ENZIM (SIFAT – SIFAT UMUM)

Kontribusi : Wheny

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses

dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Sebagai

determinan yang menentukan kecepatan berlangsungnya berbagai peristiwa fisiologik,

enzim memainkan peranan sentral dalam masalah kesehatan dan penyakit. Pemecahan

makanan untuk memasok energi serta unsur-unsur kimia pembangunan tubuh

(building blocks); perakitan building blocks tersebut menjadi protein, membran sel,

serta DNA yang mengkodekan informasi genetik; dan akhirnya penggunaan energi

untuk menghasilkan gerakan sel, semua ini dimungkinkan dengan adanya kerja

enzim-enzim yang terkoordinasi secara cermat. Sementara dalam keadaan sehat

semua proses fisiologis akan berlangsung dalam cara yang tersusun rapi serta teratur

dan homeostatis tetap dipertahankan, homeostatis dapat mengalami gangguan berat

pada keadaan patologis. Sebagai contoh, cedera jaringan hebat yang mencirikan

penyakit sirosis hepatis dapat menimbulkan gangguan berat pada kemampuan sel

membentuk enzim-enzim yang mengatalisis berbagai proses metabolisme penting

seperti sintesis ureum. Ketidakmampuan mengubah ammonia yang toksik menjadi

ureum yang nontoksik sebagai akibat dari penyakit tersebut akan diikuti dengan

intoksikasi ammonia, dan akhirnya koma hepatikum. Suatu spektrum penyakit genetik

langka tetapi yang sering sangat menurunkan keadaan umum penderitanya dan kerap

fatal, memberi contoh-contoh tambahan dramatis tentang konsekuensi fisiologis

drastis yang dapat menyertai gangguan terhadap aktivitas bahkan hanya satu enzim.

Menyusul suatu cedera jaringan berat (misal, infark jantung atau paru, cedera

remuk pada anggota gerak) atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali (misal,

karsinoma prostat), enzim yang mungkin khas bagi jaringan tertentu akan dilepas ke

dalam darah. Dengan demikian, pengukuran terhadap enzim intrasel ini didalam

1

serum dapat memberikan informasi diagnostik dan prognostic yang tidak ternilai bagi

dokter.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan beberapa

permasalahan sebagai berikut:

1) Klasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.

2) Enzim memerlukan koenzim.

3) Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur, fungsi,

mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.

4) Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik

1.3 Tujuan

Berdasarkan rumusam masalah maka makala ini bertujuan sebagai berikut:

1) Mengetahui Klasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.

2) Mengetahui bahwa Enzim memerlukan koenzim.

3) Mengetahui Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur,

fungsi, mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.

4) Mengetahui Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik

2

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 ENZIM DIKLASIFIKASIKAN BERDASARKAN TIPE DAN

MEKANISME REAKSI

Satu abad lalu, baru ada beberapa enzim yang dikenal dan kebanyakan di

antaranya mengatalisis reaksi hidrolisis ikatan kovalen. Semua enzim ini diidentifikasi

dengan penambahan akhiran –ase pada nama substansi atau substrat yang

dihidrolisisnya. Jadi, lipase menghidrolisis lemak (Yunani lipos), amilase

menghidrolisis pati (Yunani amylon), dan protease menghidrolisis protein. Meskipun

banyak sisa peristilahan ini masih tetap bertahan sampai sekarang, pemakaiannya

sudah terbukti tidak memadai ketika ditemukan berbagai enzim yang mengatalisis

reaksi yang berbeda terhadap substrat yang sama, misal, oksidasi atau reduksi

terhadap fungsi alcohol suatu gula. Sementara akhiran -ase tetap digunakan, nama

enzim yang ada sekarang ini lebih menekankan pada tipe reaksi yang dikatalisisnya.

Sebagai contoh, enzim dehidrogenase mengatalisis pengeluaran hidrogen, sementara

enzim transferase mengatalisis reaksi pemindahan gugus. Dengan semakin banyaknya

enzim yang ditemukan, ketidakjelasan juga semakin tak terelakkan, dan kerap kali

tidak jelas enzim mana yang tengah dibicarakan oleh seorang penyelidik. Untuk

mngatasi permasalahan ini, International Union of Biochemistry (IUB) telah

mengadopsi sebuah sistem yang kompleks tetapi tidak meragukan bagi peristilahan

enzim yang didasarkan pada mekanisme reaksi. Meskipun kejelasan dan pengurangan

keraguan tersebut membuat sistem nomenklatur IUB dipakai untuk ujian riset, nama

yang lebih pendek tetapi kurang begitu jelas tetap digunakan dalam buku ajar dan

laboratorium klinik. Karena alasan tersebut, sistem IUB hanya disampaikan secara

sepintas.

1) Reksi dan enzim yang mengatalisis reaksi tersebut membentuk enem kelas,

masing-masing mempunyai 4-13 subkelas.

2) Nama enzim terdiri atas 2 bagian. Nama pertama menunjukkan substrat.

Nama kedua, yang berakhir dengan akhiran –ase, menyatakan tipe reaksi yang

dikatalisis.

3) Informasi tambahan, bila diperlukan untuk menjelaskan reaksi, dapat

dituliskan dalam tanda kurung pada bagian akhir; misal, enzim yang mengatalisis

3

reaksi L-malat + NAD+ piruvat + CO2 + NADH + H + diberi nama 1.1.1.37 L-

malat: NAD+ oksidoreduktase (dekarboksilasi).

4) Setiap enzim mempunyai nomor kode (EC) yang mencirikan tipe reaksi ke

dalam kelas (digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga).

