    4.8.2. Digestin con enzimas de restriccin 107

    4.8.3. Secuenciacin del DNA 108

    4.8.4. Anlisis de las secuencias de los cDNAs 108

    5. Modelado por homologa. Bioinformtica 108

    Capacidad de los EC para la sntesis peptdica 1. Inmovilizacin del extracto crudo 109

    1.1. Entrampamiento en geles de poliacrilamida 110

    1.1.1. Actividad caseinoltica de las proteasas entrampadas 110

    1.2. Adsorcin sobre poliamida 111

    1.2.1. Evaluacin de la actividad de las enzimas inmovilizadas sobre

    diferentes sustratos. Actividad enzimtica remanente 111

    1.3. Inmovilizacin sobre gel de agarosa 112

    2. Reaccin de sntesis con extractos crudos libres e inmovilizados

    como catalizadores 113

    2.1. Seleccin de los medios de reaccin para las sntesis 113

    2.2. Seleccin de los sustratos para las sntesis 113

  • 2.3. Seleccin del pH y temperatura para las sntesis 114

    2.4. Reacciones de sntesis 114

    2.5. Control analtico de los componentes de las reacciones de sntesis 114

    2.6. Proceso de inmovilizacin 115

    2.6.1. Determinacin de la actividad enzimtica 115

    2.6.1. Determinacin de protenas 115

    2.6.1. Carga enzimtica y rendimiento de inmovilizacin 115

    2.6.1. Rendimiento de protena 116

    2.6.1. Inmovilizacin de ec de araujia hortorum en gel de azarosa 116

    2.7. Sntesis en medios orgnicos utilizando

    EC de Araujia hortorum libre como catalizador 116

    Referencias 119

    Resultados & Discusin Extractos Crudos 122

    Purificacin del extracto crudo obtenido a partir del ltex

    de Araujia angustifolia 129

    Purificacin del extracto crudo obtenido a partir del ltex

    de Araujia hortorum 141

    Clonado y secuenciamiento de araujiana aII 153

    Inmovilizacin Enzimtica & Sntesis Peptdico 168

    Referencias 177

    Conclusiones 179

  • INTRODUCCIN

  • Hiptesis de trabajo y Objetivos 1

    HIPTESIS DE TRABAJO

    Muchas plantas contienen ltex, que es exudado cuando las mismas son

    daadas, habindose detectado un considerable nmero de protenas presentes en

    esta secrecin. Sin embargo el rol de estas protenas, entre las cuales hay varias

    enzimas, es an motivo de especulacin entre los fisilogos vegetales. En un buen

    nmero de casos el ltex contiene proteasas, a veces en cantidades tan elevadas

    que han dado lugar a su aprovechamiento biotecnolgico (papana, ficina).

    En un trabajo reciente (Konno et al., 2004) 1 parece haber quedado demostrado

    que algunas proteasas juegan un importante papel en la defensa de la planta frente

    al ataque de insectos fitfagos. De todos modos este hecho no parece estar

    generalizado, ya