Digit keempat adalah untuk enzim spesifik. Jadi, EC 2.7.1.1 menyatakan kelas 2

(transferase), subkelas 7 (transfer fosfat), subsubkelas 1 (alcohol merupakan aseptor

fosfat). Digit terakhir menyatakan heksokinase atau ATP: D-heksosa 6-

fosfotrasferase, sebuah enzim yang mengatalisis pemindahan fosfat dari ATP ke

gugus hidroksil pada atom karbon keenam molekul glukosa.

2.2 ENZIM MEMERLUKAN KOENZIM

Banyak enzim yang megatalisis proses pemindahan gugus dan reaksi lain

memerlukan, di samping substratnya, sebuah molekul organik sekunder yang dikenal

sebagai koenzim karena tanpa koenzim, enzim tersebut tidak aktif. Koenzim akan

memperbesar kemampuan katalitik sebuah enzim sehingga menjadi jauh melebihi

kemampuan yang ditawarkan hanya oleh gugus fungsional asam aminonya, yang

menyusun massa enzim tersebut. Koenzim yang berikatan secara erat dengan enzim

lewat ikatan kovalen atau gaya nonkovalen kerap kali disebut sebagai gugus

prostetik.. Koenzim yang mampu berdifusi secara bebas umumnya berfungsi sebagai

unsur pembawa (yang didaur ulang secara kontinu) hydrogen (FADH), hidrida

(NADH dan NADPH), atau unit-unit kimia seperti gugus asil (koenzim A) atau gugus

metil (folat), membawanya bolak-balik antara tempat pembentukannya dan

pemakaiannya. Oleh karena itu, koenzim yang disebut belakangan ini dapat dianggap

sebagai substrat sekunder.

Jenis-jenis enzim yang membutuhkan koenzim adalah enzim yang mengatalisis

reaksi oksidoreduksi, pemindahan gugus serta isomerisasi, dan reaksi yang

membentuk ikatan kovalen (kelas IUB 1,2,5, dan 6). Reaksi lisis, termasuk reaksi

hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim-enzim pencernaan, tidak memerlukan koenzim.

2.2.1 Koenzim Dapat dianggap Sebagai Subtrat Sekunder

Untuk dua laasan penting, akan sering kali membantu untuk menganggap

koenzim sebagai substrat sekunder. Alasan pertama, perubahan kimia di dalam

koenzim terjadi tepat mengimbangi perubahan kimia yang berlangsung di dalam

4

substrat. Sebagai contoh, dalam reaksi oksideruduksi, jika satu molekul substrat

dioksidasi, satu molekul koenzim akan direduksi.

Aalsan kedua untuk memberi koenzim penghargaan yang sama adalah bahwa

aspek reaksi ini mungkin mempunyai makna fisiologik mendasar yang lebih besar.

Sebagai contoh, peran penting kmampuan otot yang bekerja secara anaerob untuk

mengubah piruvat menjadi laktat tidak terletak pada piruvat ataupun laktat. Reaksi

tersebut semata-mata bertujuan mengoksidasi koenzin NADH yang tereduksi menjadi

NAD+. Tanpa NAD+ glikolisis tidak dapat berlanjut dan sintesis ATP Anaerob (dan

dengan demikian, aktivitas kerjannya) akan terhenti. Di bawah keadaan anaerob,

reduksi piruvat menjadi laktat menghasilkan oksidasi ulang NADH dan memunkinkan

sintesis ATP. Reaksi lain dapat melakukan funsi ini sama baiknya. Sebagai contoh

pada bakteri atau ragi yang tumbuh secara anaerob, metabolit yang berasal dari

piruvat bertindak secara oksidan bagi NADH dan mereka sendiri berada dalam

keadaan tereduksi.

OH O

CH O C O

H3C C H3C C

I-Laktat Piruvat

NAD+ NADH + H+

Gambar : NAD+ bekerja sebagai kosubstrat dalam reaksi laktat hidrogenase.

5

Tabel . Mekanisme bagi regenerasi Anaerob NAD+

Oksidan Produk Tereduksi Bentuk Kehidupan

Piruvat

Asetaldehid

Dihidroksiasoton fosfat

Fruktosa

Laktat

Etanol

-Gliserofosfat

Matinol

Otot, bakteri laktat, ragi

(yeast) Eschrichia coli

bakteri heterolaktat

2.2.2 Fungsi Koenzim sebagai Reagensia Pemindah Gugus

Tipe reaksi biokimia pemindahan gugus

D – G + A A – G + D

Yang memindahkan gugus molekul fungsional (G) dari molekul donor (D-G)

kepada sebuah molekul aseptor akhir (misal, reaksi dahidrogenasi) atau sebagai

pembawa gugus intermediet (misal, reksi transaminasi). Diagram berikut melukiskan

konsep yang disebut terakhir ini.

D – H KoE A – H

D KoE - H A

Meskipun diagram ini mengesankan pembentukan hanya satu kompleks KoE-G

tunggal saat berlangsungnya seluruh reaksi, sebenarnya ada berbagai kompleks

intermediet KoE-G yang dapat terlibat dalam suatu reaksi tertentu (misal,

transaminasi).

Jika gugus yang dipindahkan merupakan hydrogen, adalah biasa untuk

menggambarkan hanya “separuh reaksi” di sebelah kiri:

D – H KoE

D KoE - H

6

Bahwa hal ini sebenarnya merepresentasikan hanya suatu kasus khusus dari

pemindahan gugus yang biasa dapat paling mudah dipahami dalam pengertian reksi

yang berlangsung di dalam sel utuh.

2.2.3 Koenzim Dapat Diklasifikasikan Menurut Gugus yang Pemindahannya

Dipermudah oleh Koenzim tersebut

Berdasarkan konsep di atas, kita dapat mengklasifikasikan koenzim sebagai

berikut:

Untuk pemindahan gugus bukan hydrogen:

Gula fosfat

KoA-SH

Tiamin pirofosfat

Piridoksal fosfat

Koenzim folat

Biotin

Koenzim kobamida (B12)

Asam lipoat

Untuk pemindahan hidrogen:

NAD+, NADP+

FMN, FAD

Asam lipoat

Koenzim Q

2.2.4 Banyak Koenzim Merupakan Derivat Vitamin B dan Derivat Adenosin

Monofosfat

Vitamin B membentuk bagian dalam struktur banyak koenzim. Vitamin B

nikotinamida, tiamin, riboflafin dan asam pantotenat merupakan unsur esensial

yang membentuk koenzim bagi oksidasi serta reduksi biologik, dan koenzim

kobamida serta asam folat berfungsi dalam metabolisme satu karbon. Banyak

koenzim mengandung adenin, ribose, serta fosfat, dan merupakan darivat adenosin

monofosfat (AMP). Contoh-contohnya mencakup NAD+ dan NADP+.

7

2.3 ENZIM MENGATALISIS REAKSI SPESIFIK ATAU REAKSI TIPE

Kesanggupan enzim mengatalisis satu reaksi spesifik dan pada hakikatnya tidak

mengatalisis reaksi yang lain mungkin merupakan sifat enzim yang paling signifikan.

Laju proses metabolisme karenanya dapat diatur oleh perubahan dalam efisiensi

katalitik enzim spesifik. Banyak enzim mengatalisis jenis reaksi yang sama

(pemindahan fosfat, reduksi-oksidasi, dl) dengan hanya sejumlah kecil substrat yang

secara structural berhubungan, kendati sering pada kecepatan reaksi yang secara

bermakna lebih rendah. Berbagai reaksi dengan substrat alternatif ini cenderung

terjadi kalau substrat terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. Meskipun kadar

sedemikian jarang ditemukan di dalam sel hidup, kadar ini dapat diciptakan di

laboratorium. Disini, substrat alami dan sintetik alternatif digunakan untuk

memfasilitasi pendeteksian enzim dan penelitian mengenai mekanisme katalitiknya.

Gambar : Pelekatan tiga titik sebuah substrat ke tapak – aktif enzim yang berbentuk

planar

2.3.1 Enzim Memperlihatkan Spesifisitas Optis

Kecuali enzim epimerase (rasemase) yang mengatalisis interkonversi isomer

optis, umumnya semua enzim akan memperlihatkan spesifisitas optis absolut untuk

paling tidak suatu porsi molekul substrat. Dengan demikian, enzim dari lintasan

glikolisis dan oksidasi langsung akan mengatalisis interkonversi gulafosfat-D tetapi

tidak gulafosfat-L. Dengan beberapa pengecualian (misal, enzim D-asam amino

oksidase pada ginjal), kebanyakan enzim mamalia bekerja pada isomer-L asam

amino.

Spesifisitas optis dapat meluas hingga satu porsi tertentu atau hingga

keseluruhan melekul substrat tersebut. Enzim glikosidase menggambarkan kedua

ujung ekstrem. Enzim ini mengatalisis hidrilisis ikatan glikosida antara gula dan

8

alcohol, bersifat sangat spesifik untuk bagian gula serta untuk ikatan ( atau ), tetapi

relatif nonspesifik untuk aglikon (porsi alcohol).

2.3.2 Enzim Bersifat Spesifik bagi Tipe Reaksi yang Dikatalisisnya

Enzim untuk proses lisis (enzim lisis) bekerja pada kelompok kimia khusus,

misal, enzim glikosidase pada glikosida, pepsin serta tripsin pada ikatan peptida, dan

esterase pada senyawa-senyawa ester. Berbagai substrat peptida yang berbeda dapat

diserang oleh hanya satu enzim sehingga mengurangi jumlah enzim pencernaan yang

seharusnya diperlukan. Enzim protease dapat pula mengatalisis proses hidrolisis

senyawa ester. Penggunaan ester sebagai substrat untuk sintesis telah mempermudah

penelitian terhadap mekanisme kerja enzim protease.

Enzim-enzim lisis tertentu memperlihatkan spesifisitas yang lebih tinggi. Enzim

kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida; pada reaksi ini, gugus karboksil berasal

dari asam amino aromatik fenilalanin, tirosin, atau triptofan. Enzim karboksipeptidase

dan aminopeptidase melepas asam-asam amino satu persatu, masing-masing secara

berturutan, dari ujung terminal karboksil atau terminal amino rantai polipeptida.

Meskipun beberapa enzim oksidoreduktase memanfaatkan NAD+ dan NADP+

sebagai akseptor elektronnya, kebanyakan hanya menggunakan salah satu di

antaranya. Secara umum, enzim oksidoreduktase yang berfungsi dalam proses

biosintesis sistem-sistem mamalia (misal, sintesis asam lemak atau sterol)

menggunakan NADPH sebagai reduktan sementara enzim yang berfungsi dalam

proses penguraian (misal, glikolisis, oksidasi asam lemak) menggunakan NAD+

sebagai oksidan.

2.4 AKTIVITAS KATALITIS YANG DIMILIKI ENZIM MEMFASILITASI

PENDETEKSIAN ENZIM TERSEBUT

Jumlah enzim yang kecil di dalam sel mempersulit pengukuran kadarnya di

dalam ekstrak jaringan atau cairan. Untungnya, aktivitas katalitis yang dimiliki enzim

dapat menjadi sarana pemeriksaan yang sensitive dan spesifik bagi pengukuran kadar

enzim itu sendiri. Kemampuan mengatalitis transformasi ribuan, puluhan ribu, atau

bahkan lebih molekul substat menjadi produk dalam periode waktu yang singkat

memberikan kepada setiap molekul enzim kemampuan untuk secara kimiawi

menguatkan keberadaannya.

9

Untuk mengukur kadar enzim di dalam sebuah sampel ekstrak jaringan atau

cairan biologik lain, kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim dalam sampel

tersebut harus ditentukan. Dalam kondisi yang tepat, hasil pengukuran kecepatan

reaksi harus sebanding dengan jumlah enzim yang ada. Karena jumlah molekul atau

massa enzim yang ada sukar ditentukan, hasil pengukuran tersebut dinyatakan dalam

unit enzim.. Jumlah relatif enzim dalam berbagai ekstrak kemudian dapat

dibandingkan. International Union of Biocemistry mengartikan satu unit aktivitas

enzim sebagai 1 mikromol (1 mol; 10-6) substrat yang bereaksi atau produk yang

ditransformasikan per menit.

2.4.1 Kadar Dehidrogenase Tergantung-NAD+ Diukur pada 340 nm

Dalam reaksi yang melibatkan NAD+ atau NADP+ (enzim-enzim

dehidrogenase), sifat NADH atau NADPH (tetapi bukan NAD+ atau NADP+ ) yang

menyerap cahaya dengan panjang gelombang 340 nm (Gambar 8-4) membawa

manfaat. Oksidasi NADH menjadi NAD+ terjadi disertai dengan penurunan densitas

optik (OD, optical density) pada 340 nm, yang proporsional dengan jumlah NADH

yang dioksidasi. Demikian pula, kalau NAD+ direduksi, OD pada 340 nm akan

meningkat sebanding dengan jumlah NADH yang terbentuk. Perubaahan OD pada

340 nm ini dapat dimanfaatkan bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim

dehidrogenase yang bergantung NAD+ atau NADP+ sebagai berikut. Bagi enzim

dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi NADH oleh substratnya yang teroksidasi,

kecepatan penurunan OD pada 340 nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi

enzim. Oleh karena itu, hasil pengukuran kecepatan oenurunan OD pada 340 nm

memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas enzim, yang dinyatakan dengan unit

aktivvitas, yang terdapat di dalam sampel biologik tertentu seperti serum atau ekstrak

jaringan

.

10

NADH

NAD+

Gambar : Spektrum Absopsi NAD+ dan NADH. Densitas yang tampak di sini adalah

untuk 44 Mg/L, larutan di dalam sebuah sel dengan lintasan cahaya 1 cm NADP+

mempunyai spectrum yangmasing-masing analog dengan spectrum NAD+ dan

NADH.

2.4.2 Kadar Banyak Enzim Dapat Diukur dengan Merangkaikannya pada

Enzim Dehidrogenase

Pada contoh diatas, laju pembentukan produk (NADH) diukur untuk

menentukan aktivitas enzim. Enzim selain dehidrogenase diukur kadarnya lewat

pengukuran kecepatan kemunculan produk (atau, yang lebih jarang dilakukan, lewat

pengukuran kecepatan hilangnya substrat). Sifat-sifat fisiokimiawi produk atau

substrat akan menentukan metode spesifik yang dipilih untuk mengukur kadar enzim.

Cara yang sering dan mudah dilakukan adalah “merangkaikan” (coupling) produk

reaksi dengan sebuah enzim dehidrogenase, dengan produk srbagai substrat.

11

2.5 ENZIM MURNI BERFUNGSI SANGAT PENTING BAGI PEMAHAMAN

STRUKTUR, FUNGSI, MEKANISME REAKSI, DAN PENGATURAN

ENZIM.

Tujuan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim

spesifikasi dan ekstra sel “Mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain.

Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialysis atau filtrasi gel, asam nukleat

melalui pngendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Permaslahannya

adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai

stuktur kimia dan fisika yang seupa.

Perjalanan suatu pemurnian tipikal dan enzim hati dengan pemulihan yang baik

serta pemurnian keseluruhan yang besarnya mencapai 490 kali lipat.

Glukosa

ATP, Mg 2+

ADP, Mg2+

Glukosa-6-Fosfat

NADP+

+ H+

6-Fosfoglukonolakton

Enzim Diperoleh dari Sumber-Sumber Alami atau dari Sel Tempat Enzim

Tersebut Siekspresikan oleh Gen yang diKlon.

Dulu, riset awal terhadap enzim terbatas pada protein yang dapat dimurnikan

dari sel-sel binatang, tanaman, atau bakteri tempat enzim tersebut terdapat secara

alami. Sekarang, teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan ilmuwan

memprouksi protein di dalam sel tempat protein tersebut normalnya tidak ditemukan.

Sel-sel hospes tipikal adalah bakteri dan ragi yang secara kuantitas mudah tumbuh.

Kemmapuan mengekspresikan protein rekombinan pada tingkat yang relatif tinggi

menjadikan para ilmuwan mempu mengisolasi enzim yang sulit dimurnikan karena

konsentrasi rendahnya di dalam sel tempat mereka ditemukan secara alami. Lebih

lanjut, melalui perubahan DNA yang mengkodekan protein melalui mutagenesis

12

NADP

GLUKOSA-6-FOSFAT DEHIDROGENAE

HEKSOKINASE

berorientasi –tapak (site-directed mutagenesis), para Ilmuwan dapat menambah,

menghilangkan, atau mengubah asam-asam amino spesifik dalam enzim rekombinan

untuk untuk memfasilitasi penentuan peran fungsional dan strukturalnya. Perubahan

dapat pula dilakukan untuk membuat protein lebih mudah dimurnikan.

Bagaimanapun, pmurnian enzim dan sumbernya yang alami tetap merupakan hal yang

penting, khususnya guna mengidentifikasi sifat serta peran modifikasi posstranslasi

yang yang berfungsi mengatur lokasi enzim serta efisiensi katalik.

Pemurnian Dilakukan menggunakan Kromatografi pada pertukaran Ion atau

pada Penyangga Penyisih Ukuran.

Porosdur pemurnian klasik yang bermanfaat adalah pengendapan dengan berbagai

konsentrasi garam (umumnya garam ammonium atau natrium sulfat) atau pelarut

(aseton atau etanol), pemanasan diferensial atau denaturasi PH Diferensil, sentifugasi

diferensial, filtrasi gel, dan elektroferosis. Adsopsi selektif dan elusi protein dari zat

penukar anio selulosa, yaitu deitilaminoetil (DEAE) selulosa dan zat penukar anion

selulosa, yaitu karboksimetil selulosa (CMC, carbokxymethylcellulose) juga telah

memberikan hasil yang sangat baik bagi pemurnian protein secara cepat dalam jumlah

besar.

Sebagi contoh,PH ekstrak ekuesosa jaringan hati diatur hingga 7, 5 yang pada PH ini,

sebagian besar protein akan memiliki muatan netto negatif. Campuran protein dapat

larut ini kemudian dialirkn lewat kolom selulosa DEAE pada PH 7.5 bemuatan negatif

akan terikat ke DEAE lewat interkasi muatan yang berlawanan, sementara protein

yang tidak bermuatan atau yang mempunyai muatan positif mengalir langsung lewat

kolom tersebut. Kemudian, kolom selulosa DEAE ini dielusikan menggunakan

gradien NaCl, yang memiliki kisaran dari konsntrasi rendah hingga tinggi, dan

dilarutkan dalam pendapan denganPH 7,5. karena Cl- bersaing dengan protein untuk

berikatan ke penyangga yang bermuatan positif, protein untuk elusikan secara selektif;

protein yang memiliki ikatan paling lemah diikat paling awal, dan protein yang

memiliki ikatan paling kuat diikat palinh akhir. Pemisahan protein analog dolakukan

mengyunakn penyangga bermuatan negatif seperti karboksimetilselulosa atau

fosfoselulosa pada PH yang sedikit lebih rendah untuk memastikan bahwa protein

bermuatan lebih positif.

Pemisahan protein dapat pula dilakukan pada baha berpori yang dikenal sebagai

“ayakan molecular”.. Kalau campuran protein dialirkan lewat kolom yang

13

mengandung ayakan molecular, protein yang berukuran kecil akan tersebar baik di

dalam ruang antar partikel maupun di dalam ruang internal atau pori-pori penyangga.

Ketika campuran protein dengan ukuran yang berbeda-beda mengalir lewat kolom,

mobilitas protein yang berukuran kecil akan terhambat, relatif terhadap protein yang

ukurannya terlalu besar untuk masuk ke dalam pori- poi ini. Dengan demikian,protein

berukuran besar akan muncul dari dalam kolom sebelum protein yang berukuran

kecil.

Tabel : Rangkuman skema pemurnian enzim tipikal

Fraksi Enzim Aktivitas

Total (mU)1

Protein

Total (mg)

Aktivitas

Spesifik

(mU/mg)

Pemulihan

Keseluruhan

Homogenat hati mentah

Cairan supernatan, pemusingan 100.000 x g

Endapan [NH4]2SO4 40 – 50 %

Endapan aseton 20 – 35 %

Fraksi kolom DEAE 80 – 110

Endapan [NH4]2SO4 43 – 48 %

Kristal pertama

Rekritalisasi

100.000

98.000

90.000

60.000

58.000

52.000

50.000

49.000

10.000

8.000

1.500

250

29

20

12

10

10

12, 2

60

240

2.000

2.600

4.160

4.900

(100)

98

90

60

58

52

50

49

Penyangga Kromatografi Afinitas Mampu Mengenali Regio Enzim Spesifik

Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk

secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, sejumlah

kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. Teknik ini menggunakan

suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang

ingin dimurnikan. Kalau campuran protein tersebut dipanjankan pada ligand tersebut.

Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein

yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai

cairan elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan

konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini

sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan

pemakaian sejumlah teknik klasik secara berturutan

Ligand yang di suka adalah substrat serta derivat koenzim atau zat perwarna

organic yang bertindak sebagai nukleotida atau analog koenzim yang berikatan secara

14

kovalen dengan sebuah penyangga inert (misal, NAD-Spandex, Blue Sepharose).

Ligand ini secara khas berikatan dengan penyangga lewat molekul penghubung.Yang

mempunyai panjang tiga hingga delapan atom karbon.

Pada kromatografi yang bersifat hidrofobik, hidrokarbon, alkil atau aril akan

terikat ke penyangga seperti sephadex. Retensi protein pada penyangga ini melibatkan

interaksi hidrofobik antara rantai alkil dan regio hidrofobik pada protein tersebut.

Protein kemudian di masukan ke dalam larutan yang menggandung garam dengan

konsentrasi tinggi (misal, [NH4]2SO4) dan dielusikan dengan garam yang sama yang

memiliki gradien menurun.

Teknologi DNA Rekombinan Dapat Menjadi Sumber Enzim Yang Kaya

Banyak gen yang mengkodekan enzim telah diklon, ditentukan rangkaiannya, dan

disisipkan ke dalam vector yang berasal dari plasmid atau faga tempat gen tersebut

dapat di kontrol oleh suatu promoter yang kuat. Promoter tersebut dapat “mendorong”

produksi enzim rekombinan hingga mencapai taraf yang jauh lebih tinggi

dibandingkan dengan yang terdapat pada sumber – sumber alam. Dengan

menggunakan promoter yang diatur oleh zat penginduksi (inducer) kimia spesifik,

ekspresi enzim rekombinan dapat diatur secara cermat. Umumnya vector ekspresi

semacam ini disisipkan ke dalam mikroorganisme yang mudah tumbuh seperti

Escherichia coli atau ragi untuk memproduksi enzim rekombinan.

Protein Fusi Rekombinan Dimurnikan dengan kromatograsi afinitas

Disamping menghasilkan sumber yang kaya akan enzim, yang sangat memfasilitasi

pemurnian, teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk menciptakan protein

termodifikasi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas. Cara yang umum

dilakukan adalah dengan mengikatkan kepada gen, sejumlah rangkaian nukleutida

yang k\mengkodekan ekstensi protein sehingga terbentuk protein fusi yang

merupakan ligand yang baik bagi penyangga afinitas spesifik. Salah satu pendekatan

yang popular adalah denngan mengikatkan rantai yang terdiri atas lima atau enam

asam amino histidin atau sebagai alternatif lain, domain pengikat substrat untuk enzim

glutation S-trasferase kepada gugus terminal amino atau karboksil enzim yang

bersangkutan. Protein fusi rekombinan trsebut kemudian dapat dimurnikan pada

kolom afinitas yang berisi ion logam bivalen terikat seperti Ni2+ (untuk fusi dengan

polihistidin) atau glutation terikat (untuk protein fusi glutation S-trasferase) (Gambar

8-6).Protein fusi sering mengandung tapak (site) pembelahan untuk protease yang

sangat spesifik seperti trombin, pada regio yang menghubungkan kedua bagian dari

15

protein fusi tersebut. Hal ini memungkinkan pengeluaran domain fusi tambahan

tersebut setelah pemurnian afinitas.

GST yang mengkodekan plasmid DNA Hasil klon

Dengan tapak trombin yang mengkodekan enzim

Ligasikan menjadi satu

Lakukan tranfeksi sel, tambahkan zatPenginduksi, kemudian lakukan pemecahan zat

Alirkan kedalam kolom afinitas glutation

(GSH)

lakukan alusi dengan GSH proses

dengan trombin

Gambar : Penggunaan protein –fusi glutation S-tranferae (GST) untuk pemurnian

enzim rekombinan

16

EnzimGST

GST T Enzim

GST Enzim

GST

Enzim

GSTGST

Elektroforesis Gel Poliakrilamida Dapat Mendeteksi Kontaminan

Penilaian homogeneitas protein paling baik dilakukan dengan elektroforesis gel

poliakrilamida (PAGE, polyacrylida gel electrophoresis) di bawah berbagai kondisi.

Yang paling popular di antaranya adalah elektroforesis gel poliakrilamida atau PAGE

dengan sodium dodesil sulfat (SDS), suatu detergen ion yang memisahkan protein

multimerik menjadi protomer. Karena setiap ikatan peptida mengikat kurang lebih dua

buah molekul SDS, polipeptida tersebut memiliki muatan negatif yang kuat. Dengan

demikian, jarak yang ditempuh setiap polipeptida ketika bermigrasi kearah anoda

bergantung pada massa molecular relatifnya (Mr). Sebagai alternatif lain, PAGE dapat

dilaksanakan dalam kondisi asli yaitu, tanpa adanya SDS atau denaturan lain sehingga

struktur kuaterner dan kerap kali pula aktivitas katalitik enzimnya dapat

dipertahankan. Dalam PAGE dua dimensi (O’Farrell), dimensi pertama memisahkan

protein yang terdenaturasi berdasarkan nilai pl-nya dengan melakukan ekuilibrasi

protein tersebut di dalam medan listrik yang mengandung urea dan dengan gradien pH

yang dipertahankan oleh amfolit terpolimerisasi. Setelah pemrosesan dengan SDS

selesai, dimensi kedua kemudian memisahkan protein berdasarkan ukuran molecular

unit protomernya.

2.6 ENZIM DAPAT DITEMUKAN DI DALAM ORGANEL SPESIFIK

Susunan spasial dan kompartementalisasi enzim, substrat, serta kofaktor di

dalam sel mempunyai makna yang teramat penting. Sebagai contoh, di dalam sel-sel

hati, enzim untuk glikolisis terdapat di dalam sitoplasma sedangkan enzim untuk

siklus asam sitrat di dalam mitokondria. Distribusi enzim diantara berbagai organel

subselular dapat dipelajari setelah dilakukan fraksionasi homogenat sel melalui

sentrifugasi berkecepatan tinggi. Kandungan enzim pada setiap fraksi kemudian

diperiksa.

Penentuan lokasi suatu enzim tertentu didalam sebuah sel atau jaringan pada

keadaan yang relatif tetap acapkali dilakukan dengan prosedur histokimiawi

(“histoenzimologi”). Sayatan tipis jaringan yang dibekukan (frozen section) dengan

ketebalan 2 hingga 10m diproses dengan substrat untuk suatu suatu enzim tertentu.

Di mana terdapat enzim, di situ akan terbentuk produk dari reaksi yang dikatalisis

enzim tersebut. Jika terwarna dan tidak larut, produk akan tetap berada di tempat

pembentukannya dan mengungkap lokasi enzim. Histoenzimologi menghasilkan

gambar grafik dan pola yang relatif bersifat fisiologik mengenai distribusi enzim.

17

2.7 ISOZIM MERUPAKAN BENTUK YANG MEMPUNYAI PERBEDAAN

FISIK TETAPI DENGAN AKTIVITAS KATALISIS YANG SAMA

Kalau teknik pemurnian enzim diaplikasikan, sebagai contoh kepada enzim

malat dehidrogenase yang berasal dari sumber yang berbeda (misal, hati tikus dan

escherichia coli), kita akan melihat dengan jelas bahwa sekalipun enzim malat

dehidrogenae yang berasal dari hati tikus maupun E coli akan mengatalisis reaksi

yang sama, sifat-sifat fisik dan kimiamereka memperlihatkan banyak perbedaan

bemakna. Bnetuk – bentuk fisik berbeda dari aktivitas yang ama juga dapat ditemukan

dalam berbagai jaringan organisme yang sama, dalam tipe-tipe sel yang berbeda,

dalam kompartemen sunselular, atau dalam organisme prokaryotik seperti E coli.

Temuan ini diperoleh sebagai hasil penerapan prosedur pemisahan elektroforentik

pada pemisahan bentuk-bentuk aktivitas enzimatik tertentu yang berbeda secara

elektroforetis.

Pemisahan dan Identifikasi Isoenzim memiliki Nilai Diagnostik

Isozim laktat dehidrogenase dalam serum dapat dilihat dengan melakukan

elektroforesis terhadap sampel serum pada bahan penyangga pati, agar atau gel

poliakrilamoda, yang biasanya dilakukan dengan PH 8,6. isozim tersebut mempunyai

muatan yang belainan pada pH 8,6 ini dan bermigrasi menuju lima daerah yang

berlainan pada elektoferogram. Isozim tersebut dideteksi berdasarkan kemampuan

masing –masing isozim. Mengatalisis proses reaksi suatu zat pewarna yang tidak

berwarna menjadi bentuk yang berwarna dan tidak larut.

Campuran Assay dehidrogenase tipikal mengandung NAD+ suatu substrat

terteduksi , bentuk teroksidasi zat pewarna redoks seperti nitroblue tetrazolium

(NBT), pembawa (carrier) electron intermediet yang diperlukan bagi pemindahan

elektron dari NADH ke NBT, serta pendapat serta ion pengaktif jika dibutuhkan..

(Laktat) SH2 S (piruvat)

18

LAKTAT DEHIDROGENASE

NAD+ NADH + H+

PMS Tereduksi PMS Teroksidasi

NBT Teroksidasi NBT tereduksi

(Tidak berwarna) (Formazan Biu)

Gambar : reaksi yang dirangkaiakn untuk mendeteksi aktivitas laktat dehidrogenase

pada sebuan elektroferogram. (NBT, netroblue tetrazolium, PMS, phenazine

methosulfate).

Isozim merupakan produk dari gen yang berkerabat erat.

Enzim oligomerik dengan protomer yang tidak sama bisa terdapat. Yang sering,

satu jaringan mengahsilkan terutama satu jenis protomer, sementara jaringan lain

menghasilkan protomer lain. Bila protomer-protomer ini dapat brgabung melalui

berbagai cara untuk membangun sebuah enzim yang aktif (misal, tetramer),

terbentuklah isozim dengan aktifitas enzimatik tersebut.

Isozim laktat dehidrogenase memiliki perbedaan pada tingkat stuktur kuanternernya.

Molekul oligomerik laktat dehidrogenase stuktur kuanternernya. Molekul oligomerik

laktat dehidrogenase (berat molekul 130.000) terdiri atas empat protomer dengan dua

tipe, yaitu tipe H dan M (berat molekul sekitar 34.000). hanya molekul tetramiklah

yang mempunyai aktivitas katalitik. Jika urutan tidak penting, protomer ini dapt

dikambinasikan melaLui cara berikut :

HHHH

HHHM

HHMM

HMMM

MMMM

19

Markert telah menggunakan sejumlah kondisi yang diketahui dapat

membongkar dan membentuk kembali struktur kuanterner untuk menerangkan

hubungan antar isozim laktat dehidrogenase. Pemecahan dan pembentukan kembali

laktat dehidrogenase –I1 atatu laktat dehidrogenase –I5 homogen tidak emnghasilkan

isozim yang baru.

2.8 ANALISIS KUANTITATIF ENZIM PLASMA TERTENTU

MEMPUNYAI MAKNA DIAGNOSTIK.

Enzim plasma nonfungsional tidak melakukan sembanrang fungsi fisiologik ynag

diketahui di dalam darah. Substrat sering tidak ditemukan di dalam plasma, dan enzim

sendiri terdapat di dalam darah manusia normal dengan kadar sampai sejuta kali lipat

lebih rendah daripada kadar di jaringan. Keberadaan enzim di dalam plasma dengan

kadar yang meningkat diatas nilai normalnya menunjukkan peningkatan laju

kerusakan jaringan.

2.9 ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI MEMFASILITASI

PENEGAKAN DIAGNOSIS PENYAKIT GENTIK

Penegakan diagnosis penyakit genetic telah memperoleh dorongan yang luar

biasa dari perkembangan teknologi DNA rekombinan. Meskipun semua penyakit

molecular telah lama diketahui terjadi sbagai akibat perubahan DNA, teknik untuk

pemeriksan langsung terhadap rangkaian DNA, teknik untuk pemeriksaan langsung

terhadap rangkaian DNA baru belakangan ini tersedia. Pengembangan pelacakan

hibridasi untuk fragmen DNA telah menghasilkan sejumlah teknik penapisan prenatal

dengan sensitivitas yang memedai guna menentukan ada tidaknya kalainan herediter,

teknik ini dilakukan dengan memetakan enzim retriksi DNA yang berasal dari sel-sel

janin dalam cairan amnion atau dengan memeriksa produk yang dihasilkan

menggunakan oligonukleotida sebagai senyawa primer untuk reaksi rantai

polimerase, (PCR, polymerase chain reaction). Pada prinsipnya berbagai pelacak

terhadap DNA dapat dilakukan untuk menengakan diagnosis sebagaian besar penyakit

genetik. Sebuah pelacak terhadap DNA yang dibuat terhadap suatu bagian gen untuk

sub unit hemoglobin normal dapat mendeteksi fragmen restrisik yang emmendek atau

tidak ada akibat delesi di dalam gen tersebut, sebagaiman terjadi pada sebagian

penyakit talasemia-, dan pada tipe-tipe talasemia - serta -, ∆ yang langka.

HASIL DIGESTI RESTRIKSI YANG SUDAH TERLACAK DAPAT

MENGUNGKAPKAN GEN HOMOLOG DENGAN RANGKAIAN BASA

BERBEDA.

20

Pelacak DNA dapat pula digunakan mendeteksi rangkaian DNA yang

behubungan erat dengan gen. Pemeriksaan analisis ini dapat dikembangkan untuk

mendeteksi berbagai variasi kromosom spesifik (perbedaan dalam rangkaian antar

kromosom homolog). Digesti DNA oleh enzim retriksi endonuklease akan

menghasilkan peta restriksi berbeda-beda (pola fragmen DNA) dari gen-gen

homologyang mengandung rangkaian basa yang berlainan . fenomena ini diberi nam

“polimorfisme panjang fragmen restriksi”. Bagi penyakit genetic yang

berhubungan dengan RFLP,seorang manusia yang menjadi pembawa penyakit

tersebut akan membawa satu kromosom dengan gen normal dan satu kromosom lagi

dengan gen cacat.

RNA KATALITIK

Meskipun jelas bukan merupakan protein, asam ribonukleat (RNA) tertentu

akan memperlihatkan aktivitas katalitik yang sangat spesifik bagi substrat tertentu.

RNA ini yang memenuhi semua kriteria klasik untuk didefinisi sebagai enzim, disebut

ribozim. Meskipun substrat yang dikatalisis oleh ribozim hanya terbatas pada ikatan

fosfodiester RNA, spesifitas kerjanya sepenuhnya sebanding kerja enzim yang klasik.

Ribozim mengatalisis reaksi trans esrterifikasi dan akhirnya reaksi hidrolisis ikatan

fosfodiester dalam molekul RNA. Reaksi ini diperlancar oleh gugus OH.

21

BAB III

PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

1. Enzim merupakan katalisator yang mengatur kecepata berlangusngnaya

berbagai proses fisiologik

2. Cacat pada fungsi enzim sering menyebabkan penyakit

3. Enzim yang mengatalisis reaksi yang melibatkan pemindahan gugus isomerisasi,

oksido-reduksi, atau sintesis ikatan kovalen memerlukan substrat yang dikenal

dengan koenzim

4. Sebagian besar enzim bersifat sangat spesifik terhadap substratnya, koenzim

serta tipe reaksi yang dikatalisisnya. Meskipun demikian, beberapa enzim

protease juga memecah ester. Bagi enzim yang bekerja pada substrat dapat pula

ikut bereaksi, tetapi umumnya dengan kecepatan yang lebih rendah.

5. Pengukuran aktivitas enzim merupakan hal sentral bagi penentuan kuantitas

enzim dalam riset atau laboratorium klinik.

6. Aktivitas enzim dehidrogenase yang bergantung –NAD(P)+ diperiksa secara

spektrofotomentris dengan mengukur perubahan absorbsi pada 330 mm yang

menyertai oksidasi atau reduksi NAD (P)H.

7. Perangkaian enzim lain pada dehidrogenase dapat memperlancar analisisnya.

8. Untuk menyelidiki struktur mekanisme kerja, dan pengaturan aktivitasnya,

enzim harus dimurnikan hingga mencapai homogeneitas sekitar 95%.

9. teknik pemurnian enzim mencakup presipitasi selektif dengan pelarut garam

atau organic dan kromatografi pada penyangga pertukaran ion, filtrasi gel,

afinitas substrat, ligand zat warna, atau interaksi hidrofobik.

10. kemampuan memanfaatkan teknik rekombinan DNA untuk mengekspresikan

enzim dalam tubuh hospes yang dipilih telah membawa revolusi dalam teknik

pemurnian enzim dengan menghasilkan enzim dalan jumalh besar yang dalam

sebagian besar keadaan, mudah dimurnikan hingga mencapa homogeneitas.

11. Kemajuan pemurnian dinilai dengan mengukur peningkatan aktifitas spesifik

suatu enzim (aktivitas per unit masa) dan homogenitas akhir lewat elektroforesis

gel poliakrilamida (PAGE).

12. Penentuan lokasi enzim intrasel yang tepat disimpulkan lewat teknik histokimia

dan fraksionasi sel, yang dirangkaiakn dengan analisis enzimatik, terhadap

22

sayatan jaringan atau fraksi homogenat sel, isozim, bentuk yang secara fisik

berbeda pada enzim nonfungsional di dalam serum menunjukan kerusakan pada

jaringan tertentu manusia, dan memberikan informasi diagnostik seta prognostic

yang berharga.

13. Kemampuan enzim restriksi endonuklease mendeteksi perubahan yang sangat

kecil pada struktur gen telah memungkinkan dokter mendiagnosis penyakit

genetic akibat mutasi yang menghasilkan enzim yang cacat atau enzim

nonfungsional.

14. RNA katalitik yang dikenl sebagai ribozim mengatalisis reaksi hidrolisis yang

sangat spesifik ikatan fosfodiester pada RNA. Reaksi ini amat penting dalam

berbagai pristiwa pemrosesan yang terlibat di dalam maturasi pra-mRNA

3.2 SARAN

Peranan enzim dalam kesehatan sangat penting, untuk itu manusia hendaknya

lebih menjaga kesehatan. Dan kami penyusun mengharapkan masukan untuk

penyempurnaan makalah ini.

23

KEPUSTAKAAN

Murray, Robert K, 1996, Harper’s, Biochemistry

Mc. Gilvery, Robert W, And Gerald W, 1983

Page David, 1981.

Triman Jr, 2007 Materi Biokimia, Surabaya

24

25

26